KR100839096B1

KR100839096B1 - 상심자 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물

Info

Publication number: KR100839096B1
Application number: KR1020060117293A
Authority: KR
Inventors: 박현; 윤용갑; 김윤철; 박길순
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2006-11-25
Filing date: 2006-11-25
Publication date: 2008-06-19
Also published as: KR20080047493A

Abstract

본 발명은 상심자(Mori Fructus)의 추출물을 함유하는 면역 활성 증강을 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 면역증강인자인 NO 분비 및 사이토카인 발현 증가 효과, 박테리아 탐식 효과(phagocytic effect)의 증강 효과, 여러 가지 보조자극분자(co-stimulatory molecule)의 발현 증가 및 TLR-4의 발현 효과, 선천성면역에 관계된 리셉터인 TLR-4(Toll-like receptor 4) 및 CD14의 발현 증가 효과 및 마우스 생체 내(in vivo mouse)내에서 면역글로블린(immunoglolubin) 증강효과 및 B 세포 및 T 세포의 활성능력을 갖는 상심자 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

상심자, 면역 활성, NO, T세포, 사이토카인, TLR-4, CD14,보조자극분자(co-stimulatory molecule), B 세포, 면역증강

Description

상심자 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물{Composition comprising the extract of Mori Fructus for immune activity}

도 1은 상심자 추출물(MF)을 농도 의존적으로 처리했을 때 마우스 일차 대식세포(PM) 및 RAW264.7 세포에서 NO 생성량을 나타낸 도이고,

도 2는 상심자 추출물(MF)을 농도 의존적으로 처리했을 때 마우스 일차 대식세포(PM) 및 RAW264.7 세포에서 TNF-알파의 분비 효과를 나타낸 도이며,

도 3 및 도 4는 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 마우스 일차 대식세포(PM)의 탐식활성(phagocytic acitivity)을 나타낸 도이고,

도 5은 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 마우스 일차 대식세포(PM)에서 보조자극분자(co-stimulatory molecule) 및 TLR-4 수용체의 발현량을 생체 내에서 비교한 도이며,

도 6은 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 TNF-알파의 발현에 TLR-4의 관련성을 나타낸 도이고,

도 7은 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 마우스 비장세포에서 세포 증식효과를 나타낸 도이며,

도 8은 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 마우스 비장세포에서 IFN-감마 분비 효과를 나타낸 도이고,

도 9은 생체 내에서 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 T세포 및 B세포의 활성을 나타낸 도이며,

도 10은 생체 내에서 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 IgG의 생성 을 나타낸 도이고,

도 11은 생체 내에서 상심자 추출물(MF) 투여에 의한 혈청 사이토카인(serum cytokine)의 분비를 나타낸 도이다.

본 발명은 상심자 추출물을 함유하는 면역 활성 증강을 위한 조성물에 관한 것이다.

면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 위시한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이적 면역(2차 방어선)은 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이중 특이성 면역계는 기억능 그리고 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다 (Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne. KUBY Immunology. 2000).

세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O2-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개 (cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로서, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다 ( Dawson, T. M. and Dawson, V. L. Annu . Rev. Med. 47, pp219-227. 1996).

백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당한다. 이중 대식세포는 많은 라이소솜을 가지고 있고 이들은 산성가수분해효소와 과산화 효소를 함유하고 있다. 또한 유리면과 플라스틱 표면에 강하게 부착하는 성질이 있으며 미생물이나 종양세포 등을 활발하게 탐식한다. 상기 세포는 IFN-γ등의 사이토카인 수용체를 가지고 있다. 이들은 보체성분, 인터페론, 인터루킨-1 및 종양괴사인자 같은 사이토카인을 생산하며 T-세포로부터 생산되는 여러 가지 사이토카인에 의해 기능이 증강될 수 있다. 백혈구의 일종인 T-세포는 혈중 소림프구의 약 70%를 차지한다. T-세포는 흉선에서 분화되며 T-세포항원수용체(TCR)를 갖는다. 말초혈액 T-세포는 CD4 양성인 TH 세포(helper T-cell)와 CD8 양성인 TC 세포(cytotoxic T-cell)로 나뉘며, CD4+ TH 세포는 MHC II 급(class) 분자에 결합된 항원을 인식하여 활성화되며, B세포를 도와서 항체생성을 가능하게 하거나 다른 T 세포의 기능을 돕는다. CD4+ TH 세포는 다시 그들이 생산하는 사이토카인을 근거로 TH1 및 TH2로 분류할 수 있다. 실험용 생쥐(mouse)의 TH1세포는 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFN-γ) 등을 분비하는 반면에 TH2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 등을 분비한다. 그러나 사람에 있어서는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-13의 생성이 엄격히 구분되지 않는다. TH1세포는 세포면역반응에 관여하며 세포독성 및 염증성 반응을 활성화한다. TH2 세포에서 생성된 사이토카인은 항체형성을 촉진시키는데, 특히 IgE의 생성을 도우며 호산구의 증식과 기능을 증강시키므로 TH2 사이토카인은 항체생성 및 알레르기 반응에서 흔히 발견된다. TH1 과 TH2 사이토카인은 서로간 억제기능을 가지고 있고, 동물의 감염증에서 항 IL-4 항체와 항 IFN-γ항체로 질환의 경과를 변화시킬 수 있음이 밝혀졌으며, 류마티스 관절염의 환자에 IFN-γ를 주사하여 증상의 호전이 관찰된 예도 있다 (Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt, Barbara A. Osborne. KUBY Immunology. 2000).

한의학에서 뽕나무 잎을 상엽(桑葉)이라 하고, 뿌리를 상근(桑根), 뿌리껍질을 상백피(桑白皮), 가지를 상지(桑枝), 열매를 상심자(桑甚子), 잎에서 나오는 유액을 상엽즙(桑葉汁), 껍질에서 채취된 유액은 상피즙(桑皮汁)이라 하며 목재를 태운 재를 상시회(桑柴灰)라고 한다. 뽕나무와 관련된 약재는 대체로 독성이 강하지 않아서 안전하게 사용할 수 있으며, 체내에 쌓인 좋지 않은 열(熱)을 없애는데 효과가 있어 고혈압과 당뇨병에 응용되고 있다(강병수 등, 본초학, 영림사, 서울, 한국, 2000).

상심자(오디)는 뽕나무과(Moraceae)에 속한 낙엽교목인 뽕나무(Morus alba L.)의 열매가 자홍색을 나타낼 때 채취하여 건조한 후 한약재로 사용되며 한방에서는 어지러움과 이명, 구갈, 소갈 등의 치료에 이용하는 것으로 알려져 있으며(강병수 등, 본초학, 영림사, 서울, 한국 2000), 일본에서는 양혈거풍의 효능과 풍열을 다스리며 강장, 진통약, 불면증, 이명, 어지러움, 요통, 변비 등의 치료에 응용하는 것으로 알려져 있다(Namba, T., The Encyclopedia of Wakan-Yaku with Color Pictures Vol. 1 Hoikusha, Osaka, Japan, 1993). 동의보감에는 소갈을 다스리고 오장을 이롭게 하며 뽕나무의 정(精)이 모여 있다고 적고 있다(동의보감국역위원회, 동의보감, 남산당, 서울, 한국, 2000). 하지만 상심자의 면역 증강 효과에 대한 작용은 아직까지 밝혀진 바 없다.

이에 본 발명자들은 천연약품자원으로부터 면역 증강 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 본 발명의 상심자 추출물의 면역증강 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생체에 독성이 없고 면역 증강 효과를 나타내는 상심자 추 출물을 함유하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상심자(Mori Fructus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 상심자 추출물은 하기와 같은 제조공정으로 제조될 수 있다.

건조시킨 상심자를 통상적인 추출방법에 따라 제조할 수 있으며, 예를 들어, 건조된 상심자 건조 중량의 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매, 바람직하게는 물을 가하여 0.5 내지 10시간, 바람직하게는 2 내지 5시간씩 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회 반복하여 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 및 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수 추출한 후, 추출액을 여지로 감압 여과한 다음, 여과액을 농축하여 동결건조한 후 본 발명의 상심자 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 상심자 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 면역 증강용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 화학요법 및 방사선요법과 같은 항암요법에 의한 면역기능의 저하 또는 골수이식 후 면역저하로 인한 질환, 면역계손상으로 인한 에이즈 및 면역기능의 저하로 인한 암질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기 상심자 추출물을 함유하는 면역저하증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 면역력 저하 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한점이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 상심자 추출물의 제조

상심자를 자연 건조시킨 후 잘게 세절하여, 건조된 상심자 2kg에 증류수 4ℓ을 가하여 100℃에서 가열추출을 2회 행한 후, 여과하고 감압 농축하여 동결건조한 후, 상심자 추출물 50g을 수득하였다.

참고예 1. 마우스로부터 일차대식세포( murine peritoneal macrophage)의 분리

C57BL/6N 마우스의 복강 내로 3% 브리워 티오글리콜래트 메디움(Brewer thioglycollate medium; BECTON DICKINSON DCM Thioglycollate medium. Brewer modified) 1ml를 세포 수확 4-7일 전에 주입 한다. 70% 알콜로 마우스의 스킨을 멸균한 다음 마우스 복강 내로 멸균된 PBS를 5-10ml 주입한 후, 19gauge 멸균 주사기로 복강 내 세포를 꺼낸다. 1200rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 세포을 펠레 팅(pelletting)한 후, 적혈구를 제거하기 위해 멸균증류수로 적혈구를 용해(lysis)한 후, 세포 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 일차 대식세포만을 분리하고 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 세포수를 카운팅(counting) 한다.

실험예 1. NO 분비 효과 및 TNF -알파 분비 효과 확인

NO 분비효과를 측정하기 위하여 아질산 이온(NO₂-)의 농도는 NaNO2를 기준으로 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하여 발색정도를 하기와 같이 측정하였다.

RAW 264.7 세포(ATCC The Global Bioresource Center TM)를 96웰 마이크로플레이트에 웰 당 1×105 씩 분주하고 상기 참고예 1의 마우스 일차 대식세포를 3×105씩 분주한 후, 농도 의존적으로(5, 10, 25, 50 및 100 μg/㎖) 상기 실시예 1에서 수득한 상심자 추출물을 처리한 후, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 또는 48시간 배양한 후, 상층액을 취하여, 100㎕의 세포 배양 상층액에 동량의 그리스 시약(Griess reagent, 0.1% (w/v)N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride + 1% (w/v) sulfanilamide in 5%(v/v)phosphoric acid)을 넣고 혼합한 다음, 상온에서 10분 두었으며, 그 후 울트로스펙 4000 스펙트로포토메터 (Pharmacia Biotech사, Uppsala, Sweden)를 사용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다(Nakai M, Sudo K, Yamada Y, Kojima Y, Kato T, Saito K, Moriwaki H, Seishima M, Dig Dis Sci. Sep ;50(9), pp1669-1676. 2005).

상기 실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이, RAW 264.7세포 및 일차 대식세포 모두에서 공통적으로 아질산 이온(NO₂-)의 농도가 증가하였다.

또한 같은 조건에서 50㎕의 세포 배양 상층액을 취하여 염증 매개물질(inflammatory mediator)인 TNF-알파(tumor necrosis factor-α)의 ELISA 검사를 실시하였다 (R&D Systems Quantikine Mouse TNF-α/TNFSF1A kit., Vilc다 J. and T. H. Lee. J. Biol . Chem , 266, p7313, 1991).

상기 실험결과, 도 2에 나타난 바와 같이, RAW 264.7세포 및 일차 대식세포 모두에서 공통적으로 염증 매개물질(inflammatory mediator)인 TNF-알파가 증가하였다.

실험예 2. 탐식활성 ( phagocytic activity) 증강 효과

상기 참고예 1의 마우스 일차 대식 세포(murine peritoneal macrophage)에 상심자 추출물 50ug/ml 및 내독소 베이스(endotoxin base)량을 리물루스 변형세포 용해물 분석법(kinetic terbidometric Limulus Amoebocyte lysate assay)(Friedl, R., Moeslinger, T., Kopp, B. & Spieckermann, P.G.Br J Pharmacol ., 134, pp1663-1670. 2001)을 실시하여 정량한 결과 0.246 EU/g 이였으며, 이 내독소 베이스에 해당하는 량을 계산하여 10. 65EU/g의 양을 음성대조군으로 처리하였다. 양성대조군으로 LPS 0.5ug/ml를 48시간 동안 처리하였다. PBS로 세척한 후, 1×105 세포를 FITC가 부착된 폴리스틸렌 입자(polystyrene particle)를 넣어준 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 배양한 후, FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석 을 실시하였다 (BD FACS calibur, Lin Y. L., Liang Y. C., Lee S. S. and Chiang B. L. J., Leukocyte. Biology, 78, p533, 2005).

상기 실험결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 음성대조군인 내독소 베이스(endotoxin base; ET(B)) 및 아무것도 처리하지 않은 것(Con)을 비교하면 상심자 추출물을 처리한 세포는 탐식 활성(phagocytic activity)이 양성 대조군인 LPS와 유사한 정도로 증가하였다.

실험예 3. 보조자극분자(co-stimulatory molecule) 및 TLR -4 발현

상기 참고예 1의 마우스 일차 대식세포(primary macrophage) 1 x 106 세포에 상기 실시예 1에서 수득한 상심자 추출물 100μg/ml을 24시간 처리한 뒤, 1% BSA로 블로킹(blocking) 하고 다양한 세포 표면 항체 (Fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-mouse MHC class II (I-A/I-E), Fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-mouse CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), PE-anti-mouse Toll-like receptor 4(TLR4)/MD-2, and PE-anti-mouse CD14. Isotype-matched controls were phycoerythrin (PE) Rat IgG2a (eBioscience, Inc.))로 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석을 실시하였다. 각 항체의 양은 0.25μg/1 x 106로 처리한 후, LPS 10μg/ml 처리한 양성 대조군과 비교하여 결과를 분석하였다(Lin Y. L., Liang Y. C., Lee S. S. and Chiang B. L. J., Leukocyte. Biology, 78, p533, 2005).

상기 실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 항원제시(antigen presentation) 세포에서 발현하는 B7 분자인 CD86과 CD80의 발현이 상심자 추출물 처리 시 음성대조군(endotoxin base)에 비해 증가하였고 TLR-4수용체와 LBP 복합체(Lipopolysaccharide Binding Protein complex)의 공통수용체(co-receptor)인 CD14의 발현이 현저히 증가하였다.

실험예 4. 상심자 추출물에 의해 유도된 TNF -알파 발현에 TLR -4의 역할

상기 참고예 1의 1.5× 105 의 일차대식세포를 20ug/ml의 마우스 TLR-4 mAb( TLR-4/MD2) 또는 CD14 mAb로 한 시간 동안 전 처리 한 후, 음성대조군으로 내독소 베이스(endotoxin base)를 처리하고 양성 대조군으로 LPS (0.05ug/ml)을 처리한다. 상기 실시예 1에서 수득한 상심자 추출물은 10ug/ml 및 50ug/ml의 농도로 24시간 처리한다. 항체(isotype-matched control)는 실험에 대한 control로써 처리 한다 (Akshi, S., H. Ogata, et al., Biochem Biophys Res Commun, 268(1), pp172-177, 2000).

상기 실험결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, 분비된 TNF-알파의 양이 음성대조군에 비해 TLR-4 또는 CD14 항체에 의해 현저하게 저해되었으며, 그 변화는 두 항체를 함께 처리했을 때 더욱 효과가 증대되었다. 따라서 상심자 추출물에 의한 마우스 일차 대식세포의 TNF-알파의 분비가 TLR-4를 경유함을 확인할 수 있었다.

실험예 5. IFN -감마 분비능 및 세포 증식에 미치는 영향

마우스로부터 비장을 취하여 분별하지 않은 비장세포를 분리한 다음, 96 웰 마이크로 플레이트에 1 x 106 비장세포를 분주한다. 상기 실시예 1에서 수득한 상심자 추출물을 농도 의존적으로(5, 10, 25, 50 및 100μg/ml) 24시간 동안 처리하고, 분비된 IFN-감마(interferon_γ)는 ELISA를 실시하여 확인하였다. 또한, 마우스 비장세포의 증식을 MTS 법(CellTiter96™ AQueous Assay)을 통해 콘에이(Con A)의 농도에 따라 측정하였다 (Wang, M., Guilbert, L.J., Li, J., Wu, Y., Pang, P., Basu, T.K. & Shan, J.J. Int Immunopharmacol , 4 , pp311-315. 2004).

상기 실험결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 상심자 추출물은 음성 대조군에 비해 세포증식을 Con A의 존재에 무관하게 증가시켰으며, 도 8에 나타난 바와 같이, IFN-감마의 분비도 증가시켰다. 따라서 상심자 추출물은 선천면역 뿐만 아니라 후천면역에 중심세포인 T 세포의 면역에도 관여함을 알 수 있었다.

실험예 6. 생체 내(In vivo )에서 T세포 및 B세포의 활성, IgG 생성 및 혈청 사이토카인(serum cytokine ) 생성에 미치는 영향

7주령의 C57BL/6N 마우스에 상기 실시예 1에서 수득한 상심자 추출물, 음성대조군인 백지 추출물(AD) (대학 한약국, 익산) 및 PBS를 100mg/kg의 농도로 10일 동안 경구 투여한 후, 비장세포를 분리하여 CD3 및 CD28 항체로 이중 염색(staining)하여 T세포의 활성을 확인하고 CD19 및 CD40 항체를 이용하여 B세포의 활성을 FACS로 분석하였다. 또한 마우스의 심장으로부터 혈액을 체취하여 혈청만을 얻어 혈청내의 면역글로블린(immunoglobulin)의 양을 ELISA로 확인하고, 혈청내 사이토카인량을 Th1/Th2 사이토카인 CBA 키트(Th1/Th2 cytokine CBA kit)를 이용하여 FACS로 분석하였다 (Bishop, J.E. and K.A. Davis. J., Immunol . Methods, 210, pp79-87. 1997).

상기 실험결과, 도 9에 나타난 바와 같이, B세포의 활성이 확인되었으며, 도 10에 나타난 바와 같이, 혈청내 면역글로블린 G1(immunoglobulin G1)의 변화는 없었지만 IgG2a의 현격한 증가가 상심자 추출물을 처리 마우스에서 확 되었다. 또한, 도 11에 나타난 바와 같이, 생체 내(In vivo)에서도 타입 1 사이토카인(Type 1 cytokine)인 TNF-알파의 증가를 확인하였다. 따라서 상심자 추출물의 경구 투여는 선천면역 뿐만 아니라 후천면역세포인 B세포의 활성에 기여하여 면역력 증강의 지표인 항체의 증가를 가져오며 이러한 반응에 타입 1 면역반응(Type 1 immune response)이 관여함을 TNF-알파의 증가로 확인하였다.

실험예 7. 경구투여 독성실험

4주령의 ICR 마우스 (오리엔트바이오, Japan)를 사용하여 급성독성실험을 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실시하였다 (Haschek WM and Rousseaux CG, Handbook of toxicologic pathology, Published by Academic press, Inc., New York, pp294-295, 1991).

각 군 (5마리/군)에 상기 실시예 1에서 수득한 상심자 추출물을 용해시켜 5g/kg/10㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 본 발명의 혼합생약추출물을 투여한 후, 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시 하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부 를 관찰하였다.

상기 실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 20 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제 를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 3 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 10 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2974 ㎎

Na2HPO4·12H2O 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 20 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 1000㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 상심자 추출물 100㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 상심자(Mori Fructus)의 추출물은 면역증강인자인 NO 분비 및 사이토카인 발현 증가 효과, 박테리아 탐식 효과(phagocytic effect)의 증강 효과, 여러 가지 보조자극분자(co-stimulatory molecule)의 발현 증가 및 TLR-4의 발현 효과, 선천성면역에 관계된 리셉터인 TLR-4(Toll-like receptor 4) 및 CD14의 발현 증가 효과 및 마우스 생체 내(in vivo mouse)내에서 면역글로블린(immunoglolubin) 증강효과 및 B 세포 및 T 세포의 활성능력을 나타내는바, 면역 저하 및 면역계가 손상된 환자에게 면역력 증강을 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

Claims

상심자(Mori Fructus) 물 추출물을 함유하는 면역 증강용 약학조성물.
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상심자 물 추출물을 함유하는 면역저하증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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