KR100851039B1 - Methods for Detecting Cancer Stem Cell or stem cell, and Screening Anti-cancer Materials/chemicals using Biomarkers of Oct-4, Cripto-1, ABCG2 or Estrogen receptor - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항암물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 인간조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포를 배양하여 제조된 줄기세포의 스피어에 후보 항암물질인 약물이나 독물 등을 처리한 다음, 상기 스피어 내에 존재하는 Oct-4, Cripto-1, ABCG2 및 에스트로겐 수용체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 줄기세포 마커의 발현이 감소하거나, 커넥신43의 발현이 증가하는 물질을 항암물질로 선택하는 것을 특징으로 하는 항암물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for screening an anticancer substance, and more specifically, to a sphere of stem cells prepared by culturing adult stem cells or tumor stem cells derived from human tissues, and then treating a drug or a poison which is a candidate anticancer substance, and then Reducing the expression of one or more stem cell markers selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2 and estrogen receptor present in the sphere, or selecting a substance that increases the expression of connectin 43 as an anticancer substance It relates to a method for screening an anticancer substance.
줄기세포, Oct-4, 커넥신43, 에스트로겐 수용체, Cripto-1, ABCG2 Stem Cells, Oct-4, Conxinsin43, Estrogen Receptor, Cripto-1, ABCG2
Description
도 1은 본 발명에 따른 유방 줄기세포의 정상 맘모스피어를 공초점 전자현미경(confocal microscope)으로 확인한 사진이다.1 is a photograph confirming a normal mammoth sphere of breast stem cells according to the present invention with a confocal microscope.
도 2는 17-베타 에스트라디올을 처치한 경우 MCF-7 맘모스피어의 Oct-4 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.Figure 2 is the result of confirming the expression of Oct-4 gene of MCF-7 mammosphere by RT-PCR when 17-beta estradiol was treated.
도 3은 17-베타 에스트라디올을 처치한 경우. MCF-7 맘모스피어의 ABCG2 발현양상을 공초점 전자현미경으로 확인한 사진이다.3 when treated with 17-beta estradiol. ABCG2 expression of MCF-7 mammosphere was confirmed by confocal electron microscopy.
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본 발명은 항암물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, (a) 인간조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포를 배양하여 줄기세포의 스피어를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 스피어에 항암 약물 후보 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 스피어 내에 존재하는 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체 및 커넥신43으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 줄기세포 마커와 결합하는 항체나 유전자를 이용하여 확인하는 단계; 및 (d) 항암 약물 후보 물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여 Oct-4, Cripto-1, ABCG2 및 에스트로겐 수용체로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 줄기세포 마커의 발현이 감소하거나, 커넥신43의 발현이 증가하는 물질을 항암물질로 선택하는 단계를 포함하는 항암물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for screening an anticancer substance, and more particularly, (a) culturing human stem cells derived from adult stem cells or tumor stem cells to prepare a sphere of stem cells; (b) treating the prepared spheres with an anticancer drug candidate; (c) identifying by using an antibody or gene that binds to at least one stem cell marker selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, an estrogen receptor and connectin 43 present in the spheres; And (d) decreased expression of at least one stem cell marker selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2 and estrogen receptors compared to the case where no anticancer drug candidates were treated, It relates to a method for screening an anticancer substance comprising the step of selecting a substance with increased expression as an anticancer substance.
종래의 발암과정의 가장 오래된 가설 중 하나로 줄기세포이론(stem cell theory)이있다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. 만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기 까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.One of the oldest hypotheses of the conventional carcinogenic process is stem cell theory. Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells. Totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells (multipotent stem cells). Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to 8-cells after fertilization of eggs and sperm have these properties. Transplantation can result in one complete individual. Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer. The inner cell mass located inside the blastocyst after 4-5 days of fertilization. It is called embryonic stem cells and differentiates into a variety of other tissue cells but does not form new life. Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into cells specific to the tissues and organs that contain them, as well as the growth and development of individual tissues and organs in the prenatal, neonatal, and adult phases. It is involved in maintaining homeostasis of adult tissues and inducing regeneration in case of tissue damage and collectively called tissue-specific pluripotent cells are called adult stem cells.
성체 줄기세포는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포로서,그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 이러한 성체줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 담당한다. 대표적인 성체줄기세포에는 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)와 중간엽(간엽) 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)가 있다. 조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 반면, 중간엽(간엽) 줄기세포는 골모세포(osteoblast), 연골모세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte) 및 근육모세포(myoblast) 등의 중배엽성 조직의 세포로 분화하는 것으로 알려져 있다. 성체줄기세포를 얻을 수 있는 대표적인 조직으로 골수가 알려져 있으며, 이러한 골수에는 조혈줄기세포, 중간엽(간엽) 줄기세포, 다분화능 성체전구세포(multipotent adult progenitor cells; MAPCs) 등의 존재가 보고되어 있다. 특히, 골수 유래 다분화능 성체전구세포가 중간엽(간엽) 줄기세포와 같이 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등으로 분화할 뿐만 아니라 신경세포, 내피세포, 간세포 등 다른 조직의 세포로도 분화가 가능하다는 연구가 발표되면서 많은 관심을 끌고 있다(Reyes M, et al., Blood 98: 2615-2625, 2001; Reyes M, et al., J. Clin. Invest. 109: 337-346, 2002). 또한 이외에 신경줄기세포, 피부줄기세포, 모낭줄기세포, 유방줄기세포, 태반 줄기세포등 모든 성인의 장기에 성체줄기세포가 존재하는 것이 확인되었다. 최근에는 성체줄기 세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다. Adult stem cells are stem cells that appear during the developmental process, when each organ of the embryo is formed or during the adult stage, and its differentiation ability is generally limited to only cells that constitute specific tissues. These adult stem cells remain in most organs after adulthood and play a role in supplementing the loss of normal or pathological cells. Representative adult stem cells include hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs). Hematopoietic stem cells differentiate mainly into blood cells such as red blood cells, white blood cells, and platelets, while mesenchymal (mesenchymal) stem cells are osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and myoblasts. It is known to differentiate into cells of mesoderm tissues, such as. Bone marrow is known as a representative tissue capable of obtaining adult stem cells, and the presence of hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and multipotent adult progenitor cells (MAPCs) has been reported in these bone marrow. . In particular, bone marrow-derived multipotent adult progenitor cells can differentiate into osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, etc. like mesenchymal (mesenchymal) stem cells, as well as cells of other tissues such as neurons, endothelial cells, and hepatocytes. Has been published (Reyes M, et al., Blood 98: 2615-2625, 2001; Reyes M, et al., J. Clin. Invest. 109: 337-346, 2002). In addition, it was confirmed that adult stem cells exist in all adult organs such as neural stem cells, skin stem cells, hair follicle stem cells, breast stem cells and placental stem cells. In recent years, the use of adult stem cells, experiments to differentiate into a variety of tissues, such as hepatocytes have been successful because of the attention.
또한, 최근, 지방 조직이 다분화능 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다(B. Cousin et al., BBRC., 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC., 328:258, 2005). 즉, 지방추출(liposuction)에 의해 얻어진 인간 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것은 in vitro상에서 지방세포, 골형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는 세포라는 사실이 보고되었다(P.A. Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al., BBRC., 315:255, 2004). 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목받고 있는 것이다. 또한, 최근 연구에서는 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있음이 동물 모델 실험을 통하여 알려짐으로써, 줄기세포의 새로운 소스로서 두각을 나타내고 있다. In addition, it has recently been found that adipose tissue is a new source of pluripotent stem cells (B. Cousin et al., BBRC ., 301: 1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110: 349, 2004; S Gronthos et al., J. Cell Physiol ., 189: 54, 2001; MJ Seo et al., BBRC ., 328: 258, 2005). In other words, it has been reported that the undifferentiated cell population is included in the human adipose tissue obtained by liposuction, which is a cell having differentiation ability into adipocytes, osteoblasts, myoblasts and chondrocytes in vitro (PA Zuk et al., Tissue Eng. , 7: 211, 2001; AM Rodriguez et al., BBRC ., 315: 255, 2004). These adipose tissues have the advantage of being able to be extracted in large quantities, and are attracting attention as a source of new stem cells to supplement the existing disadvantages. In addition, recent studies have shown that adipose tissue-derived cells have the ability to promote muscle regeneration and neurovascular differentiation through animal model experiments, and have emerged as a new source of stem cells.
지금까지 알려진 지방 유래 줄기세포로는 상피세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기 세포(Martin Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005), 골 형성 및 지방 세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기세포(Y. Cao et al., BBRC, 332:370, 2005), 신경세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기세포(K. M. Safford et al., BBRC, 294:371, 2005), 지방세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포(R. Ogawa et al., BBRC, 319:511, 2004), 골 형성 및 연골 형성세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포(R. Ogawa et al., BBRC, 313:871, 2004), 연골세포로 분화가능한 인간 지방 유래 줄기세포(H.A. Awad et al., Biomaterials, 25:3211, 2004), 신경 세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포(J. Fujimura et al., BBRC, 333:116, 2005) 및 골세포, 연골세포, 신경세포 또는 근육세포로 분화가능한 지방 유래 줄기세포(미국특허공보 제6,777,231호) 등이 있다.So far known fat-derived stem cells include human adipose-derived adult stem cells capable of differentiation into epithelial cells (Martin Brzoska et al ., BBRC , 330: 142, 2005), human adipose-derived adult stem cells capable of bone formation and differentiation into adipocytes. (Y. Cao et al ., BBRC , 332: 370, 2005), human adipose-derived adult stem cells capable of differentiating into neurons (KM Safford et al., BBRC , 294: 371, 2005), mice capable of differentiating into adipocytes Adipose-derived stem cells (R. Ogawa et al., BBRC , 319: 511, 2004), rat adipose-derived stem cells capable of differentiating into osteogenic and chondrogenic cells (R. Ogawa et al., BBRC , 313: 871, 2004) ), Human adipose derived stem cells capable of differentiation into chondrocytes (HA Awad et al ., Biomaterials , 25: 3211, 2004), rat adipose derived stem cells capable of differentiating neurons (J. Fujimura et al., BBRC , 333: 116, 2005) and adipose derived stem cells capable of differentiating into osteoblasts, chondrocytes, neurons or muscle cells (US Patent Publication No. 6, 777,231).
상기 정상 성인 줄기세포를 분리하기 위한 기술의 도래와 함께, 정상 성인 유방줄기세포가 분리되고 특정되었다. 이 정상 성인 유방줄기세포에 대하여 세개의 미국 특허가 존재한다(US 5650317; US 5814511; US 61400119). 또한, 이들 세포의 특징과 관련 있는 여러 문헌이 반포되어 있다. With the advent of the technology for isolating normal adult stem cells, normal adult breast stem cells have been isolated and characterized. There are three US patents for this normal adult breast stem cell (US 5650317; US 5814511; US 61400119). In addition, several documents relating to the characteristics of these cells have been published.
한편, 인간 유방암은 세계에 걸쳐 여성들이 걸리는 주요한 암들 중 하나이다. 인간 유방암과 관련하여 유전자, 식이, 방사선, 호르몬 등을 포함하여 많은 요소들이 있지만, 그 중 어느 하나도 어떻게 유방암 발생 과정의 여러 단계, 여러 메카니즘에 기여를 하는지는 명확하게 증명되지 못하고 있다. 일반적으로, 발암과정은 단일정상세포에서 "개시단계(initiation phase)'로 일컬어지는 비가역적 현상이 일어남으로서 이루어진다. 이러한 단일 세포는 더 이상 최종적인 분화를 할 수 없고 "불사(immortal)"가 된다. 그러나, 이 개시화 세포는 아직 악성 종양 세포가 아니다. 악성 종양세포가 되기 위해서는 이들 세포가 분열하여 세포군이 팽창되어야 한다. 이 단계를 "촉진(promotion)" 단계라고 한다. 이 단계에서 세포분열, 세포의 증식 및 개시화된 세포의 예정된 세포사 과정의 저해작용 등에 의해서 개시화 세포의 풀(pool)이 증가한다. 광범위한 촉진 단계 이후, 개시화된 세포군의 개개의 세포는 암세포의 모든 특질(hallmark)을 갖기에 충분한 유전적/표현형적 변화를 축적한다. 이 마지막 단계를 "진행(progression)" 단계라고 하며, 이때 세포는 정상 조직에 침입할 수 있고 먼 곳으로 전이가 가능하여 악성 암세포가 된다. 과거의 인간 유방암의 예방은, 인간 유방암이 어떻게 "개시/촉진/진행"의 모델에 꼭 들어맞는지에 대해 일반적으로 인정되는 메카니즘에 대한 이해가 없었기 때문에 예방법 자체가 매우 제한적이었다. 또한, 유방암의 치료는 환자의 정상 세포에 비해 유방암 세포만을 선별적으로 죽이는 노력에 기초하고 있었다.Human breast cancer, on the other hand, is one of the major cancers in women around the world. There are many factors associated with human breast cancer, including genes, diet, radiation, and hormones, but none of them clearly demonstrate how they contribute to the different stages and mechanisms of breast cancer development. In general, the carcinogenic process occurs by irreversible phenomena called "initiation phases" in single normal cells, which can no longer have final differentiation and become "immortal". However, this initiating cell is not yet a malignant tumor cell, in order to become a malignant tumor cell, these cells must divide and expand the cell population, which is called a "promotion" step. The pool of initiating cells is increased by proliferation of cells, inhibition of the intended cell death process of the initiated cells, etc. After extensive facilitation, individual cells of the initiating cell populations have all hallmarks of cancer cells. Accumulate enough genetic and phenotypic changes to have this final step, called the "progression" phase, where the cells are likely to invade normal tissue. And cancer can become malignant cancer cells in the past.Prevention of human breast cancer in the past had no understanding of the generally accepted mechanism of how human breast cancer fits into the "initiation / promotion / progress" model. Prophylaxis itself was very limited, and the treatment of breast cancer was based on an effort to selectively kill only breast cancer cells as compared to normal cells of the patient.
그러나, 최근 종양이 "암 줄기세포(종양 성장 유지에 제한없는 능력을 지님)" 및 부분적으로 분화된 "암 비-줄기세포(종양의 영구 성장을 유지할 수 없음)"를 모두 포함한다는 사실을 발견하였다.However, recent discoveries have shown that tumors include both "cancer stem cells (with unlimited capacity to maintain tumor growth)" and partially differentiated "cancer non-stem cells (which cannot sustain tumor growth)". It was.
커넥신43 유전자의 비-발현 및 Oct-4 유전자(전사 인자)의 발현은, 정상 성인 유방줄기세포, 비-발암성 줄기세포이면서 불멸인 세포(개시화 세포), 정상 유방줄기세포와 불멸화된 유방줄기세포로부터 유도된 약하거나 강한 발암성을 가진 세포를 특징 짓는다. 반면, 정상 성인 유방줄기세포의 분화된 정상 딸세포는 Oct-4 유전자를 억제하고 커넥신43 유전자를 발현시킨다. 이러한 결과는 정상 성인 유방줄기세포가 인간 유방암 발생에 "표적(target)" 세포가 된다는 유력한 실험적 증거를 제공한다. 그리고 최근까지 알려지지 않았던 Cripto-1 유전자가, 널리 이용되는 인간 유방암세포주인 MCF-7에서뿐만 아니라, 정상 인간 유방줄기세포 및 유방줄 기세포로부터 유도된 불멸성의, 약하거나 높은 발암성을 띠는 세포에서 발현한다는 사실이 밝혀졌다(M. Al-Hajj et al, Wicha, 2003, USA 100: 3983-3988). Non-expression of the leucine 43 gene and expression of the Oct-4 gene (transcription factor) are normal adult breast stem cells, non-carcinogenic stem cells and immortalized cells (initiating cells), normal breast stem cells and immortalized cells. Characterizes weak or strong carcinogenic cells derived from breast stem cells. In contrast, normal daughter cells differentiated from normal adult mammary stem cells inhibit Oct-4 gene and express congesin43 gene. These results provide potent experimental evidence that normal adult breast stem cells become "target" cells for human breast cancer development. And the Cripto-1 gene, which has not been known until recently, is expressed not only in the widely used human breast cancer cell line MCF-7, but also in immortal, weak or highly carcinogenic cells derived from normal human breast and breast stem cells. (M. Al-Hajj et al, Wicha, 2003, USA 100: 3983-3988).
Oct-4는 줄기세포에서 미분화상태 표지인자로써 잘 알려져 있고, 기술분야에서는 대한민국특허출원 제10-2004-0105716호 "인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체", 대한민국특허출원 제10-2004-0096780호 "포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct-4 유전자 발현 억제용 이중나선 알엔에이", 대한민국특허출원 제10-2006-0092128호 "파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법" 등에서 나타난 바와 같이, 미분화상태의 줄기세포임을 입증하기 위한 실험으로 Oct-4 발현능 실험을 하는 것이 통상이다. 그리고 Cripto-1은 미국특허 7,078,176 "Cripto-1의 탐지 및 정량"에서 나타난 바와 같이, 여성의 유선(mammary gland)의 최말단 부위에 줄기세포에서 처음으로 발견되었다. 사람의 암종 가운데 50~80% 정도가 Cripto-1의 과발현 특성을 보이고, 이 Cripto-1 단백질은 세포 형질전환(cell transformation)을 야기하고 세포 침습성(cell invasion)과 이동 능력을 증가시킨다. Oct-4 is well known as an undifferentiated state marker in stem cells, and in the art, Korean Patent Application No. 10-2004-0105716, "monoclonal antibody specific for human embryonic stem cells", Korean Patent Application No. 10-2004- 0096780 "Maintenance of Undifferentiated State of Mammalian Embryos and Stem Cells Double-stranded RNA for Oct-4 Gene Expression Inhibition", Korean Patent Application No. 10-2006-0092128 "Human Umbilical Cord Blood with Increased Proliferative Capacity by Osteoblast-based Red-like Structure As shown in "derived multipotent stem cells and methods for producing the same", etc., it is common to perform Oct-4 expression test as an experiment for proving that they are undifferentiated stem cells. Cripto-1 was first detected in stem cells at the distal end of the mammary gland of women, as shown in US Pat. No. 7,078,176, "Detection and Quantitation of Cripto-1." About 50-80% of human carcinomas show Cripto-1 overexpression, which causes cell transformation and increases cell invasion and migration capacity.
ABCG2(ATP-binding cassette(ABC) transporter G2)는 ATP-binding cassette(ABC) transporter 의 일종이며 ABC transporter는 세포막에 존재하는 매우 중요한 단백질로서, 줄기세포, 태반, 장, 골격근, 조혈세포 등에서 발견된다. 이 단백질은 세포막에 존재하며 ATP 에너지를 이용하여 세포 밖으로 약물을 퍼내는 작용을 하여 세포내 약물의 농도를 낮춰 세포가 약물에 대한 저항성을 가지게 한ㄱ거나, 혹은 세포질 내에서 세포내 약물을 막소포로 격리시켜 세포밖으로 퍼내는 기 전으로 약물에 대한 저항성을 나타내기도 한다. 암세포나 줄기세포가 약물에 대해 저항성을 나타내는 주요 요인으로 생각되며, 지금까지 48 개의 ABC 유전자가 동정되었는데, 크게 A부터 G까지의 7가지 그룹으로 나뉜다. 그들 중에 대표적으로 P-glycoprotein/ABCB 1, MRP(Multi Drug Resistance Protein) 1/ABCC 1, MRP 2/ABCC 2, MRP 3/ABCC 3, BCRP(Breast Cancer Resistance Protein)/ABCG 2 등이 항암 약물에 저항성을 가지는 것으로 생각된다. ABCG2 (ATP-binding cassette (ABC) transporter G2) is a kind of ATP-binding cassette (ABC) transporter and ABC transporter is a very important protein in the cell membrane, and is found in stem cells, placenta, intestine, skeletal muscle, and hematopoietic cells. . The protein is present in the cell membrane and uses ATP energy to pump the drug out of the cell, thereby lowering the concentration of the intracellular drug, thereby making the cell resistant to the drug, or membrane vesicles within the cytoplasm. It is also a mechanism of resistance to drugs as it is isolated and transported out of cells. Cancer cells and stem cells are thought to be the major factor that shows resistance to drugs, and 48 ABC genes have been identified so far, which are divided into seven groups from A to G. Among them, P-glycoprotein / ABCB 1, MRP (Multi Drug Resistance Protein) 1 / ABCC 1, MRP 2 / ABCC 2, MRP 3 / ABCC 3, BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) / ABCG 2, etc. It is considered to have resistance.
현재 유방암 예방 및 치료방법이 실패하는 대부분의 주요한 이유 중의 하나는 종양 치료 약물이 유방암세포의 "표적된" 결정적인 세포, 즉 "암 줄기세포"를 목표으로 하고 있지 않기 때문이다. 그러므로, 인간 유방 "암줄기 세포"를 표적화하기 위해서는 [a] Oct-4(정상 유방 및 유방 암줄기세포 모두의 "줄기세포성(stemness)"을 유지하는 데에 필요한 유전자) 및 [b] 커넥신43 (정상 인간 유방 줄기세포의 분화시에 필요한 유전자)의 발현에 영향을 주는 새로운 치료 방법을 고안해야만 한다. One of the major reasons for the failure of current methods of preventing and treating breast cancer is that tumor therapeutic drugs do not target the "targeted" critical cells of breast cancer cells, namely "cancer stem cells." Therefore, in order to target human breast "cancer stem cells", [a] Oct-4 (the gene required to maintain "stemness" of both normal breast and breast cancer stem cells) and [b] connectin 43 New therapeutic methods must be devised to influence the expression of genes necessary for the differentiation of normal human breast stem cells.
종양 세포 또는 암줄기세포를 죽이기 위해 노력하는 것보다는 이러한 두 개의 유전자의 발현을 변화시키는 것이 암줄기세포의 최종 분화를 유도할 수 있다. 최근, 트리코스타틴-A 및 SAHA[Suberoylanilide Hydroxamic Acid]와 같은 약물이 유전자 발현을 바꾼다는 사실이 실험중이다(F.A. Marks et al., Dokmanovic 14: 1497-1511, 2005). 그러나, 지금까지 직접적으로 Oct-4, 커넥신43 유전자 등에 영향을 미칠 수 있는 물질(agent)을 스크린하기 위한 체계적인 접근은 없었다.Rather than trying to kill tumor cells or cancer stem cells, altering the expression of these two genes can induce the final differentiation of cancer stem cells. Recently, it has been tested that drugs such as Trichostatin-A and Suberoylanilide Hydroxamic Acid (SAHA) alter gene expression (F.A. Marks et al., Dokmanovic 14: 1497-1511, 2005). However, there has been no systematic approach to screening agents that can directly affect Oct-4, the leucine 43 gene, and so on.
이에 본 발명자들은 정상 인간 유방 줄기세포 또는 유방암 세포주 MCF-7로부터 유래된 인간 맘모스피어(mammosheres)를 이용하여 정상 인간유방줄기세포가 커넥신43은 발현하지 않지만, Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체를 발현한다는 점을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the inventors of the present invention do not express leucine 43 in normal human breast stem cells using human mammosheres derived from normal human breast stem cells or breast cancer cell line MCF-7, but Oct-4, Cripto-1, ABCG2 The inventors have discovered that they express estrogen receptors and have completed the present invention.
본 발명의 목적은 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체의 발현을 저해하고 커넥신43의 발현을 증가시키는 항암물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a method for screening an anticancer substance that inhibits the expression of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, estrogen receptor and increases the expression of connectin 43.
본 발명의 다른 목적은 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체의 발현을 증가시키고 커넥신43의 발현을 저해하는, 발암 연구에 도움이 되는 인간 종양 촉진 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for screening a human tumor promoting substance, which is useful for oncology studies, which increases the expression of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, estrogen receptor and inhibits the expression of connectin43.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 인간조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포를 배양하여 줄기세포의 스피어를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 스피어에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 스피어 내에 존재하는 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체 및 커넥신43으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 줄기세포 마커와 결합하는 항체나 유전자를 이용하여 확인하는 단계; 및 (d) 항암 후보 물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여 Oct-4, Cripto-1, ABCG2 및 에스트로겐 수용체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 줄기세포 마 커의 발현이 감소하거나, 커넥신43의 발현이 증가하는 물질을 항암물질로 선택하는 단계를 포함하는 항암물질의 스크리닝 방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) preparing a sphere of stem cells by culturing adult stem cells or tumor stem cells derived from human tissue; (b) treating the prepared sphere with an anticancer candidate substance; (c) identifying using an antibody or gene that binds to at least one stem cell marker selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, an estrogen receptor and connectin 43 present in the spheres; And (d) decreased expression of one or more stem cell markers selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, and estrogen receptors compared to the case where no anticancer candidates were treated, or expression of connectin43 It provides a method for screening an anticancer substance comprising the step of selecting the increasing substance as an anticancer substance.
또한 본 발명은 (a) 인간조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포를 배양하여 스피어를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 스피어에 인간 종양 촉진 후보 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 스피어 내에 존재하는 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체 및 커넥신43으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 줄기세포 마커와 결합하는 항체를 이용하여 확인하는 단계; 및 (d) 인간 종양 촉진 후보 물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여 Oct-4, Cripto-1, ABCG2 및 에스트로겐 수용체로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 줄기세포 마커의 발현이 증가하거나, 커넥신43의 발현이 감소하는 물질을 인간 종양 촉진 물질로 선택하는 단계를 포함하는 인간 종양 촉진 물질의 스크리닝 방법을 제공한다In another aspect, the present invention comprises the steps of (a) culturing adult stem cells or tumor stem cells derived from human tissue to prepare a sphere; (b) treating the prepared spheres with human tumor promoting candidates; (c) identifying using an antibody binding to at least one stem cell marker selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, an estrogen receptor, and leucine 43 present in the spheres; And (d) increase the expression of at least one stem cell marker selected from the group consisting of Oct-4, Cripto-1, ABCG2 and estrogen receptors as compared to no treatment with human tumor promoting candidates, It provides a method for screening a human tumor promoting substance comprising the step of selecting a substance that decreases the expression of the human tumor promoting substance.
또한, 본 발명의 인간조직 유래 성체 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 선택된 인간 조직 유래 줄기세포로부터 선택할 수 있고, 종양 줄기세포는 유방암, 뇌암, 위장관암, 폐암, 간암, 자궁암, 대장암 및 혈액암 등으로 구성된 군에서 선택된 종양 유래 종양 줄기세포로부터 선택할 수 있다.In addition, the human tissue-derived adult stem cells of the present invention can be selected from human tissue-derived stem cells selected from the group consisting of breast, bone marrow, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus, and the like. It can be selected from tumor-derived tumor stem cells selected from the group consisting of breast cancer, brain cancer, gastrointestinal cancer, lung cancer, liver cancer, uterine cancer, colon cancer and hematological cancer.
바람직하게는 인간조직 유래 성체 줄기세포는 유방 줄기세포이고, 상기 종양 줄기세포는 유방암 세포주인 것을 특징으로 한다. Preferably the adult stem cells derived from human tissues are breast stem cells, the tumor stem cells are characterized in that the breast cancer cell line.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 (i) 인간 유방줄기세포; (ii) 이러한 정상 인간 유방줄기세포가 악성 종양으로 신성형적(neoplastic)으로 변형될 수 있다는 점 및, 그렇게 형성된 종양성 인간 유방 세포는 정상 유방 줄기세포와 마커(Oct-4, Cripto-1, ABCG2 및 에스트로겐 수용체)를 공유한다는 점; (iii) 이러한 정상 인간유방줄기세포는 커넥신43은 발현하지 않지만, Oct-4, Cripto-1, ABCG2 및 에스트로겐 수용체를 발현한다는 점; (iv) 정상 유방세포와 MCF-7에서 유래한 맘모스피어는 에스트로겐에 노출되었을 때 Oct-4 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다는 점의 최근의 발견에 기초한 최초의 새로운 방법이다. The present invention (i) human breast stem cells; (ii) the fact that such normal human breast stem cells can be neoplastic into malignant tumors, and the tumorous human breast cells so formed are normal breast stem cells and markers (Oct-4, Cripto-1, ABCG2). And estrogen receptors); (iii) such normal human breast stem cells do not express connectin43 but express Oct-4, Cripto-1, ABCG2 and estrogen receptors; (iv) Mammoth spheres derived from normal breast cells and MCF-7 are the first new methods based on recent findings that can increase Oct-4 gene expression when exposed to estrogens.
본 발명자들은 상기의 발견에 기초하여 인간조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포를 이용하여, 직접적으로 Oct-4, 커넥신43 유전자 등에 영향을 미칠 수 있는 물질(agent), 즉 인간 종양의 증식을 억제 또는 저해하는 항암물질을 스크린하는 방법을 찾아냈다. 특히, 유방암의 발생에 매우 중요한 여성호르몬인 에스트로겐이 Oct-4의 유전자발현에 영향이 미친다는 사실의 최초 발견을 기초로 하였다. 본 발명에서, 인간조직 유래 성체 줄기세포는 이미 공지되어 있는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 선택된 인간 조직 유래 줄기세포로부터 분리, 사용할 수 있고, 종양 줄기세포는 유방암세포주 MCF-7를 포함하여, 뇌암, 위장관암, 폐암, 간암, 자궁암, 대장암 또는 혈액암 등 인간 유래의 다양한 종류의 암조직 및 암세포주로부터 분리하여 사용할 수 있다.Based on the above findings, the present inventors have used human tissue-derived adult stem cells or tumor stem cells to increase the proliferation of agents, ie, human tumors, which can directly affect Oct-4, connectin 43 gene, and the like. A method of screening for anti-cancer substances that inhibits or inhibits has been found. In particular, it was based on the first discovery that estrogen, a female hormone that is very important for the development of breast cancer, influences the gene expression of Oct-4. In the present invention, adult stem cells derived from human tissues may be isolated and used from human tissue derived stem cells selected from the group consisting of known breast, bone marrow, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, and uterus. Tumor stem cells, including breast cancer cell line MCF-7, can be used separately from various types of cancer tissues and cancer cell lines derived from humans, such as brain cancer, gastrointestinal cancer, lung cancer, liver cancer, uterine cancer, colon cancer or blood cancer.
본 발명의 일 예에서는 우선, 다음과 같은 방법을 통하여, 인간 유방 및 복부 등의 체지방조직으로부터 다분화능 줄기세포 및 종양 줄기세포 후보군을 분리 및 정제한다. 이와 관련하여 한국 특허출원 10-2006-99052호를 참조할 수 있다.In one embodiment of the present invention, first, the multipotent stem cells and tumor stem cell candidate groups are separated and purified from body fat tissues such as human breast and abdomen through the following method. In this regard, reference may be made to Korean Patent Application No. 10-2006-99052.
수득한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 후보군을 일차항체인 Oct-4 또는 Cripto-1을 함유한 PBS에 하룻밤동안 반응시킨다. PBS로 3회 세척하고, 형광이 표지되고 상기 일차항체를 인식할 수 있는 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시킨다. PBS로 세 번 세척한 후, 마운팅(mounting) 한 후 현미경으로 촬영하여, Cripto-1 및 Oct-4를 모두 발현하는지 여부를 확인함으로써 상기 줄기세포 후보군으로부터 최종적으로 줄기세포를 확인한다.The resulting adipose tissue-derived multipotent stem cell candidate group was reacted overnight to PBS containing the primary antibody Oct-4 or Cripto-1. Washed three times with PBS, and reacted in the dark for 1 hour with a secondary antibody that is fluorescently labeled and can recognize the primary antibody. After washing three times with PBS, and then mounted (mounted) and photographed under a microscope, the stem cells are finally identified from the stem cell candidate group by confirming whether they express both Cripto-1 and Oct-4.
본 발명의 일 구체예로, 정상 인간 유방 줄기세포 또는 유방암 세포주 MCF-7로부터 유래된 인간 "맘모스피어(mammosheres)"를 제조한다. 맘모스피어는 조직 배양 분야에서 널리 사용되고 있는 기술을 이용하여 제조한다. 통상적으로 분화된 상피세포는 세포 부착(cell attachment)을 요구하고, 생체내에서 이들 세포는 3차원적 마이크로 환경에서 존재한다. 보통은, 생체내에서 이러한 세포들은 정상의 폴라 오리엔테이션(polar orientation) 및 적절한 유전자 발현을 위해 어떤 기질에 부착한다. 이러한 세포들이 체외에 자리 잡아 배양 접시 표면에 부착할 수 없을 때, 그들은 현탁액 상태로 유지될 것이고, 만약 그들이 어떤 것에 부착하지 않는다면 그들은 죽게 된다. 그러나, 자가복제 능력이 있는 줄기세포의 경우 분화된 세포와 달리 기질에 부착하지 않아도 생존할 수 있다(G. Dontu et al., Journal of mammary gland biology and neoplasia 10: 75-86, 2005). 그러므로 배지 내에 부유 시킨 낱개의 세포 중 자기 복제 능력을 가진 줄기세포만이 분열, 증식하여 3차원적 구조인 맘모스피어를 형성하게 된다.In one embodiment of the present invention, human "mammosheres" derived from normal human breast stem cells or breast cancer cell line MCF-7 are prepared. Mammoth spheres are prepared using techniques that are widely used in the field of tissue culture. Typically differentiated epithelial cells require cell attachment, and in vivo these cells exist in a three-dimensional microenvironment. Usually, in vivo these cells attach to certain substrates for normal polar orientation and proper gene expression. When these cells settle in vitro and cannot attach to the surface of the culture dish, they will remain in suspension and if they do not attach to anything they die. However, unlike differentiated cells, stem cells capable of self-replicating can survive without attachment to the substrate (G. Dontu et al ., Journal of mammary gland biology and neoplasia 10: 75-86, 2005). Therefore, only stem cells having self-replicating ability among the cells suspended in the medium divide and proliferate to form a three-dimensional structure of mammospheres.
상기 맘모스피어를 에스트로겐에 노출시키면 Oct-4의 발현이 극적으로 증가한다. 이러한 결과는 에스트로겐이 정상 인간 유방 줄기세포(에스트로겐 수용체 양성임) 및 MCF-7 유방암줄기세포(역시 에스트로겐 수용체 양성임)의 대칭적 세포 증식을 자극함을 시사한다. 이러한 발견으로 인하여, Oct-4 유전자의 발현을 증가시키는 에스트로겐의 역할을 모방(mimic)할 수 있는 물질(에스트로겐양, estrogen-like))을 스크린하기 위해 잠재적인 인간 체외분석법(human in vitro assay)을 개발할 수 있음이 명백해졌다. Exposure of the mammospheres to estrogen dramatically increases the expression of Oct-4. These results suggest that estrogen stimulates symmetrical cell proliferation of normal human breast stem cells (positive estrogen receptor) and MCF-7 breast cancer stem cells (also positive estrogen receptor). These findings suggest a potential human in vitro assay to screen for substances that can mimic the role of estrogens that increase the expression of Oct-4 genes (estrogen-like). It became clear that it could be developed.
즉, 에스트로겐이 종양 촉진물질일 것이기 때문에 이들 물질들도 종양 개시제라기 보다는 "잠재적인 종양 촉진물질(tumor promoter)"일 것이다. 즉, 본 발명에서 사용하는 "인간 종양 촉진 물질"이라는 용어는 인간 종양을 증식 또는 이를 촉진시키는 역할을 하는 물질을 의미한다.That is, since estrogens will be tumor promoters, these materials will be "tumor promoters" rather than tumor initiators. That is, the term "human tumor promoting substance" used in the present invention means a substance that serves to proliferate or promote human tumors.
본 발명에서 맘모스피어가 성장함에 따라서, 당업자는 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 그리고, Oct-4, ABCG2, Cripto-1, 에스트로겐 수용체 및 커넥신43에 대한 면역형광 항체(immunofluorescent antibody)를 이용하여, 맘모스피어에서 Oct-4, ABCG2, Cripto-1, 에스트로겐 수용체의 발현을 증가시키고, 반면 커넥신43의 발현은 감소시키는 종양 촉진 물질을 스크린할 수 있다. As the mammosphere grows in the present invention, those skilled in the art will appreciate RT-PCR (Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) and immunofluorescent antibodies against Oct-4, ABCG2, Cripto-1, estrogen receptor and connectin43. Can be used to screen for tumor promoting agents that increase the expression of Oct-4, ABCG2, Cripto-1, estrogen receptors in mammoth spheres, while decreasing the expression of connectin43.
또한, 정상 인간 및 MCF-7 맘모스피어의 동일한 세트로, Oct-4, ABCG2, Cripto-1, 에스트로겐 수용체의 발현을 저해하지만 커넥신43의 발현을 증가시키는 물질을 스크린하는데 역시 사용할 수 있다. 이러한 물질은 유방암에 대한 항암물질로 간주될 수 있을 것이다. 본 발명에서 사용하는 "항암물질"이라는 용어는 인간 종양의 증식을 억제 또는 저해하는 역할을 하는 물질을 의미한다.In addition, the same set of normal human and MCF-7 mammospheres can also be used to screen for substances that inhibit the expression of Oct-4, ABCG2, Cripto-1, estrogen receptors but increase the expression of connectin43. Such substances may be considered anticancer agents for breast cancer. The term "anticancer substance" used in the present invention means a substance that serves to inhibit or inhibit the proliferation of human tumors.
본 발명에서, 하나의 세트에서는 오직 스크린할 후보 물질의 용매를 배양기에 가하고, 다른 세트에서는 대조군으로서 인간 유방암 발암원으로서 에스트로겐을 용량 의존적 방식(dose-dependent fashion)으로 가하며, 세번째 세트에서는 의심되는 인간 유방암 발암물질을 용량 의존적 방식으로 비-세포독성(non-cytotoxic) 수준으로 가한다. 이중 어떤 세트가 정상 인간 유방 줄기세포 및 MCF-7 유방암 줄기세포의 마커를 증가시키는지를 알아낼 수 있다. 또한, 이와 동일한 구성으로 실험을 설계하되, 항암물질, 즉 종양에 대한 화학예방제 및 치료제의 가능성을 지닌 물질을 검출하기 위하여 인간 유방암 발암물질을 사용하는 대신, 제니스테인(genistein)(항-염증성 COX-2 저해제) 및 현재 치료제로 사용되고 있는 탁솔(아로마타아제 저해제)을 에스트로겐와 함께 또는 에스트로겐 없이 사용할 수 있다. 적절한 배양 시간 후에 엔드포인트(endpoint)를 설정하게 되는데 이는 맘모스피어의 수, 크기, RT-PCR에 의한 마커 유전자 발현의 변화 및 이들 유전자에 의해 합성되는 단백질의 발현 등을 포함한다.In the present invention, in one set only the solvent of the candidate substance to be screened is added to the incubator, in the other set the estrogen as a human breast cancer carcinogen as a control in a dose-dependent fashion, and in the third set the suspected human Breast cancer carcinogens are added to non-cytotoxic levels in a dose dependent manner. It can be found which sets increase markers of normal human breast stem cells and MCF-7 breast cancer stem cells. In addition, the experiment was designed with the same configuration, but instead of using human breast carcinogens to detect anticancer substances, ie, substances with the potential of chemopreventive and therapeutic agents for tumors, genistein (anti-inflammatory COX- 2 inhibitors) and taxols (aromatase inhibitors) currently used as therapeutic agents can be used with or without estrogen. Endpoints are established after an appropriate incubation time, including the number, size of mammoth spheres, changes in marker gene expression by RT-PCR, and expression of proteins synthesized by these genes.
만약 어떤 물질이 정상 및 MCF-7 인간 맘모스피어의 줄기세포를 자극한다면, 그 물질은 유방 조직의 정상적인 성장을 자극하거나, 인간 유방암 줄기세포의 성장을 비정상적으로 자극하는 잠재성을 지니고 있다고 할 수 있을 것이다. 이러한 잠 재성은 줄기세포 마커 유전자의 발현이 증가하는 것과, 그리고 대조군 세트와 비교하여 그들의 코딩된 단백질이 존재하는 것으로 확인할 수 있다. 반면에 맘모스피어의 크기가 줄어들거나, 코딩된 단백질의 발현이 대조군과 비교하여 감소한 경우에는 잠재적인 인간 유방암 예방 또는 치료제의 가능성을 지니고 있다고 할 수 있다.If a substance stimulates normal and MCF-7 human mammosphere stem cells, the substance has the potential to stimulate normal growth of breast tissue or abnormally stimulate the growth of human breast cancer stem cells. will be. This potential can be confirmed by increased expression of stem cell marker genes and the presence of their encoded proteins as compared to the control set. On the other hand, if the size of the mammosphere is reduced or the expression of the encoded protein is reduced compared to the control group, it may be said to have the potential of preventing or treating human breast cancer.
그리고, 본 발명에서 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체 또는 커넥신43의 발현은 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 이용한다. RT-PCR의 방법은 당분야에 공지되어 있는 기술이다. RT-PCR은 특정 부위의 RNA를 주형(template)로 하여 이에 상응하는 cDNA를 합성한 다음, 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 (1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 (2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 이루어지며 (2)과정은 게놈(genomic) DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 하이브리다이제이션과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐만 아니라, 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 되는 기술이다.In the present invention, the expression of Oct-4, Cripto-1, ABCG2, estrogen receptor or leucine 43 uses RT-PCR (Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). The method of RT-PCR is a technique known in the art. RT-PCR is a technique of synthesizing a corresponding cDNA using a template of RNA of a specific site, and then PCR amplification using the same, the experimental process (1) using reverse transcriptase It consists of preparing cDNA from RNA and (2) amplifying a specific region using cDNA. (2) process is the same as amplifying a specific gene region from genomic DNA. This method is not only simpler than the RNA analysis that was possible through methods such as Northern blot hybridization, but also helps in the study of mRNA sequencing and transcription, since the gene sequence can be determined. This is the technology.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
특히, 하기 실시예에서는 유방 유래 줄기세포 및 유방암 세포주만을 사용하고 있으나, 이 밖에도 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등의 인간조직 유래 성체 줄기세포와, 유방암, 위장관암, 폐암, 간암, 자궁암, 대장암 또는 혈액암 등의 인간 유래의 다양한 종류의 암조직 및 암세포주를 사용할 수 있는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.In particular, in the following examples, only breast-derived stem cells and breast cancer cell lines are used. In addition, adult stem cells derived from human tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, and uterus, breast cancer, and gastrointestinal cancer It will be apparent to those skilled in the art that various types of cancer tissues and cancer cell lines derived from humans, such as lung cancer, liver cancer, uterine cancer, colon cancer or hematological cancer, can be used.
실시예 1 : 유방 줄기세포 및 유방암 세포주의 배양과 맘모스피어의 제조Example 1 Culture of Mammary Stem Cells and Breast Cancer Cell Lines and Preparation of Mammoth Spear
(1) 유방 줄기세포의 분리 및 유방암 세포주 배양(1) Isolation of Breast Stem Cells and Culture of Breast Cancer Cell Lines
서울대학교 유방암센터에서 분양받은 여성의 유방조직을 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 콜라게나아제 타입 1(1mg/ml)을 첨가한 DMEM/F12 media를 이용해 37℃에서 12시간동안 침지(digestion)하였다. PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액은 석션(suction)하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 석션하고 남은 펠렛에 0.25% 트립신-EDTA를 가하고 37℃에서 5-10분간 인큐베이션한 뒤 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 석션하고 바닥에 남은 펠렛에 디스파아제(dispase)를 가하고 37℃에서 5-10분간 인큐베이션한 뒤 PBS로 세척한 후 100㎛와 40㎛ 메쉬(mesh)로 걸렀다. 거른 세포 부유액은 1000rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액은 석션하고 세포만 분리하였다.Breast tissues of women who had been sold at the Seoul National Cancer Center were washed with PBS. The tissue was chopped and then digested for 12 hours at 37 ° C. using DMEM / F12 media to which collagenase type 1 (1 mg / ml) was added. After washing with PBS and centrifuged for 5 minutes at 1000rpm. The supernatant was suctioned and the pellet remaining on the bottom was washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was suctioned and 0.25% trypsin-EDTA was added to the remaining pellets, incubated at 37 ° C. for 5-10 minutes, washed with PBS, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was suctioned, dispase was added to the remaining pellets on the bottom, incubated at 37 ° C. for 5-10 minutes, washed with PBS, and filtered with 100 μm and 40 μm mesh. The filtered cell suspension was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was suctioned and only the cells were separated.
한편, 인간 유방암 세포주 MCF-7은 ATCC HTB-22™ (American Type Culture Collection, Virginia, USA)로부터 얻었다. 플라스크에서 D-media에 5% FBS를 첨가한 배지로 키우던 세포를 PBS로 세 번 세척하고 0.25% 트립신-EDTA를 가하고 37℃에서 3분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척하고 1000rpm에서 5분간 원심분리한 후에 상층액은 석션하고 세포 펠렛만을 남겼다.On the other hand, human breast cancer cell line MCF-7 is ATCC HTB-22 ™ (American Type Culture Collection, Virginia, USA). Cells grown in medium with 5% FBS in D-media were washed three times in PBS with 0.25% trypsin-EDTA and incubated at 37 ° C. for 3 minutes. The cells were washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, after which the supernatants were suctioned and only cell pellets were left.
(2) 줄기세포 맘모스피어의 제조(2) Preparation of Stem Cell Mammoth Spear
상기에서 수득한 세포 펠렛을 각각 재부유하여 MEBM(2% B27 supplement, 20 ng/mL EGF, antibiotic-antimycotic, 20 ug/ml Gentamycin, 1 ng/ml Hydrocortisone, 5 ug/ml Insulin, 100 μM 2-mercaptoethanol) 배지를 이용하여 ultralow attachment plate에 뿌리고, 3일마다 배지를 첨가하면서 배양하여 7-10일 간 인큐베이션하여 유방 줄기세포 및 유방암 세포주의 맘모스피어를 분리하였다. 유방 조직 유래 줄기세포의 맘모스피어를 공초점 현미경으로 관찰하였다(도1). The cell pellets obtained above were resuspended respectively to give MEBM (2% B27 supplement, 20 ng / mL EGF, antibiotic-antimycotic, 20 ug / ml Gentamycin, 1 ng / ml Hydrocortisone, 5 ug / ml Insulin, 100 μM 2- mercaptoethanol) medium was sprinkled on the ultralow attachment plate, cultured with the medium added every 3 days, incubated for 7-10 days to isolate the mammospheres of breast stem cells and breast cancer cell lines. Mammoth spheres of stem cells derived from breast tissues were observed by confocal microscopy (FIG. 1).
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실시예 2: 인간 유방암 촉진물질(promoter)의 스크리닝Example 2: Screening of Human Breast Cancer Promoter
(1) 유방암 촉진 후보 물질의 처리(1) Treatment of breast cancer promotion candidate substance
상기 실시예1의 방법에 따라 맘모스피어를 제조하되, 하나의 세트에서는 오직 스크린할 후보 물질의 용매를 배양기에 가하고, 다른 세트에서는 의심되는 인간 유방암 촉진 후보 물질을 용량 의존적 방식으로 비-세포독성(non-cytotoxic) 수준으로 가하였다. 3일 후에 처치한 물질과 배지를 처음과 동일한 농도로 배양기에 첨가하면서 7-10일 간 5% CO2 환경에서 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. Mammaspires are prepared according to the method of Example 1, in one set only a solvent of the candidate substance to be screened is added to the incubator, and in another set the suspected human breast cancer promoting candidate substance in a non-cytotoxic manner in a dose dependent manner. at non-cytotoxic levels. After 3 days, the treated material and medium were incubated in a 37 ° C. incubator in a 5% CO 2 environment for 7-10 days with addition to the incubator at the same concentration as the first.
(2) Oct-4 및 ABCG-2의 검출(2) Detection of Oct-4 and ABCG-2
RT-PCR 과정과 면역형광 염색 과정을 통해 상기 배양한 맘모스피어에 대하여 마커 유전자의 발현과 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 여부를 검출하였다. RT-PCR 과정은 다음과 같이 이루어졌다. 상기 맘모스피어를 포함한 배지를 수거하여 40㎛ 메쉬로 걸러 맘모스피어만을 획득하여 PBS로 세척한 뒤 1000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액은 석션하고 맘모스피어만을 포함한 세포 펠렛으로부터 RNA를 추출하여 역전사(Reverse Transcription) 반응을 통해 cDNA를 얻었다. cDNA와 Oct-4 유전자, ABCG2 유전자의 프라이머를 반응시켜 PCR 과정을 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA 서열은 1.5% 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였다.
면역형광 염색 과정은 다음과 같이 이루어졌다. 상기 맘모스피어를 포함한 배지를 수거하여 40um 메쉬로 걸러 맘모스피어만을 획득하여 PBS로 세척한 뒤, 2% FBS를 포함한 배지에 부유하여 4 웰(well) 챔버 슬라이드에 5시간 동안 부착시켰다. PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 고정한 다음, PBS로 세 번 세척한 후, 0.2% 트리톤-X100를 함유한 PBS로 침투(permeabilization)시켰다. 그 다음, PBS로 세 번 세척한 후, 10% NGS로 1시간동안 반응시키고, 일차항체인 Oct-4와 ABCG2을 함유한 PBS에 하룻밤동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척하고, 형광이 표지되고 상기 일차항체를 인식할 수 있는 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 15분간 반응시켜 핵만을 대조염색하였다. PBS로 세 번 세척한 뒤 마운팅(mounting)한 후 현미경으로 촬영하여, 상기 마커들의 발현 여부를 확인하였다. RT-PCR and immunofluorescence staining were used to detect the expression of the marker gene and the expression of the protein encoded by the gene for the cultured mammoth spheres. The RT-PCR process was performed as follows. The medium containing the mammosphere was collected, filtered with 40 μm mesh to obtain only mammosphere, washed with PBS, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was sucked, RNA was extracted from cell pellets containing mammosphere, and reverse transcription. Transcription) cDNA was obtained through the reaction. The primers of cDNA, Oct-4 gene and ABCG2 gene were reacted to amplify the gene through PCR. The amplified DNA sequence was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
The immunofluorescent staining process was performed as follows. The mammosphere containing medium was collected, filtered with 40 um mesh to obtain only mammospheres, washed with PBS, suspended in medium containing 2% FBS, and attached to 4 well chamber slides for 5 hours. Washed three times with PBS, fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde, washed three times with PBS, and then permeabilized with PBS containing 0.2% Triton-X100. Then, washed three times with PBS, then reacted with 10% NGS for 1 hour, and reacted overnight with PBS containing the primary antibodies Oct-4 and ABCG2. Washed three times with PBS, and reacted for 1 hour in the dark with a secondary antibody that is fluorescently labeled and can recognize the primary antibody. After washing three times with PBS, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) was reacted for 15 minutes to counterstain nuclei only. After washing three times with PBS and mounting (mounting) and photographed under a microscope, the expression of the markers were confirmed.
그 결과, 실시예 1에서 제조한 MCF-7 맘모스피어에 유방암 촉진 물질로 알려진, 에스트로겐의 일종인 17-베타 에스트라디올을 농도별로 처치한 경우, 줄기세포의 발현 마커로 알려진 Oct-4의 발현이 확연히 증가하였음을 확인하였고(도 2), 또한, ABCG2 발현 역시 증가되어 있는 양상을 공초점 전자현미경(confocal microscope)로 확인하였다(도 3).As a result, when MCF-7 mammosphere prepared in Example 1 was treated with a concentration of 17-beta estradiol, a kind of estrogen known as a breast cancer promoting substance, the expression of Oct-4, which is an expression marker of stem cells, It was confirmed that the increase significantly (Fig. 2), and also the increase in ABCG2 expression was confirmed by confocal microscope (Fig. 3).
(3) 유방암 촉진 물질의 선택(3) selection of breast cancer promoting substances
스크린할 후보 물질들 중에서, 상기 RT-PCR과 면역형광염색 과정을 통해 Oct-4 또는 ABCG2의 발현이 증가한 경우인 17-베타 에스트라디올을 유방암 촉진 물질이라고 판명하였다. Among candidate substances to be screened, 17-beta estradiol, which is a case where the expression of Oct-4 or ABCG2 is increased through RT-PCR and immunofluorescence staining, has been identified as a breast cancer promoting substance.
실시예 3: 항-유방암 촉진 물질의 스크리닝Example 3: Screening of Anti-breast Cancer Promoting Materials
(1) 항-유방암 후보물질의 처리(1) Treatment of anti-breast cancer candidates
상기 실시예1의 방법에 따라 맘모스피어를 제조하되, 하나의 세트에서는 오직 스크린할 후보 물질의 용매를 배양기에 가하고, 다른 세트에서는 대조군으로서 인간 유방암 발암원으로서 에스트로겐을 용량 의존적 방식(dose-dependent fashion)으로 가하며, 세번째 세트에서는 의심되는 인간 항-유방암 촉진 후보 물질을 용량 의존적 방식으로 비-세포독성(non-cytotoxic) 수준으로 가하였다. 3일 후에 처치한 물질과 배지를 처음과 동일한 농도로 배양기에 첨가하면서 7-10일 간 5% CO2 환경에서 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. A mammothsphere was prepared according to the method of Example 1, but in one set only a solvent of candidate material to be screened was added to the incubator, and in another set a dose-dependent fashion of estrogen as a human breast cancer carcinogen as a control. In the third set, suspected human anti-breast cancer promoting candidates were added at a non-cytotoxic level in a dose dependent manner. After 3 days, the treated material and medium were incubated in a 37 ° C. incubator in a 5% CO 2 environment for 7-10 days with addition to the incubator at the same concentration as the first.
(2) Oct-4 및 ABCG-2의 검출(2) Detection of Oct-4 and ABCG-2
실시예 2에서와 마찬가지로 RT-PCR 과정과 면역형광 염색 과정을 수행하여 상기 마커 유전자의 발현과 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 여부를 검출하였다.
RT-PCR 수행을 위해, 상기 배양된 맘모스피어를 포함한 배지를 수거하여 40㎛ 메쉬로 걸러 맘모스피어만을 획득하여 PBS로 세척한 뒤 1000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액은 석션하고 맘모스피어만을 포함한 세포 펠렛으로부터 RNA를 추출하여 역전사(Reverse Transcription) 반응을 통해 cDNA를 얻었다. cDNA와 Oct-4 유전자, Cripto-1 유전자, ABCG2 유전자, 에스트로겐 수용체 유전자, 커넥신43 유전자의 프라이머를 반응시켜 PCR 과정을 통해 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA 서열은 1.5% 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였다.
면역형광 염색법을 수행을 위해, 상기 배양된 맘모스피어를 포함한 배지를 수거하여 40um 메쉬로 걸러 맘모스피어만을 획득하여 PBS로 세척한 뒤, 2% FBS를 포함한 배지에 부유하여 4 웰 챔버 슬라이드에 5시간 동안 부착시켰다. PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 고정한 다음, PBS로 세 번 세척한 후, 0.2% Triton-X100를 함유한 PBS로 침투(permeabilization)시켰다. 그 다음, PBS로 세 번 세척한 후, 10% NGS로 1시간동안 반응시키고, 일차항체인 Oct-4, Cripto-1, ABCG2, 에스트로겐 수용체 또는 커넥신43을 함유한 PBS에 하룻밤동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척하고, 형광이 표지되고 상기 일차항체를 인식할 수 있는 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 15분간 반응시켜 핵만을 대조염색하였다. PBS로 세 번 세척한 뒤 마운팅한 후 현미경으로 촬영하여, 상기 마커들의 발현 여부를 확인하였다.As in Example 2, RT-PCR and immunofluorescence staining were performed to detect the expression of the marker gene and the expression of the protein encoded by the gene.
In order to perform RT-PCR, the culture medium containing the cultured mammoths was collected and filtered with 40 μm mesh to obtain only the mammoths, washed with PBS, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was suctioned and cells containing only mammothsores. RNA was extracted from the pellet and cDNA was obtained by reverse transcription. The cDNA, Oct-4 gene, Cripto-1 gene, ABCG2 gene, estrogen receptor gene, and connectin 43 gene were reacted to amplify the gene by PCR. The amplified DNA sequence was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
To carry out immunofluorescence staining, the cultured medium containing the mammosphere was collected, filtered with 40 um mesh to obtain only mammospheres, washed with PBS, suspended in a medium containing 2% FBS, and then placed on a 4 well chamber slide for 5 hours. While attached. Washed three times with PBS, fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde, washed three times with PBS, and then permeabilized with PBS containing 0.2% Triton-X100. After washing three times with PBS, it was reacted with 10% NGS for 1 hour and reacted overnight with PBS containing the primary antibodies Oct-4, Cripto-1, ABCG2, estrogen receptor or leucine 43. Washed three times with PBS, and reacted for 1 hour in the dark with a secondary antibody that is fluorescently labeled and can recognize the primary antibody. After washing three times with PBS, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) was reacted for 15 minutes to counterstain nuclei only. After washing three times with PBS and mounted and photographed under a microscope, the expression of the markers was confirmed.
(3) 항-유방암 물질의 선택(3) selection of anti-breast cancer substances
스크린할 항-유방암 촉진 후보 물질중에서, 상기 RT-PCR과 면역형광염색 과정을 통해 Oct-4의 발현이 증가한 경우인 제니스테인(genistein)을 항-유방암 촉진 물질이라고 판명하였다. Among the anti-breast cancer promoting candidates to be screened, genistein, which is a case where the expression of Oct-4 is increased through the RT-PCR and immunofluorescence staining, has been identified as an anti-breast cancer promoting substance.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, those skilled in the art, these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. It is intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
본 발명은 인간 유방암 줄기세포는 커넥신43의 비발현 및, Oct-4, 에스트로겐 수용체, Cripto-1의 발현 특징을 지니고, 에스트로겐이 이 발현을 증가시킬 수 있다는 발견에 기초한, 항암물질의 간단하고 새로운 스크리닝 방법을 제공함으로써, 더이상 인간 "3차원" 마이크로환경의 범주를 제공할 수 없는 설치류의 생물학적 평가법, 분자/생화학적 또는 비-인간 체외 분석법을 사용할 필요가 없게 되었다. 또한, 장기 설치류 모델 또는 부적절한 체외 모델 사용없이 화학적 예방(chemo-preventive)제 및 치료제를 매우 빠르고 값싸게 스크리닝할 수 있고, 이를 통해 인간 유방암 발암과정의 메커니즘 연구에 유용하게 사용할 수 있는 장점이 있다.The present invention is a simple and anticancer substance based on the discovery that human breast cancer stem cells have non-expression of connectin43 and expression of Oct-4, estrogen receptor, Cripto-1, and estrogen can increase this expression. By providing a new screening method, there is no longer the need to use biological assessment, molecular / biochemical or non-human in vitro assays for rodents that cannot provide a range of human “three-dimensional” microenvironments. In addition, chemo-preventive agents and therapeutic agents can be screened very quickly and inexpensively without the use of long-term rodent models or inappropriate in vitro models, which can be useful for studying the mechanism of human breast cancer carcinogenesis.
Claims (5)
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2006
- 2006-11-28 KR KR1020060118443A patent/KR100851039B1/en active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ann N Y Acad Sci. 2006 Nov;1089:36-58 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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