KR100848643B1 - Nanohybrid Particles for Diagnosis and Treatment of Tumor - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나노입자가 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분 결합영역을 포함하는 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있으되, 상기 다작용기 리간드의 교차연결영역은 다른 다작용기 리간드의 교차연결영역과 교차연결되어 있으며 상기 활성성분 결합영역에는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자, 상기 나노하이브리드 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 진단용 또는 치료용 조성물 및 상기 조성물을 생체 또는 시료에 주입하고 상기 생체 또는 시료로부터 상기 나노하이브리드 입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 종양 유무를 진단한 후 경우에 따라 종양 세포를 선택적으로 살상하는 단계를 포함한 종양의 진단방법 또는 치료방법에 관한 것이다.In the present invention, the nanoparticles are surrounded by a multifunctional ligand including an attachment region, a cross-linking region and an active ingredient binding region, wherein the cross-linking region of the multi-functional ligand is cross-linked with the cross-linking region of another multi-functional ligand. Tumor diagnostic or therapeutic nanohybrid particles, tumor diagnostics comprising the nanohybrid particles and a pharmaceutically acceptable carrier are characterized in that the active ingredient binding region is bound to a substance that can specifically bind to a tumor marker. Or injecting the therapeutic composition and the composition into a living body or a sample and detecting a signal emitted by the nanohybrid particles from the living body or the sample to diagnose tumor presence and selectively killing tumor cells in some cases. About diagnosis or treatment of tumor It is.

다작용기 리간드, 종양 진단 또는 치료용 나노하이브리드 입자 Multifunctional Ligands, Nanohybrid Particles for Diagnosing or Treating Tumors

Description

종양 진단 또는 치료용 나노하이브리드 입자{Nanohybrid Particles for Diagnosis and Treatment of Tumor}Nanohybrid Particles for Diagnosis and Treatment of Tumor

도 1은 본 발명에 따른 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자의 제조방법 및 진단방법에 대한 모식도이다.1 is a schematic diagram of a method for producing and diagnosing nanohybrid particles for diagnosing or treating tumors according to the present invention.

도 2는 본 발명에 따른 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자의 다양한 양태를 나타낸 것이다.Figure 2 shows various embodiments of the nanohybrid particles for diagnostic or therapeutic tumors according to the present invention.

도 3은 수용성 산화철 나노입자와 허셉틴이 결합하여 나노하이브리드 입자가 형성되었는지 여부를 동적 레이저 광 산란법(DLS)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.Figure 3 shows the results confirmed by the dynamic laser light scattering method (DLS) whether the water-soluble iron oxide nanoparticles and Herceptin is combined to form nanohybrid particles.

도 4는 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자가 생체외에서 유방암 표지 항원을 발현하는 세포에 선택적으로 결합함을 유세포 분석방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다(유방암 표지 항원의 발현양은 대조군 < 1.Bx-PC3 < 2.MDA-MB-231 ≤ 3.BT-474 < 4.NIH3T6.7 순서로 증가한다).Figure 4 shows the results confirmed by the flow cytometry that the nanohybrid particles according to the invention selectively binds to cells expressing breast cancer marker antigen in vitro (expression of breast cancer marker antigen is control <1.Bx-PC3 < 2.MDA-MB-231 ≤ 3.BT-474 <4.NIH3T6.7 in order).

도 5는 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자가 생체외에서 유방암 표지 항원을 발현하는 세포에 선택적으로 결합함을 자기공명영상으로 확인한 결과를 나타낸 것이다(유방암 표지 항원의 발현양은 대조군 < 1.Bx-PC3 < 2.MDA-MB-231 ≤ 3.BT-474 < 4.NIH3T6.7 순서로 증가한다).Figure 5 shows the results confirmed by magnetic resonance imaging that the nanohybrid particles according to the invention selectively binds to cells expressing breast cancer marker antigen in vitro (expression of breast cancer marker antigen is control <1.Bx-PC3 < 2.MDA-MB-231 ≤ 3.BT-474 <4.NIH3T6.7 in order).

도 6은 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자가 생체내에서 유방암 표지 항원을 발현하는 세포에 선택적으로 결합함을 자기공명영상으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the results confirmed by magnetic resonance imaging that the nanohybrid particles according to the present invention selectively binds to cells expressing a breast cancer marker antigen in vivo.

도 7은 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자가 생체내에서 유방암 표지 항원을 발현하는 세포에 선택적으로 결합함을 조직면역염색학적 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.Figure 7 shows the results confirmed by the tissue immunostaining method that the nanohybrid particles according to the invention selectively binds to cells expressing breast cancer marker antigen in vivo.

도 8은 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자가 생체외에서 난소암 표지 수용체를 발현하는 세포에 선택적으로 결합함을 자기공명영상으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.Figure 8 shows the results confirmed by magnetic resonance imaging that the nanohybrid particles according to the invention selectively binds to cells expressing the ovarian cancer marker receptor in vitro.

도 9는 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자가 유방암 표지 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 살상할 수 있음을 나타낸 그래프이다.9 is a graph showing that the nanohybrid particles according to the present invention can selectively kill cells expressing breast cancer marker antigens.

본 발명은 나노하이브리드 입자에 관한 것으로 보다 자세하게는 나노입자가 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분 결합영역을 포함하는 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있으되, 상기 다작용기 리간드의 교차연결영역은 다른 다작용기 리간드의 교차연결영역과 교차연결되어 있으며 상기 활성성분 결합영역에는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자, 이를 포함하는 진단용 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 및 치료방법에 관한 것이다.The present invention relates to nanohybrid particles, and more particularly, wherein the nanoparticles are surrounded by a multifunctional ligand including an attachment region, a cross-linking region, and an active ingredient-binding region, wherein the cross-linking region of the multi-functional ligand is another multi-functional ligand. It is cross-linked with the cross-linking region of the active ingredient binding region for the diagnostic or therapeutic nano-hybrid particles, characterized in that the material that can specifically bind to the tumor marker, the diagnostic or therapeutic comprising the same The present invention relates to a composition and a method for diagnosis and treatment using the same.

바이오 기술 분야에서 나노입자들은 암세포 특이적 살상, 면역반응의 부스팅(boosting), 세포 융합, 유전자 또는 약물 전달, 진단 등에 이용되고 있다. 이러한 용도에 이용되기 위해서 나노입자들은 활성성분을 부착할 수 있는 부분을 구비해야할 뿐만 아니라 생체내 즉, 수용성 환경에서 원활하게 운반 및 분산되어야 한다. 당업계에서는 이러한 조건을 만족시키기 위한 다양한 기술들이 개발되어져 왔다.In the field of biotechnology, nanoparticles are used for cancer cell specific killing, boosting immune response, cell fusion, gene or drug delivery, and diagnosis. In order to be used for these applications, the nanoparticles must not only have a portion capable of attaching the active ingredient, but also must be smoothly transported and dispersed in vivo, that is, in an aqueous environment. Various techniques have been developed in the art to satisfy these conditions.

미국특허 US　6,274,121호는 상자기성 입자와 이 입자의 표면에 조직 특이적 결합 물질, 진단용 또는 약제학적 활성 물질과 커플링(coupling)할 수 있는 결합자리를 포함하는 무기 또는 유기 물질로 이루어진 상자기성 입자를 개시하고 있다.US Pat. No. 6,274,121 discloses paramagnetic particles made of inorganic or organic materials comprising paramagnetic particles and binding sites capable of coupling with tissue specific binding substances, diagnostic or pharmaceutically active substances on the surface of the particles. It is starting.

미국특허 US 6,649,138호는 반도체 또는 금속 물질을 포함하는 소수성 나노입자의 표면에 다중 양친성 분산제 층을 형성하여 상기 나노입자의 수용성을 개선한 방법이 개시되어 있다. 상기 양친성 분산제로는 (1) 친수성 측쇄를 갖는 소수성 백본(backbone), (2) 소수성 측쇄를 갖는 친수성 백본 또는 (3) 친수성 및 소수성 측쇄를 동시에 갖는 소수성 또는 친수성 백본이 이용되었다.US Pat. No. 6,649,138 discloses a method of improving the water solubility of nanoparticles by forming multiple amphiphilic dispersant layers on the surface of hydrophobic nanoparticles comprising semiconductor or metal materials. As the amphiphilic dispersant, (1) a hydrophobic backbone having a hydrophilic side chain, (2) a hydrophilic backbone having a hydrophobic side chain, or (3) a hydrophobic or hydrophilic backbone having both hydrophilic and hydrophobic side chains was used.

미국특허공개 US 2003/0092029호는 결합부(binding-moiety)를 포함하는 나노입자에 관한 것으로 상기 결합부는 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 폴리사카라이드이다. 상기 나노입자는 생체외에서 핵산 및 단백질과 같은 목적 분자를 검출하는데 이용되거나 생체내에서 질병을 진단하기 위한 조영제로서 이용될 수 있다.US Patent Publication US 2003/0092029 relates to nanoparticles comprising a binding moiety, wherein the binding moiety is an oligonucleotide, polypeptide or polysaccharide. The nanoparticles can be used to detect target molecules such as nucleic acids and proteins in vitro or as contrast agents for diagnosing diseases in vivo.

그러나 미국특허 US 6,274,121호 및 미국특허공개 US 2003/0092029호는 나노입자를 수용액에서 합성하는데 이러한 경우 나노입자의 크기 조절이 어렵고 합성된 나노입자는 불균일한 크기 분포도를 나타낸다. 또한, 저온에서 합성되기 때문에 나노입자의 결정성이 낮고 비화학양론적 화합물(non-stoichiometric compound)이 형성되는 경향이 있다. 아울러, 상기 나노입자의 표면은 단분자 계면 안정제로 코팅되어 있는데 나노입자와의 결합력이 크지 않아 수용액에서 안정성이 떨어진다는 단점을 갖고 있다. 미국특허공보 US 6,649,138호에서 언급된 수용성 나노입자는 양친성 폴리머에 의해 둘러싸여 있어서 무기 나노입자에 비해 직경이 크게 증가하는 문제점을 갖고 있다.However, U.S. Patent No. 6,274,121 and U.S. Patent Publication No. 2003/0092029 synthesize nanoparticles in an aqueous solution. In this case, it is difficult to control the size of the nanoparticles and the synthesized nanoparticles exhibit non-uniform size distribution. In addition, since they are synthesized at a low temperature, nanoparticles tend to have low crystallinity and non-stoichiometric compounds are formed. In addition, the surface of the nanoparticles is coated with a single molecule interfacial stabilizer has a disadvantage in that the stability of the aqueous solution is poor because the bonding strength with the nanoparticles is not large. The water-soluble nanoparticles mentioned in US Pat. No. 6,649,138 are surrounded by amphiphilic polymers and have the problem of greatly increasing diameters compared to inorganic nanoparticles.

한편, 나노입자가 조영제로 이용된 구체적인 종래기술로서 대한민국특허출원 제 10-1998-0705262호는 혈액 체재를 연장하는데 사용되는 복합 나노입자에 관한 것으로 보다 자세하게는 산화 개열된 녹말 코팅과 임의의 관능화된 폴리알킬렌 옥사이드 코팅을 구비한 초상자성 철 산화물 코어 입자를 포함하는 입자와 이를 포함하는 MRI 조영제를 개시하고 있다.On the other hand, as a specific conventional technology in which nanoparticles are used as a contrast agent, Korean Patent Application No. 10-1998-0705262 relates to composite nanoparticles used to extend blood stay, and more specifically, oxidation-starved starch coating and arbitrary functionalization. Disclosed is a particle comprising a superparamagnetic iron oxide core particle with a polyalkylene oxide coating and an MRI contrast agent comprising the same.

그러나 상기 나노입자는 종양 특이성이 없을 뿐만 아니라 녹말 코팅은 나노입자의 크기를 크게 증가시키기 때문에 혈액내 반감기 등이 저하되고 쿠퍼씨 세포 등에 의해 탐식되므로 정확한 진단을 요구하는 경우 이용하는데 한계가 있다. 또한, 이상과 같이 수상에서 불안정한 나노입자는 생체내에서 원활하게 확산 및 분산되지 못하기 때문에 진단하는데 장시간이 소요될 뿐만 아니라 응집(aggregation)되는 경우에는 조직 깊숙이 침투하지 못하고 질병 이외의 부위에서 정체되어 오진할 우려가 있다.However, the nanoparticles not only have no tumor specificity, but because starch coating greatly increases the size of the nanoparticles, the half-life in the blood is reduced, and they are fed by Cooper's cells. In addition, as described above, nanoparticles that are unstable in an aqueous phase may not be diffused and dispersed smoothly in vivo, and thus, may not only take a long time to diagnose, but also may not be able to penetrate deep into tissues when they are aggregated. There is a concern.

추가로 국제공개특허 WO 01/56546호는 생물조직의 표적부위를 치료하기 위한 마그네토리포좀(magnetoliposome) 함유 조성물과 이를 이용한 치료방법에 관한 것으로 상기 치료방법은 별도의 진단 과정을 통하여 표적부위를 결정한 후 상기 마그네토리포좀 함유 조성물을 투여하고 표적부위에 자기장을 걸어주어 상기 마그네토리포좀이 표적부위에 집중되도록 하여 표적부위만을 선택적으로 치료할 수 있다. 그러나 상기 종래 기술에서는 진단과 치료가 분리되어져 있어 번거로운 단점이 있다.In addition, WO 01/56546 discloses a composition containing a magnetoliposome for treating a target site of a biological tissue and a treatment method using the same. The treatment method is determined after determining a target site through a separate diagnosis process. By administering the magnetoposome-containing composition and applying a magnetic field to the target site, the magnetoposome may be concentrated on the target site, thereby selectively treating only the target site. However, in the prior art, the diagnosis and the treatment are separated, which is a cumbersome disadvantage.

따라서 본 발명자들은 수상에서 안정하여 분산 및 확산이 원활한 수용성 나노입자의 활성성분 결합영역에 종양 마커와 결합할 수 있는 물질을 결합시켜 만든 종양 진단용 나노하이브리드 입자가 정확하고 효율적으로 종양을 진단할 뿐만 아니라 동시에 종양 부위만을 선택적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Therefore, the inventors of the present invention not only accurately and efficiently diagnose tumors with tumor diagnostic nanohybrid particles made by binding a substance capable of binding tumor markers to the active ingredient binding region of water-soluble nanoparticles that are stable in the water phase and are easily dispersed and diffused. At the same time, it was confirmed that only tumor sites can be treated selectively, and thus the present invention has been completed.

한 관점으로서 나노입자가 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분 결합영역을 포함하는 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있으되, 상기 다작용기 리간드의 교차연결영역은 다른 다작용기 리간드의 교차연결영역과 교차연결되어 있으며 상기 활성성분 결합영역에는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자를 제공한다.In one aspect, the nanoparticles are surrounded by a multifunctional ligand comprising an attachment region, a crosslinking region and an active ingredient binding region, wherein the crosslinking region of the multifunctional ligand is crosslinked with the crosslinking region of another multifunctional ligand. The active ingredient binding region provides a nanohybrid particle for tumor diagnosis or treatment, characterized in that the material that can specifically bind to the tumor marker is bound.

다른 관점으로 상기 나노하이브리드 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 진단용 또는 치료용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a tumor diagnostic or therapeutic composition comprising the nanohybrid particles and a pharmaceutically acceptable carrier.

또 다른 관점으로 (1) 상기 진단용 또는 치료용 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계; 및 (2) 상기 생체 또는 시료로부터 상기 나노하이브리드 입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 종양의 유무를 진단하는 단계; 또는 (3) 확인된 종양 세포를 선택적으로 살상하는 단계를 포함한 종양의 진단방법 또는 치료방법을 제공한다.In another aspect (1) injecting the diagnostic or therapeutic composition into a living body or a sample; And (2) diagnosing the presence of a tumor by sensing a signal emitted by the nanohybrid particles from the living body or sample; Or (3) selectively killing the identified tumor cells.

본 발명에서 "수용성 나노입자"는 나노입자가 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분과의 결합영역을 포함하는 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있으되, 상기 다작용기 리간드의 교차연결영역은 다른 다작용기 리간드의 교차연결영역과 교차연결되어 있는 것을 특징으로 하는 입자를 의미하는 것으로 수용성 환경에서 특히 안정적이다.In the present invention, the "water-soluble nanoparticle" is surrounded by a multifunctional ligand, wherein the nanoparticle includes an attachment region, a cross-linking region and a binding region with an active ingredient, wherein the cross-linking region of the multi-functional ligand is a polyfunctional ligand. Particles characterized by being cross-linked with the cross-linked region, which is particularly stable in water-soluble environments.

본 발명에서 "나노입자(nanoparticles)"는 자성 물질(magnetic material), 자성 합금(magnetic alloy) 물질 또는 이들을 함유하는 다성분 혼성 구조체를 포함하는 직경이 1nm 내지 1000nm, 바람직하게는 2nm 내지 100nm인 입자를 의미한다.In the present invention, "nanoparticles" are particles having a diameter of 1 nm to 1000 nm, preferably 2 nm to 100 nm, including a magnetic material, a magnetic alloy material or a multicomponent hybrid structure containing them. Means.

자성 물질의 예로는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM'2O4, MxOy(M 또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr, 0<x≤3, 0<y≤5) 등이 포함되며, 자성 합금의 예에는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, NiFeCo 등이 포함된다. 한편, 다성분 혼성 구조체는 상기 자성 물질 및 자성 합금으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 입자를 말한다.Examples of magnetic materials include Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM ' 2 O 4 , M x O y (M or M '= Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr, 0 <x≤3, 0 <y≤5) and the like, and examples of magnetic alloys include CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, NiFeCo and the like. Meanwhile, the multicomponent hybrid structure refers to a particle including two or more components selected from the magnetic material and the magnetic alloy.

본 발명에서 "다작용기 리간드"는 (a) 부착영역, (b) 교차연결영역 및 (c) 활성성분 결합영역을 포함하는 물질을 의미한다. 이하에서 상기 다작용기 리간드를 보다 구체적으로 설명한다.In the present invention, "multifunctional ligand" means a material including (a) an attachment region, (b) a cross-linking region, and (c) an active ingredient binding region. Hereinafter, the multifunctional ligand will be described in more detail.

상기 "부착영역"은 나노입자와 부착할 수 있는 작용기(functional group)를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 말단을 의미한다. 따라서 부착영역은 나노입자를 이루는 물질과 친화성이 높은 작용기를 포함하는 것이 바람직하며, 나노입자를 이루는 물질에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 부착영역은 예를 들면 -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H 또는 -OH를 포함할 수 있다.The "attachment region" means a portion of a multifunctional ligand including a functional group capable of attaching nanoparticles, preferably a terminal. Therefore, the attachment region preferably includes a functional group having high affinity with the material forming the nanoparticles, and may be variously selected according to the material forming the nanoparticles. The attachment region may include, for example, -COOH, -NH 2 , -SH, -CONH 2 , -PO 3 H, -PO 4 H, -SO 3 H, -SO 4 H or -OH.

상기 "교차연결영역"은 근접한 다작용기 리간드와 교차연결할 수 있는 작용기를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 중심부를 의미한다. "교차연결"이란 한 다작용기 리간드가 근접하여 위치한 다른 다작용기 리간드와 분자간 인력(intermolecular interaction)으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 분자간 인력의 종류[예, 소수성 인력, 수소 결합, 공유 결합(예, 디설파이드 결합), 반데르 발스 결합, 이온 결합 등]는 특별히 제한적이지 않기 때문에 교차연결할 수 있는 작용기는 목적한 분자간 인력의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 교차연결영역은 예를 들면 -SH, -NH2, -COOH, -OH, -에폭시(epoxy), -에틸렌(ethylene) 또는 -아세틸렌(acetylene)을 작용기로서 포함할 수 있다.By "crosslinking region" is meant a portion, preferably central, of a multifunctional ligand comprising a functional group capable of crosslinking with an adjacent multifunctional ligand. By "crosslinking" is meant that one polyfunctional ligand is coupled in an intermolecular interaction with another polyfunctional ligand in close proximity. The kind of intermolecular attraction (e.g., hydrophobic attraction, hydrogen bond, covalent bond (e.g. disulfide bond), van der Waals bond, ionic bond, etc.) is not particularly limited. It can be variously selected according to. The cross linking region may include, for example, -SH, -NH 2 , -COOH, -OH, -epoxy, -ethylene or -acetylene as a functional group.

상기 "활성성분 결합영역"은 활성성분과 부착할 수 있는 작용기를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 상기 부착영역과 반대편에 위치한 말단을 의미한다. 상기 활성성분 결합영역의 작용기는 활성성분의 종류 및 이의 화학식에 따라 달라질 수 있다(표 1 참조). 본 발명에서 활성성분 결합영역은 -SH, -COOH, -NH2, -OH, -NR4 +X-, -술포네이트(sulfonate), -니트레이트(nitrate) 또는 포스포네이트(phosphonate)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.The "active component binding region" means a portion of a multifunctional ligand including a functional group attachable to the active component, preferably a terminal located opposite to the attachment region. The functional group of the active ingredient binding region may vary depending on the type of active ingredient and its chemical formula (see Table 1). Active ingredient-binding region in this invention -SH, -COOH, -NH 2, -OH , -NR 4 + X - include nitrates (nitrate) or phosphonate (phosphonate) -, - sulfonate (sulfonate), It may, but is not limited to.

이러한 수용성 나노입자는 대한민국특허출원 제 10-2004-0070303호에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 제조방법은 본 발명에 참고문헌으로서 포함된다.Such water-soluble nanoparticles can be prepared according to the method disclosed in Korean Patent Application No. 10-2004-0070303. The preparation method is included in the present invention as a reference.

다작용기 리간드에 포함될 수 있는 활성성분 결합영역의 작용기의 예 Examples of functional groups of active ingredient binding regions that can be included in multifunctional ligands I I IIII IIIIII R-NH2 R-NH 2 R'-COOHR'-COOH R-NHCO-R'R-NHCO-R ' R-SH R-SH R'-SHR'-SH R-SS-RR-SS-R R-OH R-OH R'-(에폭시기)R '-(epoxy) R-OCH2C(OH)CH2-R'R-OCH 2 C (OH) CH 2 -R ' RH-NH2 RH-NH 2 R'-(에폭시기)R '-(epoxy) R-NHCH2C(OH)CH2-R'R-NHCH 2 C (OH) CH 2 -R ' R-SH R-SH R'-(에폭시기)R '-(epoxy) R-SCH2C(OH)CH2-R'R-SCH 2 C (OH) CH 2 -R ' R-NH2 R-NH 2 R'-COHR'-COH R-N=CH-R'R-N = CH-R ' R-NH2 R-NH 2 R'-NCOR'-NCO R-NHCONH-R'R-NHCONH-R ' R-NH2 R-NH 2 R'-NCSR'-NCS R-NHCSNH-R'R-NHCSNH-R ' R-SH R-SH R'-COCH2 R'-COCH 2 R'-COCH2S-RR'-COCH 2 SR R-SH R-SH R'-O(C=O)XR'-O (C = O) X R-OCH2(C=O)O-R'R-OCH 2 (C = O) O-R ' R-(아지리딘기) R- (aziridine group) R'-SHR'-SH R-CH2CH(NH2)CH2S-R'R-CH 2 CH (NH 2 ) CH 2 S-R ' R-CH=CH2 R-CH = CH 2 R'-SHR'-SH R-CH2CHS-R'R-CH 2 CHS-R ' R-OH R-OH R'-NCOR'-NCO R'-NHCOO-RR'-NHCOO-R R-SH R-SH R'-COCH2XR'-COCH 2 X R-SCH2CO-R'R-SCH 2 CO-R ' R-NH2 R-NH 2 R'-CON3 R'-CON 3 R-NHCO-R'R-NHCO-R ' R-COOH R-COOH R'-COOHR'-COOH R-(C=O)O(C=O)-R' + H2OR- (C = O) O (C = O) -R '+ H 2 O R-SH R-SH R'-X R'-X R-S-R'R-S-R ' R-NH2 R-NH 2 R'CH2C(NH2+)OCH3 R'CH 2 C (NH 2+ ) OCH 3 R-NHC(NH2+)CH2-R'R-NHC (NH 2+ ) CH 2 -R ' R-OP(O2-)OH R-OP (O 2- ) OH R'-NH2 R'-NH 2 R-OP(O2-)-NH-R'R-OP (O 2- ) -NH-R ' R-CONHNH2 R-CONHNH 2 R'-COHR'-COH R-CONHN=CH-R'R-CONHN = CH-R ' R-NH2 R-NH 2 R'-SHR'-SH R-NHCO(CH2)2SS-R'R-NHCO (CH 2 ) 2 SS-R '

(I: 다작용기 리간드의 활성성분 결합영역의 작용기, II: 활성성분, (I: functional group of the active ingredient binding region of the multifunctional ligand, II: active ingredient,

III: I과 II의 반응에 따른 결합예)III: binding example according to reaction of I and II)

한 관점으로 본 발명은 상기 수용성 나노입자의 활성성분 결합영역에 종양을 진단 및/또는 치료할 수 있는 물질을 결합시킨 나노하이브리드 입자를 제공한다. 즉, 본 발명에서 "나노하이브리드 입자"는 나노입자가 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분 결합영역을 포함하는 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있으되, 상기 다작용기 리간드의 교차연결영역은 다른 다작용기 리간드의 교차연결영역과 교차연결되어 있으며 상기 활성성분 결합영역에는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있는 입자를 의미한다.In one aspect, the present invention provides a nanohybrid particle having a substance capable of diagnosing and / or treating a tumor in an active ingredient binding region of the water-soluble nanoparticle. That is, in the present invention, "nanohybrid particles" are nanoparticles are surrounded by a multifunctional ligand comprising an attachment region, a cross-linking region and an active ingredient binding region, the cross-linking region of the multi-functional ligand of the other multi-functional ligand It refers to particles that are cross-linked with the cross-linked region and the active component binding region is bound to a substance capable of specifically binding to the tumor marker.

본 발명의 나노하이브리드 입자는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.The nanohybrid particles of the present invention are used to diagnose and / or treat various diseases associated with tumors, such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer and cervical cancer. Can be used.

이와 같은 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라고 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 수용성 나노입자의 활성성분 결합영역에 결합시켜 만든 나노하이브리드 입자는 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커 뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. 한편, 본 발명의 명세서에서 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 "활성성분"과 동일한 의미이며, 이들은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.Such tumor cells express and / or secrete certain substances which are produced little or no in normal cells and are generally termed "tumor markers". Nanohybrid particles made by binding a substance capable of specifically binding such a tumor marker to the active ingredient binding region of the water-soluble nanoparticles can be usefully used for tumor diagnosis. Various tumor markers are known in the art, as well as substances that can specifically bind to them. Meanwhile, in the specification of the present invention, a substance capable of specifically binding to a tumor marker has the same meaning as "active ingredient", and they may be used interchangeably.

본 발명에서 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다(표 2 참조).Tumor markers in the present invention can be classified into ligands, antigens, receptors, and nucleic acids encoding them according to the mechanism of action (see Table 2).

종양 마커 및 활성 성분의 예Examples of Tumor Markers and Active Ingredients 종류Kinds 종양 마커의 예Examples of Tumor Markers 활성 성분의 예Examples of active ingredients 리간드Ligand 시냅토타그민 I의 C2C2 of Synaptotamine I 포스파티딜세린Phosphatidylserine 아넥신 VAnnexin V 인테그린Integreen 인테그린 수용체Integrin receptor VEGFVEGF VEGFRVEGFR 안지오포이에틴 1, 2Angiopoietins 1 and 2 Tie2 수용체Tie2 receptor 소마토스타틴Somatostatin 소마토스타틴 수용체Somatostatin Receptor 바소인테스티날 펩타이드Basointestinal Peptide 바소인테스티날 펩타이드 수용체Basointestinal Peptide Receptor 항원antigen 암성 태아성 항원Cancerous Fetal Antigens 허셉틴(Genentech, USA)Herceptin (Genentech, USA) HER2/neu 항원HER2 / neu antigen 전립선 특이 항원Prostate-specific antigen 리툭산(Genentech, USA)Rituxan (Genentech, USA) 수용체Receptor 폴산 수용체Folic acid receptor 폴산Folic acid

종양 마커가 리간드인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자의 활성성분으로 도입할 수 있는데 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.When the tumor marker is a ligand, a substance capable of specifically binding to the ligand may be introduced as an active ingredient of the nanohybrid particles according to the present invention, but the receptor may specifically bind to the ligand. Or the antibody will be suitable. Examples of ligands and receptors that can specifically bind to the present invention include synaptotagmin C2 (synaptotagmin C2) and phosphatidylserine, annexin V and phosphatidylserine, integrin and its Receptors, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptors, angiopoietin and Tie2 receptors, somatostatin and its receptors, vasointestinal peptides and their receptors. It is not.

종양 마커가 항원인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자의 활성성분으로 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다.When the tumor marker is an antigen, a substance capable of specifically binding to the antigen may be introduced as an active ingredient of the nanohybrid particle according to the present invention, and an antibody capable of specifically binding to the antigen may be suitable. Examples of antigens and antibodies that specifically bind to the present invention include carcinoembryonic antigens (colon cancer marker antigens), Herceptin (Genentech, USA), and HER2 / neu antigens (HER2 / neu antigens-breast cancer markers). Antigen) and Herceptin, prostate-specific membrane antigen (prostate cancer marker antigen) and rituxan (IDCE / Genentech, USA).

종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자의 활성성분으로 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다.A representative example where the tumor marker is a "receptor" is a folic acid receptor expressed in ovarian cancer cells. A substance capable of specifically binding to the receptor (folic acid in the case of folic acid receptor) may be introduced as an active ingredient of the nanohybrid particles according to the present invention, and a ligand or an antibody capable of specifically binding to the receptor is suitable. something to do.

상술한 바와 같이 항체는 본 발명에 있어서 특히 바람직한 활성성분이다. 항체는 특정 대상과만 선택적이고 안정적으로 결합하는 성질을 갖고 있으며, 항체의 Fc 영역에 있는 리신의 -NH2, 시스테인의 -SH, 아스파라긴산 및 글루탐산의 -COOH는 수용성 나노입자의 활성성분 결합영역 작용기와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있기 때문이다.As mentioned above, antibodies are particularly preferred active ingredients in the present invention. The antibody has the property of selectively and stably binding only to a specific target, and -NH 2 of lysine, -SH of cysteine, -COOH of aspartic acid and glutamic acid in the Fc region of the antibody are active ingredient binding region functional groups of water-soluble nanoparticles. Because it can be useful to combine with.

이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물 (예, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다. 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.Such antibodies can be obtained commercially or prepared according to methods known in the art. In general, a mammal (eg, mouse, rat, goat, rabbit, horse or sheep) is immunized one or more times with an appropriate amount of antigen. After a period of time when the titer reaches an appropriate level, it is recovered from the serum of the mammal. The recovered antibody can be purified using known processes if desired and stored in a frozen buffered solution until use. Details of this method are well known in the art.

한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자의 활성성분으로 이용할 수 있다.On the other hand, "nucleic acid" includes RNA and DNA encoding the aforementioned ligand, antigen, receptor or part thereof. Nucleic acid having a specific base sequence can be detected using a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence because the nucleic acid has a feature that forms a base pair between complementary sequences as known in the art . A nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the nucleic acid encoding the enzyme, ligand, antigen, receptor can be used as an active ingredient of the nanohybrid particles according to the present invention.

또한, 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 활성성분 결합영역의 작용기와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다.In addition, the nucleic acid has a functional group such as -NH 2 , -SH, -COOH at the 5'- and 3'- terminal may be useful for binding to the functional group of the active ingredient binding region.

이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).Such nucleic acids can be synthesized by standard methods known in the art, for example using automated DNA synthesizers (such as those available from BioSearch, Applied Biosystems, etc.). As an example, phosphorothioate oligonucleotides can be synthesized by the methods described in Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol. 16, p. 3209. Methylphosphonate oligonucleotides can be prepared using a controlled free polymer support (Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol. 85, p.7448).

다른 관점으로 본 발명은 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 진단용 또는 치료용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for diagnosing or treating tumors comprising the nanohybrid particles according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명에 따른 종양 진단용 또는 치료용 조성물은 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.Tumor diagnostic or therapeutic compositions according to the invention may be administered via routes commonly used in the medical arts, and parenteral administration is preferred, for example via intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous or topical routes. May be administered.

본 발명에 따른 종양 진단용 또는 치료용 조성물에 사용되는 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함한다. 본 발명의 진단 용 또는 치료용 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다. 본 발명의 진단용 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Carriers used in the composition for diagnosing or treating tumors according to the present invention include carriers and vehicles commonly used in the medical field. Pharmaceutically acceptable carriers that may be used in the diagnostic or therapeutic compositions of the invention include, but are not limited to, ion exchange, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (E.g. various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g. , Colloidal silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrates, polyethylene glycol, sodium carboxymethylcellulose, polyarylates, waxes, polyethylene glycols and wool, and the like. The diagnostic or therapeutic composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.

한 양태로서, 본 발명에 따른 종양 진단용 또는 치료용 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.In one embodiment, the tumor diagnostic or therapeutic composition according to the invention may be prepared in an aqueous solution for parenteral administration. Preferably, buffer solutions such as Hanks' solution, Ringer's solution, or physically buffered saline may be used. Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.

본 발명의 바람직한 종양 진단용 또는 치료용 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.Preferred tumor diagnostic or therapeutic compositions of the invention may be in the form of sterile injectable preparations as sterile injectable aqueous or oily suspensions. Such suspensions can be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (eg Tween 80) and suspending agents. Sterile injectable preparations may also be sterile injectable solutions or suspensions (eg solutions in 1,3-butanediol) in nontoxic parenterally acceptable diluents or solvents. Vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution, and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, nonvolatile oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. For this purpose any non-irritating non-volatile oil can be used including synthetic mono or diglycerides.

또 다른 관점으로 본 발명은 (1) 본 발명에 따른 종양 진단용 또는 치료용 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계; 및 (2) 상기 생체 또는 시료로부터 상기 나노하이브리드 입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 종양의 유무를 진단하는 단계; 또는 (3) 확인된 종양 세포를 선택적으로 살상하는 단계를 포함한 종양의 진단방법 또는 치료방법을 제공한다.In another aspect, the present invention comprises the steps of (1) injecting a tumor diagnostic or therapeutic composition according to the invention into a living body or a sample; And (2) diagnosing the presence of a tumor by sensing a signal emitted by the nanohybrid particles from the living body or sample; Or (3) selectively killing the identified tumor cells.

상기 "시료"는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 이와 같은 종양의 진단방법을 통하여 생체내(in vivo) 및 생체외에서(in vitro) 종양의 진단이 가능하다.The "sample" refers to tissue or cells isolated from a subject to be diagnosed. Through such a tumor diagnosis method, it is possible to diagnose tumors in vivo and in vitro.

상기 진단방법에 있어서 나노하이브리드 입자에 의해 발산되는 신호는 자기장을 이용하는 각종 장비들에 의해서 감지될 수 있는데 그러한 장치에는 자기공명영상 진단장치(MRI)가 포함될 것이다.In the diagnostic method, the signal emitted by the nanohybrid particles may be detected by various devices using a magnetic field. Such a device may include a magnetic resonance imaging diagnostic apparatus (MRI).

자기공명영상 진단장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵이 에너지를 흡수하여 에너지가 높은 상태로 만든 후 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다.The magnetic resonance imaging apparatus puts a living body in a strong magnetic field and irradiates radio waves of a specific frequency so that atomic nuclei such as hydrogen in biological tissues absorb energy and make energy high, and then stops propagating the atomic nuclei energy such as hydrogen. It is a device that processes the energy by converting this energy into a signal and processing it with a computer. Since magnetism or propagation is not obstructed by bone, clear three-dimensional tomograms can be obtained at longitudinal, transverse, and arbitrary angles around solid bones or tumors of the brain or bone marrow.

상술한 바와 같은 진단방법을 통하여 생체에 종양이 존재하는 것으로 확인된 경우에는 이어서 종양 세포만을 선택적으로 살상하는 단계를 포함한 치료방법을 진행할 수 있다.When it is confirmed that the tumor is present in the living body through the above-described diagnostic method, a treatment method may be performed including selectively killing only tumor cells.

본 발명에 따른 치료방법의 한 양태는 종양 특이성 고온 치료법(Hyperthermia)을 기반으로 하는데 "고온 치료법"이란 외부에서 자성 나노입자에 라디오 주파수의 교류 자기장을 걸어주면 자성 나노입자가 자기적 전자 스핀의 자기 이완 과정(Neel relaxation)을 통해 열을 방출하게 되는데 이 때 발생하는 열이 자성 나노입자의 주변 온도에 영향을 주어 37℃의 생체 온도를 40 내지 45℃의 온도로 올려서 세포를 사멸시키는 치료법을 의미한다. 본 발명에 따른 진단 및 치료용 조성물을 생체에 주입하고 신호를 발산하는 부분(종양)을 확인한 후 그 부분에 자기장을 걸어주어 열을 발생시키면 종양 세포들만 선택적으로 살상할 수 있다.One aspect of the treatment method according to the present invention is based on tumor specific hyperthermia, which is called "thermotherapy" from an external magnetic field applied to the magnetic nanoparticles in an alternating magnetic field at radio frequency, It releases heat through the relaxation (Neel relaxation). Heat generated at this time affects the ambient temperature of the magnetic nanoparticles, and it means a treatment that kills cells by raising the biological temperature of 37 ℃ to 40-45 ℃. do. After injecting a diagnostic and therapeutic composition according to the present invention into a living body and confirming a portion (tumor) that emits a signal, a magnetic field is applied to the portion to generate heat, thereby selectively killing only tumor cells.

다른 양태는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질 자체가 세포 살상 효과를 갖고 있는 경우에 선택할 수 있는 치료 방법이다. 구체적으로 앞서 기술한 허셉틴 및 리툭산과 같은 항체들은 종양 세포에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 그 자체가 종양 세포를 살상할 수도 있다. 따라서 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 허셉틴 또는 리툭산과 같은 항체인 경우에는 해당 종양을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 종양 세포를 살상하여 종양을 치료할 수도 있다.Another aspect is a treatment method that can be selected when the substance itself that can specifically bind a tumor marker has a cytotoxic effect. Specifically, the antibodies described above, such as Herceptin and Rituxan, can not only bind tumor cells specifically but can also kill tumor cells by themselves. Therefore, if the substance that can specifically bind the tumor marker is an antibody such as Herceptin or Rituxan can not only diagnose the tumor, but also kill the tumor cells to treat the tumor.

또 다른 양태는 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자를 항암제의 캐리어(carrier)로서 이용하는 경우인데 나노하이브리드 입자 바람직하게는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질에 추가로 항암제를 결합시킨 것으로 이러한 나노하이브리드 입자는 종양 세포에 집중되어 종양을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 항암제를 종양 부위에 집중시켜서 정상 세포에는 영향을 미치지 않은 채로 종양 세포만을 선택적으로 살상할 수 있다.Another embodiment is a case where the nanohybrid particles according to the present invention are used as carriers of an anticancer agent, and the nanohybrid particles are preferably combined with an anticancer agent to a substance capable of specifically binding to a tumor marker. Particles can concentrate on tumor cells to diagnose tumors, as well as to selectively kill only tumor cells without affecting normal cells by focusing anticancer agents on the tumor site.

본 발명에 따른 치료 방법에서 이용될 수 있는 항암제로는 이에 제한되는 것은 아니지만 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 택솔(taxol), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등이 있다.Anticancer agents that can be used in the treatment method according to the present invention include, but are not limited to, cisplatin, carboplatin, procarbazine, cyclophosphamide, diactinomycin ( dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, bleomycin, taxol, plicomycin, mitomycin, etoposide, taxoxifen tamoxifen, transplatinum, vinblastin and methotrexate.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention, those skilled in the art. Will be self-evident.

<실시예 1><Example 1>

유방암 진단용 산화철-허셉틴(HERCEPTIN) 나노하이브리드 입자의 제조Preparation of Iron Oxide-HERCEPTIN NanoHybrid Particles for Breast Cancer Diagnosis

허셉틴[(10mg/ml, in 10mM 인산완충용액, pH7.2) Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA] 100㎕를 취하여 에펜도르프 튜브에 담은 후, 0.2mg의 sulfo-SMCC [40(N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxy-succimide ester]를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시켜 허셉틴의 리신 잔기를 말레이미드기로 치환시켰다. 과량의 sulfo-SMCC 분자들은 Sephadex G-25 column을 통해 제거한 후, 말레이드기로 치환된 허셉틴을 200㎕의 수용성 산화철 나노입자를 함유한 용액(10mM PB, pH 7.2, 2mg/ml)과 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Sephacryl S-300 column을 통하여 반응하지 않은 허셉틴과 산화철 수용성 나노입자를 제거한 후 센트리콘 여과 키트(centricon filtration kit)를 이용하여 약 2mg/ml의 농도로 농축시키는 과정을 통해 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자를 제조하였다.100 μl of Herceptin [(10 mg / ml, in 10 mM phosphate buffer, pH7.2) Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA] was taken in an Eppendorf tube and 0.2 mg of sulfo-SMCC [40 ( N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxy-succimide ester] was added and reacted for 30 minutes at room temperature to replace the lysine residue of Herceptin with a maleimide group. Excess sulfo-SMCC molecules were removed through the Sephadex G-25 column, and then Herceptin substituted with Malade group was dissolved in a solution containing 200 μl of water-soluble iron oxide nanoparticles (10 mM PB, pH 7.2, 2 mg / ml) for 24 hours. The reaction was carried out at room temperature. After the reaction, the unreacted Herceptin and iron oxide water-soluble nanoparticles were removed through the Sephacryl S-300 column, and then concentrated to a concentration of about 2 mg / ml using a centricon filtration kit. Nanohybrid particles were prepared.

수용성 산화철 나노입자와 허셉틴의 결합은 동적 레이저 광 산란법(Dynamic Light Scattering; Brookheaven, BI-200SM)을 이용하여 확인하였다. 구체적으로 허셉틴이 결합된 수용성 산화철 나노입자 및 수용성 산화철 나노입자를 각각 10ml의 물에 희석시키고, 불순물을 제거하기 위해 500nm PTFE syringe filter 에 통과시킨 후, DLS 장비에 로딩한 후 60회 스캐닝하였다. 이러한 스캐닝 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 수용성 산화철 나노입자가 허셉틴과 결합함에 따라 그 크기가 9nm에서 28nm로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.The binding of the water-soluble iron oxide nanoparticles and Herceptin was confirmed using a dynamic laser light scattering method (Brookheaven, BI-200SM). Specifically, each of the water-soluble iron oxide nanoparticles and the water-soluble iron oxide nanoparticles bound to Herceptin were diluted in 10 ml of water, passed through a 500 nm PTFE syringe filter to remove impurities, and then loaded into a DLS device and scanned 60 times. This scanning result is shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, as the water-soluble iron oxide nanoparticles bind with Herceptin, its size increased from 9 nm to 28 nm.

<실시예 2><Example 2>

산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 생체 외에서의 종양 세포 선택성 확인Confirmation of Tumor Cell Selectivity of Iron Oxide-Herceptin Nanohybrid Particles in Vitro

상기 실시예 1에서 제조된 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 유방암 표지 항원인 HER2/neu 항원에 대한 결합 특이성 및 효율을 분석하기 위하여 생체외 자기공명영상과 유세포 분석을 동시에 시행하였다.In vitro magnetic resonance imaging and flow cytometry were performed simultaneously to analyze the binding specificity and efficiency of the HER2 / neu antigen, the breast cancer marker antigen, of the iron oxide-Herceptin nanohybrid particles prepared in Example 1 above.

HER2/neu 항원 미발현, 발현 및 과발현 세포주들에 대하여 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자를 반응시키는 과정은 다음과 같았다. 먼저 상기 세포주들을 실온에서 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 배양 중인 디쉬에서 분리하였다. 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자를 107 세포를 포함하는 50㎕ PBS 완충용액에 항체 기준으로 20㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 이것을 얼음에 약 30분 정도 두었다가 3 차례 세척하였다. 일차항체(허셉틴)와 산화철 수용성 나노입자가 결합된 나노하이브리드 입자를 찾기 위하여 FITC 중합된 이차항체와 약 20분간 반응하였다. 한편, 대조군으로는 anti-HMEN-B3 항체를 포함하는 나노하이브리드 입자(이하, "대조군 나노하이브리드 입자"라 명명함)를 이용하였다.The process of reacting the iron oxide-Herceptin nanohybrid particles to HER2 / neu antigen non-expressing, expression and overexpressing cell lines was as follows. The cell lines were first isolated in culture dishes using 0.25% trypsin / EDTA at room temperature. Iron oxide-Herceptin nanohybrid particles were added to 50 μl PBS buffer containing 10 7 cells at a concentration of 20 μg / ml on an antibody basis. It was left on ice for about 30 minutes and washed three times. In order to find the nanohybrid particles in which the primary antibody (Herceptin) and the iron oxide water-soluble nanoparticles were combined, the reaction was performed with the FITC polymerized secondary antibody for about 20 minutes. On the other hand, as a control, nanohybrid particles containing an anti-HMEN-B3 antibody (hereinafter referred to as "control nanohybrid particles") were used.

A. 유세포 분석A. Flow Cytometry

FACScan flow cytometer(Becton Dickinson, San Diego, CA)를 이용하여 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 항원 특이성과 그 효율성을 측정하였다. 각각의 세포주에 대하여 일만 번의 이벤트를 측정하였다. 형광인덱스는 형광 강도 분포의 평균값과 중간값 범위를 이용하였다. 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자 및 대조군 나노하이브리드 입자를 각각 HER2/neu 수용체를 발현하는 세포주에 처리한 후 전술된 바와 동일하게 FITC 중합된 이차항체와 반응시켜서 형광발현 여부를 형광 현미경(fluorescent microscopy)을 이용하여 확인하고 이의 결과를 도 4에 나타내었다.Antigen specificity and efficiency of iron oxide-Herceptin nanohybrid particles were measured using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, San Diego, Calif.). Ten thousand events were measured for each cell line. The fluorescent index was used as the average value and the median range of the fluorescence intensity distribution. Iron oxide-Herceptin nanohybrid particles and control nanohybrid particles were treated with cell lines expressing HER2 / neu receptors, respectively, and reacted with FITC polymerized secondary antibodies as described above to determine whether fluorescence was detected using fluorescence microscopy. Confirmed and the results are shown in FIG.

도 4에 나타난 바와 같이 HER2/neu 수용체의 발현 정도가 증가함에 따라 형광 발현 강도도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. HER2/neu 수용체 발현 정도가 낮은 BX-PC-3 세포주의 경우(도 4의 1)는 대조군 나노하이브리드 입자를 사용한 경우(도 4의 대조군) 보다 형광 발현 강도가 약간 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 수용체 발현 정도가 증가함에 따라 (BX-PC-3 세포주 < MDA-MB-231 세포주 ≤ BT-474 세포주 < NIH3T6.7 세포주) 형광 발현 강도도 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 4, as the expression level of the HER2 / neu receptor was increased it was confirmed that the fluorescence expression intensity also increased. In the BX-PC-3 cell line with low HER2 / neu receptor expression level (FIG. 4), the fluorescence expression intensity was slightly increased compared with the control nanohybrid particles (control of FIG. 4). As the expression level increased (BX-PC-3 cell line <MDA-MB-231 cell line ≤ BT-474 cell line <NIH3T6.7 cell line) it was confirmed that the fluorescence expression intensity gradually increased.

B. 자기공명영상에 의한 분석B. Analysis by Magnetic Resonance Imaging

자기공명영상을 이용하여 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 항원 특이성을 분석하기 위해 각각의 세포들을 PCR용 튜브로 옮긴 후 원심분리하여 세포를 가라앉혔다. 각 세포주들의 항원 특이성에 따른 자기공명영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다(도 5). 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6 분. 항원 특이성에 대한 자기공명영상 조영효과의 정량적 평가를 위해 T2 맵을 시행하였다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TR = 4000ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160ms, 영상여기횟수 2, 영상획득시간 4분.In order to analyze the antigen specificity of the iron oxide-Herceptin nanohybrid particles using magnetic resonance imaging, each cell was transferred to a PCR tube and centrifuged to sink the cells. 1.5 T (Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) system was used to see the contrast effect of magnetic resonance imaging according to antigen specificity of each cell line, and micro-47 coil was used. Coronal images were obtained with Fast Field Echo (FFE) pulse trains (FIG. 5). Specific parameters were as follows: resolution 156 x 156 mu m, section thickness 0.6 mm, TE = 20 ms, TR = 400 ms, image excitation count 1, image acquisition time 6 minutes. T2 map was performed to quantitatively evaluate the magnetic resonance imaging contrast effect on antigen specificity. Specific parameters were as follows: resolution 156 x 156 μm, section thickness 0.6 mm, TR = 4000 ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ms, image excitation count 2, image acquisition time 4 minutes .

도 5의 결과는 도 4에서 보여준 형광 발현 결과와 일치하여 HER2/neu 수용체 발현 정도가 점점 증가함에 따라 자기공명영상 신호가 점점 회색을 거쳐 검은색으로 나타나는 것을 확인하였다. 발현 정도가 낮은 BX-PC-3 세포주의 경우(도 4의 1) 대조군 나노하이브리드 입자를 사용한 경우(도 4의 대조군) 보다 약간 어두운 색으로 변하는 것을 확인할 수 있으며 수용체 발현 정도가 증가함에 따라(BX-PC-3 세포주 < MDA-MB-231 세포주 ≤ BT-474 세포주 < NIH3T6.7 세포주) 점점 검은색으로 변해가는 것을 확인할 수 있었다. 이는 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자가 HER2/neu 수용체를 발현하는 세포주에 선택적으로 결합함으로써 자기공명영상 신호를 점점 검은색으로 나타내는 것으로 본 발명의 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자가 생체외 유방암 진단에 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.The results of FIG. 5 were consistent with the fluorescence expression results shown in FIG. 4, and as the degree of HER2 / neu receptor expression was gradually increased, the magnetic resonance imaging signal gradually became gray and black. In the case of BX-PC-3 cell line with low expression level (1 in FIG. 4), it was found to turn slightly darker than when using the control nanohybrid particles (control in FIG. 4), and as the expression level of the receptor was increased (BX -PC-3 cell line <MDA-MB-231 cell line <BT-474 cell line <NIH3T6.7 cell line) It was confirmed that the black color gradually. The iron oxide-herceptin nanohybrid particles selectively show magnetic resonance imaging signals by selectively binding to cell lines expressing the HER2 / neu receptor. The iron oxide-herceptin nanohybrid particles of the present invention can be used for diagnosing in vitro breast cancer. It could be confirmed.

<실시예 3><Example 3>

산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 생체 내에서의 종양 세포 선택성 확인Confirmation of Tumor Cell Selectivity in Vivo of Iron Oxide-Herceptin Nanohybrid Particles

누드마우스의 근위대퇴부에 형성된 HER2/neu 항원이 과발현된 세포주에 의해 형성된 종괴에 대한 표적 영상을 수행하기 위해 산화철-허셉틴 나노하이브리드(400㎍ Fe, n=5) 입자를 꼬리 정맥을 통하여 투여한 후 즉시, 1시간, 2시간, 4시간 시점에서 각각 영상하였다. 이 때 대조군 나노하이브리드 입자를 동일한 방법에 따라 영상한 것을 대조군으로 사용하였다.Iron oxide-Herceptin nanohybrid (400 μg Fe, n = 5) particles were administered through the tail vein to perform target imaging of a mass formed by a cell line overexpressed with HER2 / neu antigens formed in the proximal thigh of the nude mouse. Immediately, images were taken at 1, 2 and 4 hours. At this time, the control nanohybrid particles were imaged according to the same method was used as a control.

구체적인 영상 방법은 다음과 같았다. 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다(도 6). 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 234 x 234㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 4, 영상획득시간 6분. 상기 항원 특이성에 대한 자기공명영상 조영효과의 정량적 평가를 위해 T2 맵을 시행하였다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 234 x 234㎛, 절편두께 3mm, TR = 4000ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160ms, 영상여기횟수 2, 영상획득시간 4분.The specific imaging method was as follows. A 1.5 T (Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) system was used and a micro-47 coil was used. Coronal images were obtained with Fast Field Echo (FFE) pulse trains (FIG. 6). Specific parameters were as follows: resolution 234 x 234 μm, section thickness 0.6 mm, TE = 20 ms, TR = 400 ms, image excitation count 4, image acquisition time 6 minutes. T2 map was performed to quantitatively evaluate the magnetic resonance imaging contrast effect on the antigen specificity. Specific parameters were as follows: resolution 234 x 234 μm, section thickness 3 mm, TR = 4000 ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ms, image excitation count 2, image acquisition time 4 minutes.

도 6에 나타낸 바와 같이 대조군 나노하이브리드 입자를 사용한 경우 유방암 표지자 과발현 종양의 자기영상 신호는 나노하이브리드 입자 투여전과 후에 거의 변하지 않음을 관측할 수 있으며(도 6의 A), 이에 반해 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자를 사용할 경우 자기영상 신호가 점점 감소함을 알 수 있었다(도 6의 B). 이러한 결과를 정량분석하기 위해서 핵 스핀-스핀 이완(T2)값을 비교한 결과(도 6C) 대조군 나노하이브리드 입자의 경우 투여전과 후에 T2값 변화가 없는데 반해 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 투여 후에는 T2값이 계속하여 감소함을 확인하였다. 이는 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자가 유방암 표지자를 발현하는 종양에 선택적으로 결합하였음을 나타내는 것으로 본 발명에 따른 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자가 유방암 진단에 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6, it can be observed that magnetic control signals of breast cancer marker overexpressing tumors hardly change before and after nanohybrid particle administration when the control nanohybrid particles are used (FIG. 6A), whereas iron oxide-Herceptin nanohybrid It can be seen that the magnetic image signal is gradually reduced when the particles are used (B of FIG. 6). Nuclear spin-spin relaxation (T2) values were compared to quantify these results (FIG. 6C). The control nanohybrid particles showed no change in T2 values before and after administration, whereas T2 after administration of iron oxide-Herceptin nanohybrid particles. It was confirmed that the value continued to decrease. This indicates that the iron oxide-herceptin nanohybrid particles selectively bind to tumors expressing breast cancer markers, and it was confirmed that the iron oxide-herceptin nanohybrid particles according to the present invention can be used for diagnosing breast cancer.

<실시예 4><Example 4>

산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 생체 내에서의 종양 세포 선택성에 대한 조직면역염색학적 검증Tissue Immunostaining Verification of Tumor Cell Selectivity in Vivo of Iron Oxide-Herceptin Nanohybrid Particles

누드마우스에 있는 종괴(NIH3T6.7)를 분리한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정한 후 O.C.T compound(Sakura, Tokyo, Japan)를 이용하여 조직을 봉입하고 10㎛ 정도의 절편을 만든 후 면역염색을 시행하였다. 면역염색을 위한 일차항체는 허셉틴으로 하였고, 이차 항체로는 사람 면역글로불린(IgG ,IgA, IgM)의 Fc 부분에 대한 fluorescein-conjugated goat IgG fraction(ICN Biomedicals, Inc. Aurora, OH 44202)을 사용하였다. 혈관내피세포에 대한 면역염색을 위해서는 일차 항체로 purified anti-mouse CD31 (PECAM-1) (A Becton Dickinson Co.)을 사용하였고, 이에 대한 이차 항체로는 Cy5 goat anti-rat IgG+IgM (Biomeda corp.)을 이용하였다. 면역형광은 confocal microscopy(Olympus Optical, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였고 관련 결과를 도 에 나타내었다.Masses in nude mice (NIH3T6.7) were isolated and fixed with 4% paraformaldehyde. After fixation, tissues were sealed using O.C.T compound (Sakura, Tokyo, Japan), sections of about 10 ㎛ were prepared, and immunostaining was performed. The primary antibody for immunostaining was Herceptin, and the secondary antibody was a fluorescein-conjugated goat IgG fraction (ICN Biomedicals, Inc. Aurora, OH 44202) for the Fc portion of human immunoglobulins (IgG, IgA, IgM). . For immunostaining of vascular endothelial cells, purified anti-mouse CD31 (PECAM-1) (A Becton Dickinson Co.) was used as the primary antibody, and the secondary antibody was Cy5 goat anti-rat IgG + IgM (Biomeda corp). .) Was used. Immunofluorescence was analyzed using confocal microscopy (Olympus Optical, Tokyo, Japan) and the results are shown in the figure.

도 7에 나타낸 바와 같이 암세포가 녹색 형광을 발현하는 것으로 볼 때 본 발명에 따른 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자가 유방암 항원 과발현 종양 세포에 선택적으로 결합하여 유방암 진단에 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 7, when the cancer cells express green fluorescence, it was confirmed that the iron oxide-Herceptin nanohybrid particles according to the present invention can be selectively bound to breast cancer antigen overexpressing tumor cells and used for diagnosing breast cancer.

<실시예 5><Example 5>

난소암 진단용 산화철-PEG-폴산(folic acid) 나노하이브리드 입자의 제조Preparation of Iron Oxide-PEG-Folic Acid Nanohybrid Particles for Ovarian Cancer Diagnosis

폴산[(10mg/ml, in 10mM 인산완충용액, pH7.2) Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA] 100㎕를 취하여 에펜도르프 튜브에 담은 후, 0.2mg의 PEG를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시켜 양쪽 말단에 아민기를 갖고 있는 PEG의 한쪽 아민기를 폴산으로 치환시켰다. 과량의 폴산 분자들은 Sephadex G-25 column을 통해 제거한 후, 얻어진 PEG-폴산에 sulfo-SMCC를 첨가함으로써 말단 아민기를 말레이미드기로 치환시켰다. 다시 Sephadex G-25 column을 통해 과량의 sulfo-SMCC를 제거한 후 200㎕의 수용성 산화철 나노입자를 함유한 용액(10mM PB, pH 7.2, 2mg/ml)과 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Sephacryl S-300 column을 통하여 반응하지 않은 PEG-폴산과 수용성 산화철 나노입자를 제거한 후 센트리콘 여과 키트(centricon filtration kit)를 이용하여 약 2mg/ml의 농도로 농축시키는 과정을 통해 산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자를 제조하였다.Take 100 μl of folic acid [(10mg / ml, in 10mM phosphate buffer, pH7.2) Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA], put into eppendorf tube, add 0.2mg PEG at room temperature The reaction was carried out for 30 minutes to replace one amine group of PEG having an amine group at both ends with folic acid. Excess folic acid molecules were removed through a Sephadex G-25 column, and then the terminal amine group was substituted with a maleimide group by addition of sulfo-SMCC to the resulting PEG-folic acid. The excess sulfo-SMCC was removed through a Sephadex G-25 column and reacted with a solution containing 200 μl of water-soluble iron oxide nanoparticles (10 mM PB, pH 7.2, 2 mg / ml) at room temperature for 24 hours. After the reaction, the unreacted PEG-folic acid and water-soluble iron oxide nanoparticles were removed through a Sephacryl S-300 column, and then concentrated to a concentration of about 2 mg / ml using a centricon filtration kit. -PEG-folic acid nanohybrid particles were prepared.

<실시예 6><Example 6>

산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자를 이용한 생체외 난소암 진단In Vitro Ovarian Cancer Diagnosis Using Iron Oxide-PEG-Folic Acid Nanohybrid Particles

상기 실시예 5에서 제조된 산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자의 폴산 수용체에 대한 결합 특이성 및 효율을 분석하기 위하여 생체외 자기공명영상을 시행하였다.In vitro magnetic resonance imaging was performed to analyze the binding specificity and efficiency of the iron oxide-PEG-folic acid nanohybrid particles prepared in Example 5 to the folate receptor.

폴산 수용체 미발현, 발현 및 과발현 세포주들에 대하여 산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자를 반응시키는 과정은 다음과 같았다. 먼저 상기 세포주들을 실온에서 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 배양 중인 디쉬에서 분리하였다. 산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자를 107 세포를 포함하는 50㎕ PBS buffer에 철 기준으로 20㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 이것을 얼음에 약 30분 정도 두었다가 3 차례 세척하였다.The reaction of the iron oxide-PEG-folic acid nanohybrid particles to the folate receptor unexpressed, expressed and overexpressed cell lines was as follows. The cell lines were first isolated in culture dishes using 0.25% trypsin / EDTA at room temperature. Iron oxide-PEG-folic acid nanohybrid particles were added to 50 μl PBS buffer containing 10 7 cells at a concentration of 20 μg / ml based on iron. It was left on ice for about 30 minutes and washed three times.

자기공명영상을 이용하여 나노하이브리드 입자의 항원 특이성을 분석하기 위해 각각의 세포들을 PCR용 튜브로 옮긴 후 원심분리하여 세포를 가라앉혔다. 각 세포주들의 항원 특이성에 따른 자기공명영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다(도 8). 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6분. 항원 특이성에 대한 자기공명영상 조영효과의 정량적 평가를 위해 T2 맵을 시행하였다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TR = 4000ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160ms, 영상여기횟수 2, 영상획득시간 4분.In order to analyze the antigen specificity of the nanohybrid particles using the magnetic resonance imaging, each cell was transferred to a PCR tube and centrifuged to sink the cells. 1.5 T (Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) system was used to see the contrast effect of magnetic resonance imaging according to antigen specificity of each cell line, and micro-47 coil was used. Coronal images were obtained with Fast Field Echo (FFE) pulse trains (FIG. 8). Specific parameters were as follows: resolution 156 x 156 mu m, section thickness 0.6 mm, TE = 20 ms, TR = 400 ms, image excitation count 1, image acquisition time 6 minutes. T2 map was performed to quantitatively evaluate the magnetic resonance imaging contrast effect on antigen specificity. Specific parameters were as follows: resolution 156 x 156 μm, section thickness 0.6 mm, TR = 4000 ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ms, image excitation count 2, image acquisition time 4 minutes .

도 8에 나타낸 바와 같이 폴산 수용체 발현 정도가 증가함에 따라 (A431 세포주 < SKOV 세포주 < OVCAR 세포주) 자기공명영상 신호가 점점 검은색으로 변해가는 것을 확인할 수 있었다. 이는 산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자가 폴산 수용체를 발현하는 세포주에 선택적으로 결합함으로써 자기공명영상 신호를 점점 검은색으로 나타내는 것을 의미하는 것으로 본 발명에 따른 산화철-PEG-폴산 나노하이브리드 입자가 생체외 난소암 진단에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.As shown in FIG. 8, the magnetic resonance imaging signal of the folate receptor expression (A431 cell line <SKOV cell line <OVCAR cell line) gradually turned black. This means that the iron oxide-PEG-folic acid nanohybrid particles selectively show magnetic resonance imaging signals in black by selectively binding to cell lines expressing the folic acid receptor. The iron oxide-PEG-folic acid nanohybrid particles according to the present invention are ex vivo. It can be seen that it can be used to diagnose ovarian cancer.

<실시예 7><Example 7>

산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자의 유방암 세포 살상 효과 확인Confirmation of Breast Cancer Cell Killing Effects of Iron Oxide-Herceptin Nanohybrid Particles

실시예 1에서 제조된 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자가 유방암을 세포를 선택적으로 살상할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 트리판 블루 배제법(Trypan Blue Exclusion Assay)을 시행하였다.Trypan Blue Exclusion Assay was performed to determine whether the iron oxide-Herceptin nanohybrid particles prepared in Example 1 can selectively kill cells in breast cancer.

HER2/neu 항원 발현하는 세포(NIH3T6.7) 또는 미발현 세포(HeLa) 107개를 포함하는 배양액에 12.5, 25, 50, 100, 200㎍/ml 농도로 트리판 블루 염색을 수행하였고 이의 결과를 도 9에 나타내었다.Trypan blue staining was performed at 12.5, 25, 50, 100, 200 μg / ml concentrations in culture containing 7 7 HER2 / neu antigen-expressing cells (NIH3T6.7) or unexpressed cells (HeLa). Is shown in FIG. 9.

도 9에 나타낸 바와 같이 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자는 HER2/neu 항원 미발현 세포에는 어떠한 영향도 미치지 않는 반면에 HER2/neu 항원 발현 세포에 대해서는 25㎍/ml의 농도 이상에서부터 사멸시키는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 9, the iron oxide-Herceptin nanohybrid particles did not have any effect on the HER2 / neu antigen-expressing cells, whereas the HER2 / neu antigen-expressing cells were killed at a concentration of 25 µg / ml or higher. .

본 발명에 따른 나노하이브리드 입자는 수용액에서 안정적으로 분산 및 확산될 수 있어 종양 진단 및 치료의 효율성 및 정확성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 나노하이브리드 입자를 이용하여 한번에 종양을 진단하고 치료할 수 있다.The nanohybrid particles according to the present invention can be stably dispersed and diffused in an aqueous solution, thereby improving the efficiency and accuracy of tumor diagnosis and treatment. In addition, the nanohybrid particles according to the present invention can be used to diagnose and treat tumors at once.

Claims (14)

Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM'2O4, MxOy, (M 또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr 0<x≤3, 0<y≤5)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자성 물질, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자성 합금 물질 또는 상기 자성 물질 및 자성 합금으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 다성분 혼성 구조체를 포함하는 1 내지 1000nm 직경의 나노입자가 -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H 및 -OH로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용기를 포함하는 나노입자와 결합하는 부착영역, -SH, -NH2, -COOH, -OH, 에폭시, -에틸렌 및 -아세틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용기를 포함하는 교차연결영역 및 -SH, -COOH, -NH2, -OH, -NR4 +X-, -술포네이트, -니트레이트 및 포스포네이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 작용기를 포함하는 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 활성성분을 포함한 활성성분 결합영역을 포함하는 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있고, 상기 교차연결영역은 다른 다작용기 리간드의 교차연결영역과 교차연결되어 있으며, 상기 활성성분 결합영역에는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있고, 상기 종양마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 시냅토타그민 I의 C2, 아넥신 V, 인테그린, VEGF, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 소마토스타틴, 바소인테스티날 펩타이드, 암성 태아성 항원, HER2/neu 항원, 전립선 특이 항원 및 폴산 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 것을 특징으로 하는 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자.Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM ' 2 O 4 , M x O y , magnetic material selected from the group consisting of (M or M '= Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr 0 <x≤3, 0 <y≤5), CoCu, CoPt, FePt , Nanoparticles having a diameter of 1 to 1000 nm comprising a magnetic alloy material selected from the group consisting of CoSm, NiFe and NiFeCo or a multicomponent hybrid structure comprising two or more components selected from the magnetic material and the magnetic alloy. An attachment region for binding to a nanoparticle comprising a functional group selected from the group consisting of NH 2 , —SH, —CONH 2, —PO 3 H, —PO 4 H, —SO 3 H, —SO 4 H, and —OH, And -SH, -COOH, -NH 2 , -OH, -NR 4 + X and a crosslinking region comprising a functional group selected from the group consisting of SH, -NH 2 , -COOH, -OH, epoxy, -ethylene and -acetylene -, - sulfonate, - nitrate and phosphonate groups can be specific binding to the tumor marker containing functional groups selected from the consisting of It is surrounded by a multifunctional ligand comprising an active ingredient binding region including an active ingredient, wherein the cross linking region is cross-linked with the cross linking region of another multifunctional ligand, and the active ingredient binding region specifically includes a tumor marker. A substance capable of binding is bound, and a substance capable of specifically binding to the tumor marker is C2, annexin V, integrin, VEGF, angiopoietin 1, angiopoietin 2, synaptotagmine I, For diagnosing or treating tumors, characterized in that it is a substance capable of specifically binding to a tumor marker selected from the group consisting of somatostatin, vasointestinal peptide, cancerous fetal antigen, HER2 / neu antigen, prostate specific antigen and folic acid receptor Nanohybrid Particles. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항에 따른 종양 진단용 또는 치료용 나노하이브리드 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양 진단용 또는 치료용 조성물.A tumor diagnostic or therapeutic composition comprising the nanohybrid particles for diagnostic or therapeutic use according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 제 10항에 있어서, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 또는 치료용 조성물.11. The tumor diagnostic or therapeutic composition according to claim 10, formulated for intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous or topical administration. (1) 제 10항에 따른 종양 진단용 또는 치료용 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계; 및 (2) 상기 생체 또는 시료로부터 상기 나노하이브리드 입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 종양의 유무를 진단하는 단계; 또는 (3) 확인된 종양 세포를 선택적으로 살상하는 단계를 포함한 사람을 제외한 포유동물을 대상으로 한 종양의 진단방법 또는 치료방법.(1) injecting the tumor diagnostic or therapeutic composition according to claim 10 into a living body or a sample; And (2) diagnosing the presence of a tumor by sensing a signal emitted by the nanohybrid particles from the living body or sample; Or (3) a method for diagnosing or treating tumors in mammals other than humans, including selectively killing identified tumor cells. 제 12항에 있어서, 상기 신호를 감지하는 단계에서 자기공명영상 진단장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 사람을 제외한 포유동물을 대상으로 한 종양의 진단방법 또는 치료방법.The method for diagnosing or treating tumors in mammals other than humans according to claim 12, wherein a magnetic resonance imaging apparatus is used to detect the signals. 제 12항에 있어서, 신호가 발산되는 부분에 자기장을 걸어주어 열을 발생시켜서 종양 세포만을 선택적으로 살상하는 것을 특징으로 하는 사람을 제외한 포유동물을 대상으로 한 종양의 진단방법 또는 치료방법.The method for diagnosing or treating tumors in mammals other than humans according to claim 12, characterized in that only a tumor cell is selectively killed by applying a magnetic field to a portion where a signal is emitted to generate heat.
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