KR100825154B1

KR100825154B1 - - mRNA QUANTIFICATION METHOD USING CAPILLARY ELECTROPHORESIS-BASED SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM

Info

Publication number: KR100825154B1
Application number: KR1020060093997A
Authority: KR
Inventors: 정규열; 박영섭; 서종혁; 장경진
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2008-04-24
Also published as: KR20080028573A

Abstract

본 발명은 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성을 이용한 mRNA 정량 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 표적 유전자 mRNA에 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 존재하에서, 역전사 반응을 통해 표적 유전자 mRNA에 상보적인 DNA를 제조하는 단계; 상기 표적 유전자 mRNA에 상보적인 DNA를 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성을 수행하여 표적 유전자 DNA의 양을 결정하는 단계를 포함하는 세포내 mRNA의 정량 방법에 관한 것이다. 본 발명의 mRNA 정량 방법은 PCR에 의한 증폭 과정을 거치지 않아 이로부터 유래될 수 있는 실험상의 오차를 줄일 수 있다. 따라서, 세포내 mRNA의 정량이 정확하고 신뢰성 있게 수행된다. 또한 본 발명의 mRNA 정량 방법은, 종래의 mRNA 정량 방법에 비해, 공정 과정이 단순하다. 신속한 mRNA 정량이 수행된다.The present invention relates to a method for quantifying mRNA using capillary electrophoresis-single-chain polymorphism, wherein the method is complementary to target gene mRNA through reverse transcription in the presence of a first primer that specifically binds to target gene mRNA. Preparing DNA; The present invention relates to a method for quantifying intracellular mRNA, comprising performing a capillary electrophoresis-single-chain polymorphism on DNA complementary to the target gene mRNA to determine the amount of target gene DNA. MRNA quantification method of the present invention can reduce the experimental error that can be derived from the amplification process by PCR without going through it. Thus, quantification of intracellular mRNA is performed accurately and reliably. In addition, the mRNA quantification method of the present invention is simpler than the conventional mRNA quantification method. Rapid mRNA quantification is performed.

모세관 전기영동, 단일쇄 형태변환 다형성, mRNA 정량 Capillary Electrophoresis, Single Chain Morphology, mRNA Quantitation

Description

모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성을 이용한 세포내 ｍＲＮＡ 정량 방법{mRNA QUANTIFICATION METHOD USING CAPILLARY ELECTROPHORESIS-BASED SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM}Method for quantifying intracellular mRNA using capillary electrophoresis-single chain morphology polymorphism {mRNA QUANTIFICATION METHOD USING CAPILLARY ELECTROPHORESIS-BASED SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM}

도 1a는 시험관내 전사로 얻은 eGFP mRNA를 이용한 역전사 단일사슬 DNA의 모세관 전기영동 크로마토그램이다.1A is a capillary electrophoresis chromatogram of reverse transcription single chain DNA using eGFP mRNA obtained by in vitro transcription.

도 1b는 12-㎖ 역전사 반응액에서 서로 다른 양의 mRNA를 이용한 경우의 eGFP mRNA를 이용한 역전사 단일사슬 DNA의 모세관 전기영동 크로마토그램이다.Figure 1b is a capillary electrophoresis chromatogram of reverse-transcription single-chain DNA using eGFP mRNA when using different amounts of mRNA in the 12-ml reverse transcription reaction solution.

도 1c는 eGFP mRNA의 양과 CE-SSCP 피크(peak) 면적간의 상관관계를 보여주는 그래프이다.1C is a graph showing the correlation between the amount of eGFP mRNA and the CE-SSCP peak area.

도 2는 IPTG 인덕션 이후 pET23b-eGFP를 지닌 대장균 BL21(DE3)에서 분리한 총 RNA와 서열번호 3으로 기재되는 eGFP-S 프라이머를 이용한 eGFP 특이적인 역전사 결과 단일 사슬 DNA에 대한 CE-SSCP 결과를 시간이 경과함에 따라 보여주는 크로마토그램으로서, (A) 1시간, (B) 2시간, (C) 7시간 이후의 결과물에 대한 크로마토그램이며, (D)는 대조군으로 대장균 JM109를 사용한 경우의 크로마토그램이다. 블록 화살표(1,2)는 eGFP mRNA와 상관없는 피크를 나타낸다.Figure 2 shows the time of CE-SSCP results for eGFP-specific reverse transcription results using single-stranded DNA with total RNA isolated from Escherichia coli BL21 (DE3) with pET23b-eGFP after IPTG induction and the eGFP-S primer set forth in SEQ ID NO: 3. The chromatogram shown as time passes, and the chromatogram for the result after (A) 1 hour, (B) 2 hours, and (C) 7 hours, and (D) are chromatograms when E. coli JM109 was used as a control. . Block arrows (1, 2) indicate peaks independent of eGFP mRNA.

도 3은 IPTG 인덕션 이후 서열번호 4로 기재되는 eGFP-L 프라이머를 이용하 여 재조합 대장균의 총 RNA로부터 나온 eGFP mRNA에 관한 CE-SSCP 크로마토그램으로서, (A) 1시간, (B) 2시간, (C) 7시간에 이후의 결과물에 대한 크로마토그램이다.FIG. 3 is a CE-SSCP chromatogram for eGFP mRNA derived from total RNA of recombinant E. coli using eGFP-L primers as set forth in SEQ ID NO: 4 after IPTG induction, (A) 1 hour, (B) 2 hours, ( C) Chromatogram for the result after 7 hours.

도 4는 대장균 EF-Tu와 eGFP mRNA에 연관된 프라이머를 사용하여 역전사반응 후 CE-SSCP 크로마토그램으로서, (A)는 대장균 EF-Tu에 특이적인 서열번호 5로 기재되는 프라이머와 pET23b-eGFP를 지닌 대장균 BL21(DE3)로부터 분리한 전체 RNA를 이용하여 역전사 반응을 수행한 것이고, (B)는 EF-Tu에 특이적인 서열번호 5로 기재되는 프라이머와 서열번호 4로 기재되는 eGFP-L 프라이머와 pET23b-eGFP를 지닌 대장균 BL21(DE3)로부터 분리한 전체 RNA를 이용하여 역전사 반응을 수행한 것이며, (C)는 eGFP-L와 EF-Tu에 특이적인 프라이머를 대장균 JM109로부터 분리한 전체 RNA를 이용하여 역전사 반응을 수행한 것을 가리킨다.FIG. 4 is a CE-SSCP chromatogram after reverse transcription using primers associated with E. coli EF-Tu and eGFP mRNA, (A) having primers described in SEQ ID NO: 5 specific for E. coli EF-Tu and pET23b-eGFP Reverse transcription was performed using total RNA isolated from Escherichia coli BL21 (DE3), and (B) is a primer described in SEQ ID NO: 5 specific for EF-Tu, an eGFP-L primer described in SEQ ID NO: 4, and pET23b. Reverse transcription reaction was carried out using total RNA isolated from E. coli BL21 (DE3) with eGFP, and (C) using total RNA isolated from E. coli JM109 primers specific for eGFP-L and EF-Tu. Indicates the reverse transcription reaction was performed.

도 5a는 pET23b-eGFP를 포함하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 시간이 경과함에 따른 성장 정도를 보여주는 그래프이다.Figure 5a is a graph showing the degree of growth over time of recombinant E. coli BL21 (DE3) containing pET23b-eGFP.

도 5b는 IPTG 인덕션 이후에 pET23b-eGFP를 포함하는 대장균 BL21(DE3)이 시간이 경과함에 따라 만든 eGFP mRNA의 발현량의 변화를 보여주는 그래프로서, 특이적 상대 eGFP mRNA의 양은 그램 셀 당 EF-Tu mRNA 피크 넓이에 의해 정상화된 eGFP mRNA의 상대적인 피크 넓이로 정의된다.Figure 5b is a graph showing the change in the expression level of eGFP mRNA produced by E. coli BL21 (DE3) containing pET23b-eGFP over time after IPTG induction, the specific relative eGFP mRNA amount is EF-Tu per gram cell It is defined as the relative peak width of eGFP mRNA normalized by mRNA peak width.

도 5c는 IPTG 인덕션 이후 시간이 경과함에 따른 eGFP 비활성을 보여주는 그래프이다.5C is a graph showing eGFP deactivation over time after IPTG induction.

본 발명은 mRNA를 정량화하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 직접적이고, 보다 정확하고, 경제적으로 mRNA를 정량화하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for quantifying mRNA, and more particularly, the present invention relates to a method for quantifying mRNA directly, more accurately and economically.

어떤 상태에서 특정 세포에 특이적인 mRNA의 정량법은 생리학적 특성을 표현하는 중요한 특징 중의 하나이다(Debouck, C., et al., Nat. Genet., 1999, 21, 48-50; Castensson, A., et al., Genome Res., 2000, 10, 1219-1229; Bassett, D.E., et al., Nat. Genet., 1999, 21, 51-55). 특히, 수천 개의 서로 다른 mRNA 중에서 특정 mRNA의 양을 측정하는 것은, mRNA가 염기 서열을 제외하고는 거의 유사한 화학적 특성을 지니고 있기 때문에, 가장 힘든 부분이라 할 수 있다.Quantification of mRNA specific for specific cells under certain conditions is one of the important features that express physiological properties (Debouck, C., et al., Nat. Genet., 1999, 21, 48-50; Castensson, A., et al., Genome Res., 2000, 10, 1219-1229; Bassett, DE, et al., Nat. Genet., 1999, 21, 51-55). In particular, measuring the amount of a specific mRNA among thousands of different mRNAs is the most difficult part because the mRNA has almost similar chemical properties except the base sequence.

노던 블랏팅이나 역전사 효소반응 이후 리얼타임 PCR 방법 등 유전자 간의 수소 결합에 기반한 방법은 mRNA 정량법 중 현재 가장 흔히 쓰이는 방법으로 알려져 있다(Freeman, W.M., et al., Biotechniques 1999, 26, 112-122, 124-115; Oldach, D., Gastroenterology 1999, 116, 763-764; Kozian, D.H., et al., Trends Biotechnol. 1999, 17, 73-78; Soares, M.B., Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8, 542-546). 그러나 노던 블랏팅법은 에러를 유발할 수 있는 실험 과정들에 상당부분 의존하고 있다(Shakhov, A.N., et al., J. Leukoc. Biol. 2000, 68, 151-157). 리얼타임 PCR법은, 현재 상용화되어 있는 방법들 중 가장 정량성이 뛰어나다고 알 려져 있음에도 불구하고, 목적 mRNA에 대한 많은 전처리 공정을 필수적으로 요구하는 간접적인 정량법이다. 따라서, 프라이머(primer)-유전자간의 수소 결합 및 PCR에 의한 증폭 과정을 배제시킨 보다 정확한 mRNA 정량법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.Methods based on hydrogen bonding between genes, such as Northern blotting or real-time PCR after reverse transcriptase, are known to be the most commonly used methods of mRNA quantification (Freeman, WM, et al., Biotechniques 1999, 26, 112-122, 124-115; Oldach, D., Gastroenterology 1999, 116, 763-764; Kozian, DH, et al., Trends Biotechnol. 1999, 17, 73-78; Soares, MB, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8 , 542-546). However, Northern blotting relies heavily on experimental procedures that can cause errors (Shakhov, A.N., et al., J. Leukoc. Biol. 2000, 68, 151-157). Real-time PCR is an indirect quantitative method that requires many pretreatment steps for the target mRNA, although it is known to be the most quantitative among the currently available methods. Therefore, there is a need for the development of more accurate mRNA quantitation that eliminates the hydrogen bonding between primer-gene and amplification by PCR.

본 발명의 목적은 mRNA를 효과적으로 정량화하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 단일 반응으로부터 얻은 역전사물로부터 mRNA를 직접적으로 정량화하는 방법이 제공된다.It is an object of the present invention to provide a method for efficiently quantifying mRNA. According to the present invention, a method is provided for directly quantifying mRNA from reverse transcripts obtained from a single reaction.

젤 전기영동의 변성되지 않은 조건하에서 구조의 차이에 기인한 이동성의 변화에 근간한 단일 사슬 DNA의 분리, 즉 단일쇄 형태변환 다변성법 (SSCP)은 현재 유전자 분석에 있어서 다방면으로 개발되고 있는 경제적인 방법이다(Kourkine, I.V., et al., Electrophoresis 2002, 23, 1375-1385; Andersen, P.S., et al., Hum. Mutat. 2003, 21, 455-465; Larsen, L.A., et al., Hum. Mutat. 1999, 13, 318-327). 특히, 모세관 전기영동 기술의 출현은 이 분석법이 보다 높은 재현성과 고효율, 고민감성을 가지게 해 주었다(Altria, K.D., Methods Mol. Biol. 1996, 52, 3-13). 모세관 전기영동법을 이용한 단일쇄 형태변환 다변성의 분석의 핵심은 여러가지 단일 사슬 DNA 분자를 높은 재현성과 민감성으로 분리해 내는 것이고, 이는 이 기술을 다양한 mRNA의 정확한 정량을 동시에 수행하는데 응용할 수 있음을 보여준다.Under unmodified conditions of gel electrophoresis, the isolation of single-chain DNA based on changes in mobility due to structural differences, namely single chain conformation polymorphism (SSCP), is an economical development that is currently being developed in a number of ways for genetic analysis. Method (Kourkine, IV, et al., Electrophoresis 2002, 23, 1375-1385; Andersen, PS, et al., Hum. Mutat. 2003, 21, 455-465; Larsen, LA, et al., Hum. Mutat. 1999, 13, 318-327). In particular, the emergence of capillary electrophoresis technology has made the assay more reproducible, more efficient and more sensitive (Altria, K.D., Methods Mol. Biol. 1996, 52, 3-13). The key to the analysis of single-chain conformational polymorphisms using capillary electrophoresis is to isolate multiple single-chain DNA molecules with high reproducibility and sensitivity, demonstrating that the technique can be applied to simultaneously perform accurate quantification of various mRNAs.

본 발명에서, mRNA의 역전사와, 얻어진 역전사물의 CE-SSCP에 근거한 빠르고 정확한 mRNA 정량을 위한 새로운 분석법의 유용성을 확인하였다. 순수 eGFP mRNA (enhanced green fluorescent protein mRNA)와 대장균 연장 요소 Tu (EF-Tu) 의 동시분석을 이용한 분석 환경의 표준화는 상기한 분석법이 신뢰성 높고 재현성이 뛰어난 mRNA 분석에 이용될 수 있음을 보여준다. 발현 동력학에 있어서 eGFP 활성분석과 비교연구를 통해 발현 분석에 대한 CE-SSCP의 잠재력 또한 본 발명를 통해 기술하였다.In the present invention, the usefulness of the new assay for reverse transcription of mRNA and fast and accurate mRNA quantification based on CE-SSCP of the obtained reverse transcript was confirmed. Standardization of the assay environment using simultaneous analysis of pure eGFP mRNA (enhanced green fluorescent protein mRNA) and Escherichia coli elongation factor Tu (EF-Tu) shows that the assay described above can be used for reliable and reproducible mRNA analysis. The potential of CE-SSCP for expression analysis through eGFP activity analysis and comparative studies in expression kinetics was also described in the present invention.

본 발명은 mRNA를 정량화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 표적 mRNA의 선택적 역전사와, 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성에 의한 얻어진 역전사물에 대한 정량으로 구성된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 표적 mRNA에 특이적으로 결합하는 제1 프라이머의 존재하에서, 역전사 반응을 통해 표적 mRNA에 상보적인 DNA를 포함하는 역전사물을 제조하는 단계, 및 상기 표적 mRNA에 상보적인 DNA를 포함하는 역전사물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성에 적용시켜 표적 DNA의 양을 결정하는 단계를 적어도 포함하여 이루어진다.The present invention relates to a method for quantifying mRNA, which method comprises the selective reverse transcription of target mRNA and the quantification of the obtained reverse transcript by capillary electrophoresis-single chain morphology polymorphism. More specifically, the present invention provides a method for preparing a reverse transcript comprising DNA complementary to a target mRNA in the presence of a first primer that specifically binds to a target mRNA, and DNA complementary to the target mRNA. Applying a reverse transcript comprising a capillary electrophoresis-single-chain morphology polymorphism to determine the amount of target DNA.

본 명세서에 있어서, "표적 mRNA"는 정량이 요구되는 mRNA를 의미한다. 본 발명에 따른 방법의 유용성을 테스트하기 위해, 실시예로서 eGFP mRNA를 표적 mRNA로서 사용하였다. 다양한 mRNA가 표적 mRNA로서 사용될 수 있다. 본 명세서에서, "표준 mRNA"는 세포의 상태 변화 등에 상관없이 발현 정도가 일정한 mRNA를 의미한다. 표준 mRNA의 예로서는 세포내 골격 등을 이루는 구조 유전자의 mRNA를 들 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 구조 유전자로서 전사연장인자(elongation factor)를 사용하였다.In the present specification, "target mRNA" means mRNA that requires quantification. To test the utility of the method according to the invention, eGFP mRNA was used as target mRNA as an example. Various mRNAs can be used as target mRNAs. In the present specification, "standard mRNA" refers to an mRNA whose expression level is constant regardless of a change in state of a cell or the like. Examples of standard mRNAs include mRNAs of structural genes that form the intracellular framework. In an embodiment of the present invention, the elongation factor was used as the structural gene.

본 발명에 따른 방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 전처리 공정으로서, 세포내 mRNA가 분리된다. 세포내 mRNA의 분리는 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입할 수 있는 다양한 RNA 분리 키트를 사용하여 세포내의 전체 mRNA를 분리할 수 있다. 전체 mRNA 중 표적 mRNA의 정량을 위해, 분리된 mRNA들은, 표적 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(이하, 제1 프라이머)의 존재하에서, 역전사 반응에 적용된다. 역전사 반응을 통해, 표적 mRNA에 상보적인 DNA를 포함하는 역전사물이 얻어진다. 필요할 경우, 상기 역전사 반응은 상기 전체 mRNA 내의 표준 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(이하, 제2 프라이머)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 프라이머는 표준 mRNA의 역전사를 통해, 상기 표준 mRNA에 상보적인 DNA를 생성한다. 상기 제2 프라이머의 사용은, 표적 mRNA의 양과 표준 mRNA의 양의 상대적 비의 결정을 통해, 표적 mRNA의 정량화를 보다 간단하게 수행할 수 있는 이점을 제공한다.Referring to the method according to the invention in more detail as follows. As a pretreatment process, intracellular mRNAs are isolated. Isolation of intracellular mRNA can be performed by well known methods. For example, a variety of commercially available RNA isolation kits can be used to separate total mRNA in cells. For quantification of the target mRNA in the total mRNA, the isolated mRNAs are subjected to a reverse transcription reaction in the presence of a primer (hereinafter referred to as a first primer) that specifically binds to the target mRNA. The reverse transcription reaction yields a reverse transcript containing DNA complementary to the target mRNA. If necessary, the reverse transcription reaction may further include a primer (hereinafter referred to as a second primer) that specifically binds to a standard mRNA in the total mRNA. The second primer produces a DNA complementary to the standard mRNA through reverse transcription of the standard mRNA. The use of the second primer provides the advantage that the quantification of the target mRNA can be made more simply by determining the relative ratio of the amount of target mRNA to the amount of standard mRNA.

상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 상기 표적 유전자 및 표준 유전자 mRNA에 선택성을 갖는 것이 좋다. 상기 프라이머가 임의의 다른 유전자 및/또는 핵산서열에 결합하게 되며, 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성을 수행한 후 표적 유전자 DNA의 양을 결정할 때, 원하지 않는 피크(peak)가 나타난다. 만약, 원하지 않는 피크가 표적 유전자 또는 표준 유전자의 피크와 겹치게 된다면, 데이터 분석시 오차를 유발할 가능성이 있다.Preferably, the first primer and the second primer have selectivity to the target gene and standard gene mRNA, respectively. The primer will bind to any other gene and / or nucleic acid sequence, and an undesired peak appears when determining the amount of target gene DNA after performing capillary electrophoresis-single chain morphology polymorphism. If unwanted peaks overlap with the peaks of the target or standard genes, there is a possibility of causing errors in the data analysis.

또한, 상기 프라이머는 검출에 용이한 다양한 수단에 의해 표지되는 것이 좋다. 프라이머의 표지는 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. 대표적 예로는 형광물질 또는 방사성동위원소에 의한 프라이머의 표지를 들 수 있다. 이 때, 상기 프라이머의 표지는 통상 5' 방향에서 수행된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 플루오레세인(fluorescein)의 헥사클로로(hexachloro) 유도체(이하, "HEX"라 함)가 사용되었다.In addition, the primer is preferably labeled by a variety of means that are easy to detect. Labeling of primers is well known in the art. Representative examples include the labeling of primers with fluorescent or radioisotopes. At this time, the labeling of the primer is usually carried out in the 5 'direction. In a preferred embodiment of the invention, hexachloro derivatives of fluorescein (hereinafter referred to as "HEX") were used.

특정한 mRNA와 단일 사슬 DNA의 정량을 위하여, 형태변환 다형성은 높은 수준의 민감성과 재현성 있는 전기영동 분석법을 요구한다(Johansson, M., et al., Melanoma Res. 2000, 10, 213-222; Camacho, A., et al., J. Biotechnol. 2004, 107, 107-114). 이런 관점에서, 다른 전통적인 전기영동 관련 방법들과 달리 모세관 전기영동은 그 민감성과 재현성에 있어서 형태변환 다형성의 분석에 적합하다(Wong, M.L., et al., Biotechniques 2005, 39, 75-85).For quantification of specific mRNA and single chain DNA, morphological polymorphisms require high levels of sensitivity and reproducible electrophoretic assays (Johansson, M., et al., Melanoma Res. 2000, 10, 213-222; Camacho , A., et al., J. Biotechnol. 2004, 107, 107-114). In this respect, unlike other traditional electrophoretic methods, capillary electrophoresis is suitable for analysis of morphological polymorphisms in sensitivity and reproducibility (Wong, M.L., et al., Biotechniques 2005, 39, 75-85).

생물학적 분석법에서 매우 중요한 요소임에도 불구하고, 정확한 세포내 mRNA 양을 측정하는 것은 가장 힘든 과정 중 하나이다. 이러한 종래 방법상의 문제점을 개선하기 위하여, 본 발명자들은 모세관 전기영동법에 기초한 단일쇄 형태변환 다형성(CE-SSCP)을 이용한 mRNA 분석법을 제공한다.Despite being a very important factor in biological assays, measuring the exact amount of intracellular mRNA is one of the most difficult processes. In order to improve this problem in the conventional method, the present inventors provide mRNA analysis using single-chain morphology polymorphism (CE-SSCP) based on capillary electrophoresis.

본 발명에 있어서, mRNA는 단일 반응으로부터 얻은 역전사물로부터 직접적으 로 정량할 수 있다. 이는 다양하고 복잡한 실험 단계 및 측정 기기의 한계로 인해 초래될 수 있는 실험상의 오차들을 줄이는데 도움을 준다. 또한, 리얼타임 PCR과는 달리 역전사효소 반응에 의해 제조된 단일 사슬 DNA를 다른 데이터 추정없이 CE-SSCP만을 통해 직접적으로 정량할 수 있다. 구체적으로, 역전사를 통해 얻어진 단일 사슬 DNA는 CE-SSCP 환경에서 동일한 접힘 패턴을 유지하였다. 이것은 역전사를 통해 얻어진 단일 사슬 DNA가 CE-SSCP 환경에서 단일 피크를 나타낼 수 있음을 의미한다.In the present invention, mRNA can be quantified directly from reverse transcripts obtained from a single reaction. This helps to reduce experimental errors that can be caused by various and complex experimental steps and limitations of the measuring instrument. In addition, unlike real-time PCR, single-chain DNA prepared by reverse transcriptase reaction can be directly quantified directly through CE-SSCP without any other data estimation. Specifically, the single chain DNA obtained through reverse transcription maintained the same folding pattern in the CE-SSCP environment. This means that the single chain DNA obtained through reverse transcription can exhibit a single peak in the CE-SSCP environment.

본 발명의 한 실시예에서는 시험관내 전사를 통해 얻은 eGFP mRNA를 이용한 mRNA 정량에서 CE-SSCP의 재현성과 정확성을 검증하였다. 대장균 연장요소인 EF-Tu를 내부 표준 유전자로 이용하였고, 재조합 대장균으로부터 얻은 전체 RNA 중에서 eGFP mRNA의 정확한 정량을 위해 이에 특이적으로 결합하는 역전사 프라이머를 선별하였으며, 이를 이용하여 샘플간의 오차를 최소화할 수 있음을 확인하였다(도 4 참조). 또한, mRNA 레벨(level)과 단백질 레벨에서의 발현 동역학을 분석하였으며, 이를 eGFP 활성 분석과 비교함으로써 발현 분석에 있어서의 CE-SSCP의 잠재력을 평가할 수 있었다(도 5c 참조).In one embodiment of the present invention, the reproducibility and accuracy of CE-SSCP were verified in mRNA quantification using eGFP mRNA obtained through in vitro transcription. EF-Tu, an E. coli extension factor, was used as an internal standard gene, and reverse transcriptase primers specifically binding to the total RNA obtained from recombinant E. coli were selected for accurate quantification of eGFP mRNA. It was confirmed that it can (see Figure 4). In addition, expression kinetics at mRNA level and protein level were analyzed and the potential of CE-SSCP in expression analysis could be assessed by comparing this with eGFP activity assay (see FIG. 5C).

본 발명에서 사용한 샘플 RNA로부터 역전사 효소반응만을 통해 제조한 DNA를 이용한 CE-SSCP 방법은, 종래 모세관 전기영동법을 이용한 역전사 이후 PCR을 이용한 정량법과 비교할 때 복잡한 실험 과정에서 오는 잠재적인 오차를 피할 수 있다는 장점을 제공한다(Camacho, A., et al., J. Biotechnol. 2004, 107, 107-114). 더 나아가, 전체 정량 과정이 단 몇 개의 과정으로만 이루어져 있고, 또한 대부분 자동화되어 있기 때문에, 본 발명의 mRNA 정량 방법은 mRNA 정량분석에 있어서 그 효율이 매우 높다.The CE-SSCP method using DNA prepared only by reverse transcriptase reaction from the sample RNA used in the present invention can avoid the potential error that comes from complicated experiments when compared to the quantitative method using PCR after reverse transcription using conventional capillary electrophoresis. Advantage (Camacho, A., et al., J. Biotechnol. 2004, 107, 107-114). Furthermore, since the whole quantification process consists of only a few processes and is mostly automated, the mRNA quantification method of the present invention is very efficient in mRNA quantification.

한편, CE-SSCP를 이용한 mRNA 정량 방법에 있어서 가장 중요한 고려사항 중 하나는 역전사 효소반응시 사용하게 되는 프라이머의 제작이다. 표적 mRNA는 수천개의 서로 다른 mRNA 중에서 특이적으로 전사되어야 하기 때문에, 기대하지 않은 mRNA와 프라이머 사이의 결합은 가능한 한 피해야한다(도 2 참조). 나아가, 표적 유전자를 수차례 순환에 의해 증폭시킴으로써 결과적으로 프라이머의 특이성이 덜 중요하게 되는 PCR과 비교할 때, 역전사 반응을 위한 프라이머 제작은 정확한 정량을 위해 매우 필수적이라 할 수 있다.On the other hand, one of the most important considerations in the method of quantifying mRNA using CE-SSCP is the preparation of primers used in reverse transcriptase reaction. Because target mRNAs must be specifically transcribed among thousands of different mRNAs, binding between unexpected mRNAs and primers should be avoided as much as possible (see Figure 2). Furthermore, when compared to PCR where the target gene is amplified by circulation several times, resulting in less specificity of the primers, primer preparation for reverse transcription reactions is very essential for accurate quantification.

프라임겐(Primegen)과 같은 몇몇 프라이머 제작을 위한 알고리즘이 DNA 마이크로 어레이를 위해 특이적인 프로브 제작용으로 개발되어 왔다(Nicklas, J.A., et al., J. Forensic. Sci. 2003, 48, 936-944). 이들은 DNA 마이크로어레이나 노던 블롯 분석법을 위해 전문화되어 있기에 역전사를 통해 생긴 단일 사슬 DNA의 1차 또는 2차 구조와 연관있는 CE-SSCP 분석용으로는 적합하지 않은 것으로 보인다. 앞으로, CE-SSCP 분석에 응용하기 위한 새로운 프라이머 제작에 대한 연구가 본 발명에 기초하여 가속화될 것으로 예상된다.Algorithms for the fabrication of some primers, such as Primegen, have been developed for the production of probes specific for DNA microarrays (Nicklas, JA, et al., J. Forensic. Sci. 2003, 48, 936-944 ). Because they are specialized for DNA microarray or Northern blot analysis, they do not appear to be suitable for CE-SSCP analysis involving the primary or secondary structure of single-chain DNA from reverse transcription. In the future, research on the preparation of new primers for application to CE-SSCP analysis is expected to be accelerated based on the present invention.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1. 플라스미드 벡터의 제조 1. Preparation of Plasmid Vector

PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 FNdeI 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 RXhoI 프라이머(주식회사 바이오니아, 대한민국)를 사용하였다. 주형으로 100 ng의 PUC19-eGFP 플라스미드, 각각 50 ng의 상기 프라이머, 0.5 U의 Taq 중합효소, 각 250 mM의 4가지 dNTP, 2 mM의 MgCl₂, 10 ㎕의 5X 버퍼를 이용하여 DNA를 증폭하였다. 제한효소, T4 DNA 리가제(ligase), Taq DNA 중합효소는 New England Biolabs (Beverly, MA, US)로부터 구입하였으며, pET23b 벡터는 Novagen (Darmstadt, German)으로부터 구입하였다. PCR은 다음 조건에서 30회 반복 수행하였다: 95℃에서 4분 노출 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 노출을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 반응시켰다.As the primers used for PCR, the FNdeI primer described in SEQ ID NO: 1 and the RXhoI primer described in SEQ ID NO: 2 (Bionia, Korea) were used. DNA was amplified using 100 ng of PUC19-eGFP plasmid, 50 ng of the primer, 0.5 U of Taq polymerase, 250 mM of each of 4 dNTPs, 2 mM of MgCl ₂ , and 10 μl of 5 × buffer as a template. . Restriction enzymes, T4 DNA ligase, Taq DNA polymerase were purchased from New England Biolabs (Beverly, MA, US) and the pET23b vector was purchased from Novagen (Darmstadt, German). PCR was repeated 30 times under the following conditions: after 4 minutes exposure at 95 ° C., 30 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 55 ° C., 30 seconds at 72 ° C., 30 times, and finally 7 minutes at 72 ° C. Reacted.

PCR 이후 반응 혼합물을 1% 아가로즈젤에 로딩(loading)하였으며, 증폭된 DNA는 젤 적출 키트(주식회사 바이오니아)로 정제하였다. 증폭된 PCR 산출물과 pET23b 플라스미드는 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단하였으며, PCR 정제 키트(주식회사 바이오니아)와 젤 적출 키트로 각각 정제하였다. 증폭된 eGFP 유전자를 pET23b의 NdeI과 XhoI 절단 위치에 삽입함으로써 pET23b-eGFP 플라스미드를 제작하였다.After PCR, the reaction mixture was loaded on 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified by gel extraction kit (Bionia Co., Ltd.). The amplified PCR product and the pET23b plasmid were digested with NdeI and XhoI restriction enzymes, and purified by PCR purification kit (Bionia Co., Ltd.) and gel extraction kit, respectively. The pET23b-eGFP plasmid was constructed by inserting the amplified eGFP gene into the NdeI and XhoI cleavage positions of pET23b.

실시예Example 2. 2. 시험관내In vitro 전사된 Deceased eGFPeGFP mRNAmRNA 와 Wow CECE -- SSCPSSCP 분석과의 상관관계 Correlation with Analysis

<2-1> <2-1> eGFPeGFP mRNAmRNA 의 of 시험관내In vitro 전사 Warrior

eGFP mRNA는 시험관내 전사 키트(Ambion, Austin, TX, US)로 합성하였다. 1 g의 pET23b-eGFP 주형 DNA, 2 ㎕의 75 mM ATP, 2 ㎕의 75 mM GTP, 2 ㎕의 75 mM UTP, 2 ㎕의 75 mM CTP, 2 ㎕의 10X 반응 버퍼, 2 ㎕의 효소를 섞은 후, 총 부피가 20 ㎕가 되도록 뉴클레아제가 포함되지 않은 물을 추가하였다. 혼합된 시료를 37℃에서 시험관내 전사 반응시킨 후, 제조사의 지침에 따라 eGFP mRNA를 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)로 제거하였다. RNA의 농도는 스펙트로미터 UV-1700 (Shimadzu, Kyoto, Japan)으로 260 nm의 파장에서 측정하였다.eGFP mRNA was synthesized with an in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX, US). 1 g pET23b-eGFP template DNA, 2 μl 75 mM ATP, 2 μl 75 mM GTP, 2 μl 75 mM UTP, 2 μl 75 mM CTP, 2 μl 10X reaction buffer, 2 μl of enzyme After that, water without nuclease was added so that the total volume was 20 μl. After the mixed samples were in vitro transcribed at 37 ° C., eGFP mRNA was removed with an RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. The concentration of RNA was measured at a wavelength of 260 nm with spectrometer UV-1700 (Shimadzu, Kyoto, Japan).

<2-2> <2-2> 역전사Reverse transcription 반응 reaction

슈퍼스크립트 Ⅱ 역전사 효소와 RNase 억제제는 인비트로젠(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 역전사 반응을 위하여, 여러 가지 농도의 eGFP mRNA 또는 E. coli 총 RNA를 1 ㎕의 dNTP 혼합물 (0.2 mM)과 1 ㎕의 HEX로 표지된 서열번호 3으로 표시되는 eGFP-S 프라이머(100 M)와 혼합시켰다. 이어서 뉴클리아제가 제거된 물을 총 부피가 12 ㎕가 되도록 투여하였다. RNA를 변성시키기 위해 혼합물을 65℃에서 배양한 후 4 ㎕의 5X 스트랜드 버퍼, 1 ㎕의 RNase 억제제, 2 ㎕의 0.1 M DTT를 투여하였다. 42℃에서 2분간 배양한 후 1 ㎕의 슈퍼스크립트 Ⅱ 역전사 효소를 혼합물에 투여하였다. 역전사 반응을 50분간 진행시키고 70℃에서 15분간 두었다.Superscript II reverse transcriptase and RNase inhibitors were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). For reverse transcription reaction, various concentrations of eGFP mRNA or E. coli total RNA were mixed with 1 μl of dNTP mixture (0.2 mM) and 1 μl of HEX with eGFP-S primer (100 M). Mixed. Nuclease-free water was then administered to a total volume of 12 μl. The mixture was incubated at 65 ° C. to denature RNA, followed by 4 μl 5 × strand buffer, 1 μl RNase inhibitor, 2 μl 0.1 M DTT. After incubation at 42 ° C. for 2 minutes, 1 μl of Superscript II reverse transcriptase was administered to the mixture. Reverse transcription was allowed to proceed for 50 minutes and placed at 70 ° C. for 15 minutes.

<2-3> 모세관 전기영동<2-3> capillary electrophoresis

1.5 ㎕의 PCR 산물에 17.7 ㎕의 탈이온화된 포름아마이드(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, US)와 0.3 N 수산화나트륨 0.8 ㎕을 혼합하였다. 샘플들은 95℃에서 4분 동안 변성시킨 후 즉시 얼음에 식혔다. SSCP 모세관전기영동은 에이비아이 프리즘 310 분석기(Applied Biosystems, Inc.)에 의해 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 모세관은 어플라이드 바이오시스템즈 사의 제품으로 47 ㎝ X 50 ㎜의 것을 사용하였다. 변성되지 않는 고분자 매트릭스는 3.5% 진스캔 폴리머(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하였고, 용액으로는 10% 글리세롤이 함유된 1X TBE를 사용하였다. 전기영동의 조건은 다음과 같다: 15.0 kV의 삽입전압, 13.0 kV의 전기영동 전압, 210초의 실린지 펌프 시간, 35℃의 온도와 24분의 수집시간. 이 분석기의 레이저는 DNA에 표지된 5'플루오로세인 포스포아마이드를 탐지한다. 그 신호는 자동적으로 DNA 분석 소프트웨어(Gene mapper, Applied Biosystems, Inc.)에 의해 분석된다. 크로마토그램의 X 축 데이터 값은 상기 소프트웨어에 의해 제공된 임의 단위에서의 용출 시간을 나타내는 것으로서, 제조사의 지침에 따라 변환 상수인 400 데이터 값/분을 적용하면 실제 시간 단위로 변환할 수 있다. 용출 시간은 스캔(소프트웨어 단위)으로 표시되며, 피크의 넓이는 자동으로 결정된다.17.7 μl of deionized formamide (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif., US) and 0.8 μl 0.3 N sodium hydroxide were mixed with 1.5 μl of PCR product. Samples were denatured at 95 ° C. for 4 minutes and immediately cooled on ice. SSCP capillary electrophoresis was performed by an Abiay Prism 310 analyzer (Applied Biosystems, Inc.). The capillary tube used in this example was a product of Applied Biosystems Co., Ltd. using 47 cm X 50 mm. The unmodified polymer matrix was used with 3.5% Gin Scan Polymer (Applied Biosystems, Inc.) and 1X TBE containing 10% glycerol as a solution. The conditions of electrophoresis were as follows: insertion voltage of 15.0 kV, electrophoresis voltage of 13.0 kV, syringe pump time of 210 seconds, temperature of 35 ° C. and collection time of 24 minutes. The analyzer's laser detects the 5'fluorosane phosphamide labeled on DNA. The signal is automatically analyzed by DNA analysis software (Gene mapper, Applied Biosystems, Inc.). The X-axis data value of the chromatogram represents the elution time in arbitrary units provided by the software, which can be converted to actual time units by applying a conversion constant of 400 data values / minute according to the manufacturer's instructions. Elution time is expressed in scans (software units) and the width of the peak is determined automatically.

그 결과, eGFP mRNA와 연관된 피크는 3034± 7.3 위치에서 발견되었고, 이는 CE-SSCP 크로마토그램 전체 범위에서 단 하나의 주된 피크였다(도 1a). 이는 역전사를 통해 나온 단일 사슬 DNA가 CE-SSCP 환경에서 동일한 접힘(folding) 패턴을 유지한다는 것을 보여준다. 또한, eGFP mRNA의 양이 0.7 g이 될 때 까지는 CE- SSCP 피크 넓이와 정비례함을 알 수 있었다. 그러나, eGFP mRNA가 0.7 g 이상이 되면 미세한 다른 피크가 관찰되었는데, 이는 모세관 내의 과량의 역전사물의 농도가 너무 높아서 분자간 상호작용을 피할 수 없었기 때문인 것으로 생각된다(도 1b 및 도 1c).As a result, a peak associated with eGFP mRNA was found at position 3034 ± 7.3, which was only one major peak across the entire CE-SSCP chromatogram (FIG. 1A). This shows that the single chain DNA from reverse transcription maintains the same folding pattern in the CE-SSCP environment. In addition, it was found that the amount of eGFP mRNA was directly proportional to the CE-SSCP peak width until the amount of eGFP mRNA was 0.7 g. However, when eGFP mRNA was more than 0.7 g, fine other peaks were observed, which is thought to be because the concentration of excess reverse transcript in the capillary was too high to avoid intermolecular interactions (FIGS. 1B and 1C).

상기 결과는 CE-SSCP를 이용한 mRNA 정량 방법이 적절한 농도범위에서 특이적인 mRNA의 양을 정량하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, 추가적인 PCR 반응이나 분리 정제 과정을 거치지 않아도 정확하고 높은 재현성의 피크 값을 얻을 수 있었으므로, CE-SSCP에 의해 특정한 mRNA를 빠르고 정확하게 정량할 수 있음을 확인하였다.The results show that the mRNA quantification method using CE-SSCP can be useful for quantifying the amount of specific mRNA in the appropriate concentration range. In addition, since it was possible to obtain accurate and high reproducible peak values without additional PCR reaction or separation purification process, it was confirmed that the specific mRNA can be quickly and accurately quantified by CE-SSCP.

실시예Example 3. 3. 생체내In vivo 유도된 Induced eGFPeGFP mRNAmRNA 와 Wow CECE -- SSCPSSCP 분석과의 상관관계 Correlation with Analysis

pET23b-eGFP 플라스미드를 포함하는 E. coli BL21(DE3)를 50 g/㎖의 암피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에서 배양한 후 하나의 콜로니를 선별하였다. 대조군으로는 eGFP 유전자가 없는 대장균 JM109를 사용하였다. 이들을 50 g/㎖의 암피실린을 함유한 5 ㎖의 LB 배양액에서 배양하였고 250 rpm으로 37℃에서 성장시켰다. OD₆₀₀ 값이 0.4가 되었을 때 1 M의 IPTG를 농도가 1 mM이 될 때까지 투여하였으며, 배양액을 매 1시간마다 수집하였다. 수집한 샘플로부터 얻은 총 RNA를 RNeasy 키트로 정제하였다. 총 RNA 농도는 파장 260 nm의 스펙트로포토미터로 측정하였다. 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 역전사 반응을 수행한 후, 실시 예 <2-3>과 동일한 방법으로 CE-SSCP를 수행하였다.E. coli BL21 (DE3) containing pET23b-eGFP plasmid was incubated in LB agar plates containing 50 g / ml ampicillin and one colony was selected. As a control, E. coli JM109 without eGFP gene was used. They were incubated in 5 ml LB broth containing 50 g / ml ampicillin and grown at 37 ° C. at 250 rpm. When the OD ₆₀₀ value was 0.4, 1 M of IPTG was administered until the concentration was 1 mM, and the culture was collected every 1 hour. Total RNA from the collected samples was purified by RNeasy kit. Total RNA concentration was measured with a spectrophotometer with a wavelength of 260 nm. After performing reverse transcription in the same manner as in Example <2-2>, CE-SSCP was performed in the same manner as in Example <2-3>.

그 결과, eGFP mRNA와 연관된 주 피크가 시험관내 전사반응을 통한 eGFP mRNA의 위치와 동일한 3034 부근에서 관측되었지만, 예상치 않은 마이너 피크 또한 관측되었다(도 2의 A). 이것은 pET23b-eGFP가 없는 대장균 JM109에서도 동일한 마이너 피크가 관측된 것으로 보아(도 2의 D), 역전사 프라이머가 eGFP가 아닌 다른 mRNA에도 결합했기 때문에 야기된 것으로 보인다. 두 종류의 마이너 피크 중에서 두번째 피크는 넓이가 거의 일정한 반면, 첫번째 피크는 배양시간에 따라 넓이가 변하였다(도 2의 A 내지 C). 이는 eGFP-S 프라이머가 대장균 내의 eGFP mRNA 외에도 조절인자와 구조인자 등 적어도 두개의 mRNA와 결합한다는 것을 보여준다. 따라서, 이와 같은 예기치 않은 결합을 피하기 위해 eGFP mRNA에 보다 특이적인 프라이머를 디자인하는 것이 중요하며, 또한 보다 정확한 정량을 위해 대장균 내에 구조적으로 발현되는 대장균 전사연장인자 Tu (EF-Tu)를 표준 유전자로 사용하였다.As a result, a major peak associated with eGFP mRNA was observed near 3034, which was the same as the position of eGFP mRNA via in vitro transcription, but an unexpected minor peak was also observed (A in FIG. 2). The same minor peak was also observed in E. coli JM109 without pET23b-eGFP (FIG. 2D), possibly due to the reverse transcriptase binding to mRNA other than eGFP. Among the two kinds of minor peaks, the second peak was almost constant in width, while the first peak was changed in width according to incubation time (A to C of FIG. 2). This shows that the eGFP-S primer binds to at least two mRNAs in addition to eGFP mRNA in E. coli, including regulators and structural factors. Therefore, to avoid such unexpected binding, it is important to design primers more specific to eGFP mRNA, and also the Escherichia coli transcription extension factor Tu (EF-Tu), which is structurally expressed in E. coli for more accurate quantification, as a standard gene. Used.

실시예Example 4. 4. eGFPeGFP mRNAmRNA 에만 특이적으로 결합하는 Only specifically binding to 프라이머의Of primer 제조 Produce

오직 eGFP mRNA에만 특이적인 역전사 프라이머를 제조하기 위하여, 발현되는 부분의 300 bp에서 500 bp까지의 범위에서 여러 가지 프라이머를 합성한 후, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 CE-SSCP를 수행하였다. 그 결과, 서열번호 4로 기재되는 eGFP-L 프라이머를 시험관내 전사후 CE-SSCP를 수행한 결과 3620 위치 근처에서 mRNA에 따른 피크를 관측할 수 있었다.In order to prepare a reverse transcript primer specific only to eGFP mRNA, various primers were synthesized in the range of 300 bp to 500 bp of the expressed portion, and then CE-SSCP was performed in the same manner as in Example 2. As a result, CE-SSCP was performed after in vitro transcription of the eGFP-L primer set forth in SEQ ID NO: 4, and the peak according to mRNA could be observed near the 3620 position.

다음으로 생체내에서 IPTG 인덕션한 후, 상기 eGFP-L 프라이머를 이용하여 CE-SSCP로 검사해 본 결과, IPTG 인덕션 시간과 상관없이 오로지 한 개의 피크만이 3628± 11에서 관측되었으며 이는 시험관내 전사 후 관찰한 값과 일치하였다(도 3). Next, in vivo IPTG induction, and then tested by CE-SSCP using the eGFP-L primers, only one peak was observed at 3628 ± 11 irrespective of the IPTG induction time, which is post-in vitro transcription It was consistent with the observed value (FIG. 3).

실시예Example 5. 표적 유전자와 표준 유전자에 특이적인 5. Specific to target genes and standard genes 프라이머를Primer 이용한 동시 분석 Simultaneous analysis

샘플을 준비하는 과정에서 발생되는 오차를 피해 보다 정확한 mRNA 정량을 하기 위하여, 대장균 내에서 구조적으로 발현되는 대장균 전사연장인자 Tu (EF-Tu)를 내부 표준 유전자로 사용하였다. EF-Tu mRNA의 역전사 반응에 사용되는 프라이머로 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 CE-SSCP를 수행하였다.In order to quantify the mRNA more accurately in order to avoid errors in preparing the sample, E. coli transcription extension factor Tu (EF-Tu) structurally expressed in E. coli was used as an internal standard gene. CE-SSCP was carried out in the same manner as in Example 3, except that the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5 was used as a primer used for reverse transcription of EF-Tu mRNA.

그 결과, EF-Tu mRNA의 역전사 후 생성된 단일 사슬 DNA와 연관된 피크는 pET23b-eGFP를 가진 대장균 BL21(DE3)과 JM109 모두에서 4435±9.4 부근에서 재현성 있게 관찰되었다(도 4의 A 내지 C). 반면, eGFP mRNA와 연관된 피크는 오직 pET23b-eGFP를 가진 대장균 BL21(DE3)에서만 보였다(도 4의 B). 이러한 결과는 구조적으로 발현되는 EF-Tu를 이용한 역전사 효소반응과 결합된 CE-SSCP 분석법이 생체내에서 발현되는 특이적인 대상 mRNA의 매우 정확한 정량법이 될 수 있음을 명확하게 보여준다.As a result, peaks associated with single-chain DNA generated after reverse transcription of EF-Tu mRNA were reproducibly observed around 4435 ± 9.4 in both E. coli BL21 (DE3) and JM109 with pET23b-eGFP (FIGS. 4A-C). . In contrast, peaks associated with eGFP mRNA were seen only in Escherichia coli BL21 (DE3) with pET23b-eGFP (FIG. 4B). These results clearly show that the CE-SSCP assay coupled with reverse transcriptase reaction with structurally expressed EF-Tu can be a very accurate quantification of specific target mRNAs expressed in vivo.

실시예Example 6. 6. eGFPeGFP 활성과 Active and mRNAmRNA 발현량과의 상관관계 Correlation with Expression

pET23b-eGFP 플라스미드를 포함하는 E.coli BL21(DE3)을 50 g/㎖의 암피실린이 포함된 LB 배양액에서 성장시켰고, OD₆₀₀ 값이 0.4가 되었을 때 1 M의 IPTG를 농도가 1 mM이 될 때까지 투여하였으며, 배양액을 매 40분마다 수집하였다. 대장균의 농도는 스펙트로미터 UV-1700 (Shimadzu, Kyoto, Japa)으로 260 nm의 파장에서 측정하였고, 1 OD₆₀₀ = 0.3 g/ℓ의 관계식으로 값을 계산하였다.E. coli BL21 (DE3) containing pET23b-eGFP plasmid was grown in LB cultures containing 50 g / ml of ampicillin, and when the OD ₆₀₀ value was 0.4, 1 M IPTG was brought to 1 mM concentration. The cultures were collected every 40 minutes. The concentration of E. coli was measured at a wavelength of 260 nm with a spectrometer UV-1700 (Shimadzu, Kyoto, Japa), and the value was calculated by the relationship of 1 OD ₆₀₀ = 0.3 g / L.

배양액으로부터 수집한 pET23b-eGFP를 포함하는 E.coli BL21(DE3)을 얼음에 두어 차게 만든 후, eGFP의 활성을 제조사의 지침에 따라 VICTOR3TM 1420 멀티라벨 카운터(PerkinElmer, Wellesley, MA, USA)로 측정하였다. 486 nm 여기(excitation) 필터와 96웰 플레이트의 535 nm 방출(emission) 필터를 사용하여 1초간 측정하였다. eGFP의 비활성(specific activity)은 기기의 임의 단위로서 그램 세포 당 발광량으로 정의하였다.E. coli BL21 (DE3) containing pET23b-eGFP collected from the culture was cooled and iced, and eGFP activity was measured on a VICTOR3TM 1420 multilabel counter (PerkinElmer, Wellesley, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. It was. Measurement was performed for 1 second using a 486 nm excitation filter and a 535 nm emission filter in a 96 well plate. Specific activity of eGFP was defined as the amount of luminescence per gram cell as an arbitrary unit of instrument.

그 결과, mRNA 레벨은 1시간 경과시 최대였으며(도 5b), eGFP 활성은 mRNA 발현과 비교할 때 약간 뒤쳐진다는 것을 알 수 있었다(도 5c). 이러한 eGFP 활성의 뒤처짐은 eGFP 형광을 띄기 위한 단백질이 형성되는 데 시간이 걸리는 것에 기인하는 고유의 특성이다(Lawrence, J.V., et al., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33, 482-484). eGFP의 고유 특성에 의한 시간 지연 현상과 더불어, mRNA 레벨과 단백질 활성값이 완전히 연관되어 있다는 점에서 eGFP 유전자의 발현 동역학이 분석되었다. 이러한 실험결과로부터 역전사 효소반응과 결합된 CE-SSCP 분석법이 특정 유전자의 발현에 관한 동역학 분석법에 이용될 수 있다는 것을 확인하였 다.As a result, it was found that the mRNA level was maximum after 1 hour (FIG. 5B), and eGFP activity was slightly inferior to mRNA expression (FIG. 5C). This lagging of eGFP activity is an inherent characteristic due to the time it takes for the proteins to efluorine eGFP to form (Lawrence, J.V., et al., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33, 482-484). In addition to the time lag caused by the intrinsic properties of eGFP, the expression kinetics of eGFP genes were analyzed in that mRNA levels and protein activity values were completely related. From these results, it was confirmed that the CE-SSCP assay combined with reverse transcriptase reaction could be used for kinetic analysis of specific gene expression.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 mRNA 정량 방법은 PCR에 의한 증폭 과정을 거치지 않아 이로부터 유래될 수 있는 실험상의 오차를 줄일 수 있고, 또한 종래의 mRNA 정량 방법에 비해 공정 과정이 단순하므로, 빠르고 정확하고 신뢰성 있게 세포내 mRNA 양을 측정할 수 있게 한다. 그리고, 본 발명의 방법은 특이적인 표적 mRNA에 대해 높은 재현성을 지닌 정량을 가능하게 한다. 특히, CE-SSCP에 의한 mRNA 정량을 이용한 발현 동역학의 비교연구와 eGFP 활성분석으로부터, 본 발명의 방법이 mRNA 정량법 중 가장 정량적이라는 것을 알 수 있었다(도 5c 참조). 이러한 결과는 잘 제작된 역전사 프라이머를 이용하여 단일 샘플로부터 다수의 mRNA를 동시에 분석할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.As described above, the mRNA quantification method of the present invention can reduce the experimental error that can be derived from the amplification process by PCR, and also because the process is simpler than the conventional mRNA quantification method, Enables accurate and reliable measurement of intracellular mRNA levels. In addition, the methods of the present invention allow quantitation with high reproducibility for specific target mRNAs. In particular, from comparative studies of expression dynamics using CE-SSCP quantification and eGFP activity analysis, it was found that the method of the present invention was the most quantitative among the mRNA quantification methods (see FIG. 5C). These results suggest the possibility of simultaneously analyzing multiple mRNAs from a single sample using well-designed reverse transcriptase primers.

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Claims

a) 전체 mRNA 중에서 표적 mRNA를 역전사시키는 단계와,a) reverse transcription of the target mRNA from the total mRNA,

b) 얻어진 역전사물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성에 적용시켜, 표적 mRNA에 상보적인 DNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하여 이루어진, mRNA를 정량화하는 방법.b) subjecting the obtained reverse transcript to capillary electrophoresis-single-chain polymorphism to quantify the amount of DNA complementary to the target mRNA.

제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 역전사가 상기 표적 mRNA에 특이적인 제1 프라이머의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the reverse transcription of step a) is performed in the presence of a first primer specific for the target mRNA.

제 2항에 있어서, 상기 단계 a)의 역전사가, 상기 표적 mRNA에 더하여, 표준 mRNA의 존재하에서 수행되고, 상기 제1 프라이머에 추가하여, 상기 표준 mRNA에 특이적인 제2 프라이머의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the reverse transcription of step a) is performed in the presence of a standard mRNA, in addition to the target mRNA, and in addition to the first primer, in the presence of a second primer specific for the standard mRNA. Characterized in that the method.

제 3항에 있어서, 상기 표준 mRNA는 구조 유전자의 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.4. The method of claim 3, wherein said standard mRNA is mRNA of a structural gene.

제 4항에 있어서, 상기 구조 유전자는 전사연장인자인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 4, wherein the structural gene is a transcriptional extension factor.

제 2항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 방사능동위원소 또는 형광 물질에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 2, wherein said first primer is labeled with a radioisotope or fluorescent substance.

제 3항에 있어서, 상기 제2 프라이머가 방사능동위원소 또는 형광 물질에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 방법.4. The method of claim 3, wherein said second primer is labeled with a radioisotope or fluorescent substance.

제 1항에 있어서, 상기 표적 mRNA가 eGFP mRNA (enhanced green fluorescent protein mRNA)인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the target mRNA is enhanced green fluorescent protein mRNA (eGFP mRNA).

제 8항에 있어서, eGFP mRNA에 특이적인 프라이머가 서열번호 4를 갖는 것을 특징으로 하는 방법. 10. The method of claim 8, wherein the primer specific for eGFP mRNA has SEQ ID NO.

세포내 전체 mRNA를 분리하는 단계;Isolating intracellular total mRNA;

전체 mRNA 중에서 표적 mRNA에 특이적인 제1 프라이머와 표준 mRNA에 특이적인 제2 프라이머를 준비하는 단계;Preparing a first primer specific to a target mRNA and a second primer specific to a standard mRNA among total mRNAs;

상기 제1 프라이머와 제2 프라이머의 존재하에서, 역전사 반응을 통해 표적 mRNA 및 표준 mRNA에 상보적인 DNA를 포함하는 역전사물을 제조하는 단계; 및Preparing a reverse transcript comprising DNA complementary to a target mRNA and a standard mRNA through reverse transcription in the presence of the first primer and the second primer; And

상기 역전사물을 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성에 적용시켜, 표준유전자 DNA에 대한 표적 유전자 DNA의 양을 결정하는 단계를 포함하는 mRNA의 정량 방법.Applying said reverse transcript to capillary electrophoresis-single-chain polymorphism to determine the amount of target gene DNA relative to standard gene DNA.

제 10항에 있어서, 상기 표준 mRNA는 구조 유전자의 mRNA인 것을 특징으로 하는 세포내 mRNA의 정량 방법.The method of claim 10, wherein the standard mRNA is a mRNA of a structural gene.

제 11항에 있어서, 상기 구조 유전자는 전사연장인자인 것을 특징으로 하는 방법.12. The method of claim 11, wherein said structural gene is a transcriptional extension factor.

제 10항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 상기 표적 mRNA 및 표준 mRNA에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the first primer and the second primer specifically bind only to the target mRNA and the standard mRNA, respectively.

제 10항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 방사능동위원소 또는 형광 물질에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the first primer and the second primer are each labeled with a radioisotope or fluorescent substance.

제 10항에 있어서, 상기 표적 mRNA가 eGFP mRNA (enhanced green fluorescent protein mRNA)인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 10, wherein the target mRNA is enhanced green fluorescent protein mRNA (eGFP mRNA).

제 10항에 있어서, 상기 표적 mRNA에 특이적인 제1 프라이머가 서열번호 4를 갖는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 10, wherein the first primer specific for the target mRNA has SEQ ID NO.