KR100849166B1 - - 14 Single nucleotide polymorphic of UDP-glucuronosyltransferase 1A4 and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유디피-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1에이4(UDP-glucuronosyltransferase 1A4; 이하 'UGT1A4'라 함) 유전자의 단일염기 다형성 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 UGT1A4 유전자의 염기서열 중 292번째 염기가 C에서 T로 치환된 염기가 포함된 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 확인함으로써 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a single base polymorphism of the UDP-glucuronosyltransferase 1A4 (hereinafter referred to as 'UGT1A4') gene and its use. More specifically, the present invention relates to a method for diagnosing a disease caused by a deficiency of the UGT1A4 enzyme by confirming the presence or absence of a polynucleotide containing a base substituted with a C from T for the 2nd base of the UGT1A4 gene of SEQ ID NO: 1. It is about.
본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성으로 인해 정상적인 UGT1A4 효소가 생산되지 못하고 기능이 결여된 단백질 단편의 생성이 유도됨으로써 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환이 유발될 수 있다. 따라서, 상기 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 분석함으로써 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환을 진단할 수 있다.Due to the monobasic polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention, a normal UGT1A4 enzyme may not be produced and a production of a protein fragment lacking function may be induced, thereby causing a disease due to a deficiency of the UGT1A4 enzyme. Thus, by analyzing the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene it is possible to diagnose diseases caused by the deficiency of the UGT1A4 enzyme.
UGT1A4, 단일염기 다형성UGT1A4, Monobasic Polymorphism
Description
도 1은 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역을 PCR 증폭한 후 자동서열분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 화살표는 단일염기 다형성이 일어난 부분을 표시한 것이다.Figure 1 shows the result of PCR amplification of the first exon region of the UDP-glucuronosyltransferase 1A4 gene and analyzed by an automatic sequencer. Arrows indicate where monobasic polymorphisms occurred.
도 2는 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역에 위치하는 292번째 염기에 단일염기 다형성이 유발되어 종결 코돈이 생성된 변이 유전자 서열을 나타낸 것이다.Figure 2 shows a variant gene sequence in which a single base polymorphism is induced at the 292th base located in the first exon region of the UDP-glucuronosyltransferase 1A4 gene to generate a stop codon.
도 3은 본 발명에 따른 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A4 유전자의 단일염기 다형성을 파이로시퀀싱 방법으로 분석한 결과이다.Figure 3 is a result of analyzing the single-base polymorphism of the UDP-glucuronosyltransferase 1A4 gene according to the present invention by a pyro sequencing method.
본 발명은 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A4의 단일염기 다형성 및 그 용도 에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 UGT1A4 유전자의 염기서열 중 292번째 염기가 C에서 T로 치환된 염기가 포함된 폴리뉴클레오티드의 존재여부를 확인함으로써 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a monobasic polymorphism of UDP-glucuronosyltransferase 1A4 and its use. More specifically, the present invention relates to a method for diagnosing a disease caused by a deficiency of the UGT1A4 enzyme by confirming the presence or absence of a polynucleotide containing a base substituted with a C from T for the 2nd base of the UGT1A4 gene of SEQ ID NO: 1. It is about.
UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제(UDP-glucuronosyltransferase, 이하 UGT라 함)는 생체 내에 존재하면서 페놀, 알코올, 아민류 및 지방산과 같은 광범위한 내재성 물질 및 외래 물질의 글루쿠로닉산 접합체 생성을 촉매 하는 효소이다. 상기 UGT에 의한 촉매 반응에 의해 독성이 있는 내인성 화합물이나 외부로부터 유입된 화합물이 수용성 물질로 전환되어 담즙이나 소변으로 배출된다(Parkinson A, Toxicol Pathol 24:48-57, 1996).UDP-glucuronosyltransferase (UDP-glucuronosyltransferase, hereinafter referred to as UGT) is an enzyme that exists in vivo and catalyzes the production of glucuronic acid conjugates of a wide range of endogenous and foreign substances such as phenols, alcohols, amines and fatty acids. to be. By virtue of the catalytic reaction by the UGT, the toxic endogenous compound or the compound introduced from the outside is converted into a water-soluble substance and discharged into bile or urine (Parkinson A, Toxicol Pathol 24: 48-57, 1996).
상기 UGT는 간의 소포체 및 핵막에 주로 존재하며 신장 및 피부와 같은 다른 조직에서 발현되기도 한다. UGT 효소는 크게 일차 아미노산 서열간의 유사성을 토대로 하여 2개의 아족 즉, UGT1 및 UGT2로 분류된다. 이중에서 인간 UGT1A의 이성질체는 9종류(UGT1A1 및 UGT1A3-10)가 있으며 이 중에서 5종류(UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6 및 UGT1A9)는 간 조직에서 발현된다.The UGT is mainly present in the liver endoplasmic reticulum and nuclear membrane and is also expressed in other tissues such as kidneys and skin. UGT enzymes are largely classified into two subgroups, UGT1 and UGT2, based on similarities between primary amino acid sequences. Of these, there are nine isomers of human UGT1A (UGT1A1 and UGT1A3-10), and five of them (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, and UGT1A9) are expressed in liver tissue.
상기 UGT1A 족 중에서 UGT1A4는 간 이외에도 담관이나 결장 등에서 발현된다. 상기 효소의 기능은 발암원인 벤지딘(benzidine)이나 β-나프틸아민(β-napthylamine)과 같이 외부로부터 유입되는 생체 이물질에 대한 대사에 관여하며, 안드로스탄디올(androstanediol) 등과 같은 내부합성물질 대사에도 관여하는 것으 로 알려져 있다. UGT1A4 is expressed in the bile duct and colon in addition to the liver. The function of the enzyme is involved in metabolism of biological foreign substances, such as benzidine or β-napthylamine, which is a carcinogen, and also in metabolism of internal synthetic substances such as androstanediol. It is known to be involved.
현재까지 상기 UGT1A4의 유전적 다형성으로는 첫 번째 엑손부위에서 2종류의 변이가 발견되었으며, 이들 변이가 벤지딘이나 β-나프틸아민과 같은 외래 물질 및 트랜스-안드로스테론이나 디하이드로 테스토스테론과 같은 내인성 물질의 대사에 관련된 효소활성을 억제하는 결과를 초래함이 보고 된 바 있다.To date, the genetic polymorphism of UGT1A4 has found two kinds of mutations in the first exon region, and these mutations are foreign substances such as benzidine or β-naphthylamine and endogenous substances such as trans-androsterone or dihydrotestosterone. It has been reported that the result is to inhibit the enzyme activity related to the metabolism of.
즉, 상기 UGT1A4 효소의 기능을 변화시킬 수 있는 유전자 변이가 발생하는 경우 생체로 유입되는 약물이나 독성이 있는 물질, 및 생체 분자의 대사에 악영향을 미칠 수 있다. That is, when a genetic mutation that can change the function of the UGT1A4 enzyme occurs, it may adversely affect the metabolism of drugs, toxic substances, and biological molecules introduced into the living body.
이에 본 발명자들은 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 연구하던 중 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역에서 단일염기 다형성을 새롭게 발견하였으며 상기 단일염기 다형성으로 인해 종결코돈이 생성되어 완전한 형태의 UGT1A4 효소가 생산되지 못하고 기능이 결여된 단백질 단편만이 생성됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors discovered a single nucleotide polymorphism in the first exon region of the UGT1A4 gene while studying the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene, and the single nucleotide polymorphism produced a stop codon, which prevented the production of a full-form UGT1A4 enzyme. The present invention was completed by confirming that only this missing protein fragment was produced.
따라서, 본 발명의 목적은 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 검출방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for detecting a polynucleotide comprising a monobasic polymorphic base of the UGT1A4 gene.
또한, 본 발명의 다른 목적은 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 UGT1A4 효소의 결핍으로 인해 유발되는 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing a disease caused by a deficiency of the UGT1A4 enzyme, which comprises a primer capable of amplifying a single nucleotide polymorphic sequence of the UGT1A4 gene.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 검출방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for detecting a polynucleotide comprising a single base polymorphic base of the UGT1A4 gene.
또한, 본 발명은 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 UGT1A4 효소의 결핍으로 의해 유발되는 질환의 진단용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for diagnosing a disease caused by a deficiency of the UGT1A4 enzyme, which comprises a primer capable of amplifying a single nucleotide polymorphic sequence of the UGT1A4 gene.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 UGT1A4 유전자의 염기서열 중 292번째 염기가 C에서 T로 치환된 연속되는 염기서열을 포함한다.In the present invention, the polynucleotide including the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene includes a sequential nucleotide sequence in which the 292th base of the nucleotide sequence of the UGT1A4 gene of SEQ ID NO: 1 is substituted with C to T.
본 발명자들은 한국인 50명의 게놈 DNA에서 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 분석한 결과, UGT1A4의 첫 번째 엑손 영역(서열번호 1의 염기서열에서 1번째 염기∼867번째 염기까지)에서 292번째 염기인 C가 T로 변이된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 단일염기 다형성이 UGT1A4 유전자의 가닥에 위치하는지의 여부와 동일한 DNA 가닥에 다른 유전자 변이는 없는지, 염색체의 다른 부분에 위치한 유사 유전자로부터 기인한 것이 아닌지의 여부를 조사하기 위하여 상기 단일염기 다형성 이 발견된 변이 유전자를 포함하는 피험자의 DNA를 주형으로 하고 각각의 엑손 별 단편으로 나누어 PCR을 수행하고 증폭된 산물의 서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 피험자는 두 가닥의 DNA 중 한 가닥은 변이형, 한 가닥은 야생형을 가지고 있는 것으로 나타났다(실시예 1 참조). The present inventors analyzed a single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene in 50 genomic DNAs of 50 Koreans. As a result, C, the 292th base in the first exon region of UGT1A4 (from
또한, 상기 본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성은 한국인에 특이적인 것을 특징으로 한다.In addition, the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention is characterized in that it is specific to Koreans.
본 발명의 일 실시예에서는 한국인, 베트남인 및 중국인을 대상으로 하여 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역의 염기서열 292번째 염기의 다형성을 분석한 결과, UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성은 한국인에게만 나타나며 그 빈도가 약 0.32%임을 확인할 수 있었다(실시예 3 참조).In one embodiment of the present invention, as a result of analyzing the polymorphism of the 292th base of the first exon region of the UGT1A4 gene targeting Koreans, Vietnamese, and Chinese, the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene appears only in Korean and its frequency is about 0.32% was confirmed (see Example 3).
본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 검출할 수 있다.Single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention can be detected by a method comprising the following steps.
(a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;(a) taking a biological sample from a human;
(b) 상기 (a) 단계의 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; 및(b) extracting nucleic acids from the sample taken in step (a); And
(c) 상기 (b) 단계의 핵산의 서열을 분석하여 UGT1A4 유전자의 292번째 염기가 C에서 T로 치환되었는지 여부를 확인하는 단계.(c) analyzing the sequence of the nucleic acid of step (b) to determine whether the 292th base of the UGT1A4 gene is substituted for C in T.
상기 (a) 단계에서 상기 생물학적 시료는 피험자의 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발일 수 있다. 바람직하게는 혈액일 수 있다.In the step (a), the biological sample may be blood, skin cells, mucosal cells and hair of the subject. Preferably blood.
상기 (b) 단계에서 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 상기 (a) 단계에서 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 추출용 키트를 사용할 수 있다. 예를 들면, DNA 또는 RNA 추출용 키트는 Qiagen, Inc.(미국 캘리포니아) 및 Stratagene(미국 캘리포니아)에서 구입할 수 있다. 상기에서 RNA를 추출하여 사용하는 경우에는 역전사에 의해 cDNA를 제조하여 사용한다.In step (b), the nucleic acid may be DNA or RNA, preferably DNA. The method of extracting nucleic acids from the sample collected in step (a) is not particularly limited, and techniques known in the art or commercially available kits for extraction may be used. For example, kits for DNA or RNA extraction can be purchased from Qiagen, Inc. (California, USA) and Stratagene (California, USA). In the case of extracting and using RNA from the above, cDNA is prepared by reverse transcription.
상기 (c) 단계에서 핵산 서열을 분석하여 UGT1A4 유전자의 292번째 염기가 C에서 T로 치환되었는지 여부를 확인하는 방법으로는 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 그 서열 부분을 직접 결정하는 방법으로서 자동염기서열분석기를 사용하거나 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행할 수 있다. 또한, PCR-RFLP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), DNA 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 방법, 인베이더법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리화법 등의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 나아가, 상기 여러 종류의 서열분석방법을 조합하여 사용할 수도 있다.The method for determining whether the 292th base of the UGT1A4 gene is substituted with C to T by analyzing the nucleic acid sequence in step (c) is not particularly limited, and methods known in the art may be used. For example, an autobase sequencer or pyrosequencing may be performed as a method of directly determining the sequence portion. In addition, PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO and all hybrid specific oligonucleotide (ASO) combined with dot hybridization Hybridization method, TaqMan-PCR method, MALDI-TOF / MS method, rolling circle amplification method, method using DNA chip or microarray, invader method, primer extension method, Southern blot hybridization method, dot hybridization method, etc. Known methods can be used. Furthermore, the above various kinds of sequencing methods may be used in combination.
바람직하게는, 자동염기서열분석법 및 파이로시퀀싱 방법을 사용한다. 상기 파이로시퀀싱은 DNA 시퀀싱에 이용되기도 하는 공지의 SNP 분석방법으로 DNA가 중합되는 동안 방출되는 PPi(inorganic pyrophosphate)의 빛의 발현을 검출하는 방법이다.Preferably, auto sequencing and pyro sequencing methods are used. The pyro sequencing is a well-known SNP analysis method, which is also used for DNA sequencing, is a method for detecting the expression of light of PPi (inorganic pyrophosphate) emitted during the polymerization of DNA.
또한, 본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성의 분석은 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하여 UGT1A4 유전자의 292번째 염기가 포함된 연속하는 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR 증폭하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.In addition, the analysis of the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention comprises the steps of PCR amplification with a primer capable of amplifying a sequential sequence containing the 292th base of the UGT1A4 gene using the nucleic acid of step (b) as a template Can be performed further.
바람직하게는, 상기 프라이머는 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손영역을 포함하는 염기서열을 증폭할 수 있는 것일 수 있으며 보다 바람직하게는, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머쌍 또는 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머쌍 일 수 있다. 상기 프라이머는 공지된 UGT1A4 유전자의 서열(서열번호 1)을 기초로 하여 당업계 공지의 방법에 따라 디자인할 수 있다.Preferably, the primer may be one capable of amplifying a nucleotide sequence including the first exon region of the UGT1A4 gene, and more preferably, a primer pair or SEQ ID NO: 12 having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 And it may be a primer pair having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13. The primers can be designed according to methods known in the art based on the sequence of known UGT1A4 gene (SEQ ID NO: 1).
본 발명의 일 실시예에서는 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 고속으로 검사하는 방법을 구축하기 위하여, 피험자로부터 수득한 DNA 시료를 주형으로 하고 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역을 증폭할 수 있는 프라이머(서열번호 12 및 서열번호 13)로 PCR 증폭함으로써 PCR 산물을 수득한 후 PCR 산물의 염기서열을 파이로시퀀싱 방법에 의해 확인한 결과, 매우 단시간 내에 본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 검출할 수 있었다(실시예 2 참조).In one embodiment of the present invention, in order to establish a method for rapidly testing a single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene, a primer capable of amplifying the first exon region of the UGT1A4 gene with a DNA sample obtained from a subject as a template (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) to obtain the PCR product by PCR amplification and confirmed that the base sequence of the PCR product by the pyro sequencing method, it was possible to detect a single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention in a very short time ( See Example 2).
한편, 문헌에는 다섯 개의 엑손 영역을 포함하는 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손영역에서 24번째 코돈의 사이토신(70번째 염기)이 아데닌으로 치환됨으로써(GenBank Accession no. AF465196) 아미노산 서열이 프롤린에서 쓰레오닌으로 치환된 경우와 48번째 코돈의 티민(144번째 염기)이 구아닌으로 치환됨으로써(GenBank Accession no. AF465197) 아미노산 서열이 루신에서 발린으로 치환된 경우의 단일염기 다형성이 보고 된 바 있다. 상기와 같은 단일염기 다형성을 가진 유전자로부터 유도된 각각의 변이 효소는 환경독성물질이자 발암원인 베타-나프틸아민(beta-naphthylamine) 또는 벤지딘(benzidine)을 대사하는 활성이 야생형에 비해 감소하며(Ehmer et al., Hepatology, vol. 39, No. 4, 970-977, 2004), 담배 및 담배연기에 존재하는 발암원인 NNAL(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridiyl)-1-butan ol)를 대사하는 활성이 야생형이 비해 감소한다는 사실이 보고 된 바 있다(Wiener et al., Cancer research 64, 1190-1196, 2004). 따라서, UGT1A4 유전자의 독성물질이나 발암원을 대사하는 활성이 감소하게 되면 암과 같은 질환이 유발될 수 있다. On the other hand, the literature discloses that the cytosine (70th base) of the 24th codon is replaced with adenine in the first exon region of the UGT1A4 gene including five exon regions (GenBank Accession no. AF465196), so that the amino acid sequence is threonine in proline. Monobasic polymorphism has been reported when the amino acid sequence is replaced by leucine and valine by the substitution of thymine (144th base) of the 48th codon with guanine (GenBank Accession no. AF465197). Each of the mutant enzymes derived from a gene having a single nucleotide polymorphism has an activity of metabolizing beta-naphthylamine or benzidine, which is an environmental toxic substance and a carcinogen, compared to wild type (Ehmer et al., Hepatology , vol. 39, No. 4, 970-977, 2004), NNAL (4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridiyl) -1-butan ol, a carcinogen present in tobacco and tobacco smoke Has been reported to decrease metabolic activity compared to wild type (Wiener et al., Cancer research 64, 1190-1196, 2004). Therefore, when the activity of metabolizing the toxic substances or carcinogens of the UGT1A4 gene is reduced, diseases such as cancer may be induced.
본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성은 UGT1A4 유전자의 98번째 아미노산 위치에 정상적인 글루타민 발현 코드 대신 단백질의 종결코드의 생성을 유발한다(도 2 참조). 따라서, 본 발명에 따른 단일염기 다형성을 포함하는 변이 유전자는 정상적인 UGT1A4 효소를 생산해내지 못하고 기능이 결여된 단백질 단편만을 생성하게 되며 상기와 같은 단일염기 다형성을 가지는 피험자의 경우 UGT1A4 효소활성이 결여된다는 사실을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에서 새롭게 발견한 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성은 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환을 유발할 수 있다. UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 간질환성 염증, 간암, 폐암, 진균에 의한 감염증, 유방암 등이 있다. 문헌에는 UGT1A4 mRNA 수준의 감소와 간질환 환자의 염증과 상관관계가 있음이 보고 된 바 있으며(Drug metabolism and Disposition, 30:129-134, 2002), 정상적인 담즙 조직에 비해 간암(malignant hepatocellular carcinoma)에서 UGT1A4가 하향 조절(down-regulated)됨이 보고 된 바 있다. 또한, UGT1A4가 폐암을 일으키는 NNAL의 메커니즘 경로에 작용함이 알려져 있으며(Cancer Res. 1:64(3) 1190-6, 2004), 진균의 감염증 치료에 사용되는 포사코나졸(posaconazole, Noxafil) 대사에 관여함이 알려져 있다. 나아가, 여성의 유방암 치료에 사용되는 비스테로이드성 항에스트로겐인 타목시펜(Tamoxifen)의 대사에 관여함이 알려져 있다(Biochem Pharmacol. 1:67(11):2093-102, 2004). 따라서, 본 발명에서 규명한 UGT1A4 유전자의 SNP는 상기 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.The single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention causes the generation of the termination code of the protein instead of the normal glutamine expression code at the 98th amino acid position of the UGT1A4 gene (see FIG. 2). Therefore, the mutant gene comprising a single nucleotide polymorphism according to the present invention will not produce a normal UGT1A4 enzyme but will produce only a protein fragment lacking function, and in the case of a subject having such a single nucleotide polymorphism, the UGT1A4 enzyme activity will be deficient. And it was found. Therefore, the monobasic polymorphism of the newly discovered UGT1A4 gene in the present invention can cause diseases due to the deficiency of the UGT1A4 enzyme. Diseases caused by a deficiency of the UGT1A4 enzyme include, but are not limited to, liver disease inflammation, liver cancer, lung cancer, fungal infections, breast cancer, and the like. Literature has been reported to correlate with decreased levels of UGT1A4 mRNA and inflammation in patients with liver disease (Drug metabolism and Disposition, 30: 129-134, 2002), and in malignant hepatocellular carcinoma compared to normal bile tissue. It has been reported that UGT1A4 is down-regulated. It is also known that UGT1A4 acts on the mechanism pathway of NNAL that causes lung cancer (Cancer Res. 1:64 (3) 1190-6, 2004), and is responsible for the metabolism of posaconazole (Noxafil) used to treat fungal infections. It is known to be involved. Furthermore, it is known to be involved in the metabolism of tamoxifen, a nonsteroidal antiestrogenic agent used in the treatment of breast cancer in women (Biochem Pharmacol. 1:67 (11): 2093-102, 2004). Therefore, the SNP of the UGT1A4 gene identified in the present invention can be used to diagnose the disease.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 부위를 포함하는 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환의 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing a disease caused by a deficiency of the UGT1A4 enzyme, which comprises a primer capable of specifically amplifying a region including a single nucleotide polymorphism site of the UGT1A4 gene.
바람직하게는 상기 프라이머는 UGT1A4 유전자의 엑손 영역을 증폭할 수 있는 것 일수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머쌍 또는 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열을 갖는 프라이머쌍일 수 있다. 또한, 증폭된 PCR 산물을 제한효소로 처리함으로써 서열을 분석하고자 하는 경우에는 특정한 제한효소 부위가 형성되도록 설계된 프라이머를 사용할 수도 있다. 적절한 프라이머의 염기 길이로는 특별히 한정되지는 않으나 예를 들어 15∼30bp 정도, 바람직하게는 20∼25bp 정도의 것을 사용할 수 있다.Preferably, the primer may be one capable of amplifying the exon region of the UGT1A4 gene, and more preferably, a primer pair having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 or the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 It may be a primer pair having. In addition, primers designed to form specific restriction enzyme sites may be used when the sequence is to be analyzed by treating the amplified PCR product with restriction enzymes. Although it does not specifically limit as a base length of a suitable primer, For example, about 15-30 bp, Preferably about 20-25 bp can be used.
본 발명에 따른 키트는 상기 프라이머 외에 분자량 표지자, DNA 중합효소 및 완충액을 추가로 포함할 수 있다.Kits according to the invention may further comprise a molecular weight marker, DNA polymerase and buffer in addition to the primer.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
<실시예 1><Example 1>
한국인에서 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 분석Monobasic Polymorphism Analysis of UGT1A4 Gene in Koreans.
50명의 건강한 한국인 피험자로부터 혈액을 채취한 후 게놈 DNA 분리 키트(Qiagen사)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 게놈 DNA를 사용하여 UGT1A4 유전자의 전체 염기서열을 자동염기서열 분석기를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 1명의 피험자의 유전자에서 단일염기 다형성이 발견되었다. 즉, UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역의 292번째 염기인 C가 T로 변이된 것을 확인할 수 있었다. 이에 상기 단일염기 다형성이 UGT1A4 유전자의 가닥에 위치하는지의 여부와 동일한 DNA 가닥에 다른 유전자 변이는 없는지 및 염색체의 다른 부분에 위치한 유사 유전 자로부터 기인한 것이 아닌지의 여부를 조사하기 위하여 상기 단일염기 다형성이 발견된 변이 유전자를 포함하는 피험자의 DNA로부터 한 가닥의 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭 방법에 의해 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 상기 UGT1A4 유전자는 5개의 엑손을 포함하며 사이사이 매우 긴 인트론을 가지고 있기 때문에 UGT1A4 유전자를 각각의 엑손 별 단편으로 나누어 PCR을 수행하였다. 각 PCR에 사용한 프라이머 쌍 및 PCR 반응 조건은 하기의 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같다.Blood was collected from 50 healthy Korean subjects and genomic DNA was isolated using a genomic DNA isolation kit (Qiagen). Using the genomic DNA, the entire nucleotide sequence of the UGT1A4 gene was analyzed using an autobase sequence analyzer. As a result, a single base polymorphism was found in the gene of one subject. That is, it was confirmed that C, the 292th base of the first exon region of the UGT1A4 gene, was mutated to T. Thus, the single nucleotide polymorphism is examined to investigate whether the single nucleotide polymorphism is located on the strand of the UGT1A4 gene and whether there is no other genetic variation on the same DNA strand and whether it is due to a similar gene located on another part of the chromosome. A base sequence was analyzed by cloning by PCR amplification using one strand of DNA as a template from the DNA of the subject including the found mutated gene. Since the UGT1A4 gene contains five exons and has a very long intron between them, PCR was performed by dividing the UGT1A4 gene into fragments for each exon. Primer pairs and PCR reaction conditions used for each PCR are as shown in Table 1 and Table 2 below.
PCR을 수행한 결과, 증폭된 산물의 염기서열을 자동염기서열 분석기로 확인하였다. 실험 결과, 최초의 실험 결과와 동일하게 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손에서 292번째 위치의 염기인 C가 T로 변이된 것을 확인할 수 있었으며(도 1), 상기 피험자는 두 쌍의 염색체 DNA 중 한 쌍은 변이형, 다른 한 쌍은 야생형을 가지고 있는 것으로 나타났다. 한편, UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역에서 292번째 염기인 C가 T로 변이되면 98번째 아미노산 위치에 정상적인 글루타민 발현 코드 대신 단백질의 종결코드가 생성된다(도 2). 따라서, 상기와 같은 단일염기 다형성이 발생되면 정상적으로 발현되는 경우와 같이 524개의 아미노산으로 구성된 완성된 UGT1A4 효소를 생산해내지 못하고 기능이 결여된 97개의 아미노산으로 구성된 단백질 단편만이 생성된다. 따라서, 상기와 같은 단일염기 다형성을 가지는 피험자의 경우 UGT1A4 효소활성이 결여된다.As a result of PCR, the nucleotide sequence of the amplified product was confirmed by an automatic base sequence analyzer. As a result of the experiment, the first exon of the UGT1A4 gene, C, which is the base of 292 position C, was found to be mutated to T (Fig. 1). The variant, the other pair, appeared to have a wild type. On the other hand, when the 292th base C is changed to T in the first exon region of the UGT1A4 gene, the termination code of the protein is generated instead of the normal glutamine expression code at the 98th amino acid position (FIG. 2). Therefore, when such a monobasic polymorphism occurs, only a protein fragment consisting of 97 amino acids, which fail to produce a complete UGT1A4 enzyme composed of 524 amino acids and lacks a function, as is normally expressed. Thus, subjects with such monobasic polymorphism lack UGT1A4 enzymatic activity.
<실시예 2><Example 2>
PCR 및 파이로시퀀싱(Pyrosequecing)을 이용한 변이 유전자의 고속 검사법High-Speed Testing of Mutant Genes Using PCR and Pyrosequecing
UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성을 고속으로 검사하는 방법을 구축하기 위 하여 먼저, 변이를 포함하고 있는 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역을 포함하는 PCR 산물이 나오도록 하기 위한 PCR 증폭용 프라이머 쌍(서열번호 12 및 13)을 디자인하였다(표 3). 상기 프라이머 쌍을 이용하여 실시예 1의 변이 유전자를 포함하는 피험자의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭함으로써 변이 유전자가 포함된 PCR 산물을 수득하였다. PCR 반응 조건으로는 94℃ 5분간 전변성 시킨 다음 94℃ 30초, 55℃30초, 72℃ 30초로 이루어진 단계를 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분간 후신장시켰다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 전기영동하여 PCR 산물이 한 가지 종류만 생성되는 것을 확인한 다음 상기 PCR 산물과 염기서열 분석용 프라이머(서열번호 14)(표 3)를 반응시킨 후 파이로시퀀서(Pyrosequencing사)를 사용하여 UGT14 유전자의 첫 번째 엑손 부위의 염기서열 변이를 확인하였다.In order to establish a method for rapidly testing a single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene, first, a pair of primers for PCR amplification to generate a PCR product containing the first exon region of the UGT1A4 gene containing a mutation (SEQ ID NO: 12 And 13) (Table 3). The PCR product containing the mutated gene was obtained by PCR amplifying the genomic DNA of the subject including the mutated gene of Example 1 as a template using the primer pair. PCR reaction conditions were 94 ℃ for 5 minutes and then repeat the steps consisting of 94 ℃ 30 seconds, 55 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds 35 times, and finally extended at 72
실험 결과, 야생형의 경우 사이토신 시그날이 검출되고 티민 시그날은 검출되지 않았으나 변이형의 경우에는 티민 시그날이 검출되어 두 가지 유전형이 뚜렷이 구분됨을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 상기 파이로시퀀싱 방법에 의해 40분 이내에 유전자 변이 유무가 판별될 수 있음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the cytosine signal was detected in the wild type and the thymine signal was not detected in the wild type, but the thymine signal was detected in the variant type, thereby clearly distinguishing the two genotypes (FIG. 3). In addition, it was confirmed that the presence or absence of genetic variation within 40 minutes by the pyro sequencing method.
<실시예 3><Example 3>
한국인, 베트남인 및 중국인을 대상으로 하여 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성 분석Single Base Polymorphism Analysis of UGT1A4 Gene in Korean, Vietnamese, and Chinese
한국인 258명, 베트남인 96명 및 중국인 95명으로 이루어진 총 449명의 피험자를 대상으로 하여 UGT1A4 유전자의 첫 번째 엑손 영역의 292번째 염기인 C가 T로 변이되었는지 여부를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다. 즉, 상기 피험자로부터 게놈 DNA를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분리하고 이를 주형으로 하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 PCR 증폭한 후 파이로시퀀싱을 수행하였다.A total of 449 subjects consisting of 258 Koreans, 96 Vietnamese and 95 Chinese were analyzed whether C, the 292th base of the first exon region of the UGT1A4 gene, was changed to T in the same manner as in Example 2 above. It was. That is, genomic DNA was isolated from the subject by the same method as in Example 1, PCR amplification was carried out by the same method as in Example 2 using the template, and pyro sequencing was performed.
실험 결과, 변이 유전자를 가진 피험자는 한국인에게서만 한명이 추가로 발견되었다. 상기 피험자 역시 두 쌍의 염색체 DNA 중 한 쌍은 변이형, 다른 한 쌍은 야생형을 가지고 있는 것으로 나타나다. As a result, only one Korean subject with the mutant gene was found. The subject also appears to have one of two pairs of chromosomal DNA mutant and the other pair wild type.
상기 실험 결과로부터 본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성은 한국인에게만 나타나며 그 빈도가 약 0.32%임을 확인할 수 있었다.From the above experimental results, the single nucleotide polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention was found only in Korean, and the frequency was about 0.32%.
본 발명에 따른 UGT1A4 유전자의 단일염기 다형성으로 인해 정상적인 UGT1A4 효소가 생산되지 못하고 기능이 결여된 단백질 단편의 생성이 유도됨으로써 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환이 유발될 수 있다. 따라서, 상기 UGT1A4 유전자의 단 일염기 다형성을 분석함으로써 UGT1A4 효소의 결핍으로 인한 질환을 진단할 수 있는 효과가 있다.Due to the monobasic polymorphism of the UGT1A4 gene according to the present invention, a normal UGT1A4 enzyme may not be produced and a production of a protein fragment lacking function may be induced, thereby causing a disease due to a deficiency of the UGT1A4 enzyme. Therefore, by analyzing the monobasic polymorphism of the UGT1A4 gene there is an effect that can diagnose the disease caused by the deficiency of the UGT1A4 enzyme.
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