KR100831335B1 - Chitooligosaccharides compounds for inhibiting the activation and expression of matrix metalloproteinase-2 in human dermal fibroblasts and matrix metalloproteinase-2 inhibitors containing the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 MMP-2의 발현 및 활성을 억제시키는 하기 화학식 1의 COS 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 MMP-2 억제제에 관한 것으로, 이들은 MMP-2 활성과 관련된 질환의 상처, 암전이, 류마토이드, 관절염, 염증, 부갑상선항진증, 당뇨병, 각막궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 여드름, 화상, 치주질환, 동맥경화 또는 골절 치료에 효과적이다.The present invention relates to a COS compound represented by the following Chemical Formula 1, which inhibits the expression and activity of MMP-2, and an MMP-2 inhibitor containing the same as an active ingredient, which includes wounds, cancer metastases, rheumatoids, It is effective in treating arthritis, inflammation, hyperparathyroidism, diabetes, corneal ulcer, osteoporosis, gastric ulcer, trauma, acne, burns, periodontal disease, arteriosclerosis or fracture.

<화학식 1><Formula 1>

(상기 식에서, R1은 COCH₃기이다)Wherein R 1 is a COCH ₃ group

메트릭스메탈로프로테이나제-2, 키토올리고사카라이드, 인간피부섬유아세포 Matrix Metalloproteinase-2, Chitooligosaccharides, Human Skin Fibroblasts

Description

인간 피부 섬유아세포에서 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 발현 및 활성을 억제시키는 키토올리고사카라이드 화합물 및 이를 함유한 메트릭스 메탈로프로테이나제-2 억제제{Chitooligosaccharides compounds for inhibiting the activation and expression of matrix metalloproteinase-2 in human dermal fibroblasts and matrix metalloproteinase-2 inhibitors containing the same}Chitooligosaccharides compounds for inhibiting the activation and expression of matrix metalloproteinases that inhibit the expression and activity of matrix metalloproteinase-2 in human dermal fibroblasts -2 in human dermal fibroblasts and matrix metalloproteinase-2 inhibitors containing the same}

도 1은 FBS의 존재 또는 부재하에 HDF의 생존력에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the effect of different molecular weight COS on the viability of HDF in the presence or absence of FBS.

도 2는 처리 농도를 갖는 HDF에서 MMP-2 활성에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과를 나타낸 도이다. 2 is a diagram showing the effect of different molecular weight COS on MMP-2 activity in HDF with treatment concentration.

도 3은 배양 시간에 따른 HDF에서 MMP-2 활성에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과를 나타낸 도이다.Figure 3 is a diagram showing the effect of COS of different molecular weight on MMP-2 activity in HDF with incubation time.

도 4는 분자량이 상이한 COS로 처리한 후 HDF에서 프로MMP-2 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸 도이다.4 is a Western blot for proMMP-2 protein expression in HDF after treatment with different molecular weight COS.

도 5는 HDF에서 MMP-2 프로모터 활성의 전사 활성에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과를 나타낸 도이다. 5 is a diagram showing the effect of COS of different molecular weights on the transcriptional activity of MMP-2 promoter activity in HDF.

도 6은 HDF에서 MMP-2 및 c-fos 유전자 발현에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과를 나타낸 도이다.6 is a diagram showing the effect of COS of different molecular weights on MMP-2 and c-fos gene expression in HDF.

본 발명은 MMP-2의 억제제로서 COS 화합물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 HDF에서 MMP-2의 발현 및 활성을 억제시키는 COS 화합물 및 이를 유효 성분으로 함유한 MMP-2 억제제에 관한 것이다.The present invention relates to a COS compound as an inhibitor of MMP-2, and more particularly to a COS compound that inhibits the expression and activity of MMP-2 in HDF and an MMP-2 inhibitor containing the same as an active ingredient.

<화학식 1><Formula 1>

(상기 식에서, R1은 COCH₃기이다)Wherein R 1 is a COCH ₃ group

본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 및 그의 약어 의미는 다음과 같고, 특별한 정의가 없는 것은 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.The terms used throughout this specification and their abbreviated meanings are as follows, and those without special definitions have the meanings commonly used in the art.

메트릭스 메탈로프로테이나제 : matrix metalloproteinase, MMPMatrix metalloproteinases: matrix metalloproteinase, MMP

키토올리고사카라이드 : Chitooligosaccharides, COSChitooligosaccharides: Chitooligosaccharides, COS

인간 피부 섬유아세포 : human dermal fibroblasts, HDFHuman dermal fibroblasts, HDF

프로볼 12-미리스테이트 13-아세테이드 : phorbol 12-myristate 13-acetate, PMAProbol 12-myristate 13-acetate: phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA

소 태반 혈청 : fetal Bovine Serum, FBSBovine placenta serum: fetal Bovine Serum, FBS

DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium

3-(4,5-디메틸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 : 3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide: 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT

세포외 메트릭스 : extracellular metrix, ECMExtracellular matrix: extracellular metrix, ECM

활성화 단백질-1 : Activator Protein-1, AP-1Activator Protein-1: Activator Protein-1, AP-1

무독성 생중합체인 키토산은 부분적으로 디아세틸화된 N-아세틸 글루코사민 중합체로서, 갑각류 및 절지동물의 외골격으로부터 유래된 키틴을 알칼리성 디아세틸화시켜 얻어진다. 이들은 항종양 활성, 항균 활성, 항돌연변이 활성 및 면역-증진 효능과 같은 생리학적 작용으로 인해 생물의학 및 화학 분야에서 상업적 용도에 상당한 주목을 받아왔다. Chitosan, a non-toxic biopolymer, is a partially diacetylated N-acetyl glucosamine polymer obtained by alkaline diacetylation of chitin derived from crustaceans and exoskeleton of arthropods. They have received considerable attention for commercial use in biomedical and chemical fields due to physiological actions such as antitumor activity, antimicrobial activity, antimutagenic activity and immuno-enhancing efficacy.

최근 들어, 상처 치료제, 항균제, 피부 이식 템플릿 및 약물 전달 부형제로서의 키토산의 용도에 대해 많은 관심이 집중되고 있다. In recent years, a great deal of attention has focused on the use of chitosan as a wound treatment, antimicrobial, skin transplant template and drug delivery excipient.

이러한 키토산의 부분적 탈수 생성물인 COS는 높은 용해성 및 비독성으로 인해 제약 및 의학적 용도에 있어 커다란 이점을 지니고 있다. COS, a partially dehydrated product of chitosan, has great advantages for pharmaceutical and medical applications due to its high solubility and nontoxicity.

한편, MMP는 생리학적 조건하에서 섬유질화 또는 비섬유질화 콜라겐, 피브로 넥틴, 라미닌, 엘라스틴 및 기저막 글리코프로테인과 같은 ECM을 소화시킬 수 있는 일군의 분비 또는 막투과 아연-엔도펩티다제이다. MMPs, on the other hand, are a group of secretory or transmembrane zinc-endopeptidases capable of digesting ECMs, such as fibrinated or nonfibrillated collagen, fibronectin, laminin, elastin and basement glycoproteins under physiological conditions.

MMP는 ECM과 연계된 조직 형태 형성, 조직 회복 및 혈관신생의 생리학적 퇴화 뿐만 아니라, 만성 염증, 주름 형성, 관절염, 골다공증, 치주질환, 종양 침습 및 전이와 같은 과도한 ECM 퇴화로 특징지워지는 병리 증상에 있어 중요한 역할을 한다.MMP is a pathological condition characterized by excessive ECM degeneration, such as chronic inflammation, wrinkle formation, arthritis, osteoporosis, periodontal disease, tumor invasion, and metastasis, as well as tissue morphogenesis, tissue repair, and physiological degeneration of angiogenesis associated with ECM. Plays an important role in

세포외 공간에서의 이러한 MMP의 활성 억제는 전이 및 주름 형성을 억제하기 위한 시도로서 광범위하게 연구되고 있다. Inhibition of the activity of such MMPs in the extracellular space has been extensively studied as an attempt to inhibit metastasis and wrinkle formation.

최근 들어, 몇몇의 MMP 억제제가 임상적으로 시험되고 있고, 이들 MMP 억제제 중 주요한 것으로는 합성 펩타이드, 화학적 개질된 테트라시클라인, 천연 원료로부터 분리된 바이오포스페이트 또는 화합물이 있다. 그러나, 이들 주요한 약물은 힘줄과 관절에서의 근골격 통증과 같은 부작용이 있는 것으로 보고된 바 있다. In recent years, several MMP inhibitors have been clinically tested and the main ones of these MMP inhibitors are synthetic peptides, chemically modified tetracyclines, biophosphates or compounds isolated from natural sources. However, these major drugs have been reported to have side effects such as musculoskeletal pain in tendons and joints.

종양 성장 및 침습에 MMP가 연루된다는 직접적인 증거는 각각 흑생종 종양 성장 및 혈관신생이 감소된 MMP-2 넉아웃 마우스(knockout mouse)에 대한 연구로써 밝혀진 바 있다.Direct evidence that MMPs are involved in tumor growth and invasion has been found in studies on MMP-2 knockout mice with reduced melanoma tumor growth and angiogenesis, respectively.

상기 MMP중 MMP-2 (젤라티나아제 A, 72 kDa IV형 콜라제나아제) 는 분비된 엔도펩티다아제로서 기저막 콜라겐 IV를 포함한 세포외 메트릭스의 몇몇 성분을 가수분해시킬 수 있고, 종양 침습 및 전이와 관련되어 있다. MMP-2 (gelatinase A, 72 kDa type IV collagenase) in the MMP is a secreted endopeptidase that can hydrolyze some components of the extracellular matrix, including basement membrane collagen IV, and are associated with tumor invasion and metastasis. It is.

본 발명자들은 안전하고 유효한 MMP 억제제를 스크리닝하는데 노력을 경주하여 COS가 MMP-2 활성 및 발현을 억제할 수 있음을 밝혀내고, 이를 연구함으로써 본 발명에 이르게 되었다. The inventors have made an effort to screen for safe and effective MMP inhibitors to find that COS can inhibit MMP-2 activity and expression, and have led to the present invention by studying it.

따라서, 본 발명의 목적은 키토산으로부터 COS 화합물을 동정하고, 이를 이용하여 HDF에서 MMP-2 발현 및 활성을 억제하는데 효과적인 MMP-2 억제제를 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to identify a COS compound from chitosan and to provide an MMP-2 inhibitor effective for inhibiting MMP-2 expression and activity in HDF.

본 발명은 HDF에서 MMP-2의 발현 및 활성을 억제시키는 하기 화학식 1의 COS 화합물을 제공한다.The present invention provides a COS compound of Formula 1 below which inhibits the expression and activity of MMP-2 in HDF.

<화학식 1><Formula 1>

(상기 식에서, R1은 COCH₃기이다)Wherein R 1 is a COCH ₃ group

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 COS 화합물을 유효 성분으로 함유하는 MMP-2 억제제을 제공한다. 이러한 MMP-2 억제제는 산제, 정제, 캡슐제, 분말제, 연고조성물, 용액제, 젤, 페이스트, 첩포제, 과립상 형태로 제조될 수 있다.The present invention also provides an MMP-2 inhibitor containing the COS compound of Formula 1 as an active ingredient. Such MMP-2 inhibitors may be prepared in the form of powders, tablets, capsules, powders, ointments, solutions, gels, pastes, patches, granules.

또한, 본 발명은 상기 MMP-2 억제제의 의약학적 용도를 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical use of the MMP-2 inhibitor.

본 발명의 MMP-2 억제제을 사용하여 예방 및 치료할 수 있는 질환으로는 상처, 암전이, 류마토이드, 관절염, 염증, 부갑상선항진증, 당뇨병, 각막궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 여드름, 화상, 치주질환, 동맥경화 또는 골절이 있다.Diseases that can be prevented and treated using the MMP-2 inhibitor of the present invention include wounds, cancer metastasis, rheumatoid, arthritis, inflammation, parathyroidism, diabetes, corneal ulcers, osteoporosis, gastric ulcers, trauma, acne, burns, periodontal disease, arteries There is a hardening or fracture.

본 발명에서는 HDF에서 MMP-2 발현 및 활성에 대한 분자량이 상이한 COS의 억제 효과를 평가하였다. 분자량이 상이한 COS는 인간의 일반 세포에는 어떠한 세포독성 효과도 없는 것으로 나타났으며, 이는 COS가 대한민국에서 오랫동안 기능성 식품으로 섭취되어 왔다는 사실로부터도 지지되고 있는 사실이다. 광범위한 MMP-2의 특이성은 다양한 세포 활성을 조절하는 역할을 할 수 있다. COS가 HDF에서 MMP-2 발현 및 활성을 억제하는지 여부를 조사하기 위하여, 젤라틴 자이모그래프를 수행하였다. 이로부터 본 발명자들은 PMA 처리가 HDF에서 MMP-2 발현 및 활성을 촉진시킨다는 사실을 확인하였다. 더욱이, 이는 MMP-2가 N-말단 펩티다아제 도메인의 순차적 분열에 의해 활성화되는 잠재적 형태로 분비된다는 종래의 보고와도 상응하는 것이다. In the present invention, the inhibitory effect of COS with different molecular weights on MMP-2 expression and activity in HDF was evaluated. COSs with different molecular weights do not have any cytotoxic effects on human normal cells, which is supported by the fact that COS has been ingested as a functional food for a long time in Korea. The specificity of a wide range of MMP-2 can play a role in regulating various cellular activities. In order to investigate whether COS inhibits MMP-2 expression and activity in HDF, gelatin zymograms were performed. From this we found that PMA treatment promotes MMP-2 expression and activity in HDF. Moreover, this corresponds to conventional reports that MMP-2 is secreted in a potential form that is activated by sequential cleavage of the N-terminal peptidase domain.

또한, 본 발명에서는 분자량이 상이한 COS가 프로MMP-2의 활성을 억제할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. In addition, the present invention has revealed that COS having different molecular weights can inhibit the activity of proMMP-2.

키토산은 아연이온에 효과적으로 결합하는 능력을 갖고 있으며 상업적인 킬레이트와 이온-교환 수지로서 사용되고 있다는 사실은 널리 알려져 있다. 따라서, 이러한 억제 효과는 MMP-2의 활성에 절대적인 아연이온에 대한 COS의 킬레이트화 능력에 기인한다고 할 수 있다. It is well known that chitosan has the ability to effectively bind zinc ions and is used as a commercial chelate and ion-exchange resin. Therefore, this inhibitory effect can be attributed to the chelation ability of COS to zinc ions that is absolute to the activity of MMP-2.

본 발명자들은 COS가 HDF에서 MMP-2 단백질 발현을 억제할 수 있다는 사실도 밝혀내었다. 프로MMP-2 단일 클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석은 COS가 HDF에서 프로MMP-2 단백질 발현을 억제할 수 있음을 분명하게 보여준다. 또한, 3-5 kDa 의 COS는 프로MMP-2 단백질 발현에 대해 최고의 억제 효과를 나타내었고, 아이는 수회에 걸친 젤라틴 자이모그래피 분석 결과에도 상응하였다. We have also found that COS can inhibit MMP-2 protein expression in HDF. Western blot analysis with proMMP-2 monoclonal antibodies clearly shows that COS can inhibit proMMP-2 protein expression in HDF. In addition, the COS of 3-5 kDa showed the best inhibitory effect on proMMP-2 protein expression, and the child corresponded to the results of several gelatin zymography analyzes.

본 발명의 결과를 기준으로 하여, 본 발명자들은 HDF에서 COS에 의해 MMP-2 발현 및 활성을 억제할 수 있다는 사실을 확인하였다. MMP-2의 합성에서 전사 조절이 중요한 역할을 한다. Based on the results of the present invention, the inventors confirmed that COS in HDF can inhibit MMP-2 expression and activity. Transcription regulation plays an important role in the synthesis of MMP-2.

따라서, COS가 HDF에서 MMP-2 전사 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하기 위해 pMMP-2-루시페라아제 구조체를 이용하는 리포터 유전자 분석을 수행하였다. 3-5 kDa의 COS가 HDF에서 MMP-2 전사 활성을 억제할 수 있고, 이는 RT-PCR 분석의 결과에 상응한다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 결과는 c-fos 유전자 발현 수준이 3-5 kDa의 COS에 의해 감소될 수 있다는 점을 밝혀냄으로써 추가로 확인할 수 있다. MMP-2 유전자 프로모터는, MMP 유전자 군의 대부분의 요소들이 AP-1에 의해 조절되지 않음에 비해, 유지된 프록시말 AP-1 위치의 부재시에 주목할만하다. Therefore, reporter gene analysis using the pMMP-2-luciferase construct was performed to investigate whether COS could affect MMP-2 transcriptional activity in HDF. It was found that COS of 3-5 kDa can inhibit MMP-2 transcriptional activity in HDF, which corresponds to the results of RT-PCR analysis. These results can be further confirmed by revealing that c-fos gene expression levels can be reduced by COS of 3-5 kDa. The MMP-2 gene promoter is notable in the absence of a maintained proximal AP-1 position, as most elements of the MMP gene family are not regulated by AP-1.

결론적으로, 본 발명자들은 COS가 HDF에서 MMP-2 발현 및 활성을 억제한다는 실험적 증거를 제공하였다. 이러한 결과는 COS가 암전이 및 주름 형성과 같은 몇몇의 건강 문제점과 연관된 MMP-2의 방지 및 치료에 있어 중요한 역할을 할 수 있음을 제시한다.In conclusion, we provided experimental evidence that COS inhibits MMP-2 expression and activity in HDF. These results suggest that COS may play an important role in the prevention and treatment of MMP-2 associated with some health problems such as cancer metastasis and wrinkle formation.

이하 본 발명의 구성을 하기의 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 하지만, 본 발명의 범위가 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention in detail through the following examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.

<실시예><Example>

재료준비Material Preparation

게 껍질 키틴으로 제조된 키토산 (디아세틸화도 93%; 평균분자량 280 kDa; 점도 13 cP)을 키토 라이프사[ Kitto Life Co., Seoul, Korea]로부터 공여 받았다. 바실러스 에스피. [Bacillus sp., 35000 units/단백질 g) 유래 키토사나아제를 아미코겐사[Amicogen Co., Jinju, Korea]로부터 구입하였다. Chitosan (deacetylation degree 93%; average molecular weight 280 kDa; viscosity 13 cP) prepared from crab shell chitin was donated from Kitto Life Co., Seoul, Korea. Bacillus sp. Chitosanase derived from [Bacillus sp., 35000 units / protein g) was purchased from Amicogen Co., Ltd. (Amicogen Co., Jinju, Korea).

COS를 분획화 하기 위한 한외여과 멤브레인(UF) 반응기 시스템(Minitan) 및 멤브레인을 밀리포어사(Millipore Co., Bedford, MA, USA)로부터 구입하였다. DMEM, 트립신-EDTA, 페니실린/ 스트렙토마이신/ 암포테리신 (각각 10,000 U/mL, 10,000 ㎍/mL, 및 2,500 ㎍/mL) 및 FBS은 깁코 비알엘, 라이프 테크놀러지스(Gibco BRL, Life Technologies, NY, USA)로부터 획득하였다. Ultrafiltration membrane (UF) reactor systems (Minitan) and membranes for fractionating COS were purchased from Millipore Co., Bedford, Mass., USA. DMEM, Trypsin-EDTA, Penicillin / Streptomycin / Amphotericin (10,000 U / mL, 10,000 μg / mL, and 2,500 μg / mL, respectively) and FBS are available from Gibco BRL, Life Technologies, NY, USA).

인간 피부 섬유아세포는 엘지 에이치지 & 씨엠 리서치 인스티튜트(LG HG & CM Research Institute, Daejeon, Korea)로부터 공여받았다. MTT 시약, 젤라틴, 아가로스, PMA 및 기타 재료들은 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Human dermal fibroblasts were donated by LG HG & CM Research Institute, Daejeon, Korea. MTT reagents, gelatin, agarose, PMA and other materials were purchased from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.

<실시예 1> UF 멤브레인 바이오리엑터를 이용한 COS의 제조Example 1 Preparation of COS Using UF Membrane Bioreactor

키토산 100g을 증류수 1.0L에 분산시켜 1% 키토산 용액을 제조하고, 이를 1.0M 젖산 550mL와 함께 교반하고, 증류수를 가하여 최종 부피를 10 L 이상이 되게 하였다. 포화된 NaHCO₃ 용액을 사용하여 상기 용액의 pH를 5.5로 적정하였다. 키토사나아제(Bacillus sp., Amicogen Co.)가 고정되어 있는 고정 효소 컬럼 반응기에 연결된 UF 멤브레인 반응기 시스템내에서 키토산을 연속적으로 가수분해시켜 COS를 제조하였다.100 g of chitosan was dispersed in 1.0 L of distilled water to prepare a 1% chitosan solution, which was stirred with 550 mL of 1.0 M lactic acid, and distilled water was added to bring the final volume to 10 L or more. The pH of the solution was titrated to 5.5 using saturated NaHCO ₃ solution. COS was prepared by continuous hydrolysis of chitosan in a UF membrane reactor system connected to a fixed enzyme column reactor to which chitosanase (Bacillus sp., Amicogen Co.) was immobilized.

상이한 분자량 컷-오프(MWCO; molecular weight cut-off)의 UF 멤브레인 네 개 (각각 MWCO는 10, 5, 3, 및 1 kDa임)를 이용하여 COS를 다섯 개의 상이한 분자량의 분획으로 분획하였다. 10, 5, 3 및 1 kDa 분자량 컷-오프 투석 멤브레인(Pierce Biotechnology Inc, Rockfod, IL, USA)을 이용하여 분획된 COS를 개별적으로 투석하고 동결건조시켰다. COS was fractionated into five different molecular weight fractions using four UF membranes of different molecular weight cut-off (MWCO), each with a MWCO of 10, 5, 3, and 1 kDa. Fractionated COS were individually dialyzed and lyophilized using 10, 5, 3 and 1 kDa molecular weight cut-off dialysis membranes (Pierce Biotechnology Inc, Rockfod, IL, USA).

<실시예 2> 세포 배양Example 2 Cell Culture

5% CO₂ 및 37 ℃ 습윤 환경에서 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 100 ㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신이 공급된 적절한 배지를 이용하여 세포주를 단일층으로서 개별적으로 배양하였다.Cell lines were individually incubated as a single layer using appropriate media fed with 10% FBS, 2 mM glutamine and 100 μg / mL penicillin-streptomycin in a 5% CO ₂ and 37 ° C. wet environment.

DMEM을 주로 인간 태아 피부에서 성장된 HDF용 배양 배지로 사용하였다. 세포를 트립신-EDTA로 처리함으로써 일주일에 3회 패시징시키고, 5회 패시징 후 실험에 사용하였다.DMEM was used primarily as a culture medium for HDF grown on human fetal skin. Cells were passaged three times a week by treatment with trypsin-EDTA and used for experiments after five passages.

<실시예 3> MTT 분석Example 3 MTT Analysis

통상의 MTT 법을 이용하여 HDF에 대한 COS의 세포 독성도를 측정하였다. Cytotoxicity of COS against HDF was measured using a conventional MTT method.

<실시예 4> 젤라틴 자이모그래피Example 4 Gelatin Zymography

통상의 방법에 따라, COS의 존재 또는 부재하에 MMP-2 의 발현 및 활성을 측정하였다. 총 단백질 양이 동일한 조절 배지를 젤라틴 1.5 mg/mL을 함유한 각각의 폴리아크릴아미드 겔 용기에 적재하고, 비-환원 조건하에서 전기영동하였다. 목적에 따라, 각 실험 마다 상이한 양의 단백질을 사용하여 젤라틴 자이모그래피 분석을 수행하였다. 젤라티놀 대역(Gelatinolytic band)이 청색 배경에 대하여 깨끗한 구역으로 관찰되었고, 이미지마스터 소프트웨어(ImageMaster Software; Amersham Pharmacia Bioscience, NJ, USA)를 이용하여 이 대역의 강도를 평가하였다.According to a conventional method, expression and activity of MMP-2 were measured in the presence or absence of COS. Control media with the same total protein amount were loaded into each polyacrylamide gel container containing 1.5 mg / mL gelatin and electrophoresed under non-reducing conditions. Depending on the purpose, gelatin zymography analysis was performed using different amounts of protein for each experiment. The gelatinous band was observed with clear areas against the blue background and the intensity of this band was assessed using ImageMaster Software (Amersham Pharmacia Bioscience, NJ, USA).

<실시예 5> 웨스턴 블롯 분석Example 5 Western Blot Analysis

표준 공정에 따라 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 요약하면, HDF를 4 ℃에서 30 분 동안 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5의 0.4% 노니데트(Nonidet) P-40, 120 mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 2 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 80 ㎍/mL 류펩틴, 3 mM NaF 및 1 mM DTT를 함유하는 용리 완충제에 용리시켰다. 세포 용리액 10 ㎍을 4-20% 노벡스 그래디언트 겔(Novex™ gradient gel; Invitrogen, USA)상에 녹이고, 니트 로셀룰로오스 멤브레인상으로 전기이동시킨 후 , 10% 탈지 우유로 차단하였다. 화학형광(chemiluminescent) ECL 분석 키트(Amersham Pharmacia Biosciences, NJ, USA)를 제조업체의 지침에 따라 이용하여 대용형 항-MMP-2 제1 단일 클론 항체 (Cat. No. MAB13405, Chemicon, CA, USA)로 프로-MMP-2 단백질을 검출하였다. Western blotting was performed according to standard procedures. In summary, HDF was added at 50 ° C. for 30 minutes at 50 mM Tris-HCl, 0.4% Nonidet P-40 at pH 7.5, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 Elution was performed in the elution buffer containing μg / mL leupetin, 3 mM NaF and 1 mM DTT. 10 μg of cell eluate was dissolved on a 4-20% Novex gradient gel (Invitrogen, USA), electrophoresed onto nitrocellulose membrane and blocked with 10% skim milk. Replacement anti-MMP-2 first monoclonal antibody (Cat. No. MAB13405, Chemicon, CA, USA) using a chemiluminescent ECL assay kit (Amersham Pharmacia Biosciences, NJ, USA) according to the manufacturer's instructions Pro-MMP-2 protein was detected.

이미지마스터 소프트웨어(ImageMaster software;Amersham Pharmacia Biosciences, NJ, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯 밴드를 정량하였다.Western blot bands were quantified using ImageMaster software (Amersham Pharmacia Biosciences, NJ, USA).

<실시예 7> 트렌스펙션 및 리포터 유전자 분석Example 7 Transfection and Reporter Gene Analysis

HDF를 6개의 웰 플레이트에 식재하고 37 ℃에서 배양하였다. 약 70-80%의 컨플루언시(confluency)에서, 세포를 DMEM로 세척하고 5시간 동안 혈청 및 항생물질 없이 DMEM로 배양하였다. 이어 세포를 리포펙타민(Lipofectamine™) 시약(Invitrogen, USA)으로 웰 당 DNA 총량을 조절한 pGL3 리포터 벡터를 함유한 MMP-2 프로모터 1 ㎍ 및 pcDNA 3.1 300 ng 함유 DNA 혼합물로 트렌스펙션시켰다. 72 시간 배양한 후, 세포를 용리시키고, 루미노메터(luminometer; Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 루시페라아제 활성을 측정하였다. HDFs were planted in 6 well plates and incubated at 37 ° C. At about 70-80% confluency, cells were washed with DMEM and incubated with DMEM without serum and antibiotics for 5 hours. Cells were then transfected with a DNA mixture containing 1 μg of MMP-2 promoter and 300 ng of pcDNA 3.1 containing a pGL3 reporter vector adjusted to the total amount of DNA per well with Lipofectamine ™ reagent (Invitrogen, USA). After incubation for 72 hours, cells were eluted and luciferase activity was measured using a luminometer (Tecan Austria GmbH, Austria).

루시페라아제 활성을 트렌스펙션 효율로 표준화시키고, 기질로서 o-니트로페닐 β-갈락토피라노사이드를 사용하여 β-갈락토시다아제 활성을 모니터링하였다. 데이터를 "평균±표준편차(n = 3)"로 나타내었다. 얻어진 값들을 스튜던츠 티-테스트(Student's t-test)를 이용한 대조군과 비교하여 통계적으로 분석하였다.Luciferase activity was normalized to transfection efficiency and β-galactosidase activity was monitored using o-nitrophenyl β-galactopyranoside as substrate. Data are expressed as "mean ± standard deviation (n = 3)". The obtained values were statistically analyzed in comparison with the control using Student's t-test.

<실시예 7> 역전사효소-폴리메라아제 연쇄 반응(RT-PCR: Reverse Transcriptase-Poltmerase Chain Reaction)Example 7 Reverse Transcriptase-Poltmerase Chain Reaction (RT-PCR)

RT-PCR을 수행하기 위하여, HDF로 제조한 전체 RNA 1 ㎍을 AMV 역전사효소(USB coporation, OH, USA)를 이용하여 역전사시켜 제1 cDNA 스트랜드를 합성하였다. 합성된 cDNA를 MMP-2 [포워드 프라이머(forward primer): 5'-GTGCTGAAGGACACACTAAAGAAGA-3', 리버스 프라이머(reverse primer): 5'-TTGCCATCCTTCTCAAAGTTGTAGG-3'), c-fos (포워드 프라이머: 5'- CTACGAGGCGT CATCCTCCCG- 3', 리버스 프라이머: 5'- AGCTCCCTCCTCCGGTTGCGGC AT-3') 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제 (G3PDH) (포워드 프라이머: 5'- TGAAG GTCGGTGTGAACGGATTTGGC -3', 리버스 프라이머: 5'- CATGTAGGCCATGAGGTCCACC AC -3')를 위한 몇쌍의 프라이머를 갖는 Taq(Thermus Acuaticus) 폴리메라아제 (USB corporation, OH, USA)를 이용한 PCR에서 템플릿으로 이용하였다. 이어서, PCR 생성물을 2% 아가로즈 겔상에 분리하고 EtBr(ethidium bromide) 염색에 의해 시각화하였다. To perform RT-PCR, 1 μg of total RNA prepared with HDF was reverse transcribed using AMV reverse transcriptase (USB coporation, OH, USA) to synthesize a first cDNA strand. The synthesized cDNA was MMP-2 (forward primer: 5'-GTGCTGAAGGACACACTAAAGAAGA-3 ', reverse primer: 5'-TTGCCATCCTTCTCAAAGTTGTAGG-3'), c-fos (forward primer: 5'-CTACGAGGCGT) CATCCTCCCG-3 ', reverse primer: 5'-AGCTCCCTCCTCCGGTTGCGGC AT-3') and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) (forward primer: 5'- TGAAG GTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3 ', reverse primer: 5' -Used as a template in PCR using Taq (Thermus Acuaticus) polymerase (USB corporation, OH, USA) with a pair of primers for CATGTAGGCCATGAGGTCCACC AC-3 '). PCR products were then separated on a 2% agarose gel and visualized by ethidium bromide (EtBr) staining.

<실시예 8> 통계적 분석Example 8 Statistical Analysis

양방 독립적 스튜던츠 티-테스트를 이용하여 모든 데이터를 비교하였다. 0.05 미만의 P값이 통계적으로 의미 있다고 여겨졌다. 데이터를 평균±SE로 표현하였다.All data were compared using a two independent Student's T-test. P values less than 0.05 were considered statistically significant. Data are expressed as mean ± SE.

<실시예 9> HDF의 증식에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과 Example 9 Effect of COS of Different Molecular Weight on Proliferation of HDF

MMP 억제 효과를 알아보기 위하여 MTT 분석을 수행하여 FBS의 존재 또는 부재하에서 표준 HDF에 대한 COS의 비세포독 농도를 검정하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, 세포들은 분자량이 상이한(A; < 1 kDa, B; 1-3 kDa, C; 3-5 kDa, D 5-10 kDa) COS로 처리되었고, 세포 생존력은 24시간 후 MTT 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험으로부터 평균치±SD 로 나타내었다. 본 발명의 COS는 FBS의 존재 또는 부재하에서 최고 시험농도(1,000 ㎍/mL)에서도 HDF에 대해 어떠한 세포독 효과도 나타내지 않았다. To determine the effect of MMP inhibition, MTT analysis was performed to assay the non-cytotoxic concentration of COS against standard HDF in the presence or absence of FBS. As shown in FIG. 1, cells were treated with COS of different molecular weights (A; <1 kDa, B; 1-3 kDa, C; 3-5 kDa, D 5-10 kDa) COS, and cell viability was 24 hours It was then measured by MTT analysis. Data are presented as mean ± SD from three independent experiments. COS of the present invention showed no cytotoxic effect on HDF even at the highest test concentration (1,000 μg / mL) in the presence or absence of FBS.

<실시예 10> 분자량이 상이한 COS의 농도 및 시간 의존성 MMP-2 억제 효과 Example 10 Inhibition Effect of MMP-2 Concentration and Time Dependence of COS with Different Molecular Weight

상기의 결과를 기준으로 하여, HDF에서 MMP-2 발현 및 활성에 대한 분자량이 상이한 COS의 억제 효과를 검사하였다. 분자량이 상이한 COS로 처리된 HDF 조절 배지를 사용하여 젤라틴 자이모그래피를 수행하였다. 잠재적 형태의 MMP-2 (프로MMP-2)를 PMA 처리하여 활성 형태로 전환시켰다 (도 2 참조). PMA 100 ng/mL 로 촉진시켜 MMP 발현을 유도한 HDF를 혈청 없는 조건하에서 7시간 동안 분자량이 상이한 COS 50, 100 및 500 ㎍/mL로 처리하였다. 젤라틴 자이모그래피에 의해 측정한 바와 같이, 상부 패널은 조절된 배지중에서 MMP-2 활성을 나타낸다. 하부 패널은 PMA 처리군중에서 비교적 100% 활성으로 계산된 각 처리에 대한 각각의 상대 MMP-2 활성을 나타낸다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험으로부터 평균치±SD 로 나타내었다. 50 ㎍/mL 이상의 모든 COS가 PMA 처리군과 비교하여 HDF에서 MMP-2 활성에 대해 뛰어난 억제 효과를 나타내었다. MMP-2에 대한 COS의 억제 효과를 명시하기 위하여, 시간 의존성 억제 효과를 조사하였다.Based on the above results, the inhibitory effect of COS with different molecular weights on MMP-2 expression and activity in HDF was examined. Gelatin zymography was performed using HDF controlled media treated with COS of different molecular weights. Potential forms of MMP-2 (proMMP-2) were converted to the active form by PMA treatment (see FIG. 2). HDF induced with MMP expression by promoting PMA at 100 ng / mL was treated with COS 50, 100 and 500 μg / mL of different molecular weights for 7 hours under serum-free conditions. As measured by gelatin zymography, the top panel shows MMP-2 activity in controlled media. The lower panel shows the respective relative MMP-2 activity for each treatment, calculated as relatively 100% activity in the PMA treatment group. Data are presented as mean ± SD from three independent experiments. All COSs of 50 μg / mL or more showed an excellent inhibitory effect on MMP-2 activity in HDF compared to the PMA treated group. In order to specify the inhibitory effect of COS on MMP-2, time dependent inhibitory effect was investigated.

도 3에 도시한 바와 같이, PMA 100 ng/mL 로 촉진시켜 MMP 발현을 유도한 HDF를 혈청 없는 조건하에서 1, 3, 5 및 7일 동안 분자량이 상이한 COS로 처리하였다. 조절된 배지에서의 MMP-2 활성을 문헌에 기재된 바와 같이 젤라틴 자이모그래피에 의해 측정하였다. 수치들은 식[상대 MMP-2 활성 (%) = (밴드의 강도 / 하루동안 얻은 밴드의 총 강도) × 100 ]을 이용하여 상대 MMP-2 활성으로 나타내었다. 일일의 결과를 독립적인 군으로 고려하였다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험으로부터 평균치±SD로 나타내었다. PMA 처리로 인해 프로 MMP-2 활성이 비처리군에 비해 현억제졌다(P< 0.01). 더욱이, 프로MMP-2 활성은 각각 PMA 및 COS 처리군에서 배양 시간에 따라 1 kDa 이하로 명백하게 증가하였다. 그러나, 프로MMP-1 활성에 대한 1 kDa 이상의 COS의 억제 효과는 배양 시간에 따라 현저하게 증가하였다 (P< 0.01). 또한, 모든 COS 분자량 분획 중 3-5 kDa 분획이 프로MMP-2 활성에 대해 최고 억제 효과를 나타내었다.As shown in FIG. 3, HDF induced with MMP expression by promotion of PMA 100 ng / mL was treated with COS of different molecular weights for 1, 3, 5 and 7 days under serum-free conditions. MMP-2 activity in conditioned media was measured by gelatin zymography as described in the literature. The values are expressed as relative MMP-2 activity using the formula [relative MMP-2 activity (%) = (band intensity / total intensity of band obtained over day) × 100]. Daily results were considered as independent groups. Data are presented as mean ± SD from three independent experiments. PMA treatment inhibited pro MMP-2 activity compared to untreated group (P <0.01). Moreover, proMMP-2 activity was apparently increased below 1 kDa with incubation time in PMA and COS treated groups, respectively. However, the inhibitory effect of COS above 1 kDa on proMMP-1 activity increased significantly with incubation time (P <0.01). In addition, the 3-5 kDa fraction of all COS molecular weight fractions showed the highest inhibitory effect on proMMP-2 activity.

<실시예 11> 분자량이 상이한 COS의 HDF에서 MMP-2 단백질 발현 억제 효과 Example 11 Inhibitory Effect of MMP-2 Protein Expression on HDF of COS with Different Molecular Weights

프로MMP-2의 단백질 발현 수준에 따른 분자량이 상이한 COS의 억제 효과를 검정하기 위하여, HDF에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 세포 용리물에 대한 웨스턴 블롯 분석을 지시한 바대로 MMP-2 단일 클론 항체의 대용형을 이용하여 수행하였다. 하부 패널은 상대 단백질 발현율(%)을 나타 낸다. 수치들은 식[상대 단백질 발현율 (%) = (밴드의 강도 /총 밴드의 강도) × 100 ]을 이용하여 상대 단백질 발현율(%)로 나타내었다. β-액틴 단백질 발현율을 프로MMP-2 단백질의 표준화를 위한 대조구로 사용하였다. PMA 처리가 비처리군과 비교하여 프로MMP-2의 발현 수준을 현저하게 증가시켰다. 프로MMP-2단백질의 발현 수준은 PMA 처리군과 비교하여 분자량이 상이한 COS 처리로 인해 감소하였다. 분자량 3-5 kDa의 COS에서 최고 억제율이 관찰되었고, 이는 다른 분자량의 COS와는 현저하게 상이하였다(P < 0.01).Western blot analysis was performed on HDF to assay the inhibitory effect of COS with different molecular weights depending on the protein expression level of proMMP-2. As shown in FIG. 4, Western blot analysis of the cell eluate was performed using a surrogate of MMP-2 monoclonal antibody as indicated. The lower panel shows the relative protein expression rate (%). Values are expressed as relative protein expression percentage (%) using the formula [relative protein expression rate (%) = (band intensity / total band intensity) × 100]. β-actin protein expression rate was used as a control for standardization of proMMP-2 protein. PMA treatment significantly increased the expression level of proMMP-2 compared to the untreated group. The expression level of proMMP-2 protein was reduced due to COS treatment with a different molecular weight compared to the PMA treatment group. The highest inhibition was observed at COS of molecular weight 3-5 kDa, which was significantly different (P <0.01) from COS of other molecular weight.

<실시예 12> COS에 의한 HDF에서 MMP-2의 전사 활성 억제Example 12 Inhibition of Transcriptional Activity of MMP-2 in HDF by COS

MMP-2-루시페라아제 유전자를 포함한 리포터 구성체를 이용하여 MMP-2의 전사 활성이 분자량이 상이한 COS에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, MMP-2의 전사 활성을 pMMP-2 리포터 벡터 및 pcDNA 3.1로 동시전이시킨 후HDF에서 루시페라아제 분석에 의해 측정하였다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험으로부터 평균치±SD 로 나타내었다. 유의 수준을 스튜던츠 티-테스트를 이용하여 통계적으로 검정하였다(* 는 P < 0.01를 지시함). MMP-2 유전자의 전사 활성은 PMA로 처리된 대조군에서 비처리군과 비교해서 현저하게 증가하였다(P < 0.01). 그러나, PMA에 의해 유도된 MMP-2 유전자의 전사 활성은 COS로 처리함으로써 현저하게 억제되었다. 특히, 분자량 3-5 kDa의 COS는 MMP-2 유전자의 전사 활성에 대해 최고의 억제 효과를 보여주었다. MMP-2 유전자의 전사 활성에 대한 억제 효과는 COS의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 또한, 모든 COS는 100 ㎍ /mL에서 MMP-2 유전자의 전사 활성을 현저하게 억제하였다(P < 0.05).A reporter construct comprising the MMP-2-luciferase gene was used to investigate whether the transcriptional activity of MMP-2 is affected by COS of different molecular weights. As shown in FIG. 5, transcriptional activity of MMP-2 was measured by luciferase analysis in HDF after co-transition with pMMP-2 reporter vector and pcDNA 3.1. Data are presented as mean ± SD from three independent experiments. Significance levels were statistically tested using the Student's T-test (* indicates P <0.01). Transcriptional activity of the MMP-2 gene was significantly increased in the control group treated with PMA compared to the untreated group (P <0.01). However, the transcriptional activity of the MMP-2 gene induced by PMA was markedly inhibited by treatment with COS. In particular, COS with a molecular weight of 3-5 kDa showed the best inhibitory effect on the transcriptional activity of the MMP-2 gene. The inhibitory effect on the transcriptional activity of the MMP-2 gene increased with increasing COS concentration. In addition, all COSs significantly inhibited the transcriptional activity of the MMP-2 gene at 100 μg / mL (P <0.05).

<실시예 13> HDF중 MMP-2 및 c-fos의 유전자 발현에 대한 분자량이 상이한 COS의 효과 Example 13 Effect of COS of Different Molecular Weights on Gene Expression of MMP-2 and c-fos in HDF

MMP-2 유전자 발현에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여, 분자량이 상이한 COS로 처리된 HDF로부터 제조된 전체 세포성 RNA를 이용하여 RT-PCR 분석을 행하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, 세포들을 분자량이 상이한 COS 100 ㎍/mL으로 처리하고, 유전자 발현율을 RT-PCR에 의해 측정하였다. 상부 패널은 2% 아가로스 젤상에서 전기영동시킨 후의 MMP-2, c-fos 및 G3PDH 유전자의 PCR 생성물을 나타낸다. 하부 패널은 농도계량적으로 측정한 G3PDH로 표준화시킨 각각의 상대 유전자 발현 수준을 나타낸다. 수치들은 식[상대 단백질 발현율 (%) = (밴드의 강도 /총 밴드의 강도) × 100 ]을 이용하여 상대 단백질 발현율(%)로 나타내었다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험으로부터 평균치 ± SD 로 나타내었다. 유의 수준을 스튜던츠 티-테스트를 이용하여 통계적으로 검정하였다(* 는 P < 0.01를 지시함). To confirm the inhibitory effect on MMP-2 gene expression, RT-PCR analysis was performed using whole cellular RNA prepared from HDF treated with COS of different molecular weight. As shown in FIG. 6, cells were treated with 100 μg / mL COS having different molecular weights, and gene expression was measured by RT-PCR. Top panel shows PCR product of MMP-2, c-fos and G3PDH genes after electrophoresis on 2% agarose gel. The bottom panel shows each relative gene expression level normalized to G3PDH measured quantitatively. Values are expressed as relative protein expression percentage (%) using the formula [relative protein expression rate (%) = (band intensity / total band intensity) × 100]. Data are presented as mean ± SD from three independent experiments. Significance levels were statistically tested using the Student's T-test (* indicates P <0.01).

MMP-2 유전자 발현은 분자량 3-5 kDa의 COS에 의해 완전하게 억제되었다. 다른 군들 중에서는 MMP-2 유전자 발현에 있어 현저한 차이는 없었다. 또한, MMP-2 유전자 발현은 모든 MMP의 프로모터에 결합되어 있는 AP-1 전사 인자를 통해 조절된다.MMP-2 gene expression was completely inhibited by COS with a molecular weight of 3-5 kDa. Among the other groups, there was no significant difference in MMP-2 gene expression. In addition, MMP-2 gene expression is regulated through the AP-1 transcription factor, which is bound to the promoters of all MMPs.

이어서, COS가 AP-1에 대해 어떠한 억제 효과를 미치는지 여부를 조사하였다. 이로부터, 본 발명자들은 COS의 존재하에 AP-1 전자 인자의 일부분인 c-fos 유전자 발현을 시험하였다. 1kDa이상의 모든 COS는 c-fos 유전자 발현에 대해 억제 효과를 나타내었다. 더욱이, 최고의 억제 효과는 3-5 kDa의 COS에서 관찰되었다.Subsequently, it was investigated whether the COS had an inhibitory effect on AP-1. From this, we tested c-fos gene expression, which is part of the AP-1 electronic factor in the presence of COS. All COSs above 1 kDa showed an inhibitory effect on c-fos gene expression. Moreover, the best inhibitory effect was observed at COS of 3-5 kDa.

본 발명은 COS 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 억제제를 제공함으로써 HDF에서 MMP-2 발현 및 활성을 효과적으로 억제시켜, MMP-2 활성과 관련된 질환의 상처, 암전이, 류마토이드, 관절염, 염증, 부갑상선항진증, 당뇨병, 각막궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 여드름, 화상, 치주질환, 동맥경화 또는 골절 치료에 효과적이어서, 의약적적으로 유용한 발명이다.The present invention effectively inhibits the expression and activity of MMP-2 in HDF by providing a COS compound and an inhibitor containing the same as an active ingredient, wound, cancer metastasis, rheumatoid, arthritis, inflammation, hyperparathyroidism of diseases associated with MMP-2 activity It is effective in the treatment of diabetes, corneal ulcer, osteoporosis, gastric ulcer, trauma, acne, burns, periodontal disease, arteriosclerosis or fracture, and is a medically useful invention.

Claims (5)

키토산을 탈아세틸화시킨 얻은 하기 화학식 1의 글루코사민 단량체로 구성되어 분자량이 1 ~ 5 kDa인 것을 특징으로 하는, 인간의 피부 섬유아세포(HDF)에서 메트릭스메탈로프로테이나제-2(MMP-2)의 발현 및 활성의 억제를 통한 주름, 당뇨병, 외상, 화상, 치주질환 또는 동맥경화 치료용 키토올리고사카라이드(COS) 화합물.Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in human skin fibroblasts (HDF), characterized in that the molecular weight is 1 to 5 kDa, which is composed of the glucosamine monomer of Formula 1 obtained by deacetylating chitosan. A chitooligosaccharide (COS) compound for the treatment of wrinkles, diabetes, trauma, burns, periodontal disease or atherosclerosis through inhibition of expression and activity. <화학식 1><Formula 1>

(상기 식에서, R1은 COCH₃기이다)Wherein R 1 is a COCH ₃ group 삭제delete 제1항에 따른 COS 화합물을 유효성분으로 함유하는 MMP-2의 발현 및 활성을 억제를 통한 주름, 당뇨병, 외상, 화상, 치주질환 또는 동맥경화 치료용 조성물.A composition for treating wrinkles, diabetes, trauma, burns, periodontal disease or atherosclerosis through inhibiting the expression and activity of MMP-2 containing the COS compound according to claim 1 as an active ingredient. 제3항에 있어서, 상기 제제가 산제, 정제, 캡슐제, 분말제, 연고조성물, 용액제, 젤, 페이스트, 첩포제 또는 과립상 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.     4. A composition according to claim 3, wherein said preparation is prepared in powder, tablet, capsule, powder, ointment, solution, gel, paste, patch or granular form. 삭제delete

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