KR100838323B1 - 비스페놀ａ 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한검출방법 - Google Patents

비스페놀ａ 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비스페놀A 유사체와 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 폴리클론항체를 전극에 고정시키며, 상기 전극이 전도성고분자로 구성된 나노입자층으로 코팅된 임피던스 면역센서를 이용하면 인간혈청시료 등에 존재하는 흔적량의 비스페놀A를 별도의 표식물질 없이도 직접적으로 간단하고 민감하게 검출할 수 있다.
비스페놀A, 임피던스, 면역센서, 폴리클론항체, 전도성고분자

Description

비스페놀Ａ 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한 검출방법{Impedimetric immunosensor for detecting bisphenol A and detecting method using the same}
도 1은 본 발명에 따른 임피던스 면역센서의 개략도를 나타낸 것이고,
도 2는 QCM 분석 결과를 나타낸 것이고(a: 폴리클론항체 고정시, b: 폴리클론항체-항원 간의 면역반응시, c: 비특이적 폴리클론항체를 제거한 후 폴리클론항체-비스페놀A 간의 면역반응시, d: 전극 표면의 블로킹 전 폴리클론항체-항원 간의 면역반응시),
도 3은 폴리클론항체 고정 전후의 임피던스 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 4에서 A는 비스페놀A의 농도를 증가하면서 측정한 임피던스 변화에 대한 Bode plot을 나타낸 것이고, B는 임피던스 변화와 주파수 간의 상관관계를 나타낸 플롯이고, C는 비스페놀A 검출용 캘리브레이션 플롯이고,
도 5는 인간혈청시료에 본 발명에 따른 임피던스 면역센서를 적용하여 표준물 첨가법으로부터 얻어진 캘리브레이션 플롯을 나타낸다.
<도면부호>
101: 유리탄소전극 103: 나노입자층
105: 폴리클론항체층 107: 항원 또는 비스페놀A
본 발명은 인간혈청시료 등에 존재하는 흔적량의 비스페놀A를 별도의 표식물질 없이도 직접적으로 간단하고 민감하게 검출할 수 있는 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
최근, 폴리카보네이트 플라스틱이나 음식캔의 에폭시 수지 등으로부터 비스페놀A와 같은 내분비장애물질(endocrine-disrupting compounds; EDCs)이 유리되므로 내분비적인 관심이 높아지고 있다.
비스페놀A는 내분비호르몬, 에스트로겐 및 안드로겐과 유사한 효과를 나타내므로, 많은 동물에서 생식기계통뿐 아니라 중추신경계에도 영향을 미친다. 이러한 비스페놀A의 내분비 활성에 관한 많은 연구가 진행되고 있다.
비스페놀A는 에스트로겐 수용체 알파 및 베타 둘 다에 결합하여 에스트로겐과 유사하게 MCF-7 세포를 발현하는 에스트로겐 수용체의 증식을 유도한다. 또한, 비스페놀A는 정자수의 감소를 포함한 생식기 장애, 태아 노출에 따른 선천성 결손증, 전립선암, 고환암 및 유방암과 같은 다양한 암질환을 초래할 것으로 예측되며, 뇌와 심혈관계에서 다면발현성 활성을 나타낸다. 따라서, 환경에서 소량의 비스페놀A를 간단하면서도 선택적으로 그리고 민감하게 분석하는 방법의 개발이 매우 중요하다.
비스페놀A의 검출을 위해 가장 흔히 사용되는 방법으로는 질량분석법과 접목 된 가스크로마토그래피, 전기화학적 검출과 접목된 액체크로마토그래피, 질량분석법과 접목된 액체크로마토그래피가 있다.
이들 방법들은 높은 민감성과 특이성을 나타내지만, 시간을 낭비하는 전처리단계를 필요로 하므로 많은 시료들의 신속한 처리를 허락하지 않으며, 게다가 복잡하고 고가이며 즉각적인 현장의 측정에는 사용될 수 없다.
최근에는 비스페놀A 검출의 전통적인 방법인 크로마토그래피법의 대안으로, 값싸고 신속한 바이오에세이 방법들이 개발되고 있다. 대표적으로 간단하고 정확한 검출방법인 면역에세이가 있다.
박테리아 자성입자(bacterial magnetic particles; BMPs)에 화학적으로 결합된 폴리클론항체를 이용한 면역에세이 시스템 또는 표면 플라즈몬공명(surface plasmon resonance; SPR)에 기초한 경쟁적 면역에세이가 보고되어 있다.
또, 다양한 효소결합면역흡수법(enzyme-linked immunosorbent assays; ELISA)이 비스페놀A의 검출을 위해 사용되고 있다. 그러나, 일반적인 ELISA법은 복잡한 다단식 공정이고, 고가이며 현장에서 사용하기 곤란한 문제가 있다. 일반적인 면역에세이 공정의 대안으로, SPR에 근거한 광면역센서 및 내부전반사형광(total internal reflection fluorescence; TIRF)이 새로운 방법으로 사용되고 있다. 그러나, 광면역센서는 시간 낭비적인 다단계법이며 크고 고가의 장비를 필요로 하므로, 다른 기술과 비교하여 효과적이지 못하다.
따라서, 비스페놀A를 현장에서 민감하고, 선택적이면서도 값싼 비용을 지불하여 검출할 수 있는 임피던스 면역센서의 개발이 요구되며, 이러한 관점에서 전기 화학적 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서는 광면역센서의 잠재적인 대안으로 될 수 있으며, 특히 지금까지 전기화학적 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서에 관한 어떠한 보고도 없었다.
전기화학적 면역센서는 비스페놀A의 실시간 즉각적인 모니터링을 제공할 수 있고 특히 생체 액에 존재하는 흔적량의 비스페놀A를 검출할 수 있다.
이러한 면역센서 개발과 관련하여 전위차측정법, 전류측정법, 전도율측정법에 근거한 전기화학적 기술의 개발을 조사해 왔고, 전류측정법 면역센서는 항원으로 표식된 효소와 같은 분석물질의 간접적인 측정을 위하여 폭넓게 이용되고 있다. 그러나, 효소 표식 절차는 시간 소비적이고 복잡하며 여러 공정이 요구된다.
한편, 표식없는 직접적인 전기화학적 면역센서는 전극표면에 형성된 면역복합체에 대한 전자적 또는 계면적 특성에서의 변화를 관찰하여 친화력을 측정하기 위한 매력적인 접근이다. 따라서, 전기화학적 면역센서에서의 직접적인 검출 접근이 센싱 프로토콜을 간소화시킨다.
예를들어, 생체인식 공정에 있어서 전기화학 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy; EIS)이 적용된 사례가 있고, EIS를 사용하여 DNA 하이브리다이제이션 측정, 히스티딘 태그 단백질 측정, 다른 면역센서 및 DNA-단백질 상호작용을 연구해 왔다. 그러나, 임피던스 면역센서를 이용한 비스페놀A의 표식을 사용하지 않는 직접적인 검출은 아직까지 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자는 비스페놀A 유사체와 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 폴리클론항체를 전극에 고정시키며, 상기 전극이 전도성고분자로 구성된 나노입자층으로 코팅된 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 표식물질을 사용하지 않는 임피던스 면역센서를 제작하여 인간혈청시료에 함유된 흔적량의 비스페놀A를 직접적이고 간단하며 고감도로 검출할 수 있는 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비스페놀A 유사체와 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 폴리클론항체를 전극에 고정시키며, 상기 전극이 전도성고분자로 구성된 나노입자층으로 코팅된 것을 특징으로 하는 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서를 제공한다.
상기 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서는 금전극 또는 유리탄소전극에서 선택된 전극; 상기 전극의 표면에 전해중합반응을 통하여 결합되는 전도성고분자로 이루어지는 나노입자층; 및 상기 전도성고분자의 카르복실기와 공유결합에 의해 고정되는 폴리클론항체층으로 구성된다.
폴리클론항체를 생산하기 위한 항원으로 비스페놀A를 단독으로 사용하게 되면 면역반응을 개시할 수 없어 단백질과의 결합체를 사용해야 한다. 그러나, 비스페놀A의 히드록시기 중 하나와 단백질의 아미노기 간의 결합시 비스페놀A의 구조가 변화되어 낮은 선택성을 나타내게 되는 문제가 있다.
이에, 본 발명에서는 비스페놀A가 아닌 비스페놀A 유사체 예를들어, 히드록시페닐발레인산(hydroxyphenylvaleric acid)의 말단에 있는 카르복실기를 이용하여 단백질과 결합시키고, 이렇게 얻어진 결합체를 항원으로 사용하여 폴리클론항체를 생산함으로써 비스페놀A 사용으로 인한 문제를 해결하였다.
상기 비스페놀A 유사체로는 히드록시페닐발레인산, 2,4-디니트로페놀, p-니트로페놀, o-니트로페놀, 2,6-디메틸페놀 및 2,4-디클로로페놀로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용한다.
또, 상기 단백질로는 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 헤모시아닌, 오브알부민 등을 사용하며, 바람직하게는 소혈청알부민을 사용한다.
또, 상기 전도성고분자로는 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid), 디아미노터티오펜(diamino-terthiophen), 터티오펜 유사체(terthiophen salene analogues) 또는 포르밀터티오펜(formyl terthiophen)을 사용하며, 바람직하게는 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산을 사용한다.
또, 상기 나노입자층은 종래 알려진 방법(Anal . Chem ., 73, 5629-5632, 2001; Anal . Chem ., 77, 4854-4860, 2005)에 따라 전해중합반응을 통해 전도성고분자를 전극에 코팅함으로써 제작되며, 1 V/s의 주사속도로 성장한 나노입자의 입자경이 5 내지 40 nm이고, 나노입자층의 두께가 20 내지 300 nm, 바람직하게는 200 nm이다. 이러한 전도성고분자로 코팅된 나노입자층의 나노입자들은 최대표면적을 지니므로 나노입자층에 폴리클론항체가 고정되는 것을 도와준다.
본 발명에 따른 임피던스 면역센서에 있어서, 나노입자층에 대한 폴리클론항체의 고정화 및 폴리클론항체와 비스페놀A 간의 상호작용은 미량수정저울(quartz crystal microbalance; QCM) 및 전기화학적 임피던스 분석(electrochemical impedance spectroscopic technique; EIS) 기술을 이용하여 검토하였다.
이러한 임피던스 면역센서 표면에서 관찰된 특정 면역 상호작용에 따른 임피던스 변화를 이용하여 비스페놀A를 측정할 수 있고, 이때 폴리클론항체의 함량이 200-300 ng이고, pH가 5-9이며, 면역반응측정온도가 15-50℃인 것이 고감도 및 고선택도로 비스페놀A를 간단하게 측정할 수 있어 바람직하다.
특히, 본 발명에 따른 임피던스 면역센서는 현장에서 0.3 ng/ml의 비스페놀A까지도 효과적으로 감지할 수 있는 매우 감도가 뛰어난 것으로, 비스페놀A의 검출을 위해 현재까지 일반적으로 고가의 복잡한 기기를 사용하는 고성능액체크로마토그래피와 유사한 검출한계를 나타낸다.
또한, 본 발명은 비스페놀A 유사체와 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 상기 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 폴리클론항체를 제조하는 단계; 전극에 전도성고분자를 함유하는 나노입자층을 코팅하는 단계; 상기 나노입자층에 상기 폴리클론항체를 고정하는 단계; 상기 나노입자층에 남아있는 비특이적 폴리클론항체의 흡착을 제거하는 단계; 및 비스페놀A와 폴리클론항체 간의 항원항체반응을 수행하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비스페놀A의 검출방법을 제공한다.
상기 결합체는 비스페놀A 유사체의 카르복실기를 활성화하는 단계 및 상기 활성화된 비스페놀A 유사체의 카르복실기와 단백질의 아민기를 공유결합하는 단계 를 거쳐 제조되며, 이때 활성화는 카르보디이미드 또는 N-히드록시숙신이미드에서 선택된 하나 이상의 화합물에 의해 수행된다.
상기 나노입자층은 종래 알려진 방법(Anal . Chem ., 73, 5629-5632, 2001; Anal. Chem ., 77, 4854-4860, 2005)에 따라 전해중합반응을 통해 전도성고분자를 전극에 코팅함으로써 제작되며, 1 V/s의 주사속도로 성장한 나노입자의 입자경이 5 내지 40 nm이고, 나노입자층의 두께가 20 내지 300 nm, 바람직하게는 200 nm이다.
나노입자층에 폴리클론항체를 고정하는 단계는 나노입자층에 존재하는 전도성고분자의 카르복실기를 카르보디이미드 또는 N-히드록시숙신이미드에서 선택된 하나 이상의 화합물을 이용하여 활성화하고, 활성화된 카르복실기와 폴리클론항체의 아민기 간의 공유결합을 통해 폴리클론항체가 나노입자층에 고정된다.
상기 나노입자층에 남아있는 비특이적 폴리클론항체의 흡착을 제거하기 위하여 인산완충액으로 먼저 세정하여 약하게 흡착된 항체를 제거하며, 트윈20 및 젤라틴을 함유한 인산완충액(PBSTG) 및 소혈청알부민 용액에서 반응시켜 비특이적으로 흡착된 항체를 제거한다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 임피던스 면역센서 제작
1) BHPVA-BSA 결합체 제조
4,4-비스(4-히드록시페닐)발레인산[4,4-bis(4-hydroxyphenyl)valeric acid; BHPVA]를 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)과 결합시켜 마우스 면역화에 이용하였다.
BHPVA와 BSA를 결합하기 위하여, 먼저 NHS(N-hydroxysuccinimide) 및 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide]를 이용하여 BHPVA의 카르복실기를 활성화되었다. 즉, 7.0 mg의 BHPVA, 3.5 mg의 NHS 및 5.9 mg의 EDC를 칭량하여 디메틸설폭사이드(DMSO) 1.0 ml에 용해시키고 2시간 동안 교반하면서 반응을 수행하였다.
BSA 용액은 0.1 M NaHCO3 용액(HCl을 이용하여 용액의 pH를 7.0으로 조정함) 4.0 ml에 45 mg의 BSA를 용해시켜 제조하였다. BSA 용액에 BHPVA-NHS-EDC 용액을 한방울씩 가하면서 교반하고, 25℃의 온도에서 2시간 동안 반응을 수행한 후, 4℃에서 24시간 동안 0.01 M PBS로 투석하였다. 또, 상기 용액을 물을 8번 바꿔가며 48시간 동안 순수로 투석하였다. 마지막으로, 상기 용액을 동결건조하여 얻은 백색결정을 -20℃에서 보관하였다.
2) 폴리클론항체의 생산 및 정제
4주령 Balb/C 마우스 3마리를 사용하여 면역화하였다. 각 마우스에 프로인트완전보조제(Freund's complete adjuvant; FCA) 또는 프로인트불완전보조제(Freund's incomplete adjuvant; FIA)에 현탁된 BHPVA-BSA 결합체 4 mg을 0일째, 11일째, 23일째, 34일째 총 4회에 걸쳐 복강내 주사하여 면역화하고 45일째 꼬리정맥에서 채혈하였다.
첫번째 면역반응은 FCA에 현탁된 1.5 mg의 BHPVA-BSA 결합체를 항원으로 이용하였고, 이후 3차례에 걸친 면역반응에서는 FIA로 현탁된 BHPVA-BSA 결합체 0.5, 1.0 및 1.5 mg을 각각 항원으로 사용하였다.
항혈청의 항체가(titre)는 마이크로플레이트에 코팅된 BHPVA-BSA를 이용하여 ELISA로 측정되었다. 그 결과 얻어진 폴리클론항체를 modified caprylic acid-saturated ammonium sulfate(SAS)법으로 정제하였다.
3) 전도성고분자를 함유하는 나노입자층의 제조
0.1 M TBAP(tetrabutylammonium perchlorate, electrochemical grade; Fluka)/CH2Cl2(99.8%, anhydrous, sealed under N2 gas; Sigma)용액에 용해된 0.1 mM의 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복실산(TTCA) 단량체를 이미 알려진 방법으로 1000 mV/s에서 세차례에 걸쳐 0 내지 1.6 V 사이로 순환적으로 전위변화를 일으켜 유리탄소전극 위에 나노입자층을 만들었다(Biosens . Bioelectron ., 19, 1565-71, 2004; Biosens . Bioelectron ., 21, 257-65, 2005; Anal . Chem ., 77, 4854-4860, 2005).
과량 사용된 단량체를 CH2Cl2으로 세척하여 제거하였다. 그리고, 사용된 TTCA 단량체는 이미 알려진 방법에 의해 제조되었다(Synth . Met ., 126, 105-110, 2002). 이때, 나노입자층의 두께는 200 nm이었다.
상기 유리탄소전극 표면에 형성된 나노입자의 양을 측정하기 위하여 QCM(quartz crystal microbalance; SEIKO EG&G model QCA 917 및 PAR model 263A Potentiostat/Galvanostat 사용) 분석을 실시하였다.
그 결과, 주파수 변화(△f)가 0.96±0.04 kHz이었고, 공지의 식(Anal. Chem., 73, 5629-5632, 2001)을 이용하여 계산한 3회 주기 후 형성된 나노입자의 양은 1.05±0.17 ㎍이었으며, 이는 3.6±0.6×10-9 mol/cm2에 해당하는 수치이다.
4) 폴리클론항체의 고정
유리탄소전극에 코팅된 나노입자층을 10mM의 EDC를 함유하는 0.01M 인산완충용액(pH 7.0)에 6시간 동안 담구어 나노입자층의 카르복실기를 활성화하였다. EDC로 처리된 나노입자층으로 코팅된 유리탄소전극을 인산완충용액으로 세척한 후, 4℃, 0.01M PBS(pH 7.0), 폴리클론항체의 1:500 용액에서 12시간 동안 반응시켰다.
나노입자층의 카르복실기와 폴리클론항체의 아민기 간의 공유결합을 통해 폴리클론항체를 나노입자층에 고정시켰다. 유리탄소전극에 코팅된 폴리클론항체로 개질된 나노입자층은 PBS로 세정되어 약하게 흡착된 항체를 제거한 후, PBSTG 용액(0.05% 트윈20 및 0.8% 젤라틴을 함유한 PBS 용액)에서 1시간 동안, 0.1% BSA 용액에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 흡착을 제거하였다.
이러한 전극을 PBS로 3차례 세정하고 4℃에서 보관하면서 비스페놀A의 측정에 이용하였다. 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서의 계략도는 도 1과 같다.
이하, 앞서 제작된 폴리클론항체로 개질된 나노입자층으로 코팅된 유리탄소전극(면적=0.07㎠), Ag/AgCl(in saturated KCl), 백금선을 각각 작동전극, 기준전극 및 반대전극으로 이용하였고, potentiostat/galvanostat, Kosentech model KST- P2(South Korea)를 이용하여 순환전압전류(cyclic voltammograms)를 측정하였다.
<실시예 2> QCM 검토
나노입자층에 대한 폴리클론항체의 고정화 및 고정된 폴리클론항체에 대한 항원 및 비스페놀A 각각의 상호작용을 검토하기 위하여, 하기와 같이 QCM을 실시하였다. 이때, QCM 실험은 SEIKO EG&G model QCA 917 및 PAR model 263A potentiostat/galvanostat(USA)를 이용하여 수행되었다.
1) 폴리클론항체의 고정화에 대한 QCM 검토
수정진동자(quartz crystal) 금전극의 한쪽 면에 나노입자층을 성장시키고, 이렇게 나노입자층이 코팅된 금전극을 세척한 후, 인산완충용액(pH 7.0)에 용해된 0.01M EDC 용액에 침지하여 6시간 동안 나노입자층 표면의 카르복실기를 활성화하였고, 실시예 1과 동일한 방법으로 폴리클론항체를 금전극에 고정화시켰다.
도 2와 같이, 시간을 함수로 하여 폴리클론항체의 고정화 동안 주파수 변화를 관찰하였고, 그 결과 주파수가 점차 감소하며 2시간 후에는 안정적인 상태가 되었다.
따라서, 나노입자층에 대한 폴리클론항체의 고정은 실온에서 2시간 이내에 완료된다고 판단되며, 2시간 후 주파수 변화(△f)는 ca. 232Hz이었고, 나노입자층에 고정된 폴리클론항체의 양은 255±18 ng이었다.
2) 폴리클론항체에 대한 항원 및 비스페놀A 각각의 상호작용에 대한 QCM 검토
상기와 동일하게 QCM을 수행하되, PBSTG 용액 및 0.1% BSA 용액에 각각 1시 간 동안 폴리클론항체로 고정된 나노입자층을 처리하여 비특이적인 흡착을 제거한 후, 항원 및 비스페놀A 간의 특이적인 상호작용을 검토하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 주파수의 감소는 폴리클론항체-항원 및 폴리클론항체-비스페놀A 간의 각각 결합 20분 후에 안정된 상태에 도달하였고, 주파수 변화(△f)는 폴리클론항체 및 항원 간 상호작용에는 138Hz, 폴리클론항체 및 비스페놀A 간 상호작용에는 130Hz이었고, 양의 변화는 각각 151.7±22 ng 및 143±13 ng이었다.
특히, 폴리클론항체의 비특이적인 흡착을 제거하지 않은 경우에는 주파수 감소가 30분 후 안정화되었고, 주파수 변화가 165Hz로 관찰되어 바람직하지 못하므로, 반드시 비특이적인 흡착을 제거하여야 한다.
<실시예 3> 임피던스 검토
임피던스 분석은 EG&G PAR model 273A potentiostat/galvanostat(USA) 및 퍼스널컴퓨터에 연결된 락인증폭기(lock-in amplifier, PAR EG&G model 5210)를 이용하여 측정하였다. 주파수를 개로전압(open circuit voltage)에서 100kHz 내지 10Hz 또는 100Hz로 주사하여 10당 5포인트를 얻었고, 10mV의 사인전압의 진폭을 이용하였다. 이때, 임피던스 변화의 측정은 25±0.2℃의 온도에서 완충매체(0.01M PBS, pH 7.0)에서 수행되었다.
1) 폴리클론항체의 고정화에 대한 임피던스 변화 검토
0.01M PBS 용액(pH 7.0)에서 폴리클론항체 고정 전후의 임피던스 스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같고 이때 A는 Bode plot, B는 Nyquist plot을 나타낸다.
나노입자층으로 코팅된 전극은 임피던스가 폴리클론항체의 고정 후에 증가되었고, 나노입자층을 구성하는 전도성고분자로 인하여 높은 전도성을 나타내었으며, 나노입자층에 폴리클론항체를 고정화하여 나노입자층의 저항성을 증가시켰다. 따라서, 임피던스 수치는 폴리클론항체의 고정 후 증가하였다.
도 3의 A에 나타난 바와 같이, 폴리클론항체 고정 전후의 최대차이는 3.7Hz의 로그주파수에서 관찰되었고, 도 3의 B에 도시된 바와 같이, 폴리클론항체의 고정에 따른 전하이동저항(charge transfer resistance)이 증가하였다.
일반적인 등가회로를 이용하여 본 발명의 임피던스 스펙트럼을 도 3의 B의 삽입도와 같이 도시하였다. 이때, Rs는 용액 저항, Rp는 전해저항, W는 와버그 인자(Warburg element), Qdl은 위상정수인자(constant phase element)이다.
상기 Rs, Rp, W 및 Qdl은 실험데이터에서 얻어지며, 표 1과 같다. Rs은 전해용액의 벌크 특성으로, 나노입자층에 폴리클론항체를 고정하는 화학적 변형에 의해 영향을 받지 않는 수치이다.
또, Rp 및 Qdl은 전극과 전해액의 계면에서의 유전율 및 전도율에 따라 변하는 수치이고, 다른 물질이 전극 표면에 흡착된 경우에는 Rp수치가 변한다. 또, Qdl은 이온전하와 전극표면을 분리하는 층의 유전율, 전극의 표면적 및 분리층의 두께에 따라 변하는 수치이다.
본 발명에서 나타난 Qdl의 큰 감소는 높은 표면적으로 인하여 나노입자층에 고정된 폴리클론항체의 양이 크게 증가되어 폴리클론항체가 최대표면적범위를 나타내는 것을 의미한다.
2) 폴리클론항체에 대한 항원 및 비스페놀A 각각의 상호작용에 대한 임피던스 변화 검토
폴리클론항체를 고정하고 유리활성부위를 차단한 후, 폴리클론항체로 고정된 나노입자층을 PBS로 세정하고 0.01M PBS 용액에 보관하였다. 폴리클론항체-항원 및 폴리클론항체-비스페놀A 상호작용의 임피던스는 개로전압(open circuit voltage)에서 PBS 용액에 용해된 40ng/ml의 항원 및 비스페놀A를 첨가하여 수행하였다.
도 3의 A에 도시된 Bode plot으로부터 특이적 폴리클론항체-항원 및 폴리클론항체-비스페놀A 간의 상호작용에 의해 임피던스가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
이러한 임피던스의 감소는 면역상호작용으로 인한 전도성 또는 유전율의 변화에 기인한 것으로 판단된다. 임피던스 수치의 최대 차이는 로그주파수 3.7Hz에서 관찰되었다. 임피던스의 감소는 항원 또는 비스페놀A의 농도에 비례하므로, 임피던스 감소는 특이적 폴리클론항체-항원 및 폴리클론항체-비스페놀A 결합에 의해 야기되는 것으로 판단된다.
따라서, 폴리클론항체에 의해 항원 및 비스페놀A의 특이적인 인식이 다른 환원프로브나 표식효소 없이도 Bode plot에 의해 측정될 수 있다.
또, 항원 및 비스페놀A 첨가 전후 측정한 Nyquist plot으로부터 전하이동저 항이 폴리클론항체-항원 및 폴리클론항체-비스페놀A 상호작용으로 인해 감소되었다는 것을 알 수 있다.
도 3의 B의 삽입도에 나타난 등가회로를 이용하여 본 발명의 임피던스 스펙트럼을 측정하였다. 이때, Rs는 용액 저항, Rp는 전해저항, W는 와버그 인자(Warburg element), Qdl은 위상정수인자(constant phase element), n은 와버그 항의 기울기이다.
상기 Rs, Rp, W, Qdl 및 n은 실험데이터에서 얻어지며, 표 1과 같다. W, Qdl, Rp가 항원 또는 비스페놀A(BPA)와 폴리클론항체(PAb) 간의 결합에 의해 민감하게 변화하였고, 특히 이러한 결합에 의해 Rp의 감소와 Qdl의 증가가 두드러졌다.
또, Bode plot으로부터 얻어진 임피던스 차이인 △｜Z｜ 수치는 간단하고 직접적으로 얻어지므로 비스페놀A의 검출을 위해 유용하다.
PAb 고정전 PAb 고정후 항원 결합후 BPA 결합후
Rs(Ω㎠) 601.4 600 520 530
Qdl(Fcm-2s-(1-α)) 1.3×10-6 3.7×10-9 1.27×10-7 1.15×10-7
Rp(Ω㎠) 3.42×10-9 1360 900 999.7
n 0.76 0.78 0.81 0.79
W(W㎠sβ) 1.2×105 120.5 56.3 50.75
Chi-squared 1.0×10-4 5.3×10-4 3.1×10-4 4.4×10-4
< 실시예 4> 방해효과 검토
본 발명에 따른 임피던스 면역센서의 선택도를 측정하기 위하여 페놀, 히드로퀴놀, p-히드록시벤조인산, p-니트로페놀, o-니트로페놀, 2,4-디니트로페놀, 2,6-디메틸페놀, 2,4-디클로로페놀, 3-클로로페놀, 2-클로로페놀 등과 같은 페놀성 화합물 및 BHPVA 존재 하에서 임피던스 변화를 측정하였다.
방해효과를 검토하기 전에, 폴리클론항체로 고정된 나노입자층으로 코팅된 임피던스 면역센서를 먼저 PBSTG로 세정한 후 0.1% BSA 용액에서 1시간동안 반응시켜 비특이적인 결합을 제거하였다.
그 결과, 면역원인 BHPVA는 예상대로 유의적으로 비스페놀A의 검출을 방해하였다. 그러나, 다른 페놀성 화합물은 비스페놀A의 검출을 방해하지 못하였다. 즉, 비스페놀 결합(40ng/ml) 후 얻어진 △｜Z｜ 수치는 다른 페놀성 화합물의 경우에는 100배나 더 많은 농도(5㎍/ml)로 첨가하더라도 유의적인 변화가 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 임피던스 면역센서를 이용하면 비스페놀A를 다른 페놀성 화합물과 구별하여 선택적으로 검출할 수 있다.
<실시예 5> 비스페놀A의 정량적 검출
폴리클론항체의 희석율을 1:500로 하고, 30℃의 온도에서 20분 동안 pH 8.0의 면역반응조건 하에서 비스페놀A의 농도를 증가시키면서 임피던스 감소를 측정하여 비스페놀A의 정량분석을 실시하였다.
도 4의 A는 비스페놀A 상호작용 전후의 임피던스 분석에 대한 Bode plot을 나타내었다. 임피던스 측정은 비스페놀A를 1 내지 300 ng/ml의 다양한 농도로 첨가한 후 실시하였다. △｜Z｜ 수치는 비스페놀A의 농도가 증가함에 따라 증가하였다.
도 4의 B는 다양한 농도의 비스페놀A로 상호작용된 후 면역센서로부터 얻어진 로그 임피던스 수치의 차이를 나타내었다. 10Hz 내지 100kHz 사이의 주파수 범위에서 △｜Z｜ 수치가 증가하였다. 그러나, 최대 △｜Z｜ 수치는 3.7Hz의 로그 주파수에서 얻어졌다. 따라서, 3.7Hz의 로그 주파수에서 △｜Z｜ 수치가 calibration plot으로 선정되었다.
도 4의 C는 비스페놀A 검출의 calibration plot을 나타내었다. 본 발명의 임피던스 면역센서는 △｜Z｜ 수치와 비스페놀A의 농도 간의 선형 상관관계를 나타내었다. 선형 범위는 1 내지 100 ng/ml이었다. 또한, 본 발명의 임피던스 면역센서의 검출한계는 0.3 ng/ml이었다.
<실시예 5> 인간혈청시료에의 적용
실시예 1에서 제작한 임피던스 면역센서를 실제 임상에 적용하기 위하여, 건강한 인간혈청시료에 존재하는 흔적량의 비스페놀A를 측정하였다. 인간혈청시료는 구입하여 사용하였고, 표준물 첨가법(standard addition method)을 이용하여 비스페놀A 농도를 측정하였다.
도 5는 표준물 첨가법으로부터 얻어진 calibration plot을 나타내었다. 마이너스 x축에 선형 플롯을 외삽하여 인간혈청시료 중의 비스페놀A 농도를 산출하였다. 혈청시료 중 비스페놀A의 농도는 400±27 pg/ml이었다.
한편, 알려진 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography)에 근거한 멀티전극 전기화학적 검출을 이용한 경우에는 320 pg/ml의 비스페놀A를 검출하였다. 따라서, 본 발명의 임피던스 면역센서는 혈청시료에서 비스페놀A의 검출에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 임피던스 면역센서를 이용하면 인간혈청시료 등에 존재하는 흔적량의 비스페놀A를 별도의 표식물질 없이도 직접적으로 간단하고 선택적이며 민감하게 검출할 수 있기 때문에 비스페놀A에 의해 야기되는 생체 내 질환 등을 진단하는 데에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 비스페놀A 유사체와 단백질과의 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 분리한 폴리클론항체를 전극에 고정시키며, 상기 전극이 전도성고분자로 구성된 나노입자층으로 코팅된 것을 특징으로 하는 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 비스페놀A 유사체는 히드록시페닐발레인산, 2,4-디니트로페놀, p-니트로페놀, o-니트로페놀, 2.6-디메틸페놀 및 2.4-디클로로페놀로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 전도성고분자는 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid), 디아미노터티오펜(diaminoterthiophen), 터티오펜 살렌 유사체(terthiophen salene analogues) 및 포르밀터티오펜(formyl terthiophen)으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 비스페놀A 검출용 임피던스 면역센서.
  4. 비스페놀A 유사체와 단백질의 결합체를 제조하는 단계;
    상기 결합체로 면역반응시킨 마우스로부터 폴리클론항체를 제조하는 단계;
    전극에 전도성고분자를 함유하는 나노입자층을 코팅하는 단계;
    상기 나노입자층에 상기 폴리클론항체를 고정하는 단계;
    상기 나노입자층에 남아있는 비특이적 폴리클론항체의 흡착을 제거하는 단계; 및
    비스페놀A와 폴리클론항체 간의 항원항체반응을 수행하는 단계
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항에 따른 임피던스 면역센서를 이용한 비스페놀A의 검출방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 결합체는 비스페놀A 유사체의 카르복시기를 활성화하는 단계 및 상기 활성화된 비스페놀A 유사체의 카르복시기와 단백질의 아민기를 공유결합하는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 비스페놀A의 검출방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 활성화는 카르보디이미드 또는 N-히드록시숙신이미드에서 선택된 하나 이상의 화합물에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 비스페놀A의 검출방법.
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