KR100823866B1 - 톨-유사 수용체-5 자극 활성이 증가된 플라젤린 변형체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 톨-유사 수용체-5(이하 TLR5) 자극 활성이 강화된 플라젤린 변형체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 TLR5 작동제인 플라젤린의 일부 아미노산을 점돌연변이시킴으로써 TLR5 자극 활성을 향상시켜 플라젤린 고유의 활성을 강화시킨 플라젤린 변형체에 관한 것이다.

플라젤린, 위치지정돌연변이, 톨-유사 수용체-5, NF-κB

Description

톨-유사 수용체-5 자극 활성이 증가된 플라젤린 변형체{Modified flagellin improved Toll-like receptor 5 stimulating activity}

도 1은 살모넬라균 플라젤린 St-FliC, 대장균 플라젤린 Ec-FliC 및 패혈증 비브리오균 플라젤린 Vv-FlaB의 아미노산 상동성을 비교한 것이며, 각 균주의 플라젤린 단백질의 도메인을 박스로 표시하였다.

도 2는 본 발명에 따른 플라젤린 변형체 제작에 있어서 패혈증 비브리오균 플라젤린 유전자인 flaB의 70번 아미노산 서열을 아스파르트산에서 알라닌으로, 135번 아미노산 서열을 아스파라긴에서 아스파르트산으로 위치지정 돌연변이를 유도하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3은 본 발명에 따른 재조합 플라젤린 변형체가 수용액 상태에서 플라젤린 중합(polymerization)에 미치는 영향을 보여주는 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 플라젤린 변형체의 TLR5 자극 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 톨-유사 수용체-5(이하 TLR5) 자극 활성이 강화된 플라젤린 변형체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 TLR5 작동제인 플라젤린의 일부 아미노산을 점돌연변이시킴으로써 TLR5 자극 활성을 향상시켜 플라젤린 고유의 활성을 강화시킨 플라젤린 변형체에 관한 것이다.

편모(flagella)는 세균의 운동성을 결정하는 중요한 구성요소이며 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영(swimming) 혹은 유주운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 바이오필름(biofilm)을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고도 알려져 있다. 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린(flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. Hayashi 등은 포유류가 발현하는 TLR5가 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린을 인지하여 NF-κB를 활성화시킨다고 보고하였다(Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001).

톨-유사수용체(TLR)는 대표적인 '패턴인식수용체(Pattern Recognition Receptor; PRR)'로서 이는 병원체에 존재하는 ‘병원체와 관련된 분자구조(Pathogen Associated Molecular Pattern; PAMP)'를 인식하는 수용체이며 포유동물뿐만 아니라 곤충, 식물세포의 표면에도 존재한다. 지금까지 모두 13 종류의 TLR이 밝혀져 있으며 각 TLR의 작동제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Akira S, Uematsu S, Takeuchi O: Cell 124(4): 783-801, 2006).

TLR과 같은 PRR은 숙주세포의 세포 표면 혹은 세포질 내에 분포하며, 다양한 PAMP의 자극에 의해 '선천성 면역 반응(innate immune response)'을 유도하고 나아가 '획득 면역 반응(adaptive immune response)'을 조절한다. 따라서, TLR 작동제(agonist)들은 다양한 ‘면역 조절제’, 특히 ‘백신 보조제’ 개발에 적합한 표적이 될 수 있다.

백신 보조제란 백신과 함께 투여할 경우(coadministration) 백신 항원에 의해 유도되는 항원 특이적 면역 반응(Ag-specific immune response)을 향상(enhance), 지속(prolong) 또는 촉진(accelerate)시킬 수 있는 물질을 칭한다. 현재까지 사람에게 사용할 수 있도록 승인된 백신 보조제에는 'alum(알루미늄 포스페이트(aluminium phosphate) 및 알루미늄 히드록시드(aluminium hydroxide))' 및 '스쿠알렌 에멀젼(squalene emulsion)' 등이 있다. 백신 보조제는 다음 5가지의 조건 중 1가지 이상을 충족해야만 한다: 1) 항원제공세포(antigen presenting cell) 표면의 공동자극 분자(co-stimulatory moleciule) 발현 조절, 항원 특이적 T 림프구 반응 유도 혹은 사이토카인(cytokine) 분비 조절과 같은 면역조절(immunomodulation), 2) 항원 제공(presentation), 3) CD8+ T 림프구 반응, 4) 표적(targeting), 5) 항원 축적능(depot generation).

이상적인 백신 보조제는 1) 안전해야하고, 2) 체내에서 생분해되어야하며, 3) 항원 단독으로 투여했을 경우보다 높은 방어면역 혹은 치료면역능을 보여야하고, 4) 화학적 혹은 생물학적으로 확인된 물질이어야 하며, 5) 항원보다 낮은 농도 에서 작용하는 것이 좋고, 6) 상업적 혹은 임상적으로 쉽게 적용할 수 있도록 반감기가 길어야한다.

현재 백신 보조제로 사용되고 있거나 사용이 고려되고 있는 것으로는 1) 수산화 알루미늄 젤 등과 같은 미네랄 염(mineral salt), 2) 계면활성 물질, 3) 세균 유래 물질, 4) 사이토카인 혹은 호르몬, 6) 다가음이온(polyanion), 7) 폴리아크릴(polyacryl), 8) 담체(carrier), 9) 바이러스를 이용한 생 벡터(living vector), 10) 미네랄 오일(mineral oil)이나 리포좀(liposome)과 같은 운반제(vehicle) 등이 있다. 이 중에서 현재 활발한 연구가 진행되고 있으며 크게 주목받고 있는 단백질 유래 백신 보조제로는 Vibrio cholerae에서 유래한 콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 대장균 유래의 이열성 독소(heat-labile toxin, LT)가 있다. 이들 백신 보조제는 점막 부위(mucosal area) 및 혈청(serum) 중에서 항원 특이적 항체(antigen-specific antibody) 생산을 유도하며, 항원제공세포(antigen presenting cell; APC) 표면의 B7-2 발현을 유도하여 CD4+ 세포의 공동자극 신호(co-stimulatory signaling)를 촉진하는 기전에 의한다는 보고가 있다. 그러나 이들은 장독성(enterotoxicity)이 높은 외독소이므로 독성(toxicity)은 줄이고 보조제적 특성(adjuvaticity)은 높이는 방향으로 연구가 진행 중이다.

PCT 국제특허공개공보 제WO 2005/070455호에서 본 발명자들은 최근 패혈증 비브리오균의 숙주 부착 및 침습인자(adhesion/invasion factor)를 스크리닝하기 위하여 ‘전위자 돌연변이 라이브러리(transposon mutant library)’를 제작하여 숙주 세포에 대한 부착능(adhesion)과 운동성(motility)이 상실된 3 클론의 Tn-플 랭킹 영역(Tn-flanking region)을 분석하는 과정 중에 56개의 유전자로 구성된 2개의 편모관련 오페론(flagella operon)을 동정하였다. 이 과정에서 패혈증 비브리오균은 총 여섯 개의 플라젤린 유전자를 가지고 있으며(flaA, flaB , flaF , flaC , flaD , flaE) 이 중 flaB 유전자가 플라젤린을 구성하는 주요 인자임을 확인하였다. 본 발명자는 패혈증 비브리오균 극성 플라젤린(polar flagellin)을 구성하는 성분인 플라젤린 재조합 단백질(FlaB)을 패혈증 비브리오균에 대한 ‘성분 백신(component vaccine)’으로서 응용 가능성을 추진하던 중에, 플라젤린 백신 보조제 효능이 있음을 알게 되었고 이를 규명하고자 연구를 진행하였다. 그 결과, 백신 항원인 테타누스 유독소를 플라젤린과 함께 실험동물의 비강에 투여하면 플라젤린이 숙주의 TLR5에 신호를 보내어 면역체계를 활성화시킴으로써 백신의 효능을 증폭시키며, 테타누스 유독소와 플라젤린을 함께 투여하여 면역한 마우스에 치사량의 테타누스 독소를 주사할 경우에 100% 방어 면역능을 유도함으로써 탁월한 ‘점막 백신 보조제’ 효능이 있음을 증명하였다(Lee SE, Kim SY, Jeong BC, Kim YR, Bae SJ, Ahn OS, Lee JJ, Song HC, Kim JM, Choy HE, Chung SS, Kweon MN, Rhee JH.: Infect. Immun. 74: 694-702, 2006).

다양한 TLR 작동제 중에서 TLR5를 자극하는 플라젤린은 다른 TLR 작동제[CpG-DNA, MALP (mycoplasmal lipopeptide)]와는 달리 단백질 성분이기 때문에 재조합 단백질을 합성하여 지속적인 품질 관리(quality control)가 가능할 뿐만 아니라 TLR5 자극 활성이 강화된 다양한 재조합 융합 단백질을 제작할 수 있다.

플라젤린의 3차원 구조에 관한 연구 보고에 의하면 플라젤린 단량 체(monomer) 사이에서는 극성을 띄는 아미노산 잔기와 전하를 띄는 아미노산 잔기가 서로 반응(polar-charge reaction)하여 각 단량체가 축 상호작용(axial interaction)하여 다량체를 이루어 플라젤라 고유의 필라멘트 구조를 형성한다(Yonekura K, Maki-Yonekura S, Namba K: Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy. Nature. 2003 424(6949):643-50; Samatey FA, Imada K, Nagashima S, Vonderviszt F, Kumasaka T, Yamamoto M, Namba K: Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature. 2001 410(6826):331-7). Smith 등의 연구에 의하면 TLR5는 다량체화된 필라멘트 타입의 플라젤린을 인식하는 것이 아니라 플라젤린 단량체(monomer)를 인식하는 것으로 보고되었다(Smith KD, Andersen-Nissen E, Hayashi F, Strobe K, Bergman MA, Barrett SL, Cookson BT, Aderem A.Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nat Immunol. 2003 4(12):1247-53).

현재 임상에서 사용되고 있는 ‘예방 및 치료 백신제제들’(감염질환, 자가면역 질환, 알러지 질환, 암 백신) 에서 관찰되는 공통적인 문제점은 해당 반응을 증폭시켜 주는 목적으로 사용되는 백신 보조제로부터 유래한다는 것이다. 즉, 좀 더 안전하고, 효율이 좋은 백신 보조제의 개발이 강력하게 요망되고 있다.

이에 본 발명자들은 패혈증 비브리오균 플라젤린 유전자 flaB의 플라젤린 단량체(monomer)간의 축상호반응(axial interaction)에 관여할 것으로 예견되는 아미노산 서열을 돌연변이시켜 축상호반응에 관여하는 극성-전하 반응(polar-charge reaction)을 억제시킬 수 있는 재조합 플라젤린 변형체를 제조함으로써 기존의 플라젤린에 비해 TLR5 자극 활성이 월등히 향상된 플라젤린 변형체를 제작할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 TLR5 자극 활성이 향상된 플라젤린 변형체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 플라젤린 변형체를 유효성분으로 함유하는 백신 보조제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 TLR5 작동제인 플라젤린의 플라젤린 단량체(monomer)간의 상호반응을 억제하는 플라젤린 변형체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 기능이 향상된 플라젤린 변형체를 유효성분으로 함유하는 백신 보조제를 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 TLR5 작동제인 플라젤린의 일부 아미노산을 점돌연변이시킴으로써 플라젤린 단량체(monomer)의 다량체화(multimerization)를 억제하여 TLR5 자극 활 성이 강화된 플라젤린 변형체에 관한 것이다.

본 발명은 TLR5 작동제인 플라젤린의 플라젤린 단량체 간의 축 상호반응에 관여할 것으로 분석된 70 번째 아미노산인 아스파르트산(aparteic acid; D70)을 알라닌(alanine; A)으로 위치 지정 돌연변이시켜 제조한 서열번호 2의 플라젤린 변형체(D70A) 및 135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N135)을 아스파르트산(aspartic acid; D)으로 위치 지정 돌연변이시켜 제조한 서열번호 4의 플라젤린 변형체(N135D)에 관한 것이다. 또한 본 발명에 의한 플라젤린 변형체는 70 번째 아미노산인 아스파르트산(aparteic acid; D70)을 알라닌(alanine; A)으로, 135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N135)을 아스파르트산(aspartic acid; D)으로 동시에 위치 지정 돌연변이시켜 제조한 서열번호 6의 플라젤린 변형체(D70A/N135D)에 관한 것이다.

본 명세서에서 언급하는 플라젤린은 세균의 운동성을 결정하는 섬모인 플라젤라를 구성하는 단위 분자이다.

본 발명에서 제공하는 상기 플라젤린 변형체들은 TLR5 자극 활성이 월등히 향상되었으며, 이러한 현상은 수용액 상에서 플라젤린 변형체가 기존의 플라젤린에 비해서 다량체화(multimerization)가 현저히 감소되어 플라젤린 중합이 억제되어 나타남을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에 의해 제조된 TLR5 자극활성이 월등히 향상된 플라젤린 변형체는 기존의 플라젤린을 대체하여 보다 강력한 TLR5 작동제를 제공함으로써 기존의 플라젤린이 갖는 효율보다 강화된 백신 보조제를 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 플라젤린 변형체를 이용한 TLR5 자극 활성 강화를 증명하는 과정은 다음과 같다:

1) 서열번호 2, 4 및 6의 플라젤린 변형체를 제조하는 단계;

2) 상기 플라젤린 변형체가 수용액 상에서 플라젤린 중합을 억제시킴을 확인하는 단계; 및

3) 대장균에서 유도된 각 재조합 플라젤린 변형체의 TLR5 활성화를 확인하는 단계;

를 포함한다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 또는 시험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예 또는 시험예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 균주 및 플라스미드의 특성은 표 1에 정리하였다. 각각의 제조방법과 자세한 특성은 해당 실시예 및 시험예에서 적시하였다.

균주 혹은 플라스미드	특 징	출 처
Escherichia coli
DH5α	F-recA1; restriction negative	실험실 기존 보유
ER2566	F-λ- fhuA2 [ lon ] ompT lacZ :: T7 gene1 gal sulA11 ( mcrC - mrr )114:: IS10 R( mcr -73:: miniTn10 - TetS )2 R(zgb-210::Tn10)(TetS) endA1 [ dcm ]	New England Biolab
BL21(DE3)	F-ompT hsdSB ( rB - mB -) gal dcm (DE3)	Novagen
Plasmids
pCR2.1 TOPO	PCR TA 클로닝 벡터, AmpR,KmR	Invitrogen
pTYB12	IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) 발현 벡터, AmpR	New England Biolab

<각 균주의 배양 및 보관>

하기 실시예 및 시험예에서 사용한 대장균 균주들은 Luria Bertani 배지(Difco Co.)에서 배양하였다. 사용한 균주들은 배양 후 글리세롤을 30% 되게 첨가하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.

[실시예 1] 위치 지정 돌연변이 재조합 플라젤린 변형체의 제조

기존에 보고된 살모넬라균의 플라젤린 3차원 구조 분석 데이터(Yonekura K, Maki-Yonekura S, Namba K: Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy. Nature. 2003 424(6949):643-50; Samatey FA, Imada K, Nagashima S, Vonderviszt F, Kumasaka T, Yamamoto M, Namba K: Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature. 2001 410(6826):331-7)와 본 발명자의 생물정보학적 분석(bioinformatics analysis)에 의하면 패혈증 비브리오균 플라젤린 FlaB 단량체 간의 축 상호반응(axial interaction)에 필요한 아미노산 잔기는 다음과 같다. 즉 축 반응에 관여하는 각 단량체 중 상위에 존재하는 단량체(upper subunit)의 70번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid; D70)과 135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; D77)이 하위에 존재하는 단량체(lower subunit)의 각각 101번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N101)과 108번째 아미노산인 글루타민산(glutamic acid; E108)이 극성-전하 반응(polar-charge reaction)을 통해 다량체(multimer)를 형성할 것으로 분석되었다(즉, 상위 플라젤린 D70:하위 플라젤린 N101; 상위 플라젤린 N135:하위 플라젤린 E108).

본 발명에서는 플라젤린 단량체 간의 축 상호반응에 관여할 것으로 분석된 70 번째 아미노산인 아스파르트산(aparteic acid; D70)과 135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N135)을 각각 알라닌(alanine; A)과 아스파르트산(aspartic acid; D)으로 각각 위치 지정 돌연변이시켜, 서열번호 2의 D70A 및 서열번호 4의 N135D 플라젤린 변형체를 각각 제조하였다.

먼저 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 위한 주형 (template) DNA를 얻기 위해 서열번호 7의 PCR 프라이머 FlaB-V5 (5'-gcggccgcatggcagtgaatgtaaatgtaaatacaaac-3'; 클로닝을 위해 삽입한 제한효소 NotI 제한효소 인식부위를 밑줄로 그어 표시하였음)와 서열번호 8의 PCR 프라이머 FlaB-V4 (5'-cccggggcctagtagacttagcgctga-3': 클로닝을 위해 삽입한 제한효소 SmaI 제한효소 인식부위를 밑줄로 그어 표시하였음)를 사용하여 PCR을 통해 flaB 유전자의 ORF을 함유하고 있는 1,142 bp의 DNA 조각을 증폭하였다. 즉, 프라이머 FlaB-V5 및 FlaB-V4을 사용한 PCR 반응은 초기변성 95℃ 1 분 후, 변성 95℃ 30초, 어닐링 70℃ 30초, 확장 72℃ 1분, 30회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 실시하였다. 이렇게 증폭된 flaB DNA 조각은 PCR 2.1-TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen Co.)에 클로닝하여 pCMM270으로 명명하였으며, pCMM270 플라스미드는 다음의 위치 지정 돌연변이를 위한 주형 DNA(template DNA)로 사용되었다.

패혈증 비브리오균 플라젤린 유전자 flaB 70번째 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid; D70)을 알라닌(alanine; A)으로 치환하기 위하여 서열번호 9의 PCR 프라이머 FlaB-SD1 (5'-gtacgtaacgccaacgcaggtatctcaatc-3')와 서열번호 10의 PCR 프라이머 FlaB-SD2 (5'-gattgagatacctgcgttggcgttacgtac-3')와, PCR 주형인 pCMM270, 교정(proof reading) 활성이 있는 고유의 Pfu 폴리머라아제(Stratagene Co.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 돌연변이가닥(D70A)을 합성하였다. 즉, FlaB-SD1 및 FlaB-SD2 프라이머를 사용한 PCR 반응은 초기변성 95℃ 45초 후, 변성 95℃ 45초, 어닐링 63℃ 1분, 확장 68℃ 10분, 16회 반복한 후 마지막 68℃에서 10분 반응시키는 조건으로 실시하였다. 이렇게 증폭된 서열번호 1의 D70A 위치지정 돌연변이 flaB DNA는 PCR 2.1-TOPO 클로닝 벡터에 클로닝하여 pCMM272로 명명하였다.

135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N135)을 아스파르트산(aspartic acid; D)으로 치환시키기 위해 서열번호 11의 PCR 프라이머 FlaB-SD3 (5‘-cgtcttttggtggtgacaagctgctaaacg-3')와 서열번호 12의 PCR 프라이머 FlaB-SD4 (5'-cgtttagcagcttgtcaccaccaaaagacg-3'), PCR template인 pCMM270, 플라스미드 및 교정(proof reading) 활성이 있는 고유의 Pfu 폴리머라아제(Stratagene Co.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 돌연변이가닥(N135D)을 합성하였다. 즉, 서열번호 11 및 12 프라이머를 사용한 PCR 반응은 초기변성 95℃ 45초 후, 변성 95℃ 45초, 어닐링 63℃ 1분, 확장 68℃ 10분, 16회 반복한 후 마지막 68℃에서 10분 반응시키는 조건으로 실시하였다. 이렇게 증폭된 서열번호 3의 N135D 위치지정 돌연변이 flaB DNA는 pCMM273으로 명명하였다.

서열번호 6의 D70A/N135D 이중 위치지정 돌연변이 플라젤린 변형체를 제조하기 위해서는 PCR 반응의 주형으로 N135D 위치지정 돌연변이 flaB DNA를 갖고 있는 pCMM273을 사용하였다. 서열번호 9의 PCR 프라이머 FlaB-SD1과 서열번호 10의 PCR 프라이머 FlaB-SD2 플라스미드 및 교정(proof reading) 활성이 있는 고유의 Pfu 폴리머라아제(Stratagene Co.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 돌연변이가닥(D70A)을 합성하였다. PCR 반응은 초기변성 95℃ 45초 후, 변성 95℃ 45초, 어닐링 63℃ 1분, 확장 68℃ 10분, 16회 반복한 후 마지막 68℃에서 10분 반응시키는 조건으로 실시하였다. 이렇게 증폭된 서열번호 5의 D70A/N135D 이중 위치지정 돌연변이 flaB DNA는 pCMM274로 명명하였다.

위치지정 돌연변이 flaB(D70A, N135D 혹은 D70A/N135D) 유전자가 포함된 서열번호 1, 3 및 5의 DNA 조각을 제한효소 NotI과 SmaI으로 잘라낸 후 동일한 제한효소로 자른 pTYB12 플라스미드(New England Biolabs)에 클로닝한 후 각각 pCMM276, pCMM277과 pCMM278로 명명하였다. 이들 플라스미드를 ER2566 대장균에 일렉트로포레이션 방법으로 넣어 주고 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴 비드 칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합 단백질로부터 점돌연변이 플라젤린(D70A, N135D, D70A/N135D) 단백질들만을 얻었다. 분리된 점돌연변이 플라젤린 단백질 내에 함유되어 있는 내독소(endotoxin)는 AffinityPakTM Detoxi GelTM Endotoxin Removing gel(Pirece 사)을 이용하여 제거하여 사용하였다. 이렇게 분리한 재조합 단백질은 Superdex120 (Amersham 사) 컬럼을 이용하여 젤-여과(Amersham사의 AKTA-Prime을 이용)을 실시하여 고순도의 재조합 플라젤린 변형체를 분리 정제하였다.

[시험예 1] 플라젤린 변형체 재조합 플라젤린 변형체 생산 및 수용액 내에서의 생화학적 특성

플라젤린 변형체 재조합 플라젤린 변형체를 제조하기 위하여, 플라젤린 변형체를 인코딩하는 서열번호 1, 3 및 5의 유전자를 각각 pTYB12 플라스미드에 클로닝한 후 ER2566 대장균에 형질전환하고 배지에 0.3mM IPTG(Isopropyl-β-D-1-thiogalactoside)를 첨가하여 재조합 플라젤린 변형체를 유도한 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 네이티브(Native)-젤 전기영동을 실시하여 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 살펴보면, 플라젤린(FlaB)과 플라젤린 변형체(mutated FlaB)를 SDS-PAGE한 결과 서열번호 2, 4 및 6의 점돌연변이 플라젤린(D70A, N135D, D70A/N135D)과 기존의 야생형 플라젤린(FlaB)은 모두 41.5KDa에서 주요 밴드를 나타내었다. 네이티브(Native)-젤 전기영동 결과 FlaB는 매우 큰 다량체를 형성하여 대부분의 단백질은 퇴적용 젤(stacking gel)에 그대로 남아 있으며 분해 젤(resolving gel) 내로 진입한 일부의 FlaB 단백질은 66Kda과 140 KDa 사이에서 흐릿하게 분포하고 있음을 관찰하였다. 반면 본 발명에 의한 점돌연변이 플라젤린 변형체(D70A, N135D, D70A/N135D) 단백질은 140KDa 근처에서 다량체를 형성하였다. 이상의 결과는 FlaB 단백질은 수용액 상태에서 매우 큰 다량체(huge multimer)를 이루지만 본 발명에 의한 점돌연변이 플라젤린 변형체들(D70A, N135D, D70A/N135D)은 이보다 규모가 작은 다량체(multimer)로 존재함을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 의한 서열번호 2, 4 및 6의 플라젤린 변형체(D70A, N135D, D70A/N135D)가 플라젤린의 중합을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 플라젤린 변형체의 TLR5 자극 활성

야생형의 FlaB 및 본 발명에 의한 서열번호 2, 4 및 6의 플라젤린 변형체의 TLR5 자극 활성을 측정하기 위하여 TLR5 매개 신호전달에 관여하는 주요 인자인 NF-κB의 전사 활성을 측정하기 위해 24-웰 평판 배양기에 293T 세포를 1x105 세포씩 분주하여 하룻저녁 배양한 후 FuGENE6(Roche 사)을 이용하여 NK-κB 전사활성을 관찰할 수 있는 리포터 플라스미드인 NF-κB-Luc(한양대학교 의과대학 미생물학 교실의 김정목 교수로부터 획득)와 TLR5 유전자가 클로닝된 p3xFlag-hTLR5 플라스미드(미국 Wake Forest University School of Medicine, Departments of Microbiology and Immunology의 Steven B. Mizel로부터 획득) 및 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) 발현 대조군 플라스미드(Clontech 사)를 동시에 세포내로 도입시켰다. 24시간 추가 배양 후 새로운 배지를 교체하고, 실시예 1에서 분리한 서열번호 2, 4 및 6의 플라젤린 변형체(D70A, N135D, D70A/N135D)를 18-24 시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 측정하여 NF-κB 전사정도를 발광분석기(luminometer, Berthold사)를 이용해 측정하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 살펴보면, 50 ng/ml의 FlaB 재조합 단백질을 처리한 군은 인산완충액으로만 처리한 대조군에 비해 TLR5 매개 NF-κB 전사 활성이 각각 약 1.8 배 증가하였다. 반면 50 ng/ml의 D70A FlaB, N135D FlaB 및 D70A/N135D FlaB 재조합 플라젤린 변형체를 처리한 군은 인상완충액으로만 처리한 대조군에 비해 TLR5 매개 NF-κB 전사 활성이 각각 약 5.2배, 5.6배 및 4.4배 증가하였다.

본 발명에서는 PCT 국제특허공개공보 제WO 2005/070455호에 의해 플라젤린이 TLR5를 자극하여 강력한 점막백신 보조제 효능이 있는 것으로 밝혀진 플라젤린의 TLR5 자극 활성을 더욱 향상시킨 플라젤린 변형체를 제공함으로써 보다 업그레이드된 플라젤린 백신 보조제를 개발하였다. 이는 새로운 패러다임의 ‘감염질환’, ‘자가 면역 질환’ 및 ‘알러지 질환’ 등의 치료와 나아가 ‘항암면역 치료’와 같은 응용 연구(Applied Science research)는 차세대의 주목 받는 연구 테마이며, 기초 연구와 베드-사이드(bed-side)의 임상연구를 연결해 주는 중요한 고리를 제공할 것이다. 따라서, 본 발명에 의한 결과를 각종 백신제제에 적용한다면 엄청난 부가 가치를 창출할 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 톨-유사 수용체-5(TLR-5) 자극 활성이 강화된 패혈증 비브리오균의 플라젤린 변형체로서, 70번째 아미노산인 아스파르트산(aparteic acid; D70)을 알라닌(alanine; A)으로 위치 지정 돌연변이시켜 제조한 서열번호 2의 플라젤린 변형체.
2. 톨-유사 수용체-5(TLR-5) 자극 활성이 강화된 패혈증 비브리오균의 플라젤린 변형체로서, 135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N135)을 아스파르트산(aspartic acid; D)으로 위치 지정 돌연변이시켜 제조한 서열번호 4의 플라젤린 변형체.
3. 톨-유사 수용체-5(TLR-5) 자극 활성이 강화된 패혈증 비브리오균의 플라젤린 변형체로서, 70번째 아미노산인 아스파르트산(aparteic acid; D70)을 알라닌(alanine; A)으로, 135번째 아미노산인 아스파라긴(asparagine; N135)을 아스파르트산(aspartic acid; D)으로 동시에 위치 지정 돌연변이시켜 제조한 서열번호 6의 D70A/N135D 플라젤린 변형체.
4. 제 1항 내지 제3항에 의한 플라젤린 변형체를 유효성분으로 포함하는 백신 보조제.

Images