KR100815868B1

KR100815868B1 - 감초 추출물 또는 이로부터 분리한 리퀴리틴 또는리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료를 위한 조성물

Info

Publication number: KR100815868B1
Application number: KR1020060110698A
Authority: KR
Inventors: 양재하; 김상찬; 이종록; 장은영; 김상건
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2008-03-21

Abstract

본 발명은 감초 (Glycyrrhiza radix) 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 (Liquiritin) 또는 리퀴리티게닌(Liquiritigenin)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 뇌의 측핵 내 도파민 유리의 억제 효과를 나타내어 약물 중독 및 금단 증상의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

리퀴리틴, 리퀴리티게닌, 약물 중독, 금단 증상

Description

감초 추출물 또는 이로부터 분리한 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료를 위한 조성물 {Composition comprising the extract of Glycyrrhiza radix or liquiritin or liquiritigenin isolated therefrom for the prevention and treatment of drug abuse and withdrawal symptoms}

도 1은 약물 투여로 인한 흰쥐의 측핵 내 도파민 유리에 대한 감초 메탄올 추출물의 효과를 나타낸 도이고,

도 2는 약물 투여로 인한 흰쥐의 측핵 내 도파민 유리에 대한 리퀴리틴의 효과를 나타낸 도이며,

도 3은 약물 투여로 인한 흰쥐의 측핵 내 도파민 유리에 대한 리퀴리티게닌의 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 뇌의 측핵 내 도파민 유리의 억제 효과를 갖는 감초 (Glycyrrhiza radix) 추출물 또는 이로부터 분리한 리퀴리틴 (Liquiritin) 또는 리퀴리티게 닌(Liquiritigenin)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

과학문명의 발달과 급진하는 경제사회에 따른 현대인들의 잇따른 스트레스로 인해 약물중독의 확산은 가장 중요한 현대 사회문제 중의 하나이다. 약물이란 질병을 예방, 치료하는데 사용되는 물질을 지칭하며, 신체기능의 변화를 일으키는 물질을 말한다. 이러한 약물의 남용은 부정적인 측면에서 신체적, 정신적, 사회적으로 자기 파괴의 문제를 발생시킨다. 약물중독은 아편이나 신경안정제 또는 알코올과 같은 약물에 대한 신체적인 반응을 지칭한다. 이러한 약물중독은 내성, 금단증상 및 습관화의 현상을 가지는데, 약물의 사용으로 인한 통제력 상실을 의미하기도 한다. 최근의 약물남용은 청소년, 여성 약물남용자의 증가로 인한 세계적으로 심각한 정신질환중의 하나로서, 중독성 약물에 대한 치료제의 개발은 시급한 현실이다. 이러한 약물중독의 해결책으로 여러 가지 사회정책 및 치료, 재활을 위한 프로그램이 이루어지고 있지만, 근본적인 치료대책으로서, 한계점을 가지고 있다.

코카인 (Cocaine), 암페타민 (Amphetamine), 모르핀 (Morphine) 등과 같은 중독성 약물들은 약물투여에 따른 보행성 활동량을 증가시킨다 (Wiechman BE et al., Pharmacol . Biochem . Behav., 15(3), pp425-33, 1981). 따라서, 이러한 보행성 활동량은 약물중독의 지표로 사용되고 있다. 코카인은 약물강화효과를 통하여 탐닉현상이 생기는데, 이러한 행동적 변화에 영향을 주는 요인이 도파민 (Dopamine, DA) 신경전달계의 활성화이다. 특히, 코카인 투여로 인한 보상 및 강화작용은 복측 피개 영역 (Ventral tegmental area, VTA)의 A10 신경 (A10 neuron)에서 기시하여 측핵 (Nucleus accumbens)으로 투사되는 중뇌 변연계가 중요한 역할을 맡고 있다고 알려져 있다 (Einhorn LC. et al., J. Neurosci., 8(1), pp100-12, 1988).

최근의 연구들을 보면 코카인의 투여로 인하여 약물 중독과 관련이 있는 측핵 및 선조체 등의 도파민성 신경세포의 투사부위에서 신경활성의 지표라고 알려진 초기 유전자 c-fos(Immediate early gene c-fos)의 단백인 c-Fos 발현이 증가되었다는 보고가 있다. 실험동물에 반복적으로 도파민 D1 수용체 효능제인 SKF-38393를 투여한 경우, 보행성 활동량과 신경활성도의 지표인 c-Fos 의 발현이 증가되었다. 또한 도파민의 길항물질인 SCH 23390을 투여한 결과, 코카인에 의한 보행성 활동량이 줄어들었다 (Parada A., et al., Neuropharmacology, 39(9), pp1645-52, 2000). 생체내 (In vivo) 미세투석법 (Microdialysis)을 이용하여 관찰한 실험에서 약물 중독과 관련있는 부위인 선조체 및 측핵에서 코카인 투여로 인한 도파민의 농도는 현저하게 증가하였으며 (Pontieri FE., et al., Natl. Acad . Sci . USA ., 92, pp12304-8, 1995), 이는 또한, 보행성 활동량이 증가를 보임으로써, 생화학적인 측면인 도파민과 행동학적인 측면인 보행성 활동량이 상관관계가 있음을 보여주는 실험적인 증거를 제시하였다 (Kuczenski R et al., J. Neurosci., 11(9), pp2703-12, 1991). 따라서 약물의 중독성에 관여하는 신경기전의 규명이야말로 약물중독치료에 궁극적인 해답을 줄 수 있을 것이다.

동양약물학에서 감초(甘草, Glycyrrhizae radix)는 많은 복합 처방에 빈번히 응용되는 일반적으로 안전한 한약제이다(Kamei, J., et al., Eur . J. Pharmacol ., 469, pp159-163, 2003). 다년생 초본으로 근경(根莖)은 원주상(圓柱狀)인데 주근 (主根)은 매우 길고 거칠고 크며, 외피(外皮)는 적갈색에서 암갈색이다. 뿌리는 단맛이 나서 감미료, 한약재로 사용하여, 중국 동북부와 시베리아, 몽골 등지에 분포한다. 감초의 근(根)과 근경(根莖)에는 트리테르펜(triterpene) 계(系) 사포닌(saponin), 글리시르히진(glycyrrhizin)이 함유되어 있는데, 이것은 글리시르히진산의 2-글루쿠론(glucuron)산 배당체로 감초의 감미성분이다. 이 배당체에는 혈액작용은 없으나 글리시르헤틴(glycyrrhetin)산에는 있다. 감초(根)의 가수분해 성분 중에는 우랄렌(uralen)산이 추출되어 이것이 18α-글리시르헤틴 산이라는 것이 증명되었다 (정보섭 외 1인, 향약대사전, 영림사, pp684-687, 1988).

이에 따라 본 발명자들은 감초(Glycyrrhiza radix)의 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌이 뇌의 측핵 내 도파민 유리 억제를 통해 급성 약물투여에 의한 약물강화작용을 저해시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 뇌의 측핵 내 도파민 유리의 탁월한 억제효과를 갖는 감초(Glycyrrhiza radix) 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감초(Glycyrrhiza radix) 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감초(Glycyrrhiza radix) 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 의미한다.

이하, 본 발명의 감초 추출물, 리퀴리틴 및 리퀴리틴게닌을 분리하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 감초 추출물은, 건조된 감초를 세절하여 무게(㎏)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로, 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 리퀴리틴 및 리퀴리틴게닌은 하기와 같이 분리할 수 있다.

건조된 감초를 분쇄하고 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성 용매로 추출한 후에 감압농축하여 극성용매에 가용한 조추출물을 얻는 제 1단계; 상기 단계에서 얻은 조추출물을 컬럼 크로마토그래피 및 TLC를 수행하는데, 상기 실리카겔컬럼에 클로로포름 : 메탄올 ( 100:0 ~ 0:100(w/w)) 전개용매에서 처음에는 클로로포름만 전개시키고 점차적으로 메탄올의 농도를 순차적으로 높여가는 농도구배 전개용매를 컬럼에 전개시켜 분획 후, TLC상에서 R_f치가 0.4 내지 0.5를 갖는 분획끼리 모아 단일분획을 만들고 건조하여 정제된 형태의 흰색 분말의 리퀴리틴을 얻는 제 2단계를 포함한다.

또한, 감초 추출물의 유효성분 중의 하나인 리퀴리티게닌의 함량을 높이기 위하여 하기와 같이 산처리 후에 중화시켜 유효성분의 함량을 증가시킬 수 있다. 상기에서 수득한 리퀴리틴에 산성용액, 바람직하게는 1N 염산을 넣어 약 60 내지 100 ℃, 바람직하게는 100 ℃로 약 12 내지 72시간, 바람직하게는 2시간 중탕가열하여 리퀴리틴에서 당을 분리한 후, 산성분을 중화시키기 위하여 동량의 염기성용액, 바람직하게는 1N 수산화나트륨을 가하여 리퀴리티게닌의 함량이 증대된 감초 추출물을 수득할 수 있으며, 이와 같이 리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 추출물을 유효성분으로 하는 약학 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 수득된 감초 추출물 또는 이로부터 분리되는 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 감초 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 치료 및 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 0.02 내지 50% 중량백분율로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 감초 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석 제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 감초 추출물 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 감초 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 포함하는 조성물은 약물 중독 및 금당 증상의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 감초 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌은 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감초 메탄올 추출물의 제조

음건 세절한 감초 (대구 대원약업사) 3 kg에 15 ℓ의 메탄올을 가한 후, 상온에서 72시간 동안 초음파 추출하고 냉각 및 여과한 후 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 감초 메탄올 추출물 290 g을 얻었다.

실시예 2. 리퀴리틴(Liquiritin)의 분리

상기 실시예 1에서 얻은 감초 추출물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피(60 cm 230-400 mesh, 1.2 kg)에 로딩한 후 6 L의 클로로포름으로 전개하였고, 클로로포름-메탄올(CHCl₃-MeOH[50:1 (6 L), 30:1 (6 L), 15:1 (15 L)]) 경사로 분리하였다. 클로로포름-메탄올 15:1 (15 L) 분획을 감압농축하여 짙은 갈색의 소분획물 43 g을 얻었다. 이 소분획물은 다시 클로로포름-아세톤(CHCl₃-acetone[20:1 (6 L), 10:1 (5 L), 4:1 (5 L), 1:1 (5 L)]) 경사의 용매조합을 이용하였고, 2차 실리카 겔 칼럼크로마토그래피(50 cm 230-400 매쉬, 350 g)를 실시하여 다시 2차 소분획물 로 나누었다. 2차 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로부터 분리된 2차 소분획물들 중 32-67번 분획물들은 리퀴리틴(Liquiritin)이 [R_f=0.41, CHCl₃-acetone(1:1)] 풍부한 분획물들로 확인되어 이들을 농축하여 리퀴리틴(Liquiritin)이 풍부한 황색의 분획물을 얻었다(27g). 더욱 순도가 높은 리퀴리틴(Liquiritin)을 정제하기 위해 분획을 실리카 겔 칼럼크로마토 그래피(50 cm 230-400 매쉬, 200 g)를 클로로포름-메탄올(CHCl₃-MeOH) 용매조합으로 실시하여 정제된 흰색 분말의 리퀴리틴(Liquiritin) 22g을 수득하였다.

실시예 3. 리퀴리티게틴(Liquiritigenin)의 분리

상기 실시예 2에서 얻은 리퀴리틴(Liquiritin)을 DMSO에 녹이고 여기에 1N HCl을 넣어 100℃로 6시간 중탕가열하여 리퀴리틴(Liquiritin)을 산가수분해 하여 당성분을 분리하였다. 산성분을 중화시키기 위하여 동량의 1N NaOH를 가하여 리퀴리티게닌(liquiritigenin)을 수득하였다. 산가수분해 중 발생하는 당성분과 소금등 불순물들을 제거하기 위하여 클로로포름-아세톤 용매조합을 사용하였고, 실리카 겔 칼럼크로마토그래피(50 cm 230-400 매쉬, 200g)를 실시하여 리퀴리티게닌(liquiritigenin) 12 g을 얻었다.

리퀴리틴(Liquiritin)의 리퀴리티게닌(liquiritigenin)으로의 변환을 확인하기 위해 HPLC와 NMR을 측정하였고, 문헌에 기재된 물성치와 비교하여 그 변환을 확인하였다. (Young Woo Kim etc., Liquiritigenin, an aglycone of liquiritin in Glycyrrhizae radix, prevents acute liver injuries in rats induced by acetaminophen with or without buthionine sulfoximine, Chemico-Biological Interactions, 161, pp.125-138, 2006)

참고예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 체중 250-280 g의 스프라그-다우리 (Sprague-Dawley)계 수컷 랫트 (효창사이언스 사)를 사용하였고, 대구한의대학교 동물사육실에서 일정한 조건 (온도: 21± 2, 명암: 12시간 명암주기)에서, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하며 실험시작 전에 실험동물을 10분 동안 사전취급 (Handling) 하였다.

참고예 2. 통계처리

실험성적은 도파민 유리 측정에서는 약물 처리 전 세 개의 기저치의 평균값에 대한 백분율로 표시하였고 통계적 유의성은 SPSS 프로그램 (Version 11.01)의 원웨이(One-way) ANOVA로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.

실험예 1. 급성 약물 투여에 의한 측핵 내 도파민 함량변화에 대한 감초 추출물, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌의 효과

급성 약물 투여에 의한 신경화학적 변화에 미치는 감초 추출물, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌의 효과를 알아보기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 방법으로 측핵 내 도파민의 함량변화를 측정하였다. (J. Neuroche., 59(1), pp.259-266, 1992.)

1-1. 실험동물의 스테레오탁식 (Stereotaxic) 수술

상기 참고예 1에서 준비된 실험동물을 실험 시작 전 2∼3일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 50 mg/kg의 소듐 펜토바비탈 (Sodium pentobarbital)을 복강 주사하여 마취시킨 다음 스테레오탁식 수술대(KOPF957, KOPF)에 고정시키고, 미세투석 프로브 (Microdialysis probe)(8309582, CMA)를 삽입할 부위의 두피를 절개한 뒤 현미경 (광학현미경, 13301, world precision instrument)을 이용하여 람다 (Lamda)와 브레그마 (Bregma)를 찾고, 좌표 (Coordinate)를 측핵 외피 (Nucleus accumbens shell : AP 1.7, ML 0.8, DL -6.0) 위치에 가이드 카눌라 (Guide cannula)(8309018, CMA)를 설치한 후, 미세나사와 치과용 시멘트를 이용하여 가이드 카눌라를 고정시킨다. 수술을 마친 실험군은 일주일간의 회복시기를 거친 다음 미세투석 시스템(Microdialysis system)(S1121 solvent delivery system, Syknm)에 연결시켰다.

1-2. 미세투석의 실시

상기 실험예 1-1의 스테레오탁식 수술 후, 일주일간의 회복시기가 지나면 미세투석 프로브용 가이드 카눌라가 설치된 랫트를 미세투석 시스템(Microdialysis system)에 연결하였고, 미세투석법을 위해 CMA/11, 14/02 미세투석 프로브 (Shaft length : 14 mm, dimension : 0.24× 2 mm)를 가이드 카눌라를 통하여 삽입하였다. 미세투석 주입 펌프 (Microdialysis injection pump)(HARVARD APPARATUS 22와 11)를 이용하여 1.5㎕/분의 유속으로 인공뇌척수액 (CSF; artificial cerebrospinal fluid)을 프로브에 관류시켰다. 인공뇌척수액(CSF)의 조성은 염화나트륨 (NaCl) 8.66 g, 염화칼륨 (KCl) 0.224 g, 염화칼슘 (CaCl₂·H₂O) 0.0206 g, 염화마그네슘 (MgCl₂·6H₂O) 0.163 g의 수용액 500 ㎖와 이-인산나트륨 (Na₂HPO₄·H₂O) 0.214 g, 일-인산나트륨 ( NaH₂PO₄·H₂O) 0.0054 g의 수용액 500 ㎖ 혼합용액으로 이루어져 있다. 랫트가 상자 (Bowl cage) 속에서 자유로이 움직이는 상태에서 미세투석 시스템을 통해 20분 간격으로 프로브 끝의 반투과성막의 확산원리에 의한 세포 외액을 취하여 -70 ℃의 저온 냉동기 (Deep freezer)에 저장한 뒤 분석에 이용하였다.

1-3. HPLC를 이용한 미세투석액(Microdialysate)의 정량(DOPAC, Dopamine, HVA)

상기 1-2의 미세투석 실험이 끝난 후에는 측핵 (Nucleus accumbens) 내의 미세투석 프로브의 위치확인을 위한 조직학적 검증을 위하여 우선 100 ㎖의 포르말린 (Formalin, 37 %), 900 ㎖의 증류수, 6.5 g의 2 인산나트륨 (Na₂HPO_4,(dibasic)), 4 g의 1 인산나트륨 (NaH₂PO₄H₂O, (monobasic))으로 구성된 4% 포르말린 완충액 (Formalin buffer)을 제조한 후, 9% 생리식염수와 4% 포르말린 완충액 각각 4ℓ를 증류수 통에 넣어 높은 위치에 설치한 뒤 튜브를 통해 관류할 수 있도록 하였다. 미세투석 분석을 마친 흰쥐의 복부에 80 ㎎/㎏의 소듐 펜토바비탈(sodium pentobarbital)을 복강주사하여 마취시킨 뒤 수술대에 고정하여 흉곽을 열고 하부 동맥(descending arota)을 결찰한 뒤, 심첨부위에 천자하여 먼저 생리식염수를 흘려서 혈액을 씻어낸 뒤 포르말린 완충액 (Formalin buffer)을 충분히 관류한 후, 두개골로부터 뇌를 분리하여 포르말린 완충액에 저장하여 냉장보관하였다. 비브라톰(Vibratome) (752M-1661, Campclen instrument .Ltd.)을 이용하여 100 ㎛의 뇌절편을 만들어 팍시노스 및 와스트손 아트라스 (Paxinos and Wastson atlas)(George paxinos & Charles watson, Academic press Inc.)에서 주어진 좌표(coordinate)를 참고하였고, 프로브의 위치를 확인하여 측핵 부위에서 벗어난 데이타를 제외하였으며, 도파민 정량을 위해 실험에 사용한 HPLC (Syknm, S7121.)를 하기 표 1의 실험조건으로 사용하였다.

HPLC의 조건

이동상 (Mobile phase) (Sykam 7121 pump)	75 mM 1 인산나트륨 (Sodium phosphate monobasic) 1.7 mM 소디움 옥탄설포네이트(Sodium octanesulfonate) 25 M EDTA 0.714 mM 트리에틸라민 (Triethylamine) 10 % 아세토니트릴 (Acetonitrile, pH 3.0)
유속	1.0 ㎖/min
칼럼	HR-80, 80× 4.6 mm, 3 ㎛ 입자 크기 (Particle size) ; ESA
비색 측정기 Coulometric detector	ESA, 코울로캠 (CoulochemⅡ,Model 5011 with analytic cell, Guard cell Model 5020A)

1-4. 측핵 내 도파민 함량변화

코카인 투여에 의한 도파민의 유리에 미치는 감초추출물, 리퀴리틴 및 리퀴리티게닌의 효과를 알아보기 위하여 실험동물에 20 mg/kg의 코카인을 복강 내로 투여한 다음 실시예 1의 감초 메탄올 추출물은 200 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg 을 각각 1회씩 경구투여 하였으며 또한, 실시예 1의 리퀴리틴과 실시예 2의 리퀴리티게닌은 20 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg 을 각각 1회씩 경구투여 하였으며, 대조군으로 2 ㎖/kg의 5% Tween80 생리식염수를 경구투여하였다.

상기 실시예 1 및 2를 경구투여 한 다음 1시간 경과 후, 20 mg/kg의 코카인을 복강 내로 투여하였을 때 실험동물들의 측핵 내 유리 도파민의 함량 변화를 관찰하였다.

실험결과, 도 1 내지 도 3 및 하기 표 2 내지 표 4에서 보는 바와 같이, 유리된 도파민 함량은 생리식염수 투여 후 40분 경과 뒤에 코카인을 처치한 대조군에서 최고 342.0 %까지 증가한데 반해, 상기 실시예 1의 감초 메탄올 추출물 200 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg 투여군의 경우 각각 112, 165, 186% 증가하였고, 상기 실시예 2의 리퀴리틴(liquiritin) 20 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg투여군의 경우 각각 174 %, 204 %, 207 % 증가하였으며, 상기 실시예 3의 리퀴리티게닌(liquiritigenin) 20 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg 투여군의 경우 각각 140 %, 193 %, 196 % 증가하여 대조군에 비해 도파민의 유리가 유의하게 억제되었음을 확인할 수 있었다.

약물 투여로 인한 흰쥐의 측핵 내 도파민(nM) 유리에 대한 감초 메탄올 추출물의 효과

군	기저군	20 분	40 분	60 분	80 분	100 분	120 분
1.00	9.9± 0.4	8.5± 1.6	7.8± 1.0	10.9± 2.2	9.0± 1.5	9.0± 0.0	9.3± 2.0
2.00	7.7± 1.4	15.6± 3.8	25.7± 4.8	13.3± 4.4	13.9± 4.0	12.5± 4.7	12.7± 4.0
3.00	4.8± 1.5	5.4± 1.3	5.4± 1.7	4.8± 0.6	6.3± 2.5	5.4± 1.6	6.7± 1.8
4.00	9.6± 1.3	17.3± 3.6	18.9± 4.2	17.5± 3.6	17.5± 2.1	18.7± 5.7	16.5± 5.0
5.00	13.4± 1.3	15.8± 2.8	22.2± 4.6	17.9± 4.0	13.2± 3.8	19.8± 2.7	13.3± 3.0

약물 투여로 인한 흰쥐의 측핵 내 도파민(nM) 유리에 대한 리퀴리틴의 효과

군	기저군	20 분	40 분	60 분	80 분	100 분	120 분
1.00	9.9± 0.4	8.5± 1.6	7.8± 1.0	10.9± 2.2	9.0± 1.5	9.0± 1.5	9.3± 2.0
2.00	7.7± 1.4	15.6± 3.8	25.7± 4.8	13.3± 4.4	13.9± 4.0	12.5± 4.7	12.7± 4.0
3.00	4.3± 0.4	7.7± 1.7	7.3± 0.6	5.5± 0.8	6.3± 0.4	4.8± 0.7	3.6± 0.9
4.00	8.7± 1.4	12.3± 1.9	18.6± 4.8	14.8± 4.3	8.2± 1.7	9.6± 2.2	7.3± 1.4
5.00	10.5± 2.2	20.6± 7.8	21.2± 5.4	16.7± 3.5	11.3± 1.5	13.1± 4.0	12.9± 3.4

약물 투여로 인한 흰쥐의 측핵 내 도파민(nM) 유리에 대한 리퀴리티게닌의 효과

군	기저군	20 분	40 분	60 분	80 분	100 분	120 분
1.00	9.9± 0.4	8.5± 1.6	7.8± 1.0	10.9± 2.2	9.0± 1.5	9.0± 0.0	9.3± 2.0
2.00	7.7± 1.4	15.6± 3.8	25.7± 4.8	13.3± 4.4	13.9± 4.0	12.5± 4.7	12.7± 4.0
3.00	8.6± 1.3	11.5± 2.1	11.7± 1.7	9.5± 1.5	9.1± 1.3	10.8± 1.6	10.1± 1.1
4.00	6.6± 1.3	9.7± 1.7	10.9± 1.9	10.2± 3.4	9.6± 1.8	6.3± 1.1	5.2± 0.4
5.00	7.9± 1.4	10.4± 3.0	13.4± 2.8	11.2± 3.4	10.2± 2.3	8.3± 1.9	7.6± 1.1

실험예 2. 급성독성실험

6 주령의 특정병원체부재 (Specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹당 2마리씩의 동물에 본 발명의 감초추출물 및 리퀴리틴, 리퀴리티게닌을 500 ㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 감초추출물 및 리퀴리틴, 리퀴리티게닌은 랫트에서 각각 500 ㎎/㎏ 까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량 (LD₅₀)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 감초 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

감초 메탄올 추출물 100 ㎎

소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎

메틸파라벤 0.8 ㎎

프로필파라벤 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 산제의 제조

리퀴리틴 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 3. 환제의 제조

리퀴리티게닌 120㎎

옥수수 전분 100㎎

멸균증류수 적량

상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제한하여 환제를 제조한다.

제제예 4. 정제의 제조

감초 메탄올 추출물 200 ㎎

유당 100 ㎎

전분 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 5. 캡슐제의 제조

리퀴리틴 100 ㎎

유당 50 ㎎

전분 50 ㎎

탈크 2 ㎎

스테아린산마그네슘 적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 6. 액제의 제조

리퀴리티게닌 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 7. 건강 식품의 제조

감초 메탄올 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 8. 건강 음료의 제조

리퀴리틴 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 감초(Glycyrrhiza radix)의 추출물 또는 이로부터 분리된 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌은 약물중독의 지표로 사용되는 뇌의 측핵 내 도파민 유리의 억제효과를 가짐으로써 약물 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

감초 추출물 또는 이로부터 분리한 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 코카인 중독 및 금단 증상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물, 리퀴리틴 또는 리퀴리틴게닌을 0.02 내지 50% 중량백분율로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.
감초 추출물 또는 이로부터 분리한 리퀴리틴 또는 리퀴리티게닌을 유효성분으로 함유하는 코카인 중독 및 금단 증상의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.