KR100860326B1 - 에포틸론 ｂ를 함유하는 혈관재협착 예방 및 치료제 - Google Patents

Abstract

에포틸론 B(epothilone B)를 유효성분으로 포함하는 혈관재협착 예방 및 치료제가 개시된다. 본 발명에 의하면 혈관풍선성형술, 스텐트삽입술, 관동맥우회술을 포함하는 동맥우회술, 동맥-정맥 문합술 및 기타 혈관수술 등 혈관 손상을 동반하는 시술 후에 발생하는 혈관재협착을 방지할 수 있는 것으로 에포틸론 B를 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 혈관재협착의 억제 및 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공됨으로서 그 목적을 달성할 수 있다.

Description

에포틸론 Ｂ를 함유하는 혈관재협착 예방 및 치료제{Pharmaceutical composition for epothilone B for the prevention and treatment of restenosis}

도 1a, 1b, 1c 및 1d는 각각 손상된 대조군 경동맥과 에포틸론 B 처리군의 경동맥의 조영영화촬영(cineangiography) 사진(a, b 100배율, c, d 400배율)이다.

도 2a 및 2b는 각각 손상된 대조군 경동맥 및 에포틸론 B 처리군의 경동맥의 절편 사진(40 배율)이다.

도 3a 및 3b는 각각 손상된 대조군 경동맥 및 에포틸론 B 처리군의 경동맥 절편 사진(400 배율)이다.

도 4a 및 4b는 각각 우태아혈청과 혈소판 유래 성장인자에 의한 대동맥 평활근세포의 이상증식에 대한, 에포틸론 B의 처리농도에 따른 세포증식 억제효과를 나타내는 그래프이다.

도 5a 및 5b는 우태아혈청과 혈소판 유래 성장인자가 처리된 대동맥 평활근세포의 DNA 합성에 대한, 에포틸론 B의 처리 농도에 따른 DNA 합성 억제효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 에포틸론 B(epothilone B)를 유효성분으로 포함하는 혈관 재협착 예방 및 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관 손상을 동반하는 시술인 혈관풍선성형술, 스텐트 삽입술, 관동맥우회술을 포함한 동맥우회술, 동맥-정맥 문합술, 기타 혈관 수술 후에 발생하는 혈관 재협착을 방지 할 수 있는, 에포틸론 B를 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관재협착의 예방 및 치료제에 관한 것이다.

심부전, 관상동맥질환, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증, 협심증 등의 심장질환과 뇌졸중, 말초혈관 질환 등의 심혈관계 질환은 다양한 연령층에서 발생하며 적기에 치료하지 않으면 심각한 후유증과 더불어 사망에 이르게 할 수 있다. 특히, 서구화된 식생활로 인하여 관상동맥질환의 발병율이 급격히 증가되고 있어, 관상동맥질환을 효과적으로 치료하려는 노력이 계속되고 있다.

현재까지 개발된 관상동맥질환에 대한 치료법으로는, 약물요법, 유전자 치료법, 경피적 관동맥 중재술 (PCI: percutaneous coronary intervention, 풍성성형술 및 스텐트 삽입술 등 포함), 외과적으로 수술하는 관동맥우회술(CABG: coronary artery bypass graft)의 재관류요법(revascularization therapy) 등이 있다.

또한, 최근에는, 경피적 관동맥 중재술 (풍성성형술 및 스텐트 삽입술 등 포함)이 많이 사용되고 있으나, 3 내지 6개월이 경과한 후에는 약 40%가량의 환자들에 있어서 혈관 재협착(restenosis)이 일어난다는 문제점이 있다 (Ryan et al., J. Am. Coll. Cardiol., 22. 2033-2054, 1993). 이러한 혈관 재협착은 풍선도자에 의 해 손상된 혈관내피 세포, 활성화된 혈소판 또는 대식세포로부터 여러 가지의 사이토카인이 생성, 분비되면서 혈관 평활근세포의 유주(migration) 및 증식이 촉진되고, 이에 따라 세포외간질(ECM: extracellular matrix)의 생성 및 분비가 촉진되어 혈관내막의 비후를 일으켜, 발생되는 것으로 알려져 있다(Godfried et al, Am. Heart J., 129, 203-210, 1995).

한편, 정상적인 상태의 혈관 평활근세포는 증식을 하지 않지만, 스텐트시술 등을 통하여 내피세포의 중막이 손상되면서 여러 단계의 신호전달을 거쳐 혈관 평활근세포의 분열, 이동 및 증식이 유발된다. 혈관 평활근세포 증식의 기전으로는 정상적인 내피세포의 손상에 의한 증식억제인자의 제거와 증식유발인자의 활성화, 혈관 평활근세포 표면의 수용체를 통한 증식유발신호의 전달, 혈관 평활근세포의 핵 내로 전달된 증식유발신호에 의한 세포 주기의 변화 등을 들 수 있다. 정상적인 내피세포는 혈관 평활근세포의 증식을 억제하는 물질을 분비하는데, 내피세포가 손상되면 이들의 분비가 억제되고, 활성화된 혈소판에서 분비되는 혈소판 유래 성장인자(platelet derived growth factor), 혈장 중에 포함되어 있는 여러 사이토카인(cytokine) 등에 의해 혈관 평활근세포의 증식이 유발된다고 알려져 있다.

이러한 경피적 관동맥 중재술 (풍성성형술 및 스텐트 삽입술 등 포함) 후의 혈관 재협착을 방지하기 위하여 다양한 방법이 연구되고 있다. 예를 들어, 헤르데(Herdeg) 등은 탁솔이 스텐트 시술 후에 발생하는 혈관 재협착의 발생을 억제시킬 수 있음을 보고하였고(Herdeg et al., Zeischrift fur Kardiologie, 89, 390-397, 2000), 대한민국 특허등록 제 478671호에는 클로트리마졸을 유효성분으로 포 함하는 혈관 재협착 예방 및 치료용 약학 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제 516026호에는 3'-디옥시아데노신(3'-deoxyadenosine)을 유효성분으로 하는 혈관재협착 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제 2001-110793호에는 Rho 키나아제 저해활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 하는 혈관협착증의 예방 및 치료제가 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제 2003-46314호에는 항트롬빈을 유효성분으로 하는 이식 혈관병, 재협착증, 인-스텐트 재협착증(in-stent restenosis) 및 폐 고혈압과 같은 혈관 증식성 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제 2005-23249호에는 레티노이드 및 레티노이드 작용 조절제를 유효성분으로 하는 혈관내 스텐트를 사용한 경피적 관상동맥 혈관형성술 후의 혈관 재협착 및/또는 재폐색 등 혈관성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제 2005-43183호에는 커쿠민(curcumin)을 포함하는 혈관 재협착 예방 및 치료용 약학조성물이 개시되어 있다.

그러나 상기한 혈관 재협착 억제제는 혈관 재협착을 방지하는 것 이외의, 상처재생억제, 혈관손상, 간독성, 신장손상, 혈소판응집억제에 의한 출혈량 증가 등의 다양한 부작용을 나타내었기 때문에, 동맥경화의 진행과 혈관 재협착의 방지를 위해 혈관평활근 세포의 증식을 억제하는 약물에 대한 연구가 널리 진행되고 있으며, 현재 몇 가지 약물이 환자의 치료에 사용되고 있다(J Am Coll Cardiol., 2002, 39, 183-193). 그러나 현재 사용되고 있는 약물들의 경우 그 효과가 완벽하지 못해 여전히 우수한 혈관평활근 세포의 증식 억제 기능을 가진 새로운 약물의 개발이 요 구되고 있다.

따라서, 안전하면서도 효과적으로 혈관 재협착을 억제할 수 있는 물질을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 동맥경화와 혈관 재협착의 원인이 되는 혈관평활근세포의 증식을 효과적으로 억제 하는 억제제와, 이에 따른 혈관 재협착 예방 및 치료제, 동맥경화억제제를 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 하기 일반식 1로 표시되는 에포틸론 B를 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것으로 스텐트 시술을 포함한 혈관손상을 동반하는 시술 후 혈관 (관상동맥, 경동맥, 말초 혈관 등) 재협착 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 하기 일반식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 혈관 평활근세포 증식 억제제을 제공한다.

본 발명은 또 하기 일반식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 동맥경화 억제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 하기 일반식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 혈관 재협착 방지제를 제공한다.

[일반식 1]

상기에서 혈관 손상을 동반하는 시술은 혈관풍선 성형술, 동맥 우회술 (관동맥 우회술 포함), 동정맥 문합술, 스텐트 삽입술 등의 시술이 포함되고, 본 발명에 의한 예방제, 방지제 또는 치료제는 캅셀, 액제, 주사제, 연질캅셀제, 과립제 및 정제 등으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종 이상의 제형을 가질 수 있다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

동맥경화와 혈관재협착의 원인이 되는 혈관평활근세포의 증식을 효과적으로 억제하는 억제제를 제공하기 위하여 제약 분야에서 유용성이 널리 알려진 16 환 시클릭 매크롤라이드 분자인 에포틸론의 유사체를 합성하여 효능을 탐색한 결과 이중 에포티론 B가 우수한 효능을 보여 주었다.

상기한 바와 같은 에포틸론 B가 스텐트 시술후에 발생하는 혈관 재협착을 효과적으로 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, 백서경동맥 손상모델을 이용하여 손상된 혈관 외벽에 에포틸론 B를 국소 도포해 혈관의 재협착 방지에 효과가 있음을 병리조직학적 검사를 통하여 검정한 결과 대조군에 비해 에포틸론 B 처리군에서 혈관의 신생내막 억제 효과를 확인하였다. 그리고 혈관 재협착에 중요한 영향을 끼 치는 흰쥐의 대동맥 평활근세포에 에포틸론 B를 처리한 결과, 에포틸론 B가 농도의존적으로 대동맥 평활근세포의 증식을 억제할 수 있고, 상기 흰쥐의 대동맥 평활근세포에서의 DNA 합성을 농도의존적으로 억제할 수 있으며, 세포분열 주기에 있어서 휴지기(G₀/G₁) 상태인 세포의 비율을 증가시킬 수 있음을 확인하였는 바, 에포틸론 B가 스텐트 시술후에 발생하는 혈관 평활근세포의 증식을 억제하여, 혈관 재협착을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 혈관손상을 동반하는 시술 후 혈관재협착을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물은 에포틸론 B를 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

이때, 본 발명의 혈관 재협착 예방 및 치료제의 유효성분으로 함유되는 에포틸론 B는 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(예, 카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바니린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 혈관 재협착 예방 및 치료용 조성물은 혈관 재협착 예방, 및 치료 목 적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 예컨대 에포틸론 B를 1uM 이상을 포함할 수 있다. 본 발명이 일례에서, 조성물중 에포틸론 B의 함량은 시험관내(in vitro)에서는 1~1000nM에서 세포성장을 억제할 수 있으며, 생체내(in vivo)에서는 20㎍ 정도이다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.

본 발명의 혈관재협착을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물은 부작용이 없이 스텐트 시술을 포함한 혈관손상을 동반하는 시술 후에 발생하는 혈관 재협착을 예방 및 치료할 수 있으므로, 보다 안전한 관상동맥질환을 포함한 혈관질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 에포틸론 B 화합물의 분리 및 정제

입체적 고순도의 에포틸론 B화합물을 얻기 위하여 다음과 같이 3방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

첫째, 관 크로마토그래피법으로 에포틸론 B화합물 (10 mg)을 에틸아세테이트 와 메탄올 혼합용액 (0.5 mL, 1:1, v/v)에 용해한후, 이를 실리카 젤 관을 통하여 분리하면 순수한 에포틸론 B화합물 (8 mg)을 얻는다. 이때의 이동상은 에틸아세테이트; 헥산; 메탄올 (20:70:10, v/v)이다.

둘째, 재결정방법으로 에포틸론 B화합물 (10 mg)을 디에틸에테르 (0.5 mL)에 상온에서 완전히 용해한후, 이를 -20 ℃에서 6시간 동안 정치한다음 생성된 결정을 0 ℃로 냉각된 디에틸에테르 (1.0 mL x 2)로 2회 세척하고 건조하여 백색의 순수한 에포틸론 B화합물 (6 mg)을 얻는다.

셋째, 고성능액체크로마토그래피(HPLC)을 이용한 분리정제방법으로 에포틸론 B화합물 (10 mg)을 Prep-HPLC를 이용하여 목적하는 입체적 고순도의 에포틸론 B화합물 (9 mg)을 얻는다. 이때의 분석 컬럼은 SC₈ symmetry C₈, 5 μm, 3.9 x 150 mm (Water사, 미국) 또는 SC₁₈ symmetry C₁₈, 5 μm, 3.9 x 150 mm, (Water사, 미국)이며 이동상은 grad. 50%-AcCN/H₂O (v/v) 이다. 나아가 Inject Volume은 10.0 μL 이며 Run Time은 20분이다

(1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-Dihydroxy-8,8,10,12,16-pentamethyl-3-[(E)-1-methyl-(2-methyl-1,3-thiazol-4-yl)ethenyl]-4,17-dioxabicyclo[14.1.0]heptadecane-5,9-dione (에포틸론 B)

R _f = 0.3 (EtOAc/hexane/methanol 20:70:10); mp 117℃-118℃ [a]²² _D -74.4 (c 0.5, CHCl₃); IR (film, NaCl) 3481, 2963, 2931, 1734, 1686, 1457, 1378, 1293, 1259, 1187, 1148, 1054, 1008, 978, 752 cm^{-1 1}H NMR (CDCl₃, 600 MHz) d 6.96 (s, 1H, SCH=C), 6.58 (s, 1H, CH=CCH₃), 5.40 (dd, J=7.8 Hz, J=2.4 Hz 1H, CH₂COOH), 4.22 (brs, 1H), 4.21 (brs, 1H), 3.75 (t, J=3.0 Hz, 1H, CHOH), 3.28 (dq, J=6.9 Hz, J=4.8 Hz 1H, (CO)CHCH₃), 2.79 (dd, J=7.2 Hz, J=4.8 Hz 1H, CHOCCH₃), 2.68 (s, 3H, N=CCH ₃), 2.52 (dd, J=10.2 Hz, J=10.2 Hz, 1H, CH ₂COOH), 2.34 (dd, J=3.0 Hz, J=3.0 Hz, 1H, CH ₂COOCH), 2.10 (td, J=3.6 Hz, J=3.6 Hz, 1H, CH₃COCHCH ₂CHO), 2.07 (s, 3H, CH=CCH ₃), 1.90 (ddd, J=15.0, J=7.8 Hz, J=7.2 Hz, 1H, (CH₃)COCHCH ₂CHO), 1.761.67 (m, 3H), 1.521.42 (m, 2H), 1.411.37 (m, 2H), 1.36 (s, 3H, C(CH ₃)OCHCH₂), 1.26 (s, 3H, C(CH ₃)₂), 1.15 (d, J=6.6 Hz, 3H, CH(CH ₃)), 1.06 (s, 3H, C(CH ₃)₂), 0.99 (d, J=7.2 Hz, 3H, CH(CH ₃)) ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) d 220.8, 170.8, 165.4, 151.9, 137.9, 119.8, 116.3, 76.9, 74.3, 73.0, 61.9, 61.6, 53.3, 43.1, 39.4, 36.6, 32.6, 32.3, 31.0, 23.0, 22.6, 21.7, 19.8, 19.3, 17.3, 16.1, 13.8 HRMS calcd. for C₂₇H₄₂NO₆S: 508.2733 [M+H]⁺, found: 508.2757.

실시예 2: 에포틸론 B에 의한 손상된 경동맥의 협착 방지 효과 시험

(단계 1) 에포틸론 B를 포함하는 pluronic gel 제조

In vivo 상에서 에포틸론 B의 국소적 도포를 위하여 pluronic gel을 사용하였다. 실험 하루전날 F-127 pluronic gel (Sigma Chemical Company, Germany) 을 40 % 가 되도록 차가운 3 차 증류수에 녹인 뒤, 4 ℃ 에서 12 시간 이상 방치하여 분말상태의 F-127 pluronic을 완전하게 녹인다. 실험당일 에포틸론 B를 2μg/μL의 농도로 100% ethanol에 각각 용해시킨 후, 40% F-127 pluronic gel 90 μL에 에포틸론 B (2μg/μL) 10 μL의 비율로 첨가하여, 100 μL의 에포틸론 B-pluronic gel이 에포틸론 B 20μg을 함유하도록 제조하였다. 대조군도 동일한 제조법으로 에포틸론 B만 함유하지 않도록 하는 방법으로 만들었다.

(단계 2) 흰쥐 경동맥 손상 수술

실험백서에 따라 ketamine (50 mg/kg)과 xylazine (6.7 mg/kg)을 복강에 투여하여 마취시킨 후, 우측 경부를 절개하여 총경동맥, 외경동맥 및 내경동맥을 분리한다. Microvascular clamp(Acland, S&T, Switzerland)를 총경동맥의 기시부와 내경동맥의 원위부에 착용시켜 혈류를 일시적으로 중단시킨 상태에서 외경동맥을 절개한다. 절개부위에 2F Fogarty 풍선도자(Baxter Healthcare Corporation, USA)를 우측 총경동맥으로 삽입하고, 총경동맥의 직경보다 크게 풍선을 부풀린 상태에서 3 회를 왕복시켜 인위적으로 내피세포를 제거한 후 Microvascular clamp를 제거 하여 혈류를 재관류시켰다. 경동맥의 외부에 분비물 및 혈액을 깨끗이 제거한 후, 도포하기 위해 미리 준비된 에포틸론 B-pluronic gel과 에포틸론 B가 포함되지 않는 pluronic gel을 대조군과 에포틸론 B 치료군에 순서를 번갈아가며 각 실험동물의 경동맥 윗부분에 100 μL씩 고르게 도포한 후 절개부위를 봉합하였다. 수술 2주후에 경동맥 조영술을 시행하고 다시 경동맥을 채취하여 병리 조직적 검사를 시행하였다.

(단계 3) 경동맥 조영술

경동맥 손상을 시행한 지 14 일후에 다시 ketamine (50 mg/kg)과 xylazine (6.7 mg/kg)을 복강에 투여하여 전신마취를 시키고 복부 정중선을 절개한다. 복부 대동맥에 4F vascular cannula (Cook, USA)를 삽입한 후 catheter를 두부 방향으로 전진시켜 횡행 대동맥에서 총경동맥이 분지되는 시점에 최대한 가깝도록 진행시킨다. 조영제 (Visipaque^TM, Amershan Health, Cork, Ireland)를 주입하여 경동맥의 혈관 조영술을 실시하고 computerized coronary angiography (DCI Videodensitomery, Phillips, The Netherlands)를 이용하여 평균 혈관 내경 (mean luminal diameter, MLD)를 측정하였다.

경동맥 손상을 가하지 않은 쥐의 좌측 경동맥 조영술의 직경을 1 AU(arbitrary unit)로 하여 그것을 기준으로 손상을 가한 우측 경동맥의 평균 직경을 구하였다.

실험 결과 혈관내경은 대조군 0.58±0.02 AU, 에포틸론 B 처리군은 0.81±0.06 AU (p<0.01, P=0.003)로 에포틸론 B 처리에 의하여 혈관의 협착이 방지되었음을 확인하였다.

실시예 3: 병리조직 검사

대조군과 에포틸론 B 처리군의 내경의 면적, 중막의 면적, 내막의 면적, 내막과 중막의 면적비 및 협착의 정도(%)를 측정한 결과는 하기 표 1과 같다.

[표 1]

	대조군	에포틸론 B 처리군	P 값
내경의 면적(㎟)	0.19±0.08	0.26±0.08	P>0.05 (0.066)
중막의 면적(㎟)	0.11±0.01	0.11±0.02	P>0.05 (0.889)
내막의 면적(㎟)	0.22±0.05	0.16±0.03	P<0.05 (0.009)
내막과 중막의 면적비	2.06±0.46	1.51±0.35	P<0.05 (0.011)
협착의 정도(%)	55.00±13.30	39.50±13.20	P<0.05 (0.025)

표 1에서 보듯이, 중막의 면적은 에포틸론 B 처리군과 대조군의 경우가 유사하여 세포 독성 효과는 보이지 않으면서, 내막의 면적은 에포틸론 B 처리군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소되었다(p< 0.05). 또한 내막과 중막의 면적비와 협착의 정도도 에포틸론 B 처리군에서 대조군에 비하여 감소하였으며 통계학적으로도 각각 유의한 차이( p< 0.05)를 나타내었다.

실시예 4: 에포틸론 B의 대동맥 평활근세포 증식억제 효과

흰쥐의 대동맥 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cell, VSMC)을 10% FBS의 Dulbelcco's Modified Eagle Medium (DMEM) 200㎕에 5ㅧ10³cells/well의 농도 로 96-well plate에 접종하였다. 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 환경 하에 배양하여 DMEM 100㎕로 배지를 교체하여 혈청 고갈 상태를 24시간동안 지속시킨 후 각 농도의 에포틸론 B (0.1, 1, 10, 100 nM)를 처리하고, 다시 24시간동안 배양한 다음, 5% FBS 또는 50ng/ml의 농도로 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF-BB, Sigma Chem. Co., USA)를 처리했다. 24시간동안 배양시킨 뒤 세포증식 활성 조사를 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 처리 후 ELISA microplate reader로 560㎚ 파장에서 optical density(O.D) 값을 얻어 대조군과의 O.D값을 비교해 활성정도를 조사하였다.

도 4A와 4B는 에포틸론 B의 처리농도에 따른 대동맥 평활근 세포의 증식 억제효과를 나타내는 그래프이다.

실시예 5: 에포틸론 B의 대동맥 평활근세포의 DNA 합성억제 효과

상기 실시예 4에서 나타난 에포틸론 B의 세포증식 억제효과가 DNA의 합성과 관련된 것인지를 확인하고자 하였다.

즉, 혈소판 유래 성장인자를 처리하고, 20시간동안 배양한 후 1 ㎕의 [³H]티미딘을 배양액에 가하고 다시 4시간 동안 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4과 동일한 방법으로 대동맥 평활근세포를 배양하였다. 이어, 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 500㎕의 TCA(trichloroacetic acid)를 가하여 30분동안 반응시켰다. 이어, TCA를 제거하고, 세척용액(ethanol/ether, 1:1(v/v))으로 세척한 다음, 500㎕ 의 NaOH를 가하여 세포를 용해시켰다. 그런 다음, 세포용해물에 3㎖의 섬광계수용 혼합액(scintillation cocktail)을 가하고, 방사선량을 측정하여, 합성된 DNA의 상대적인 양을 비교하였다(참조: 도 5). 도 5A와 5B는 각각 5% FBS와 혈소판 유래 성장인자가 처리된 대동맥 평활근세포의 DNA 합성에 대한, 에포틸론 B의 처리 농도에 따른 DNA 합성 억제효과를 나타내는 그래프이다. 도 5A와 5B에서 보듯이, 에포틸론 B의 처리양이 증가 할수록 대동맥 평활근세포의 DNA 합성량이 감소함을 알 수 있었다.

따라서 실시예 4에서 나타난 에포틸론 B에 의한 대동맥 평활근세포의 증식억제 효과는 에포틸론 B가 상기 세포의 DNA 합성을 억제하기 때문에 발생함을 알 수 있었다.

실시예 6. 급성 독성 연구

25 ± 5 g의 ICR계 마우스와 235 ± 10 g의 특정병원부재(SPF) 스프라그-도올리(Sprague Dawley, Biogenomics사) 랫트를 각각 3마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 실시예 2의 에포틸론 B를 각각 100 mg/㎏, 10 mg/㎏, 1 mg/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰하였다.

본 실험 수행 결과, 4군 모두에서 사망한 예를 전혀 관찰할 수 없었고, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 발명의 화합물이 안전한 약물임을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 동맥경화와 혈관재협착의 원인이 되는 혈관평활근세포의 증식을 효과적으로 억제하여 스텐트시술을 포함한 혈관 손상을 동반하는 시술 후에 발생하는 혈관 재협착을 방지할 수 있는, 에포틸론 B를 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관재협착을 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 혈관재협착을 예방하기 위한 약학적 조성물은 부작용이 없이 스텐트 시술을 포함한 혈관 손상을 동반하는 시술 후에 발생하는 혈관 재협착을 예방할 수 있으므로, 보다 안전한 관상동맥질환을 포함한 혈관 질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

1. 하기 일반식 1로 표시되는 에포틸론 B를 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것으로, 풍선혈관성형술, 스텐트 삽입술, 관동맥 우회술을 포함하는 동맥 우회술, 동맥-정맥 분합술 중 하나 이상의 혈관 손상을 동반하는 시술 후 유발되는 손상된 경동맥 협착 방지 및 대동맥 평활근 세포증식억제제.

   
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