KR100835214B1 - Anomala albopilosa extracts having anti-oxidant activity and bone metabolism factor inhibition activity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항산화활성 및 골대사 관련 인자 억제활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물에 관한 것이다.The present invention relates to a bronze beetle extract exhibiting antioxidant activity and inhibitory activity against bone metabolism.
본 발명의 청동풍뎅이 추출물은, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충 또는 유충을 준비한 다음, 음건한 후, 마쇄기로 갈아 분말로 제조하고, 80 % 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하여 청동풍뎅이 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.Bronze Scarab extract of the present invention, Bronze Scarab ( Anomala albopilosa ) Adults or larvae are prepared, then dried and ground to a powder mill, immersed in 80% ethanol, and extracted three times for 1 hour using ultrasonic waves to prepare a bronze beetle extract.
본 발명에 의하여 항산화활성, 항염활성 및 골대사 관련 인자 억제활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물이 제공된다.Provided by the present invention is a bronze beetle extract exhibiting antioxidant activity, anti-inflammatory activity and inhibitory activity of bone metabolism related factors.
청동풍뎅이, 추출, 항산화, 항염, 골대사 Bronze Scarab, Extract, Antioxidant, Anti-inflammatory, Bone Metabolism
Description
도 1은 본 발명의 청동풍뎅이의 산란 후 체중 변화를 나타내는 그래프1 is a graph showing the weight change after the spawn of the bronze beetle of the present invention
도 2는 본 발명의 청동풍뎅이의 산란 후 크기 변화를 나타내는 그래프Figure 2 is a graph showing the size change after spawning of the beetle of the present invention
A : 체장 그래프, B : 체폭 그래프A: length graph, B: body width graph
도 3은 풍뎅이상과의 생장단계별 기간을 나타내는 그래프3 is a graph showing the period of growth stage of the chafer family
도 4는 본 발명의 청동풍뎅이에 대한 생장 단계별 사진Figure 4 is a step-by-step photo growth for the bronze beetle of the present invention
A : 산란 직후, B : 14 일 후, C : 부화 직전, D : 1령, A: Immediately after spawning, B: 14 days later, C: immediately before hatching, D: 1st age,
E : 2령, F : 3령, G : 번데기 직전, H : 번데기, I : 성충E: 2nd age, F: 3rd age, G: shortly before pupa, H: pupa, I: adult
도 5는 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내는 그래프5 is a graph showing the DPPH radical scavenging activity of the bronze beetle extract of the present invention
A : 성충, B : 애벌레A: Adult, B: Caterpillar
도 6은 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 크산틴 산화효소 억제활성을 나타내는 그래프Figure 6 is a graph showing the xanthine oxidase inhibitory activity against the bronze beetle extract of the present invention
A : 성충, B : 애벌레A: Adult, B: Caterpillar
도 7은 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 과산화물 라디칼 소거활성을 나타내는 그래프7 is a graph showing the peroxide radical scavenging activity of the bronze beetle extract of the present invention
A : 성충, B : 애벌레A: Adult, B: Caterpillar
도 8은 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 NO 생성 저해활성을 나타내는 그래프8 is a graph showing the NO production inhibitory activity for the bronze beetle extract of the present invention
A : 성충, B : 애벌레A: Adult, B: Caterpillar
도 9는 RAW 264.7 세포에서의 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 LDH 억제효과 및 NO 생성 억제효과를 나타내는 그래프9 is a graph showing the LDH inhibitory effect and NO production inhibitory effect on the bronze beetle extract of the present invention in RAW 264.7 cells
A : 성충, B : 애벌레A: Adult, B: Caterpillar
도 10은 MG-63 세포에서 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 IL-6 생성 억제효과를 나타내는 그래프10 is a graph showing the inhibitory effect of IL-6 production on the bronze beetle extract of the present invention in MG-63 cells
A : 성충, B : 애벌레A: Adult, B: Caterpillar
도 11은 MG-63 세포에서 IL-6 및 β-Actin 의 mRNA 발현 억제효과를 나타내는 사진11 is a photograph showing the inhibitory effect of mRNA expression of IL-6 and β-Actin in MG-63 cells
본 발명은 항산화활성 및 골대사 관련 인자 억제활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물에 관한 것이다.The present invention relates to a bronze beetle extract exhibiting antioxidant activity and inhibitory activity against bone metabolism.
현대인의 질병 중 약 90 % 이상을 유발하는 것으로 알려진 활성산소(ROS, reactive oxygen species)는 체내에서 산소가 사용되면서 다양하게 생성되는데, 그 대표적인 것으로 O2 -, OH-, H2O2가 있다(Fridovich, 1986). Activity is known to cause at least about 90% of the diseases of the modern oxygen (ROS, reactive oxygen species) is there is variously created while the oxygen used by the body, O 2 as the representative -, OH -, a H 2 O 2 (Fridovich, 1986).
이러한 활성 산소는 분자 내에 쌍을 이루지 않은 전자가 불안정한 상태로 좌충우돌하면서 주변에 있는 분자 내지 세포막, 미토콘드리아 막, 유전정보, 단백질, 지질 등에 악영향을 주게 된다. Such active oxygen is in an unstable state in which unpaired electrons are unstable, and adversely affects molecules, cell membranes, mitochondrial membranes, genetic information, proteins, lipids, and the like.
활성산소가 약 2 % 정도까지 생성되면 체내에서 항산화 체계를 통해 활성산소를 억제하거나 불활성 시킬 수 있지만, 3 % 이상으로 생성되는 경우 독성이 강한 활성 산소의 생성이 조절되지 않아 유전자, 지질, 단백질에 영향을 미쳐 류마티스성 관절염, 허혈 증상, 호흡기 질환 등을 일으킬 수도 있다. When oxygen is generated up to about 2%, the body can inhibit or inactivate free radicals through the antioxidant system.However, when more than 3% is produced, the generation of toxic free radicals is not regulated, which can affect genes, lipids, and proteins. It can also cause rheumatoid arthritis, ischemic symptoms, and respiratory illness.
특히, 신체의 모든 세포막 및 미토콘드리아 막은 이중 결합이 있는 불포화 지방산이 풍부하여 탄소 사이에 이중결합이 쉽게 활성산소에 의해 파괴될 수 있다.In particular, all cell membranes and mitochondrial membranes of the body are rich in unsaturated fatty acids with double bonds so that double bonds between carbons can be easily destroyed by free radicals.
이러한 반응을 통해 과산화 라디칼이 한번 형성되면 연쇄적으로 산화를 유도하고, 동맥경화증을 일으키며, 혈액의 흐름을 방해하여 심각한 문제를 일으키게 된다. Once the radical peroxide is formed through this reaction, it leads to oxidation in series, causes atherosclerosis, and disturbs blood flow, causing serious problems.
따라서, 인체에 자유 라디칼이 생성되면 발암, 염증, 동맥경화, 간 질환, 류마티스 관절염, 골다공증 등과 같은 여러 가지 성인병 및 노화촉진을 초래한다.Therefore, the production of free radicals in the human body leads to various adult diseases and aging, such as carcinogenesis, inflammation, arteriosclerosis, liver disease, rheumatoid arthritis, osteoporosis and the like.
이러한 활성산소에 의해 발생되는 과산화반응 및 손상에 대한 생체내 방어기구가 여러 면에서 연구되고 있으며, superoxide dismutase(SOD), catalase 및 glutathione peroxidase(GPX) 등의 효소, tocopherol, ascorbic acid, riboflavin, uric acid 등의 항산화 물질 등에 대한 연구가 이뤄지고 있다(Seo et al., 1997).In vivo defense mechanisms for peroxidation and damage caused by these free radicals have been studied in many ways, including enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase and glutathione peroxidase (GPX), tocopherol, ascorbic acid, riboflavin, uric Research is being conducted on antioxidants such as acid (Seo et. al ., 1997).
또한, 인간은 성장기뿐만 아니라 살아가면서도 골의 합성과 분해가 지속적으로 계속 된다(Mundy et al., 1993). In addition, humans continue to synthesize and decompose bones not only during the growth phase but also during their lives (Mundy et. al ., 1993).
골의 분해 현상은 성장기 때에도 계속되는데 그럼에도 지속적으로 성장을 하는 것은 골의 분해보다 합성이 더욱 활발히 일어나기 때문이다. The degradation of bone continues during the growing season, but the growth continues because the synthesis occurs more actively than the decomposition of bone.
그러나, 여러 가지 환경적 영향, 신체의 정신적 또는 육체적인 변화에 의한 호르몬의 불균형이나, 골을 만드는 것보다 분해하는 것이 더욱 활발한 노년기의 경우 작은 충격으로도 골이 쉽게 부러지는 현상이 일어나게 된다. However, in the elderly, where the environmental imbalance, hormone imbalance caused by physical or mental changes of the body, or the decomposition is more active than making bone, bone breaks easily occur even with a small impact.
흔히들 갱년기 이후의 여성에게 빈번하게 일어나는 골다공증(osteoporosis)은 신체 내에서의 호르몬의 불균형으로 인해 골을 만드는 일이 어려워지고, 골을 분해하는 것이 더욱 활발하여, 골 사이에 공간이 생김으로써 발생하는 병이다. Osteoporosis, which often occurs in postmenopausal women, is a disease caused by the formation of spaces between bones, making it difficult to make bones, and more active in breaking bones, due to hormone imbalances in the body. to be.
이 외에도 골석화증(osteopetrosis)으로 골의 분해가 잘 일어나지 않을 경우 골 내의 공간이 석회화되면서, 골의 발달이 일어나지 않거나, 팔, 다리가 짧으며 모든 면역세포의 근간인 골수의 형성이 일어나지 않는 병이 생기기도 한다. In addition, osteopetrosis is a disease in which bone disintegration does not occur well, resulting in calcification of the space in the bone, which does not cause bone development, or the formation of bone marrow, which is the basis of all immune cells, with short arms and legs. This also happens.
이러한 골석화증 또한 골이 너무 딱딱하여 골다공증에 걸린 골처럼 쉽게 부러지기도 한다. This osteoporosis can also break easily like bone with osteoporosis because the bone is too hard.
하지만, 국내에서는 골석화증 보다는 골다공증이 더욱 빈번하게 일어나고, 전 세계적으로도 골다공증이 갱년기 이후의 문제로 대두되고 있는 추세이다 (Teitelbaum et al., 1996).However, osteoporosis occurs more frequently than osteoporosis in Korea, and osteoporosis is emerging as a post-menopausal problem worldwide (Teitelbaum et. al ., 1996).
골다공증의 현행 치료제인 에스트로겐, 칼시토닌, 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 등의 골 흡수 억제제가 일반적으로 상용되고 있고, 골 형성을 촉진하는 약물로는 불소와 부갑상선 호르몬이 있으며, 이외에 비타민D 대사물질, 칼슘이 사용되고 있으나 아직 만족할만한 성과는 없는 실정이다(Rogers, 1967).Bone resorption inhibitors such as estrogen, calcitonin, and bisphosphonate, which are the current treatments for osteoporosis, are commonly used. Drugs that promote bone formation include fluoride and parathyroid hormone, and vitamin D metabolites and calcium are used. There is no satisfactory result yet (Rogers, 1967).
최근에는 에스트로겐 투여에 의한 위험성을 보완하기 위해 한약재 및 식품 등 천연물의 활성물질을 이용한 대체 요법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.Recently, researches on alternative therapies using natural substances such as herbal medicines and foods have been actively conducted to compensate for the dangers caused by the administration of estrogen.
폐경기 골다공증 예방을 위한 대표적인 대체 요법으로 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)의 식이 첨가 또는 이를 다량으로 함유하고 있는 식품의 섭취가 시도되고 있다. As a representative alternative therapy for the prevention of postmenopausal osteoporosis, dietary addition of phytoestrogen or foods containing a large amount of phytoestrogen has been attempted.
한편, 지구상에 살고 있는 전 생물군의 80 % 이상을 차지하고 있는 곤충의 유용생물자원활용에 대한 관심이나 연구는 세계적으로 매우 낮은 형편이었다. On the other hand, interest and research on the utilization of useful biological resources of insects, which account for more than 80% of the entire biodiversity living on earth, are very low worldwide.
그러나, 우리의 선조들은 민간약재로서 딱정벌레목(Coleoptera), 메뚜기목(Orthoptera), 잠자리목(Odonata) 등 일부의 곤충류를 각종 질병치료의 목적이나 건강유지를 위해 충체를 가공하여 복용하거나 직접 복용해 왔으며, 곤충의 종류마다 가지는 천연화합물의 독특한 특성을 경험적으로 이용해 왔다.However, our ancestors use some insects, such as Coleoptera, Orthoptera, or Dragonfly (Odonata) as a medicinal herb, either by processing or taking them directly for the purpose of treating diseases or maintaining health. It has been empirically taking advantage of the unique properties of natural compounds that have different types of insects.
최근에는 곤충의 다양성과 활용성이 재인식됨에 따라 다양한 분야에 활용되고 있으며 다양한 연구가 이뤄지고 있다.Recently, as the diversity and utility of insects are re-recognized, they are used in various fields and various researches are being made.
한국등록특허공보 10-0607033 "항산화활성을 갖는 잠자리추출물"에는, 잠자 리추출물의 유효성분을 이용하여 활성산소에 의한 질병을 치료 및 예방할 수 있는 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.Korean Patent Publication No. 10-0607033 "Dragonfly extract with antioxidant activity" discloses a composition capable of treating and preventing diseases caused by free radicals by using the active ingredient of the sleep extract.
또한, 한국등록특허공보 10-0453575 "귀뚜라미 자체 또는 이의 추출물을 함유하는 간보호, 강장피로회복, 알코올대사 촉진, 과산화지질 생성 억제를 위한 식품조성물"에는, 귀뚜라미 자체 또는 이의 추출물을 활성성분으로 포함하는 간보호, 노화 예방을 위한 과산화지질 생성 억제 등을 위한 식품 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.In addition, Korean Patent Publication No. 10-0453575 "food composition for protecting liver, tonic fatigue, promoting alcohol metabolism, inhibiting lipid peroxidation" containing cricket itself or its extract, contains cricket itself or its extract as an active ingredient It discloses a food composition for liver protection, inhibiting the production of lipid peroxide for the prevention of aging.
한편, 풍뎅이과는 세계적으로 약 2만 5천종이 알려져 있고, 우리나라에는 총 13과 234종이 보고되고 있다(Kim, 2001). On the other hand, about 25,000 species of chafers are known around the world, and a total of 13 and 234 species are reported in Korea (Kim, 2001).
그 중, 장수풍뎅이 유충(굼벵이)은 다양한 생리활성에 대한 연구가 시작되어 항당뇨 및 숙취해소에 효과가 있다는 보고가 있다. Among them, the beetle larvae (slugs) has been reported to be effective in antidiabetic and hangover relief began to study various biological activities.
한국등록특허공보 10-0581329 "굼벵이 추출물을 함유하는 니코틴 분해용 조성물"은, 풍뎅이류, 누에, 매미 등의 유충 등의 굼벵이를 물 또는 에탄올로 추출한 굼벵이 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 니코틴 분해용 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.Korean Patent Publication No. 10-0581329 "The nicotine decomposition composition containing slug extract" is characterized in that it contains a slug extract extracted from slugs such as scarabs, silkworms, cicada and the like with water or ethanol as an active ingredient. Disclosed is a composition for nicotine degradation.
또한, 한국등록특허공보 10-0414187 "흰점박이꽃무지 추출물 및 이의 용도"에는, 흰점박이꽃무지 유충(굼벵이) 분말에 증류수를 가하여 물 추출액을 얻은 후, 이 추출물을 투석막에 통과시켜 얻은 분자량 1,000 이하의 흰점박이꽃무지 추출물로서, 이 추출물을 유효성분으로 하는 간질환 치료제 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.In addition, Korea Patent Publication No. 10-0414187 "White spotted radish extract and its use", after distilled water was added to the white spotted radish larvae (slugs) powder to obtain a water extract, the molecular weight 1,000 obtained by passing the extract through a dialysis membrane The following white spotted radish extract has disclosed about the liver disease therapeutic composition which uses this extract as an active ingredient.
그러나, 아직까지 민간약재로 이용해온 곤충류 중 치질, 천식, 월경불순, 파상풍, 견만통(堅滿痛) 등에 유효하다고 알려져 있는 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)에 대한 생리학적 연구 및 그 활용방안에 대한 연구는 이뤄지지 않고 있는 실정이다.However, the physiological study and its application of Anomala albopilosa , which is known to be effective in hemorrhoids, asthma, dysmenorrhea, tetanus, and crayfish, among the insects that have been used as folk medicines. Is not happening.
본 발명은 항산화활성, 항염활성, 골다공증 억제활성의 다양한 생리활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.It is an object of the present invention to provide a bronze beetle extract exhibiting various physiological activities of antioxidant activity, anti-inflammatory activity, osteoporosis inhibitory activity.
또한, 청동풍뎅이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제 조성물, 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물과 골대사성 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, an object of the present invention is to provide an antioxidant composition comprising a bronze beetle extract as an active ingredient, a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases and a composition for the prevention and treatment of bone metabolic diseases.
본 발명은 항산화활성 및 골대사 관련 인자 억제활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물에 관한 것이다.The present invention relates to a bronze beetle extract exhibiting antioxidant activity and inhibitory activity against bone metabolism.
본 발명의 청동풍뎅이 추출물은, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충 또는 유충을 준비한 다음, 음건한 후, 마쇄기로 갈아 분말로 제조하고, 80 % 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하여 청동풍뎅이 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.Bronze Scarab extract of the present invention, Bronze Scarab ( Anomala albopilosa ) Adults or larvae are prepared, then dried and ground to a powder mill, immersed in 80% ethanol, and extracted three times for 1 hour using ultrasonic waves to prepare a bronze beetle extract.
풍뎅이과는 세계적으로 약 2만 5천종이 알려져 있고, 우리나라에는 총 13과 234종이 보고되고 있다(Kim, 2001). About 25,000 species of chafers are known around the world, and a total of 13 and 234 species are reported in Korea (Kim, 2001).
그 중, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)는 딱정벌레목(Coleoptera), 풍뎅이과(Scarabaeidae)에 속하는 18 ~ 25 ㎜ 크기의 식식성(植食性) 곤충으로서, 우리나라의 줄풍뎅이류(Anomala) 중에서 크고 흔한 종이다(Kim, 1998). Among them, the bronze beetle ( Anomala albopilosa ) is an 18 ~ 25 mm food-bearing insect belonging to Coleoptera and Scarabaeidae, and is a large and common species among Anomala in Korea (Kim, 1998).
청동풍뎅이는 우리나라와 일본에만 서식하는 것으로 알려져 있으며(Cho, 1969), 국내에서는 북부 지방보다 전남, 경남, 제주도 등의 남부 지방에 많이 분포하는 것으로 보고되어 있다(Kim, 2001).Bronze beetles are known to inhabit only Korea and Japan (Cho, 1969), and are reported to be distributed more in southern areas such as Jeonnam, Gyeongnam, and Jeju Island than in northern Korea (Kim, 2001).
우리나라의 경우 청동풍뎅이 성충은 참나무(Quercus acutissima), 밤나무(Castanea crenata), 포도나무(Vitis vinifera), 벚나무류(Prunus spp.), 복숭아나무(Prunus persica), 사과나무(Malus pumila), 감나무(Diospyros kaki) 등을 가해한다고 보고되고 있고(Kim, 1978), 유충은 감자와 같은 농작물이나 잡초의 뿌리를 가해한다고 알려져 있다.In Korea, the Bronze Scarab adult is Quercus acutissima ), chestnut tree ( Castanea) crenata), grapevine (Vitis vinifera ), Prunus spp .), Prunus persica , Malus pumila ), persimmon ( Diospyros kaki ), etc. (Kim, 1978), and larvae are known to cause crops such as potatoes and roots of weeds.
본 발명은 치질, 천식, 월경불순, 파상풍, 견만통(堅滿痛) 등을 치료하는데 민간 약제로 사용해 온 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)의 추출물을 이용하여 항산화능을 측정 비교하고, 항염증효과 및 골대사 관련 인자 억제효과 등을 통해 질병치료제 및 예방제로서의 가능성을 연구하였다.The present invention is a bronze beetle ( Anomala) that has been used as a folk medicine to treat hemorrhoids, asthma, dysmenorrhea, tetanus, silk pain, etc. albopilosa ) was used to evaluate the antioxidant activity and to investigate its potential as a therapeutic and prophylactic agent through anti-inflammatory effects and inhibitory effects on bone metabolism.
또한, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)의 잠재적 이용가치를 위한 대량사육 기술을 개발하기 위해서 실내에서 사육하면서 생육특성을 조사하였다.Bronze Scarab ( Anomala) albopilosa ), in order to develop a mass breeding technique for the potential value of use, the growth characteristics were examined indoors.
대량사육의 핵심기술은 생활주기(Life cycle)를 앞당기는 것인데, 본 발명에 서는 야외에서 1년에 1세대만을 거친다고 보고된 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)를 187.6 일로 생활주기(Life cycle)를 앞당김으로써 1년에 2세대 이상의 누대 사육이 가능하도록 하였다.The core technology of mass breeding is to accelerate the life cycle, and in the present invention, it is reported that only one generation per year is outdoors in the bronze beetle ( Anomala) albopilosa ) accelerated the life cycle to 187.6 days, allowing more than two generations of rods to be raised per year.
청동풍뎅이를 대량사육하여 성충 또는 유충을 준비하여 그 추출물을 제조하여 그 생리활성을 연구한 결과, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물이 다음과 같은 생리활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.As a result of studying the physiological activity by preparing the extract and preparing the extract of the adult beetle or larvae by mass breeding bronze beetle, it was found that the bronze beetle extract of the present invention exhibits the following physiological activity.
본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 생리활성은 성충추출물과 유충추출물 모두에서 항산화활성, 항염활성 및 골대사 관련인자 억제활성이 크다는 사실을 알 수 있었다.The physiological activity of the bronze beetle extract of the present invention was found to be large in antioxidant activity, anti-inflammatory activity and inhibitory activity of bone metabolism in both adult extract and larva extract.
특히, 유충은 2령 및 3령 모두에서 그 활성이 좋게 나타났으며 유사한 활성을 보였다.In particular, the larvae showed good activity in both 2 and 3 years of age and showed similar activity.
본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대하여 항산화활성을 실험한 결과, 청동풍뎅이 성충과 유충의 에탄올 추출물은 DPPH 라디칼 소거활성이 모두 농도 의존적으로 증가함을 보였으며(도 5), 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 대조군으로 사용한 천연 합성물질보다는 약했지만 IC50값이 각각 280.02 ㎍/㎖와 483.39 ㎍/㎖를 나타내어 비교적 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.As a result of the antioxidant activity of the bronze beetle extract of the present invention, the ethanol extract of bronze beetle and larvae showed a concentration-dependent increase in DPPH radical scavenging activity (FIG. 5), and adult and larval larva ethanol extracts. The DPPH radical scavenging activity was lower than that of the natural synthetic material used as a control, but the IC 50 values were 280.02 ㎍ / mL and 483.39 ㎍ / mL, respectively.
또, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 유충의 에탄올 추출 은 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 저해 활성은 추출물의 농도가 높아질수록 크산틴 산화효소에 대한 저해효과를 높여주는 것으로 나타났다(도 6).In addition, the bronze beetle ( Anomala) of the present invention albopilosa ) The ethanol extraction of adult and larvae showed that the xanthine oxidase inhibitory activity increased the inhibitory effect on xanthine oxidase as the concentration of the extract increased (FIG. 6).
크산틴/크산틴 산화효소 시스템(Xanthine/xanthine oxidase system)에 의해 생성된 과산화물 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 청동풍뎅이 성충과 유충의 에탄올 추출물은 과산화물 라디칼 소거 활성이 모두 농도 의존적으로 증가함을 보였으나, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충 에탄올 추출물이 3령 유충 에탄올 추출물에서보다 과산화물 라디칼 소거활성이 다소 높게 나타나는 경향을 보였다(도 7). The peroxide radical scavenging activity produced by the xanthine / xanthine oxidase system was measured. or bronze beetle (Anomala albopilosa ) Adult ethanol extract showed a tendency of slightly higher peroxide radical scavenging activity than that of larva ethanol extract of 3rd age (FIG. 7).
또, 본 발명의 청동풍뎅이 성충과 유충의 에탄올 추출물은 고농도로 갈수록 농도 의존적으로 산화질소 생성저해 활성을 나타내었다(도 8).In addition, the ethanol extract of the bronze beetle adult and larvae of the present invention showed a nitric oxide production inhibitory activity in a concentration-dependent manner with increasing concentration (Fig. 8).
따라서, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물은 항산화활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다(표 3).Therefore, it was found that the bronze beetle extract of the present invention exhibits antioxidant activity (Table 3).
또한, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대하여 항염활성을 실험한 결과, LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 동시에 처리한 시험구에서는 NO 생성량이 처리 농도별에 따라 농도 의존적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(도 9). In addition, as a result of the anti-inflammatory activity of the bronze beetle extract of the present invention, it was confirmed that the excessive generation of NO in the LPS-only treatment group, the bronze beetle of the present invention ( Anomala albopilosa ) It was confirmed that the NO production was reduced in a concentration-dependent manner according to the treatment concentration in the test zone treated with adult and three larva ethanol extract at the same time (Fig. 9).
Lactate dehydrogenase(LDH)에 의한 독성 평가결과 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충은 NO 형성 억제효과가 농도 의존적으로 억제되는 경향을 보였지만 고농도에서는 다소 독성을 나타냈다. 하지만, 청동풍뎅이 유충의 에탄올 추출물 에서는 NO 형성 억제효과가 농도 의존적으로 높게 나타났으며, 독성효과도 거의 나타나지 않았다.Toxicity test by Lactate dehydrogenase (LDH) showed that adult Bronze Beetle ( Anomala albopilosa ) tended to suppress NO formation inhibitory effect in a concentration dependent manner, but it was somewhat toxic at high concentration. However, the ethanol extract of the Bronze beetle larvae showed NO-inhibitory effects in a high concentration-dependent manner, and showed no toxic effects.
따라서, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물이 항염활성을 가진다는 사실을 알 수 있었다.Therefore, it was found that the bronze beetle extract of the present invention has anti-inflammatory activity.
또한, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 추출물에 대하여 골대사 관련 인자 억제활성을 실험한 결과, 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 단독 처리 시에는 IL-6의 생성에는 영향을 주지 않았지만, IL-1β와 함께 각각 다른 농도의 추출물을 처리한 결과 IL-6 생성에서 IL-1β 단독처리에 비해 농도 의존적인 억제 효과를 보였다. In addition, the bronze beetle of the present invention ( Anomala albopilosa ) extracts were tested for inhibitory activity of bone metabolism-related factors. Treatment with IL-6 did not affect the production of IL-6, but different concentrations of extracts with IL-1β showed a concentration-dependent inhibitory effect on IL-6 production compared to IL-1β alone.
이러한 결과는 IL-6 억제가 세포 독성에 의하지 않은 것임을 보여주는 것이다(도 10). These results show that IL-6 inhibition is not due to cytotoxicity (FIG. 10).
또한, IL-6 생성억제가 유전자 발현에 의한 것인지를 조사하기 위하여 IL-1β와 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물 시료를 함께 처리하여 IL-1β에 의한 IL-6 mRNA 발현에 대한 억제효과를 조사한 결과, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물에서 농도 의존적으로 모두 IL-6 억제효과가 나타났다.In addition, IL-1β and Bronze Scarab ( Anomala) were investigated to investigate whether IL-6 production inhibition was caused by gene expression. albopilosa) adult and third instar larvae were treated with the ethanol extract of the sample investigated the inhibitory effect on IL-6 mRNA expression by IL-1β result, bronze beetle (Anomala albopilosa ) Both adult and third larvae ethanol extracts showed IL-6 inhibitory effects in concentration-dependent manner.
특히, 3령 유충 에탄올 추출물에서 고농도로 갈수록 다소나마 억제 효과가 크게 나타났는데, 이는 IL-1β에 의해 발현되는 IL-6 억제에 중요한 작용을 함을 알 수 있었다(도 11).In particular, the ethanol extract of the third-larva larvae showed a somewhat higher inhibitory effect at higher concentrations, which was found to play an important role in inhibiting IL-6 expressed by IL-1β (FIG. 11).
따라서, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물이 골다공증 인자 억제활성을 가진다는 사실을 알 수 있었다.Therefore, it was found that the bronze beetle extract of the present invention has osteoporosis factor inhibitory activity.
한편, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물은 항산화활성, 항염활성, 골대사 관련인자 억제활성을 가지기 때문에, 이 청동풍뎅이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제 조성물, 염증질환 치료 및 예방용 조성물, 골다공증 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공할 수도 있다.On the other hand, because the bronze beetle extract of the present invention has antioxidant activity, anti-inflammatory activity, inhibitory activity of bone metabolism-related factors, antioxidant composition comprising this bronze beetle extract as an active ingredient, a composition for treating and preventing inflammatory diseases, treatment of osteoporosis disease And prophylactic compositions.
또한, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물은 동물용 사료첨가제 및 양식용 어류의 사료첨가제, 화장료조성물 등으로 활용될 수도 있다.In addition, the bronze beetle extract of the present invention may be utilized as a feed additive for animal feed additives and aquaculture feed additives, cosmetic composition and the like.
이하, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하고자 하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.Hereinafter, the bronze beetle extract of the present invention to be described in detail through Examples and Experimental Examples, these are not intended to limit the scope of the present invention.
<실시예 1> 본 발명의 청동풍뎅이의 대량사육Example 1 Mass Breeding of Bronze Scarab of the Present Invention
본 발명에 사용한 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)는 2005 년 7 월부터 8 월 사이에 제주특별자치도 구좌읍 송당리 일대에서 야간(21시 ~ 23시)에 수은등(300W, KP ELECTRIC CO., H300)을 사용하여 성충을 채집한 뒤 가로, 세로, 높이 45× 27× 23 ㎝정도의 플라스틱 케이지에서 100 개체를 집단사육하였다.Bronze beetle used in the present invention ( Anomala albopilosa ) collected mercury by using mercury lamps (300W, KP ELECTRIC CO., H300) at night (21-23:00) in Songdang-ri, Gujwa-eup, Jeju Special Self-Governing Province, between July and August 2005. In a plastic cage about 45 × 27 × 23 cm in height, 100 individuals were collectively bred.
난을 수집할 때는 20 메쉬의 체 위에 산란된 흙을 부어 흙과 알을 분리하였다.When collecting eggs, scattered soil was poured on a 20-mesh sieve to separate soil and eggs.
각각의 플라스틱 관(직경 3 ㎝, 높이 11.5 ㎝) 내에는 10 메쉬의 체로 쳐 굵은 알갱이를 제거한 흙에 난을 1 개씩 접종하였다.In each plastic tube (3 cm in diameter and 11.5 cm in height), one egg was inoculated into the soil from which a coarse grain was removed by a sieve of 10 mesh.
모든 령기의 유충은 사료원으로 신선한 감자를 1 ㎝ 정도의 두께로 썰어 5 ㎝의 깊이로 묻어 주었고, 성충의 먹이로는 벚나무 잎을 가지째 넣어주고 2 ~ 3 일에 한 번씩 시들기 전에 교체하여 주었다. All larvae were cut into fresh potatoes with a thickness of about 1 cm and buried to a depth of 5 cm as a feed source, and the adult foods were pruned with cherry leaves and replaced before withering every 2-3 days. .
실내사육조건(18 ~ 28 ℃, 60 ± 5 % R.H., 12L : 12D)에서 2005 년 8 월부터 2006 년 3 월까지 사육하였다.It was reared from August 2005 to March 2006 under indoor breeding conditions (18 ~ 28 ℃, 60 ± 5% R.H., 12L: 12D).
<실시예 2> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물 제조 1Example 2 Preparation of Bronze Scarab Extract of the
본 발명의 실시예 1의 방법으로 사육하여 준비한 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 2령 유충을 준비하였다.Bronze beetle ( Anomala albopilosa ) 2 larva prepared by breeding by the method of Example 1 of the present invention was prepared.
준비한 유충을 음건한 후, 마쇄기로 갈아 분말로 준비하였다.The prepared larvae were shaded and then ground to a grinder to prepare a powder.
청동풍뎅이 유충분말을 80 % 에탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하여, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물을 제조하였다. The bronze beetle larvae powder was immersed in 80% ethanol and extracted three times for 1 hour using ultrasonic waves to prepare a bronze beetle extract of the present invention.
<실시예 3> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물 제조 2Example 3 Preparation of Bronze Scarab Extract of the Present Invention
본 발명의 실시예 1의 방법으로 사육하여 준비한 청동풍뎅이 3령 유충을 준비하여, 본 발명의 실시예 2와 동일한 방법으로 청동풍뎅이 추출물을 제조하였다.Bronze beetle was prepared by breeding in the method of Example 1 of the present invention 3 larvae, was prepared in the same manner as in Example 2 of the present invention.
<실시예 4> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물 제조 3Example 4 Preparation of Bronze Scarab Extract of the Present Invention
본 발명의 실시예 1의 방법으로 사육하여 준비한 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충을 준비하여, 본 발명의 실시예 2와 동일한 방법으로 청동풍뎅이 추출물을 제조하였다. Bronze beetle ( Anomala albopilosa ) adult prepared by breeding by the method of Example 1 of the present invention was prepared, and a bronze beetle extract was prepared in the same manner as in Example 2 of the present invention.
<실험예 1> 청동풍뎅이의 크기 및 무게 측정실험Experimental Example 1 Measurement of Size and Weight of Bronze Scarab
1. 실험방법1. Experimental method
청동풍뎅이 공시충(Test insect)의 생육단계별 크기와 무게의 측정은 350 마리 집단에서 무작위로 130 마리를 취하여 12 일 간격으로 측정하였다.The size and weight of test insects were measured at 12 days intervals by randomly taking 130 animals from 350 populations.
청동풍뎅이 공시충의 생육단계별 측정에서 알은 무게(Body weight), 장폭(Body length), 단폭(Body width)을 측정하였고, 유충은 무게(Body weight), 장폭(Body length), 단폭(Body width), 두폭(Head width)의 크기변화를 측정하였다.The egg weight, body length, and body width were measured in the growth stages of the Bronze beetle specimens, and the larvae were the body weight, body length, and body width. The size change of head width was measured.
그러나, 번데기의 경우 형성된 타원구 모양의 구조물에 인위적으로 구멍을 내거나 일부를 파손시켜 충체(蟲體)를 노출하면 대부분이 건조, 부패, 감염 등으로 우화를 하지 못하고 죽기때문에(Park et al ., 1994), 번데기의 크기 및 무게의 측정은 하지 않았다.However, in the case of chrysalis, most of them do not become allegory due to drying, decay, infection, etc. due to artificially perforating or partially damaging the ellipsoid-shaped structure formed (Park et. al ., 1994), pupa size and weight were not measured.
2. 실험결과2. Experimental Results
(1) 난기의 성장특성(1) Growth Characteristics of Eggplant
산란 직후의 알은 유백색의 타원구 형태로 장폭, 단폭, 무게가 각각 2.14 ± 0.11 ㎜, 1.70 ± 0.07 ㎜, 3.11 ± 0.45 ㎎이었으며, 말기에는 2.77 ± 0.20 ㎜, 2.50 ± 0.14 ㎜, 8.72 ± 1.75 ㎎ 이었다(표 1). The eggs immediately after spawning were milky white ellipsoids with long, short, and weight of 2.14 ± 0.11 mm, 1.70 ± 0.07 mm, 3.11 ± 0.45 mg, respectively, and 2.77 ± 0.20 mm, 2.50 ± 0.14 mm, 8.72 ± 1.75 mg at the end. (Table 1).
시간이 경과하면서 크기 및 무게가 꾸준히 증가하는 경향을 보이며(도 1, 2), 원형에 가까워지는데 이는 배자의 발육과정에서 공기 중의 수분흡수로 인한 것이라 사료된다. As time goes by, the size and weight tend to increase steadily (Figures 1 and 2), which is closer to the circle, which is thought to be due to the absorption of moisture in the air during embryonic development.
부화 하기 직전에는 두부와 몸체의 형태를 육안으로 관찰할 수 있었다.Just before hatching, the shape of the head and body could be visually observed.
(2) 유충기의 성장특성(2) Growth Characteristics of Larvae
유충은 3단계의 발육과정을 거치는데, 부화 직후의 어린 유충(9.26± 1.50㎎)에서 종령 노숙유충(1155.52± 172.41㎎)까지 체충은 약 130 배의 성장을 보여주었다. The larvae go through three stages of development. The larvae showed about 130-fold growth from young larvae (9.26 ± 1.50 mg) immediately to hatching to homeless larvae (1155.52 ± 172.41 mg).
유충 영기구분의 기준으로 사용한 두폭은 1, 2, 3령이 각각 1.85 ± 0.09 ㎜, 3.10 ± 0.40 ㎜, 5.00 ± 0.20 ㎜이었다.The head widths used as the criteria for the larval permanent fraction were 1.85 ± 0.09 mm, 3.10 ± 0.40 mm, and 5.00 ± 0.20 mm, respectively.
갓 탈피한 1령 유충은 몸 전체가 유백색이고 큰 턱의 앞쪽에만 갈색을 띄었으나 시간이 지나면서 머리와 기문이 갈색으로 변했다. Freshly molten first-larva larvae were milky white and brown only at the front of the large jaw, but over time the head and body turned brown.
1령 초기에는 장폭과 단폭, 무게가 각각 7.21 ± 0.65 ㎜, 1.99 ± 0.12 ㎜, 9.26 ± 1.50 ㎎이었으며, 말기에는 13.41 ± 0.92 ㎜, 3.11 ± 0.24 ㎜, 66.98 ± 10.24 ㎎이었다. At the beginning of the first stage, the long, short, and weight were 7.21 ± 0.65 mm, 1.99 ± 0.12 mm, 9.26 ± 1.50 mg, and 13.41 ± 0.92 mm, 3.11 ± 0.24 mm, 66.98 ± 10.24 mg, respectively.
2령으로 탈피할 시기가 가까워오면 몸의 단폭이 머리의 2 배에 가까워졌다.When the time to escape to 2nd age is near, the body width is closer to twice the head.
갓 2령이 된 유충은 1령 때와 비교하여 무게의 변화가 거의 없었으나, 두폭은 육안으로도 확실히 구분될 정도로 컸다. The larvae, which are now 2 years old, had little change in weight compared to the 1st age, but their width was large enough to be clearly distinguished by the naked eye.
2령 초기에는 장폭과 단폭, 무게가 각각 16.42 ± 0.91 ㎜, 3.75 ± 0.31 ㎜, 114.00 ± 37.46 ㎎이었으며, 말기에는 23.63 ± 1.25 ㎜, 5.76 ± 0.36 ㎜, 377.54 ± 39.66 ㎎이었다.At the beginning of the second stage, the long, short, and weight were 16.42 ± 0.91 mm, 3.75 ± 0.31 mm, 114.00 ± 37.46 mg, respectively, and at the end, 23.63 ± 1.25 mm, 5.76 ± 0.36 mm, and 377.54 ± 39.66 mg.
3령 초기에는 장폭과 단폭, 무게가 각각 25.64 ± 1.84 ㎜, 6.43 ± 0.33 ㎜, 434.33 ± 85.10 ㎎이었으며, 말기에는 33.16 ± 1.84 ㎜, 8.57 ± 0.37 ㎜, 1155.52 ± 172.41 ㎎이었다. At the beginning of age 3, the long, short, and weight were 25.64 ± 1.84 ㎜, 6.43 ± 0.33 ㎜, 434.33 ± 85.10 ㎎, respectively.
1, 2령 유충과 비교해 볼 때 외부형태적인 차이점은 보이지 않았으나 경과 일수가 102.9 일로 3 배 정도 길었다(표 1).Compared with the first and second larvae, no external morphological differences were observed, but the elapsed days were 102.9 days, which was about three times longer (Table 1).
3령 말기(종령 유충)에는 번데기 시기가 가까워지면서 체색이 황색으로 변하고 움직임이 둔해졌다. At the end of 3rd age (terminated larvae), the pupal stage became closer and the body turned yellow and the movement became slow.
또한, 먹이를 먹지 않아 무게가 줄어들고, 플라스틱 튜브 밑바닥에 흙 등을 이용하여 원형의 공간을 만들어 몸을 감싸고 용화(pupation)하였다. In addition, the weight is reduced by not feeding, using a soil on the bottom of the plastic tube to create a circular space to wrap the body and pupation (pupation).
<표 1> 청동풍뎅이의 발달 단계별 크기 및 무게 측정실험 결과<Table 1> Size and weight measurement test results for each stage of development
* 평균±S.D., P<0.01* Mean ± S.D., P <0.01
* a) Park et al.(1994), b) kim et al.(2002)* a) Park et al. (1994), b) kim et al. (2002)
상기의 표 1과 같이 풍뎅이상과(Scarabaeoidea) 중에서 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)와 점박이꽃무지(P. orientalis submarmorea)를 본 발명의 청동풍뎅이와 함께 알 단계에서부터 령 단계까지 크기 및 무게를 비교한 결과, 장폭은 전 기간에 걸쳐 큰 차이를 나타내지 않았고, 체중은 령 유충의 발육단계가 진행될수록 최대 2배 정도의 차이를 보이는 것을 알 수 있었다.White spotted radish ( Protaetia ) in the Scarabeoidea as shown in Table 1 above brevitarsis ) and spotted flower ( P. orientalis) submarmorea ) was compared with the beetle of the present invention from the egg stage to the age stage, the size and weight, the long width did not show a significant difference over the entire period, the weight is up to 2 times as the development stage of the larva It can be seen that the difference.
<실험예 2> 청동풍뎅이의 생장단계별 생존율 측정실험Experimental Example 2 Measurement of Survival Rate by Growth Stage of Bronze Scarab
청동풍뎅이 공시충의 난기, 유충기, 번데기 등의 생존율 측정은 350 마리 전체를 대상으로 하여 관찰 측정하였고, 유충의 령기 구분은 두폭(Head width)의 크기변화와 탈피 유무로 구분하였다. Survival rate of eggs, larvae, and pupa were examined for 350 beetle specimens. The larval stages of caterpillars were divided into two groups: head width and size.
생존율 시험에서는 사용된 개체 중 3 령까지 생존한 개체를 대상으로 조사하였다.In the survival test, the survivors of up to three of the individuals used were examined.
그 결과, 아래의 표 2에서 보는 바와 같이 실내사육에 의한 청동풍뎅이 공시충의 생존율은 알 93.7 %, 1령 83.5 %, 2령 92.3 %, 3령 87.0 %로 나타나 1령 유충의 생존율이 다른 령기 유충들의 생존율에 비해 낮았다(표 2). As a result, as shown in Table 2 below, the survival rate of the beetle beetle by indoor breeding was 93.7%, 1st stage 83.5%, 2nd stage 92.3%, and 3rd stage 87.0%. Compared to their survival (Table 2).
<표 2> 청동풍뎅이의 생장단계별 생존율 측정결과<Table 2> Result of survival rate by growth stage of bronze beetle
<실험예 3> 청동풍뎅이의 생장단계별 기간 측정 실험Experimental Example 3 Experiment for Measuring Period of Growth Stage of Bronze Scarab
청동풍뎅이 공시충의 난기, 유충기, 번데기 등의 생장단계별 기간 측정은 350 마리 전체를 대상으로 하여 관찰 측정하였고, 유충의 령기 구분은 두폭(Head width)의 크기변화와 탈피 유무로 구분하였다. The period of each stage of growth, such as the warmth, larval stage, and pupa of bronze beetle, was observed in all 350 rats. The larval stage of caterpillar was divided into head width and size.
생존율 시험에서는 사용된 개체 중 3 령까지 생존한 개체를 대상으로 조사하였다.In the survival test, the survivors of up to three of the individuals used were examined.
그 결과, 청동풍뎅이 공시충의 생장단계별 기간은 실내사육(18~28℃, 60± 5% R.H., 12L : 12D)에서 청동풍뎅이(Anomala albopilosa)를 사육한 결과 알에서 성충으로 우화하는데 소요된 시간은 187.6 일이었다. As a result, the bronze beetle disclosure caterpillars growth stage indoor breeding period (18 ~ 28 ℃, 60 ± 5% RH, 12L: 12D) in bronze beetle (Anomala albopilosa ), the time from egg to adult maturation was 187.6 days.
이와 같은 결과는 청동풍뎅이가 야외에서 1년에 1세대만을 거치는 것과 비교해 볼 때, 사육조건에 따라서 조절된 환경에서 1년에 2세대 이상의 누대 사육이 가능하다는 것을 말해준다.This result suggests that more than two generations of hens can be reared in a year in a controlled environment according to the breeding conditions, compared to the bronze beetle only passing one generation per year in the open air.
청동풍뎅이 공시충의 발육단계별 평균기간은 알 14.3 일, 1령 19.4 일, 2령 39.2 일, 3령 102.9 일, 번데기 11.8 일 이었다.The mean periods of development of Bronze beetles were 14.3 days, 19.4 days of 1st year, 39.2 days of 2nd year, 102.9 days of 3rd year, and 11.8 days of pupa.
이는 풍뎅이 상과 중 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)와 점박이꽃무지(P. orientalis submarmorea)와 비교해볼 때 알부터 3령 유충까지의 발육기간은 훨씬 길었으나, 번데기 기간은 1/3정도 수준으로 짧게 나타났다(도 3). These are the white spotted radish ( Protaetia brevitarsis ) and the spotted radish ( P. orientalis) submarmorea ), but the developmental period from eggs to 3 larva larvae was much longer, but the chrysalis was shorter to about 1/3 (Fig. 3).
<실험예 4> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 항산화 활성 실험Experimental Example 4 Antioxidant Activity Test against Bronze Scarab Extract of the Present Invention
1. DPPH 라디칼 소거활성에 의한 항산화활성 측정1. Determination of antioxidant activity by DPPH radical scavenging activity
항산화 효과 측정 방법으로 흔히 사용되는 방법으로는 POV(peroxide value), AV(acid value), COV(carbonyl value), IV(iodine value)를 구하는 방법과 DPPH의 환원성을 이용하여 구하는 방법 등이 있다(Bindoli et al., 1977).Commonly used methods for measuring antioxidant effects include obtaining peroxide value (POV), acid value (AV), carbonyl value (COV) and iodine value (IV), and methods using reducibility of DPPH. Bindoli et al ., 1977).
DPPH는 하이드라질(hydrazyl)의 질소원자가 불안정한 상태에 있으므로 쉽게 수소원자를 받아들이는 성질을 가지고 있어, 항산화성 물질과 반응하여 수소원자를 받아들임으로서 자체의 정체성을 잃게 되는 성질을 이용하여 항산화능의 정도를 측정할 수 있게 된다. DPPH has the property of accepting hydrogen atoms easily because the nitrogen atom of hydrazyl is in an unstable state, and the degree of antioxidant capacity is exploited by the property of losing its identity by accepting hydrogen atoms by reacting with antioxidants. Can be measured.
DPPH 라디칼법은 일종의 전자공여능을 측정하는 방법으로 DPPH의 환원정도를 기준으로 측정물질의 환원력과 항산화력을 가늠하게 된다. The DPPH radical method is a measure of the electron donating ability, and it measures the reducing power and antioxidant power of the measured material based on the reduction degree of DPPH.
즉, DPPH는 질소를 중심으로 안정한 라디칼 구조를 하고 있는데, 515 ~ 517 ㎚에서 최대 흡수를 나타내다가 환원이 되어 라디칼(radical)을 소실하게 되면 측정 파장대에서 흡수가 없어지게 되므로 대조구의 흡광도 값과 비교하여 백분율로 나타내어 시료의 환원력 크기, 라디칼 제거활성, 항산화 활성으로 표시하게 된다.In other words, DPPH has a stable radical structure centered on nitrogen, and shows maximum absorption at 515 ~ 517 nm, and when it is reduced and loses radical, the absorption is lost in the wavelength range. It is expressed as a percentage by the size of reducing power, radical scavenging activity, antioxidant activity of the sample.
그러므로, 추출물내의 측정 파장대에서 강하게 흡광하는 물질이 있다면 추출물이 DPPH 라디칼을 제거하게 되고, DPPH 특유의 흡수가 없어지게 되더라도 높은 흡광값을 나타내어 항산화력이 없는 것으로 된다.Therefore, if there is a substance that absorbs strongly in the measurement wavelength band in the extract, the extract removes the DPPH radicals, and even if there is no specific absorption of DPPH, it exhibits a high absorbance value and thus has no antioxidant power.
DPPH 라디칼 소거작용 실험을 통하여 활성산소의 인체 내 독성작용을 저지하는 활성물질 분리는 항산화제가 될 가능성이 있다. In the DPPH radical scavenging experiments, the separation of active substances that inhibit the toxic effects of free radicals in humans could be an antioxidant.
항산화제는 각종 유리 라디칼 또는 유지의 페록시라디칼(peroxy radical)에 수소나 전자의 공여체로 작용하여 비 라디칼 화합물을 상쇄시킴으로써 산패를 억제하는 라디칼 소거제(radical scavenger)가 대표적이며, 그 외의 기능상 금속제거제, 과산화물 분해제와 상승제 등으로 나눌 수 있다. Antioxidants are radical scavengers that inhibit rancidity by acting as donors of hydrogen or electrons to various free radicals or peroxy radicals of fats and oils to offset non-radical compounds, and other functional metals. It can be divided into remover, peroxide decomposer and synergist.
지난 수십 년간 널리 사용되어오던 BHT(butylated hydroxy toluene), BHA(butylated hydroxy anisole)등의 합성 항산화제들은 항산화력은 뛰어나나 그들의 안전성에 관한 우려로 미국, 일본 등 선진 각국에서는 그 사용량이 법적으로 규제되어 천연 항산화제로 대체하는 추세에 있다(Jhee & Yang, 1996).Synthetic antioxidants such as butylated hydroxy toluene (BHT) and butylated hydroxy anisole (BHA), which have been widely used for the past decades, have excellent antioxidant power, but their usage is legally regulated in developed countries such as the US and Japan due to their safety concerns. Is being replaced by natural antioxidants (Jhee & Yang, 1996).
따라서, 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대하여 DPPH 라디칼법을 이용해 소거활성을 측정하였다.Therefore, the scavenging activity of the bronze beetle extract of the present invention was measured using the DPPH radical method.
본 발명의 실시예 3 및 4의 청동풍뎅이 추출물을 준비하였다.Bronze Scarab extracts of Examples 3 and 4 of the present invention were prepared.
준비한 각각의 추출물의 상층액을 회수하고 감압농축한 후, 메탄올에 녹인 각각의 시료를 준비하였다.The supernatant of each of the prepared extracts was collected and concentrated under reduced pressure, and then each sample dissolved in methanol was prepared.
각 시료를 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고, 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 100 μl of each sample was dispensed into a 96 well plate, and 0.4 mM DPPH solution was added in the same amount, and left at room temperature for 10 minutes, and the absorbance was measured at 517 nm.
대조군으로는 butylated hydroxy anisole(BHA)과 트롤록스(trolox)를 사용하였다. Butyl hydroxy anisole (BHA) and trolox were used as controls.
DPPH 라디칼 소거활성은 아래식으로부터 산출하였고 DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3 회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.DPPH radical scavenging activity was calculated from the following equation and expressed as the concentration of the sample (IC 50 ) which appears when the absorbance of DPPH was reduced by 50%. Each sample was repeated three times and the average value was obtained.
DPPH radical 소거활성 (%) = (Acontrol - Asample)/ Acontrol × 100DPPH radical scavenging activity (%) = (A control -A sample ) / A control × 100
Asample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도A sample = Absorbance of the reaction solution to which the sample is added
Acontrol = 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도A control = Absorbance of the reaction solution with methanol instead of the sample
그 결과, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 유충(3령) 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 측정 결과를 도 5에 나타내었다.As a result, the bronze beetle ( Anomala) of the present invention albopilosa ) The results of DPDP radical scavenging activity of adults and larvae (3 years) ethanol extract are shown in FIG. 5.
이들의 DPPH 라디칼 소거 활성은 모두 농도 의존적으로 증가함을 보였으며, 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 대조군으로 사용한 천 연 합성물질보다는 약했지만 IC50값이 각각 280.02 ㎍/㎖와 483.39 ㎍/㎖를 나타내어 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었다(표 3).Their DPPH radical scavenging activity was increased in a concentration dependent manner. DPPH radical scavenging activity of adult and 3 larvae ethanol extracts was weaker than the natural synthetics used as a control, but IC 50 values were 280.02 ㎍ / ml and 483.39 [mu] g / ml was shown, indicating a relatively high antioxidant activity (Table 3).
2. 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase) 억제 및 과산화물(Superoxide) 소거 활성 측정2. Xanthine oxidase Inhibition and Superoxide Scavenging Activity
청동풍뎅이 에탄올 추출물들의 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 저해 활성과 과산화물(superoxide) 라디칼 소거활성을 크산틴/크산틴 산화효소 시스템(xanthine/xanthine oxidase system)에 의해 측정하였다.The xanthine oxidase inhibitory activity and the superoxide radical scavenging activity of the bronze beetle ethanol extracts were measured by the xanthine / xanthine oxidase system.
기질로 하여 요산을 생성하는 과정에서 과산화물 라디칼을 생성하는 효소이다(Cheng et al ., 1998). It is an enzyme that produces peroxide radicals during the production of uric acid as a substrate (Cheng et al. al ., 1998).
통풍은 요산의의 수치가 높아지면서 일어나며 이들이 결정체를 이루어 관절에 흡착하여 염증이 생기며, 심한 경우 신장이나 심장 등에 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있다.Gout occurs as the level of uric acid increases, and they form crystals and adsorb on the joints, causing inflammation, and in severe cases, it is known to cause complications in the kidneys and the heart.
크산틴 산화효소 저해제는 통풍, 신장결적, 허혈, 심근증을 일으키는 요산혈증에 대한 치료제로 사용되어 왔으며, 통풍치료에 사용되는 물질로는 알로푸리놀(allopurinol), 알록산틴(alloxanthine)등이 알려져 있다. Xanthine oxidase inhibitors have been used for the treatment of uric acid causing gout, kidney defects, ischemia and cardiomyopathy, and allopurinol and alloxanthine are known to be used for the treatment of gout. .
따라서, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 추출물의 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 저해효과를 알아보았고, 또한 이들이 크산틴 산화효소의 활성으로 생성된 과산화물 라디칼에 대한 소거 활성능도 나타내는지를 알아보았다.Therefore, the bronze beetle ( Anomala) of the present invention We investigated the inhibitory effect of xanthine oxidase on albopilosa extracts and also examined whether they exhibit scavenging activity against peroxide radicals generated by xanthine oxidase activity.
크산틴/크산틴 산화효소(Xanthine/xanthine oxidase)에 의한 요산(uric acid) 생성은 290 ㎚에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 과산화물(superoxide)의 양은 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT) 환원방법에 의해 측정하였다(Cheng et al., 1998). The production of uric acid by Xanthine / xanthine oxidase was measured by increased absorbance at 290 nm, and the amount of superoxide was reduced to nitroblue tetrazolium (NBT). It was measured by the method (Cheng et al ., 1998).
반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM 크산틴(xanthine)과 1 mM EDTA를 200 mM phosphate buffer(pH 7.5) 100 ㎕에서 준비하였고, 50 mU/㎖ 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)를 첨가하여 요산(uric acid)의 생성을 유도하였다.The reaction solution was prepared in various concentrations of each sample, 100 μl of 0.5 mM xanthine and 1 mM EDTA in 200 mM phosphate buffer (pH 7.5), and 50 mU / ml xanthine oxidase was added thereto. Induced production of uric acid.
과산화물(Superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응시켰다. Superoxide scavenging activity was reacted by adding 0.5 mM NBT to the reaction solution.
크산틴 산화효소 억제 및 과산화물 소거활성은 각각 생성된 요산과 과산화물의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.Xanthine oxidase inhibition and peroxide scavenging activity were expressed by the concentration of the sample (IC 50 ) which appears when the absorbance of the produced uric acid and peroxide decreased by 50%, respectively.
그 결과, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 저해 활성은 비록 그 저해효과가 낮았지만, 추출물의 농도가 높아질수록 크산틴 산화효소에 대한 저해효과를 높여주는 것으로 나타났다(도 6).As a result, the bronze beetle ( Anomala) of the present invention albopilosa ) xanthine oxidase inhibitory activity of adult and 3 larva ethanol extracts, although the inhibitory effect was low, the higher the concentration of the extract was shown to increase the inhibitory effect on xanthine oxidase (Fig. 6). ).
크산틴/크산틴 산화효소 시스템(Xanthine/xanthine oxidase system)에 의해 생성된 과산화물 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 도 7과 같다. The results of measuring the peroxide radical scavenging activity generated by the xanthine / xanthine oxidase system are shown in FIG. 7.
청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 superoxide radical 소거 활성은 모두 농도 의존적으로 증가함을 보였으나, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충 에탄올 추출물이 3령 유충 에탄올 추출물에서보다 과산화물 라디칼 소거활성이 다소 높게 나타나는 경향을 보였다. Bronze Scarab ( Anomala albopilosa) and showed that the adult and superoxide radical scavenging activity of the third instar larvae of ethanol extract all increase in a concentration-dependent manner, bronze beetle (Anomala albopilosa ) Adult ethanol extract showed a tendency of higher peroxide radical scavenging activity than that of larvae larvae.
정상적인 oxidative phosphylation의 과정동안 소모되는 전체 산소의 0.4 ~ 4 % 정도는 자유라디칼 과산화물(free radical superoxide, ·O2 -)로 전환되며 생성된 ·O2 -는 다른 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 전환되어 직접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. Normal 0.4 ~ 4% of the total oxygen that is consumed during the course of the oxidative phosphylation are free radical peroxide (free radical superoxide, · O 2 -) to be a · O 2 generates switching-other reactive oxygen species (reactive oxygen species, ROS Is known to cause cell damage directly or indirectly.
정상적으로는·O2 -는 내인성 항산화 방어기전에 의해 SOD(superoxide dismutase)에 의해 빠르게 과산화수소로 전환된다. Normally , O 2 - is rapidly converted to hydrogen peroxide by SOD (superoxide dismutase) by endogenous antioxidant defense mechanisms.
그러나, 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화-환원 균형을 유지하는 데에 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며, 이 산화스트레스는 직접적으로 세포내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.However, if this endogenous antioxidant defense system has problems in maintaining the intracellular redox balance, the result is oxidative stress, which directly causes cellular macromolecule damage or cell damage. Plays an important role.
3. 산화질소(Nitric oxide) 소거 활성 측정3. Determination of Nitric Oxide Scavenging Activity
질소산화물(nitric oxide: NO)은 활성종으로서 세포독성이 강하며 다량의 NO가 생성되면 니트로소화(nitrosation), 니트로화(nitration)와 같은 간접적 효과 및 산화반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다. Nitric oxide (NO) is an active species with high cytotoxicity. When a large amount of NO is produced, indirect effects such as nitrosation and nitration and oxidative reactions cause harmful effects.
특히 대식세포가 활성화 되면서 생성되는 NO는 주위조직에 세포독성을 나타내는 것으로 유명한데, NO의 반감기는 6 ~ 10 초로 대단히 짧아 실질적으로 직접 검출하여 연구하는데 어려움이 많으므로 대부분의 NO 연구는 NOS 발현 유무나 NO의 안정화된 부산물인 아질산염(nitrite) 및 질산염(nitrate)을 측정하여 간접적으로 이루어지고 있다.In particular, NO produced when macrophages are activated is known to exhibit cytotoxicity to surrounding tissues. Since the half-life of NO is very short, 6 to 10 seconds, it is difficult to detect and study directly. It is done indirectly by measuring nitrite and nitrate, which are stabilized by-products of NO.
자연적으로 산화질소(nitric oxide, NO)를 생성하는 물질인 니트로프루시드나트륨(sodium nitroprusside, SNP)을 사용하여 시료의 산화질소 소거 활성을 측정하였다. Nitric oxide scavenging activity of the sample was measured using sodium nitroprusside (SNP), a substance that naturally produces nitric oxide (NO).
10 mM SNP 용액 200 ㎕에 시료를 농도별로 첨가하고 25 ℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. Samples were added to 200 μl of 10 mM SNP solution by concentration and reacted at 25 ° C. for 3 hours.
반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess시약 [2.5% (v/v) phosphoric acid에서 1% (w/v) sulfanilamide와 0.1% (w/v) naphylethylenediamine]을 첨가하였다. After the reaction, the same amount of Griess reagent [1% (w / v) sulfanilamide and 0.1% (w / v) naphylethylenediamine] in 2.5% (v / v) phosphoric acid was added.
실온에서 10 분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 산화질소 소거활성을 산출하였다. After reacting at room temperature for 10 minutes, absorbance was measured at 540 nm to calculate nitric oxide scavenging activity by the amount of nitrite remaining.
산화질소(Nitric oxide) 소거활성은 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.Nitric oxide scavenging activity was expressed as the concentration of the sample (IC 50 ) that appears when the absorbance was reduced by 50%.
청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 산화질소 생성저해 활성은 NO를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside (SNP)를 사용하여 아질산염(nitrite)의 양으로 NO 소거활성을 산출하였다.Bronze Scarab ( Anomala albopilosa) it was calculated for both adults and third instar larvae of the NO scavenging activity of ethanol extract nitrite (nitrite) production-inhibiting activity of nitric oxide by using the material of sodium nitroprusside (SNP) to generate NO in.
청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 Nitric oxide 생성저해 활성이 그다지 높게 나타나지 않았으나, 도 8에서 나타내는 것과 같이 고농도로 갈수록 농도 의존적으로 다소나마 산화질소 생성저해 활성을 갖고 있었다.Bronze Scarab ( Anomala albopilosa ) Nitric oxide production inhibitory activity of the adult and larva larvae ethanol extract did not appear very high, but as shown in FIG.
<표 3> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 항산화활성 측정실험 결과Table 3 Antioxidant Activity Test Results for the Bronze Scarab Extract of the Present Invention
* a) IC50(㎍/㎖) 값은 5 종류의 다른 농도로 처리하여 실험한 3회 반복실험 결과로 계산된 것임.* a) The IC50 (µg / mL) value is calculated from the results of three replicates, which were performed at five different concentrations.
* b) NA는 Not available method.b) NA is not available method.
<실험예 5> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 항염활성 실험Experimental Example 5 Anti-inflammatory Activity Test of Bronze Scarab Extract of the Present Invention
1. 세포배양1. Cell Culture
조골세포 계열(human osteoblast cell line)인 MG-63 세포와 대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양 받아 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 units/㎖과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하였으며, MG-63 세포는 4 일에 한번씩, RAW 264.7 세포는 3 일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.MG-63 cells, a human osteoblast cell line, and RAW 264.7 cells, a murine macrophage cell line, are supplied from Korean Cell Line Bank (KCLB) and penicillin-
2. 산화질소 생성 억제율 검색2. Detection of nitric oxide production inhibition rate
내독소로 잘 알려진 LPS는 그람음성균의 세포외막에 존재하며, RAW 264.7과 같은 macrophage 또는 monocyte에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Axtelle & Pribble, 2001). LPS, known as endotoxin, is present in the extracellular membrane of Gram-negative bacteria and is known to increase pro-inflammatory cytokine such as TNF-α, IL-6 and IL-1β in macrophages or monocytes such as RAW 264.7 (Axtelle & Pribble, 2001).
또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 phospholipase A2의 활성으로 인해 arachidonic acid가 prostagladin으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다. In addition, the formation of these inflammatory mediators leads to a process of converting arachidonic acid to prostagladin and NO formation due to phospholipase A2 activity.
Nitric oxide(NO)는 NO synthase(NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다(Vane, 1971). Nitric oxide (NO) is an inorganic free body produced from L-arginine by NO synthase (NOS) and is known to be involved in various biological processes such as immune response, cytotoxicity, neurotransmitter and vascular relaxation. It plays an important role in maintenance and also causes cytotoxicity (Vane, 1971).
이에 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 murine macrophage cell line RAW 264.7로부터의 LPS(1 ㎍/㎖) 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 정도 및 그 독성정도를 확인해 보았다.Bronze Scarab ( Anomala) albopilosa ) The effects of NO formation and its toxicity on the stimulation of LPS (1 ㎍ / ㎖) from murine macrophage cell line RAW 264.7 were investigated.
RAW 264.7 세포에 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 nitric oxide(NO) 생성 억제 효과를 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. Bronze Scarab ( Anomala) on RAW 264.7 cells albopilosa ) Adult and three larva ethanol extracts were treated with different concentrations to determine nitric oxide (NO) production inhibition effect in the form of NO 2 - present in cell culture.
즉, RAW264.7 세포를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0× 105 cells/㎖로 조절한 후 48 well plate에 접종하고, 시험물질과 LPS(1㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다. That is, RAW264.7 cells were adjusted to 1.0 × 10 5 cells / mL using DMEM medium containing 10% FBS, inoculated into 48 well plates, and treated with test material and LPS (1㎍ / mL) simultaneously. Incubated for 24 hours.
생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. The amount of NO produced was measured in the form of NO 2 − present in the cell culture solution using Griess reagent.
세포배양 상층액 100 ㎕와 Griess시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10 분 동안 반응시킨 후 530 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO2)를 표준으로 비교하였다.Mix 100 µl of cell culture supernatant with 100 µl of Griess reagent [1% (w / v) sulfanilamide, 0.1% (w / v) naphylethylenediamine in 2.5% (v / v) phosphoric acid] for 10 minutes on 96 well plates. After the reaction, the absorbance was measured at 530 nm, and the amount of generated NO was compared with sodium nitrite (NaNO 2 ) as a standard.
그 결과, LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 동시에 처리한 시험구에서는 NO 생성량이 처리 농도별에 따라 농도 의존적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(도 9). As a result, it was confirmed that the excessive generation of NO in the LPS alone treatment group, the bronze beetle of the present invention ( Anomala albopilosa ) It was confirmed that the NO production was reduced in a concentration-dependent manner according to the treatment concentration in the test zone treated with adult and three larva ethanol extract at the same time (Fig. 9).
3. LDH 세포독성 검색3. LDH Cytotoxicity Search
Lactate dehydrogenase(LDH)는 대부분의 세포에 존재하는 stable cytoplasmic enzyme으로 cytoplasmic membrane이 damage를 입으면 세포배양액으로 분비된다. 따라서 손상을 입은 세포가 분비하는 LDH activity를 측정하는 간편하고 간단한 colorimetric assay 방법이다. 본 실험에서는 LDH cytotoxicity detection kit (Takara)를 사용하여 492㎚에서 activity를 측정하였다. Lactate dehydrogenase (LDH) is a stable cytoplasmic enzyme present in most cells and is secreted into cell culture media when the cytoplasmic membrane is damaged. Therefore, it is a simple and simple colorimetric assay to measure the LDH activity of damaged cells. In this experiment, LDH cytotoxicity detection kit (Takara) was used to measure activity at 492nm.
그 결과, Lactate dehydrogenase(LDH)에 의한 독성 평가결과 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충은 NO 형성 억제효과가 농도 의존적으로 억제되는 경향을 보였지만 고농도에서는 다소 독성을 나타냈다. As a result, the results of toxicity evaluation by Lactate dehydrogenase (LDH) resulted in bronze beetle ( Anomala). albopilosa ) Adults tended to suppress NO formation inhibitory effect in a concentration-dependent manner, but at high concentrations they were somewhat toxic.
반면, 유충의 에탄올 추출물에서는 NO 형성 억제효과가 농도 의존적으로 높게 나타났으며, 독성효과도 거의 나타나지 않았다.On the other hand, the ethanol extract of larvae showed a high concentration-dependent effect on NO formation, and showed no toxic effect.
<실험예 6> 본 발명의 청동풍뎅이 추출물에 대한 골대사 관련 인자 억제활성 실험Experimental Example 6 Inhibitory Activity against Bone Metabolism of Bronze Scarab Extract of the Present Invention
골다공증의 치료는 골 질량을 증가시켜 골절의 감소 또는 방지하는데 그 목적이 있다. Treatment of osteoporosis aims to reduce or prevent fractures by increasing bone mass.
이때 증가된 골 양의 정도뿐 아니라 어느 부위에 어떠한 질(quality)의 골이 증가되는가하는 것도 중요하다. At this time, it is important not only to increase the amount of bone, but also to what site the quality of bone is increased.
에스트로겐이 골소실의 감소 및 방지하는 기전에 대해서 정확히 밝혀져 있지는 않지만 여성 호르몬은 폐경 후 여성에서 조골세포 및 골수기질 조골세포들을 조 절해서 증가된 IL-6(Interleukin-6) 생성을 억제하여 파골세포의 활동을 감소시키며(Grasol et al., 1992), 또한 파골세포의 예정사(apoptosis)를 증가시켜 골 양의 감소를 나타낸다(Hughes et al., 1996).Although estrogen is not known to reduce or prevent bone loss, female hormones regulate osteoclasts by controlling osteoblasts and bone marrow stromal osteoblasts in postmenopausal women to inhibit increased production of IL-6 (Interleukin-6). Reduces the activity of (Grasol et al ., 1992), which also increases the apoptosis of osteoclasts, indicating a decrease in bone mass (Hughes et. al ., 1996).
IL-6(Interleukin-6)는 파골세포성 골 흡수를 조절하는 다 기능적 사이토카인이며 폐경기 골다공증(Jilka et al., 1992), 파젯병(Paget's disease) (Roodman et al., 1992), 그리고 류마티스 관절염(Ohashima et al., 1998)을 포함한 많은 골질환의 병인에 영향을 끼친다. Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine that regulates osteoclast bone resorption and is characterized by postmenopausal osteoporosis (Jilka). et al ., 1992), Paget's disease (Roodman et al ., 1992), and rheumatoid arthritis (Ohashima et al . al ., 1998), which affect the pathogenesis of many bone diseases.
IL-6(Interleukin-6)는 골 흡수 인자다. IL-6 (Interleukin-6) is a bone resorption factor.
골에서 IL-6는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone)에 의해서 조절되는 조골세포성 세포에 의해 생성 된다(Feyen et al., 1989). In bone, IL-6 is produced by osteoblasts that are regulated by parathyroid hormones (Feyen et. al ., 1989).
조골세포에서 생성된 IL-6는 주변의 골 흡수에 중요한 역할을 하는 파골세포의 형성/분화를 유발 시킨다(Lowik et al., 1989). IL-6 produced in osteoblasts leads to the formation / differentiation of osteoclasts, which play an important role in the absorption of surrounding bone (Lowik et al. al ., 1989).
또한, 조골세포에서 IL-6 생성은 에스트로겐 매개체를 통하여 에스트로겐에 의해 조절되어진다고 보고되어져 왔다(Jilka et al., 1992). It has also been reported that IL-6 production in osteoblasts is regulated by estrogen through estrogen mediators (Jilka et al. al ., 1992).
이에 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 IL-6의 생성 억제정도를 조사하였다. Bronze Scarab ( Anomala) of Adult and Third Larvae Ethanol Extracts The degree of inhibition of IL-6 production was examined.
IL-1β가 조골세포(osteoblast)에서 IL-6 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 IL-1β(10ng/㎖)를 처리하여 조골세포 계열인 MG-63 세포로부터 IL-6의 생성을 유도하였다.Since IL-1β is known to increase IL-6 production in osteoblasts, IL-1β (10 ng / ml) was treated to induce the production of IL-6 from MG-63 cells.
1. Interleukin-6 생성 및 정량1. Production and Quantification of Interleukin-6
조골세포 계열인 MG-63 세포(4.0 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 접종하고, 5 % CO2 항온기에서 18 시간 전 배양하였다. Osteoblast-like MG-63 cells (4.0 × 10 5 cells / ml) were inoculated in 24 well plates using DMEM medium and incubated 18 hours before in a 5% CO 2 incubator.
이후 배지를 제거하고 10 배 농도(1 ㎎/㎖)로 조제된 시험물질 50 ㎕와 IL-1β(10ng/㎖) 450 ㎕를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. Thereafter, the medium was removed, and 50 μl of test substance prepared at 10-fold concentration (1 mg / ml) and fresh medium containing 450 μl of IL-1β (10 ng / ml) were simultaneously treated and cultured under the same conditions as in the previous culture.
24 시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 IL-6 함량을 측정하였다(Tolonen et al., 2002). After 24 hours, the culture medium was centrifuged (12,000 rpm, 3 minutes) to measure the IL-6 content of the supernatant obtained (Tolonen et. al ., 2002).
모든 시료는 정량 전까지 -20 ℃ 이하에 보관하였다. All samples were stored below -20 ° C until quantification.
IL-6 정량은 human enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit (Farmingen system, Inc, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.IL-6 was quantified using human enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Farmingen system, Inc, USA) and r 2 of the standard curve for the standard. The value was 0.99 or more.
2. RNA 분리2. RNA Isolation
MG-63 세포(4.0 × 105 cells/㎖)를 18시간 전 배양하고 10배 농도로 조제된 시험 약물과 IL-1β(10 ng/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 TRI-reagent(MRC)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. MG-63 cells (4.0 × 10 5 cells / mL) were incubated 18 hours ago and treated with 10-fold concentrations of test drug and IL-1β (10 ng / mL) for 24 hours, followed by TRI-reagent ( Total RNA was isolated using MRC).
세포에 TRI-reagent를 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심 분리(15000rpm, 15분)시켰다. The cells were homogenized by addition of TRI-reagent, and then centrifuged (15000 rpm, 15 minutes) by addition of chloroform.
상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리(12000rpm, 8분)시켜 RNA를 침전시키고 75 %의 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 에탄올을 첨가하여 원심 분리(10000rpm, 5분)시킨 후, 건조시켜 DEPC가 처리된 증류수에 녹였다. Equivalent amount of isopropanol was added to the supernatant and centrifuged (12000 rpm, 8 minutes) to precipitate RNA. 75% DEPC (diethyl pyrocarbonate) treated ethanol was added, centrifuged (10000 rpm, 5 minutes), and then dried and dried. Was dissolved in treated distilled water.
260㎚에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, 260㎚에서의 흡광도와 280㎚에서의 흡광도 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다.RNA was quantified by measuring absorbance at 260 nm, and RNA having a value in the range of absorbance at 260 nm and absorbance at 280 nm in the range of 1.7 to 1.9 was used for the experiment.
모든 실험은 RNase-free한 조건하에서 이루어졌다.All experiments were done under RNase-free conditions.
3. RT-PCR 3. RT-PCR
1㎍의 total RNA를 oligo(dT)18 primer, dNTP(0.5μM), 1unit RNase inhibitor와 M-MuLV reverse transcriptase (2U)로 70℃ 5분, 25℃ 5분, 37℃ 60분, 그리고 70℃에서 10분 heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. 1 μg total RNA was oligo (dT) 18 primer, dNTP (0.5μM), 1unit RNase inhibitor and M-MuLV reverse transcriptase (2U) at 70 ℃ for 5min, 25 ℃ for 5min, 37 ℃ for 60min, and 70 ℃ The reaction was stopped by heating at 10 minutes at.
Polymerase chain reaction (PCR)은 합성된 cDNA로부터 IL-6 및 β-Actin을 증폭시키기 위하여 2㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3'primer, 10x buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM MgCl2, 1unit Taq polymerase (Promega, USA)를 섞고 distilled water로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cycler를 이용하여 실시하였다. Polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify IL-6 and β-Actin from the synthesized cDNA, 2 μl cDNA, 4 μM 5 'and 3'primer, 10x buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM MgCl 2 , 1unit Taq polymerase (Promega, USA) were mixed and the whole was adjusted to 25 μl with distilled water and then carried out using a Perkin-Elmer Thermal Cycler.
이때, PCR 조건은 94℃/20초, 55 ~ 62℃/30초, 72 ℃/40초, 30 cycle이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.2 % agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band를 확인하였다(표 4).At this time, PCR conditions are 94 ℃ / 20 seconds, 55 ~ 62 ℃ / 30 seconds, 72 ℃ / 40 seconds, 30 cycles, the product produced by PCR is subjected to electrophoresis on 1.2% agarose gel and stained with ethidium bromide Specific bands were identified (Table 4).
<표 4> RT-PCR 분석시 사용한 프라이머 염기서열<Table 4> Primer base sequence used in RT-PCR analysis
4. 결과4. Results
그 결과, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 단독 처리 시에는 IL-6의 생성에는 영향을 주지 않았다(date not shown).As a result, the bronze beetle ( Anomala of Adult and Third Larvae Ethanol Extracts Treatment alone did not affect the production of IL-6 (date not shown).
하지만, IL-1β와 함께 각각 다른 농도의 추출물을 처리한 결과 IL-6 생성에서 IL-1β 단독처리에 비해 농도 의존적인 억제 효과를 보였다. However, treatment with different concentrations of extracts with IL-1β showed a concentration-dependent inhibitory effect on IL-6 production compared to IL-1β alone.
이러한 결과는 IL-6 억제가 세포 독성에 의하지 않은 것임을 보여준다(도 10). These results show that IL-6 inhibition is not due to cytotoxicity (FIG. 10).
IL-6 생성억제가 mRNA 발현을 억제한 결과인지를 조사하기 위하여 IL-1β와 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물 시료를 함께 처리하여 IL-1β에 의한 IL-6 mRNA 발현에 대한 억제효과를 조사하였다. IL-1β and Bronze Scarab ( Anomala) to Investigate IL-6 Inhibition as a Result of Inhibiting mRNA Expression albopilosa ) The adult and three larvae ethanol extract samples were treated together to investigate the inhibitory effect on IL-6 mRNA expression by IL-1β.
그 결과, 청동풍뎅이(Anomala albopilosa) 성충과 3령 유충 에탄올 추출물에서 농도 의존적으로 모두 IL-6 억제효과가 나타났으나, 특히 3령 유충 에탄올 추출물에서 고농도로 갈수록 다소나마 억제 효과가 크게 나타났는데, 이는 IL-1β에 의해 발현되는 IL-6 억제에 중요한 작용을 함을 알 수 있었다. As a result, the bronze beetle ( Anomala albopilosa ) Both adult and third larva ethanol extracts showed IL-6 inhibitory effects, but especially the third larva ethanol extract showed a higher inhibitory effect at higher concentrations, which were expressed by IL-1β. It was found to play an important role in inhibiting IL-6.
β-Actin을 같이 나타내줌으로써 동일한 양의 RNA를 가지고 실험에 이용한 것을 보여주었다(도 11).By showing β-Actin together, it was shown that the same amount of RNA was used in the experiment (FIG. 11).
본 발명에 의해서, 항산화활성, 항염활성, 골대사 관련인자 억제활성의 다양한 생리활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물이 제공된다.According to the present invention, there is provided a bronze beetle extract exhibiting various physiological activities of antioxidant activity, anti-inflammatory activity, inhibitory activity of bone metabolism-related factors.
또한, 청동풍뎅이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제 조성물, 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물과 골대사성 질환의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.In addition, there is provided an antioxidant composition comprising a bronze beetle extract as an active ingredient, a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases and a composition for the prevention and treatment of bone metabolic diseases.
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