KR100813268B1

KR100813268B1 - A method of separating a microorganism using an ion exchange and means for capturing microorganisms, a container for the pretreatment of sample containing microorganism and device for separating a microorganism

Info

Publication number: KR100813268B1
Application number: KR1020060092919A
Authority: KR
Inventors: 황규연; 정성영; 김준호
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2008-03-13

Abstract

A method and an apparatus for isolating a microorganism from a sample are provided to isolate microorganism cells including bacteria cells, fungus cells or viruses efficiently. A container for sample pre-treatment is provided to attach the microorganism in the sample to a solid support efficiently. A method for isolating a microorganism from a sample comprises the steps of: (a) reacting a sample including the microorganism with an inorganic exchange material; and (b) contacting the reacted sample with a microorganism capturing means, wherein the sample is urine including the microorganism, the inorganic exchange material is zeolite, the microorganism is bacteria, fungi or viruses, the microorganism capturing means is selected from the group consisting of a non-planar shaped solid support having a pillar structure where pillars with an aspect ratio of 1:1-20:1 are formed, a solid support having the hydrophobicity of a water contact angle of 70-95‹, and a solid support where the surface is coated by amino silane. An apparatus for separating a microorganism comprises: a first container for pre-treatment of the sample including the microorganism containing the inorganic ion exchange material; and a second container including the micro-capturing means communicated with the first container, wherein the second container further comprises a buffer solution storage portion. Further, the zeolite is H typed zeolite.

Description

이온교환반응 및 미생물 포획 수단을 이용하여 시료로부터 미생물을 분리하는 방법, 미생물 시료의 전처리용 용기 및 미생물분리 장치{A method of separating a microorganism using an ion exchange and means for capturing microorganisms, a container for the pretreatment of sample containing microorganism and device for separating a microorganism}A method of separating a microorganism using an ion exchange and means for capturing microorganisms, a container for the pretreatment of sample containing microorganism and device for separating a microorganism}

도 1은 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 뇨 중의 대장균을 분리한 결과를 나타내는 것으로, 뇨의 구성성분의 영향을 나타내는 것이다. 1 shows the result of separating E. coli in urine using a solid support having a surface on which pillar arrays are formed, and shows the effect of the components of urine.

도 2는 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 뇨 중의 대장균을 농축한 결과를 나타내는 것으로, 뇨의 희석 및 유속에 따른 결과를 나타내는 것이다.Figure 2 shows the result of the concentration of Escherichia coli in the urine using a solid support having a surface on which the column array is formed, showing the result of dilution and flow rate of urine.

도 3은 뇨 시료를 제올라이트 처리한 것이, 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.It is a figure which shows the effect which the zeolite treatment of the urine sample has on the efficiency which a microorganism adheres to a solid support body.

도 4 및 도 5는 각각 암모늄 형 및 소듐 형 제올라이트와 혼합된 뇨 시료 중의 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율을 나타내는 도면이다. 4 and 5 are diagrams showing the efficiency of microorganisms in urine samples mixed with ammonium and sodium zeolites to adhere to the solid support, respectively.

도 6은 뇨 시료를 희석없이 제올라이트 처리한 것이, 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.6 is a diagram showing the effect of the zeolite treatment of the urine sample without dilution on the efficiency of microorganisms adhere to the solid support.

본 발명은 이온교환반응 및 미생물 포획 수단을 이용하여 시료로부터 미생물을 분리하는 방법, 미생물 분리를 위한 전처리용 용기 및 미생물분리 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating microorganisms from a sample using ion exchange reactions and microbial capture means, a pretreatment vessel for microbial separation, and a microbial separation apparatus.

종래 미생물을 분리하는 방법에는 원심분리 및 여과의 과정이 일반적으로 사용되었다. 또한, 특정한 세포를 농축 또는 분리하기 위하여는, 상기 특정한 세포에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 리간드가 결합되어 있는 지지체에 상기 세포를 특이적으로 결합시켜, 이를 농축 또는 분리하는 방법이 사용되었다. 예를 들면, 상기 세포에 특이적인 단백질에 결합하는 항체가 결합되어 있는 지지체에 상기 세포가 포함되어 있는 시료를 흘려 보내주어 상기 세포를 상기 항체에 결합시키고, 결합되지 않은 세포는 세척하는 단계를 포함하는, 친화성 크로마토그래피 방법이 포함된다. In the conventional method of separating microorganisms, centrifugation and filtration processes have been generally used. In addition, in order to concentrate or isolate a specific cell, a method of specifically binding the cell to a support to which a receptor or ligand that specifically binds the specific cell is bound, and a method of concentrating or separating the cell has been used. For example, by flowing a sample containing the cells to a support having an antibody binding to a protein specific to the cells bound to bind the cells to the antibody, and washing the unbound cells Affinity chromatography methods are included.

또한, 한국특허 공개 제2006-0068979호에는 상부 유리 기판의 양끝에 연결되어 있으며, 외부로부터의 전기적 입력을 기계적 진동으로 변환하여 상기 상부 유리 기판에 가하는 압전 트랜스듀서; 및 상기 상부 유리 기판과 평행한 하부 기판 상에 배열된 N개의 전극을 포함하되, 상기 상부 유리 기판과 하부 기판의 사이는 세포가 혼합된 유체로 채워지며, 상기 각 전극은 상기 압전 트랜스듀서의 길이 방향과 수직인 방향으로 놓여져 있으며, 상기 N개의 전극들은 상기 압전 트랜스듀서의 길이 방향을 따라 일정 간격으로 배열되어 있는 세포 분리 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 초음파장 및 진행파 유전영동을 이용한 세포 분리 시스템이 개시되어 있다. In addition, Korean Patent Publication No. 2006-0068979 discloses a piezoelectric transducer connected to both ends of an upper glass substrate and converting an electrical input from the outside into mechanical vibration to apply to the upper glass substrate; And N electrodes arranged on a lower substrate parallel to the upper glass substrate, wherein a gap between the upper glass substrate and the lower substrate is filled with a fluid mixed with cells, and each electrode has a length of the piezoelectric transducer. And the N electrodes are arranged in a direction perpendicular to the direction, the cell separation system using an ultrasonic field and traveling wave electrophoresis, characterized in that it comprises a cell separation device arranged at a predetermined interval along the longitudinal direction of the piezoelectric transducer. Is disclosed.

그러나, 상기한 바와 같은 종래 기술은 모두 고체 기판 상에 리간드 또는 수용체를 고정화하거나, 외부 동력을 제공하여 특정한 세포를 선택적으로 농축 또는 분리하는 것이다. 따라서, 고체 지지체 자체 특성 및 액체 매질의 조건을 이용하여 세포를 분리하는 방법 및 장치는 알려진 바 없다. However, all of the prior art as described above is to immobilize a ligand or receptor on a solid substrate, or to provide external power to selectively concentrate or isolate specific cells. Thus, methods and apparatus for separating cells using the properties of the solid support itself and the conditions of the liquid medium are unknown.

또한, 고체 지지체 자체 특성 및 액체 매질의 조건을 이용하여 세포를 분리하는 방법에 있어서, 세포가 고체 지지체에 결합하는 것을 방해하는 시료 중에 존재하는 물질을 이온교환반응에 의하여 제거하는 방법도 알려진 바 없다. In addition, in the method for separating cells using the characteristics of the solid support itself and the conditions of the liquid medium, there is no known method for removing a substance present in the sample that prevents the cells from binding to the solid support by ion exchange reaction. .

본 발명의 목적은 이온교환반응 및 미생물 포획 수단을 이용하여 시료로부터 미생물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for separating microorganisms from a sample using ion exchange reactions and microbial capture means.

본 발명의 다른 목적은 미생물 분리를 위한 전처리용 용기를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a container for pretreatment for microbial separation.

본 발명의 또 다른 목적은 이온교환반응 및 미생물 포획 수단을 이용하여 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide an apparatus for separating microorganisms from a sample using ion exchange reactions and microbial capture means.

본 발명은, 미생물을 포함하는 시료를 무기 이온교환물질과 접촉시켜, 상기 시료와 상기 무기 이온교환물질을 반응시키는 단계; 및 The present invention comprises the steps of contacting a sample containing a microorganism with an inorganic ion exchange material, the sample and the inorganic ion exchange material; And

상기 반응된 시료를 미생물 포획 수단과 접촉시키는 단계를 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하는 방법을 제공한다. Provided is a method for separating microorganisms from a sample comprising contacting the reacted sample with a microbial capture means.

본 발명의 시료로부터 미생물을 분리하는 방법은, 미생물을 포함하는 시료를 무기 이온교환물질과 접촉시켜, 상기 시료와 상기 무기 이온교환물질을 반응시키는 단계를 포함한다. The method for separating microorganisms from a sample of the present invention includes contacting a sample containing a microorganism with an inorganic ion exchange material to react the sample with the inorganic ion exchange material.

본 접촉 단계에 의하여, 미생물을 포함하는 시료와 무기 이온교환물질 사이에 이온교환 반응 및 흡착 반응 등이 일어난다. 상기 반응에 의하여, 상기 시료 중의 이온물질 및 유기물 등이 제거되어, 상기 시료 중의 미생물이 고체 지지체에 부착하는 것을 방해하는 물질들이 제거되는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.By this contacting step, an ion exchange reaction and an adsorption reaction occur between the sample containing the microorganism and the inorganic ion exchange material. By the reaction, it is believed that the ionic and organic substances in the sample are removed to remove substances that prevent the microorganism in the sample from adhering to the solid support, but the present invention is not limited to a specific mechanism.

상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉 단계에 있어서, 상기 미생물을 포함하는 시료는, 생물학적 시료, 바람직하게는 혈액, 뇨, 또는 타액, 더욱 바람직하게는 뇨이다. 본 발명의 방법에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다.In the step of contacting the sample with the inorganic ionic material, the sample containing the microorganism is a biological sample, preferably blood, urine, or saliva, more preferably urine. In the method of the present invention, "biological sample" means a sample containing or consisting of cells or tissues, such as cells or biological liquids isolated from an individual. The subject may be an animal including a human. Examples of biological samples include saliva, sputum, blood, blood cells (e.g. white blood cells, red blood cells), amniotic fluid, serum, semen, bone marrow, tissue or microneedle biopsy samples, urine, peritoneal fluid, pleural fluid and cell culture. Included. Biological samples include tissue sections, such as frozen sections taken for histological purposes.

상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉 단계에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스인 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the step of contacting the sample with the inorganic ionic material, the microorganism may be bacteria, fungi or viruses, but is not limited to these examples.

상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉 단계에 있어서, 상기 무기 이온교환물질은 이온교환 특성을 가지는 무기물질이면, 어느 것이나 포함된다. 상기 무기이온교환물질의 예에는, 제올라이트, 모래, 금속산화물 (예를 들면, SiO₂, Al₂O₃, Na₂O)이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 제올라이트는 바람직하게는, H 형 제올라이트인 것이다. In the step of contacting the sample with the inorganic ionic material, the inorganic ion exchange material may include any inorganic material having ion exchange characteristics. Examples of the inorganic ion exchange material include, but are not limited to, zeolites, sands, and metal oxides (eg, SiO ₂ , Al ₂ O ₃ , Na ₂ O). The zeolite is preferably an H-type zeolite.

본 발명에 있어서, 제올라이트란 TO4 (T =Al 또는 Si)로 나타내어지는 구석 공유 사면체 (corner-sharing tetrahedra)로 구성되는 결정성 알루미노실리케이트이다. 1 내지 20Å 미만의 균질한 분자 크기의 세공 및 채널을 가지며, 넓은 표면적 (약 900 m2/g)을 갖는다. 제올라이트는 이온화 가능한 기가 H+, NH4+ 또는 Na+인지 여부에 따라 각각 H 형, NH4 형, 또는 Na 형이라고 한다. 상기 H 형 제올라이트는 NH4 형 제올라이트를 550℃에서 2 시간 동안 태워서 얻을 수 있으나, 이 제조 방법에 한정되는 것은 아니다. 상업적으로는 Aldrich 사에서 제공되는 제올라이트 Y가 있다. 상기 제올라이트는 분말 형태 또는 고체 지지체에 고정화되어 있는 형태일 수 있으나, 특정한 형태에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, zeolite is a crystalline aluminosilicate composed of a corner-sharing tetrahedra represented by TO4 (T = Al or Si). It has homogeneous molecular size pores and channels of less than 1-20 microns and has a large surface area (about 900 m 2 / g). Zeolites are said to be H type, NH 4 type, or Na type, respectively, depending on whether the ionizable group is H +, NH 4 + or Na +. The H type zeolite can be obtained by burning NH 4 type zeolite at 550 ° C. for 2 hours, but is not limited thereto. Commercially there is zeolite Y provided by Aldrich. The zeolite may be in a powder form or a form immobilized on a solid support, but is not limited to a specific form.

상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉 단계에 있어서, 상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉은 용액 중에 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 무기 이온 물질은 용기, 예를 들면 튜브, 마이크로채널 또는 마이크로챔버에 포함되어 있거나 그 벽면 또는 바닥에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉은 적당한 온도 (예를 들면, 상온)에서 적당한 시간 동안 이루어지는 것으로, 이는 당업자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.In the step of contacting the sample with the inorganic ionic material, the contact between the sample and the inorganic ionic material is preferably made in a solution. The inorganic ionic material may be contained in a vessel, for example a tube, a microchannel or a microchamber, or immobilized on a wall or bottom thereof. The contact of the sample with the inorganic ionic material is made at a suitable temperature (eg, room temperature) for a suitable time, which can be easily selected by those skilled in the art.

상기 시료와 무기 이온 물질의 접촉 단계에 의하여, 시료 중의 양이온성의 이온물질 (Na⁺, K⁺ 등)의 농도가 낮아진다. 그에 따라, 미생물이 고체 지지체에 부착하는 것을 방해하는 물질인 염을 제거할 수 있다. 또한, 흡착에 의하여 크레아틴 및 PCR을 저해하는 물질 (예, 요소)를 제거할 수 있다.By the step of contacting the sample with the inorganic ionic material, the concentration of the cationic ionic material (Na ⁺ , K ^+, etc.) in the sample is lowered. Thus, it is possible to remove salts which are substances which prevent the microorganisms from adhering to the solid support. In addition, it is possible to remove substances (eg, urea) that inhibit creatine and PCR by adsorption.

본 발명의 방법은, 또한, 상기 반응된 시료를 미생물 포획 수단과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 반응된 시료는 이온교환 반응에 의하여 이온물질이 감소되어 있는 시료이다. The method also includes contacting the reacted sample with a microbial capture means. The reacted sample is a sample in which ionic substances are reduced by an ion exchange reaction.

상기 미생물 포획 수단은 미생물을 결합시키는 특성을 가진 물질이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 미생물을 결합시키는 고체 물질, 반고상 물질, 또는 액체 물질이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 미생물 포획 수단은 바람직하게는, 비평면 형상의 고체 지지체이다. The microorganism trapping means includes any material having a property of binding microorganisms. For example, it may be a solid material, a semi-solid material, or a liquid material that binds microorganisms, but is not limited to these examples. The microorganism trapping means is preferably a non-planar solid support.

따라서, 본 발명의 방법의 일 구체예는, 미생물을 포함하는 시료를 무기 이온교환물질과 접촉시켜, 상기 시료와 상기 무기 이온교환물질을 반응시키는 단계; 및 Thus, one embodiment of the method of the present invention comprises the steps of contacting a sample comprising a microorganism with an inorganic ion exchange material, reacting the sample with the inorganic ion exchange material; And

상기 반응된 시료를 비평면 형상의 고체 지지체와 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시키는 단계를 포함하는 것이다. Contacting the reacted sample with a non-planar solid support in the range of pH 3.0 to 6.0.

상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉에 의하여 상기 미생물은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다. 이는 고체 지지체의 표면적이 증가하는 동시에, pH 3.0 내지 6.0의 액체 매질을 사용함으로써 미생물의 세포막이 변성되어 용액에 대한 용해도가 저하되어 고체 표면에 부착하는 비율이 상대적으로 높아지는 것으로 여겨지나, 본 발명의 범위가 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. The microorganism is attached to the solid support by contact of the reacted sample with the solid support. This is believed to increase the surface area of the solid support and at the same time, by using a liquid medium of pH 3.0 to 6.0, the cell membrane of the microorganisms is denatured, solubility in the solution is lowered, so that the rate of attachment to the solid surface is relatively high, but of the present invention The scope is not limited to this particular mechanism.

상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 미생물을 낮은 pH에서 완충 역할을 할 수 있는 용액 또는 버퍼에 의하여 희석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼 (예, 소듐 포스페이트, pH 3.0 내지 6.0) 또는 아세테이트 버퍼 (소듐 아세테이트, pH 3.0 내지 6.0)로 희석된 것일 수 있다. 상기 희석의 정도는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는, 99:1 내지 1:1,000의 배율, 더욱 바람직하게는, 99:1 내지 1:10의 배율, 더욱 바람직하게는 99:1 내지 1:4로 희석되는 것일 수 있다. In the step of contacting the reacted sample with the solid support, the sample may be diluted with a solution or buffer that can serve as a buffer for the microorganism at low pH. Preferably, the buffer may be diluted with phosphate buffer (eg sodium phosphate, pH 3.0 to 6.0) or acetate buffer (sodium acetate, pH 3.0 to 6.0). The degree of dilution is not particularly limited, but is preferably a magnification of 99: 1 to 1: 1,000, more preferably 99: 1 to 1:10, more preferably 99: 1 to 1: 1. It may be diluted to 4.

상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것이다. 상기 시료는, 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 아세테이트 및 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 이온 농도를 갖는 것이다.In the step of contacting the reacted sample with the solid support, the sample has a salt concentration of 10 mM to 500 mM, preferably 50 mM to 300 mM. The sample is one having an ion concentration selected from the group consisting of 10 mM to 500 mM, preferably 50 mM to 300 mM of acetate and phosphate.

상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the step of contacting the reacted sample with the solid support, the solid support has a non-planar shape and thus has a surface whose surface area is increased compared to the plane. The solid support may be a concave-convex structure is formed on the surface. In the present invention, the "concave-convex structure" refers to a structure having a concave and convex surface without smooth surface. The uneven structure includes a surface having a columnar structure in which a plurality of pillars are formed or a surface having a network structure in which a plurality of pores is formed, but is not limited to these examples.

상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고체 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집합체)으로 사용될 수 있다. In the step of contacting the reacted sample with the solid support, the non-planar solid support may have any shape. For example, a solid support having a pillar structure having a plurality of pillars formed on a surface thereof, a solid support having a bead shape, and a sieve structure having a plurality of pores formed on a surface thereof. It may be selected from the group consisting of a solid support. The solid support may be used alone or as a collection of a plurality of the solid supports (eg, an aggregate packed in a tube or a container).

상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 튜브 또는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 미생물을 분리하는 방법은 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device) 내에서 수행될 수 있다. In the step of contacting the reacted sample with the solid support, the solid support may be in the form of an inner wall of a microchannel or microchamber in a tube or microfluidic device. Accordingly, the method for separating microorganisms of the present invention is provided in a fluidic device or microfluidic device in which one or more inlets and outlets are provided and the inlets and outlets are communicated through channels or microchannels. It can be performed in.

본 발명의 방법의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단면 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다. In one embodiment of the method of the present invention, in the contacting step of the reacted sample and the solid support in the method of the present invention, the solid support may have a columnar structure in which a plurality of pillars are formed on the surface thereof. . The manufacture of pillars on solid supports is well known in the art. For example, fine pillars can be formed at high density using a photolithography process or the like used in a semiconductor manufacturing process. The pillar has an aspect ratio of 1: 1 to 20: 1, but is not limited thereto. In the present invention, "aspect ratio" means the ratio of the cross-sectional diameter to the height of the column. The pillar structure may be a ratio of the distance between the pillar height and the pillar is 1: 1 to 25: 1. The pillar structure may have a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.

본 발명의 방법에 있어서 상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO₂ 층에 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. In the contacting step of the reacted sample and the solid support in the method of the present invention, the non-planar solid support may have a hydrophobicity of 70 ° to 95 ° water contact angle. The hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 ° consists of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS). The compound selected from the group may be coated and given. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° preferably has octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxy in the SiO ₂ layer of the solid support. Compounds selected from the group consisting of silanes (DFS) may be self-assembled monolayer (SAM) coated.

본 발명의 방법에서, 상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO₂ 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.In the method of the present invention, in the contacting step of the reacted sample with the solid support, the non-planar solid support may have one or more amine-based functional groups on its surface. Surface having at least one functional group of the amine-based may be a polyethyleneimine trimethoxysilane (PEIM) is coated on the surface of the solid support. The coated surface may preferably be a self-assembled monomolecular (SAM) coating of polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM) on the SiO ₂ layer of the solid support. The amine-based functional group has a positive charge in the range of pH 3.0 to 6.0.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 상기한 바와 같은 물 접촉각 특성을 갖는 것 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 것이면 어떠한 재질의 지지체도 포함된다. 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 및 플라스틱 물질 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 표면은, 상기 표면을 가진 고체 지지체에 미생물을 포함하는 시료가 접촉되는 경우, 미생물이 부착하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. In the method of the present invention, in the step of contacting the reacted sample with the solid support, the solid support may be any material as long as it has water contact angle characteristics as described above or one or more amine-based functional groups on its surface. Also included. For example, glass, silicon wafers, plastic materials, and the like are included, but are not limited to these examples. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° or a surface having at least one amine-based functional group on the surface thereof is considered to be attached to the microorganism when the sample containing the microorganism contacts the solid support having the surface. The present invention is not limited to a specific mechanism.

본 발명의 미생물을 분리하는 방법은, 상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉 단계 후에 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 목적 미생물 이외의 물질을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척에는 상기 고체 지지체 표면에 부착된 목적 미생물은 상기 고체 지지체로부터 이탈시키지 않으면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물을 제거할 수 있는 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 사용될 수 있 다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다. The method for separating the microorganism of the present invention may further include washing a substance other than the target microorganism that is not attached to the solid support after contacting the reacted sample with the solid support. The washing may be any solution capable of removing impurities that may adversely affect subsequent processes without leaving the target microorganisms attached to the solid support surface from the solid support. For example, acetate buffers and phosphate buffers used as binding buffers can be used. The wash solution is preferably a buffer having a pH in the range of pH 3.0 to 6.0.

본 발명에 있어서, "미생물의 분리"란 시료 중의 미생물을 순수 분리하는 것 뿐만 아니라 농축하는 것을 포함하는 것이다. In the present invention, "separation of microorganisms" includes not only pure separation of microorganisms in a sample but also concentration.

본 발명의 방법에 따라, 상기 고체 지지체 상에 부착되어 농축된 미생물은, 상기 고체 지지체 상에 부착된 상태로 DNA의 분리와 같은 추가의 처리 단계에 사용될 있다. 또한, 상기 고체 지지체 상에 부착되어 농축된 미생물은, 상기 고체 지지체로부터 용출되어 추가의 처리 단계에 사용될 있다. According to the method of the present invention, the microorganisms attached and concentrated on the solid support can be used for further processing steps such as the separation of DNA while attached on the solid support. In addition, the microorganisms attached and concentrated on the solid support can be eluted from the solid support and used for further processing steps.

따라서, 본 발명의 방법은 상기 반응된 시료와 고체 지지체의 접촉단계 및/또는 세척 단계 후에 상기 부착된 미생물을 용출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 용출 단계에 있어서, 용출에 사용되는 용액은 상기 고체 지지체로부터 미생물을 이탈시키는 성질을 갖는 것이면, 당업계에 알려진 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 물 및 트리스 버퍼 등이 사용될 수 있다. 상기 용출 용액은 바람직하게는, pH 6.0 이상인 용액이다.Thus, the method of the present invention may further comprise eluting the attached microorganism after the contacting and / or washing step of the reacted sample with the solid support. In the eluting step, any solution known in the art may be used as long as the solution used for eluting has a property of detaching microorganisms from the solid support. For example, water and tris buffers and the like can be used. The elution solution is preferably a solution of pH 6.0 or higher.

본 발명은 또한, 상기한 본원의 방법에 의하여 분리된 미생물로부터 핵산 분리, 핵산 증폭 반응 및 핵산 혼성화 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 과정을 상기 고체 지지체가 포함되어 있는 동일한 공간 또는 다른 공간에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 미생물을 처리하는 방법을 제공한다. 상기 핵산 분리, 핵산 증폭 및 핵산 혼성화 반응은 당업계에 알려진 임의의 방법이 될 수 있다. The present invention also provides a method for carrying out one or more processes selected from the group consisting of nucleic acid separation, nucleic acid amplification reaction and nucleic acid hybridization reaction from a microorganism separated by the above-described method in the same space or another space containing the solid support. Characterized in that, it provides a method for treating microorganisms. The nucleic acid isolation, nucleic acid amplification and nucleic acid hybridization reaction can be any method known in the art.

본 발명은 또한, 무기 이온교환물질이 포함되어 있는 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기를 제공한다. The present invention also provides a container for sample preparation containing a microorganism containing an inorganic ion exchange material.

본 발명의 용기에 있어서, 상기 무기 이온교환물질은 이온교환 특성을 가지는 무기물질이면, 어느 것이나 포함된다. 상기 무기 이온교환물질의 예에는, 제올라이트, 모래, 금속산화물 (예를 들면, SiO₂, Al₂O₃, Na₂O)이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 제올라이트는 바람직하게는, H 형 제올라이트이다. In the container of the present invention, any of the inorganic ion exchange materials may be included as long as the inorganic material has ion exchange characteristics. Examples of the inorganic ion exchange material include, but are not limited to, zeolites, sands, and metal oxides (eg, SiO ₂ , Al ₂ O ₃ , Na ₂ O). The zeolite is preferably an H-type zeolite.

본 발명에 있어서, 제올라이트란 TO₄ (T =Al 또는 Si)로 나타내어지는 구석 공유 사면체 (corner-sharing tetrahedra)로 구성되는 결정성 알루미노실리케이트이다. 1Å 내지 20Å의 균질한 세공 및 채널을 가지며, 넓은 표면적 (약 900 m²/g)을 갖는다. 제올라이트는 이온화 가능한 기가 H⁺, NH₄ ⁺ 또는 Na⁺인지 여부에 따라 각각 H 형, NH₄ 형, 또는 Na 형이라고 한다. 상기 H 형 제올라이트는 NH₄ 형 제올라이트를 550℃에서 2 시간 동안 태워서 얻을 수 있으나, 이 제조 방법에 한정되는 것은 아니다. 상업적으로는 Aldrich 사에서 제공되는 제올라이트 Y가 있다. 상기 제올라이트는 분말 형태 또는 고체 지지체에 고정화되어 있는 형태일 수 있으나, 특정한 형태에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, zeolite is a crystalline aluminosilicate composed of a corner-sharing tetrahedra represented by TO ₄ (T = Al or Si). Have homogeneous pores and channels of 1 to 20 microns and have a large surface area (about 900 m ² / g). Zeolites are said to be H type, NH ₄ type, or Na type, respectively, depending on whether the ionizable group is H ⁺ , NH ₄ ⁺ or Na ⁺ . The H type zeolite may be obtained by burning NH ₄ type zeolite at 550 ° C. for 2 hours, but is not limited thereto. Commercially there is zeolite Y provided by Aldrich. The zeolite may be in a powder form or a form immobilized on a solid support, but is not limited to a specific form.

본 발명의 용기에 있어서, 상기 무기 이온 물질은 용기, 예를 들면 튜브 또는 마이크로채널 또는 마이크로챔버에 포함되어 있거나 그 벽면 또는 바닥에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 용기는 무기 이온 물질이 포함되어 있거나 고정화되어 있는 튜브 또는 마이크로채널 또는 마이크로챔버일 수 있다. 또한, 본 발명의 용기는 상기 마이크로채널 및 마이크로챔버를 포함하는 미세유동장치 또는 랩온어칩일 수 있다. In the container of the present invention, the inorganic ionic material may be contained in a container, for example, a tube or a microchannel or a microchamber, or fixed to a wall or bottom thereof. Thus, the vessel of the present invention may be a tube or microchannel or microchamber containing or immobilized with an inorganic ionic material. In addition, the container of the present invention may be a microfluidic device or a lab-on-a-chip comprising the microchannel and microchamber.

본 발명의 용기에 있어서, 상기 미생물을 포함하는 시료는, 생물학적 시료, 바람직하게는 혈액, 뇨, 또는 타액, 더욱 바람직하게는 뇨이다. 본 발명의 방법에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다. 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스인 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the container of the present invention, the sample containing the microorganism is a biological sample, preferably blood, urine or saliva, more preferably urine. In the method of the present invention, "biological sample" means a sample containing or consisting of cells or tissues, such as cells or biological liquids isolated from an individual. The subject may be an animal including a human. Examples of biological samples include saliva, sputum, blood, blood cells (e.g. white blood cells, red blood cells), amniotic fluid, serum, semen, bone marrow, tissue or microneedle biopsy samples, urine, peritoneal fluid, pleural fluid and cell culture. Included. Biological samples include tissue sections, such as frozen sections taken for histological purposes. The microorganism may be a bacterium, fungus or virus, but is not limited to these examples.

본 발명의 용기는, 상기 용기 중의 무기 이온 물질과 미생물을 포함하는 시료를 접촉시켜, 상기 시료 중의 세포가 고체 지지체에 결합하는 것을 방해하는 물질을 제거하는 전처리를 하는데 사용하기 위한 것이다. The container of the present invention is for use in pretreatment for contacting a sample containing an inorganic ionic substance in the container with a microorganism to remove a substance that prevents the cells in the sample from binding to a solid support.

본 발명의 용기는 상기 시료를 주입하고 배출하기 위한 입구 및 출구를 포함할 수 있다. The container of the present invention may include an inlet and an outlet for injecting and discharging the sample.

본 발명은 또한, 무기 이온교환물질이 포함되어 있는 미생물을 포함하는 시 료 전처리용 제1 용기; 및 The invention also provides a first container for sample pretreatment comprising microorganisms containing an inorganic ion exchange material; And

상기 제1 용기와 연통되어 있는 미생물 포획 수단이 포함되어 있는 제2 용기를 포함하는, 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치를 제공한다. An apparatus for separating microorganisms from a sample comprising microorganisms is provided, the second vessel including a microorganism trapping means in communication with the first vessel.

본 발명의 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치는, 상기한 무기 이온 물질이 포함되어 있는 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기 (이하 제1 용기)가 미생물 포획 수단이 포함되어 있는 제2 용기와 연통되어 있는 것을 특징으로 한다. An apparatus for separating microorganisms from a sample containing microorganisms of the present invention includes a second sample containing a microorganism trapping means including a sample pretreatment vessel (hereinafter referred to as a first vessel) containing microorganisms containing the above-mentioned inorganic ionic substance. It is characterized by being in communication with the container.

상기 제1 용기에 있어서, 상기 무기 이온교환물질은 이온교환 특성을 가지는 무기물질이면, 어느 것이나 포함된다. 상기 무기 이온교환물질의 예에는, 제올라이트, 모래, 금속산화물 (예를 들면, SiO₂, Al₂O₃, Na₂O)이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 제올라이트는 바람직하게는, H 형 제올라이트이다. In the said 1st container, as long as the said inorganic ion exchange material is an inorganic substance which has an ion exchange characteristic, all are contained. Examples of the inorganic ion exchange material include, but are not limited to, zeolites, sands, and metal oxides (eg, SiO ₂ , Al ₂ O ₃ , Na ₂ O). The zeolite is preferably an H-type zeolite.

본 발명에 있어서, 제올라이트란 TO4 (T =Al 또는 Si)로 나타내어지는 구석 공유 사면체 (corner-sharing tetrahedra)로 구성되는 결정성 알루미노실리케이트이다. 1Å 내지 20Å의 균질한 세공 및 채널을 가지며, 넓은 표면적 (약 900 m2/g)을 갖는다. 제올라이트는 이온화 가능한 기가 H+, NH4+ 또는 Na+인지 여부에 따라 각각 H 형, NH4 형, 또는 Na 형이라고 한다. 상기 H 형 제올라이트는 NH4 형 제올라이트를 550℃에서 2 시간 동안 태워서 얻을 수 있으나, 이 제조 방법에 한정되는 것은 아니다. 상업적으로는 Aldrich 사에서 제공되는 제올라이트 Y가 있다. 상기 제올라이트는 분말 형태 또는 고체 지지체에 고정화되어 있는 형태일 수 있으나, 특정한 형태에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, zeolite is a crystalline aluminosilicate composed of a corner-sharing tetrahedra represented by TO4 (T = Al or Si). It has homogeneous pores and channels of 1 mm 3 to 20 mm 3 and has a large surface area (about 900 m 2 / g). Zeolites are said to be H type, NH 4 type, or Na type, respectively, depending on whether the ionizable group is H +, NH 4 + or Na +. The H type zeolite can be obtained by burning NH 4 type zeolite at 550 ° C. for 2 hours, but is not limited thereto. Commercially there is zeolite Y provided by Aldrich. The zeolite may be in a powder form or a form immobilized on a solid support, but is not limited to a specific form.

상기 제1 용기에 있어서, 상기 무기 이온 물질은 용기, 예를 들면 튜브 또는 마이크로채널 또는 마이크로챔버에 포함되어 있거나 그 벽면 또는 바닥에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 용기는 무기 이온 물질이 포함되어 있거나 고정화되어 있는 튜브 또는 마이크로채널 또는 마이크로챔버일 수 있다. 또한, 본 발명의 용기는 상기 마이크로채널 및 마이크로챔버를 포함하는 미세유동장치 또는 랩온어칩일 수 있다. In the first vessel, the inorganic ionic material may be contained in a vessel, for example, a tube or a microchannel or a microchamber, or may be immobilized on a wall or bottom thereof. Thus, the vessel of the present invention may be a tube or microchannel or microchamber containing or immobilized with an inorganic ionic material. In addition, the container of the present invention may be a microfluidic device or a lab-on-a-chip comprising the microchannel and microchamber.

상기 제1 용기에 있어서, 상기 미생물을 포함하는 시료는, 생물학적 시료, 바람직하게는 혈액, 뇨, 또는 타액, 더욱 바람직하게는 뇨이다. 본 발명의 방법에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다. 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스인 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the first container, the sample containing the microorganism is a biological sample, preferably blood, urine, or saliva, more preferably urine. In the method of the present invention, "biological sample" means a sample containing or consisting of cells or tissues, such as cells or biological liquids isolated from an individual. The subject may be an animal including a human. Examples of biological samples include saliva, sputum, blood, blood cells (e.g. white blood cells, red blood cells), amniotic fluid, serum, semen, bone marrow, tissue or microneedle biopsy samples, urine, peritoneal fluid, pleural fluid and cell culture. Included. Biological samples include tissue sections, such as frozen sections taken for histological purposes. The microorganism may be a bacterium, fungus or virus, but is not limited to these examples.

상기 제1 용기는, 상기 용기 중의 무기 이온 물질과 미생물을 포함하는 시료를 접촉시켜, 상기 시료 중의 세포가 고체 지지체에 결합하는 것을 방해하는 물질 을 제거하는 전처리를 하는데 사용하기 위한 것이다. The first container is for use in pretreatment for contacting a sample containing an inorganic ionic substance in the container with a microorganism to remove a substance that prevents the cells in the sample from binding to the solid support.

상기 제1 용기는 상기 시료를 주입하기 위한 입구를 더 포함할 수 있다. The first container may further include an inlet for injecting the sample.

본 발명의 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치에 있어서, 상기 제2 용기는 상기 제1 용기와 연통되어 있다. 또한, 상기 장치는 제1 용기와 제2 용기의 연결 부위에 구비된 밸브와 펌프를 더 포함하고, 상기 제1 용기로부터 제2 용기로의 시료의 이동을 조절할 수 있다. In the apparatus for separating microorganisms from a sample containing microorganisms of the present invention, the second container is in communication with the first container. In addition, the device further comprises a valve and a pump provided at the connection portion of the first vessel and the second vessel, it is possible to control the movement of the sample from the first vessel to the second vessel.

상기 제2 용기에 포함되어 있는 상기 미생물 포획 수단은 그 특성 및 미생물을 포함하는 시료의 염 농도 및 pH 등의 특성에 의하여 미생물을 그 표면에 부착시킬 수 있다. The microorganism trapping means included in the second container may adhere the microorganisms to the surface by the characteristics thereof and the characteristics such as salt concentration and pH of the sample containing the microorganisms.

따라서, 본 발명의 장치의 일 구체예는, 무기 이온교환물질이 포함되어 있는 미생물을 포함하는 시료 전처리용 제1 용기; 및 Thus, one embodiment of the device of the present invention, the first container for sample preparation containing a microorganism containing an inorganic ion exchange material; And

상기 제1 용기와 연통되어 있는 비평면 형상의 고체 지지체가 포함되어 있는 제2 용기를 포함하는, 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치이다. An apparatus for separating microorganisms from a sample containing microorganisms, comprising a second vessel containing a non-planar solid support in communication with the first vessel.

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. The solid support, included in the second container, has a non-planar shape and has a surface whose surface area is increased compared to the plane. The solid support may be a concave-convex structure is formed on the surface. In the present invention, the "concave-convex structure" refers to a structure having a concave and convex surface without smooth surface. The uneven structure includes a surface having a columnar structure in which a plurality of pillars are formed or a surface having a network structure in which a plurality of pores is formed, but is not limited to these examples.

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고체 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집합체)으로 사용될 수 있다. The non-planar solid support included in the second container may have any shape. For example, a solid support having a pillar structure having a plurality of pillars formed on a surface thereof, a solid support having a bead shape, and a sieve structure having a plurality of pores formed on a surface thereof. It may be selected from the group consisting of a solid support. The solid support may be used alone or as a collection of a plurality of the solid supports (eg, an aggregate packed in a tube or a container).

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 고체 지지체는 튜브, 칼럼 또는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 상기 제2 용기의 일 형태는 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device) 내에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2 용기는 상기 고체 지지체가 고정화되어 있거나 포함되어 있는 랩온어칩의 형태일 수 있다. 본 발명의 용기의 일 구체예는, 비드 형상의 상기 고 체 지지체가 칼럼 내에 충진되어 있는 용기이다. The solid support, contained in the second vessel, may be in the form of an inner wall of a microchannel or microchamber in a tube, column or microfluidic device. Thus, one form of the second vessel is provided with one or more inlets and outlets, in a fluidic or microfluidic device in which the inlet and outlet are communicated through a channel or microchannel. Can be performed. In addition, the second container may be in the form of a lab-on-a-chip in which the solid support is immobilized or contained therein. One embodiment of the container of the present invention is a container in which the bead-shaped solid support is filled in a column.

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단면 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다. The solid support included in the second container may have a pillar structure in which a plurality of pillars are formed on a surface thereof. The manufacture of pillars on solid supports is well known in the art. For example, fine pillars can be formed at high density using a photolithography process or the like used in a semiconductor manufacturing process. The pillar has an aspect ratio of 1: 1 to 20: 1, but is not limited thereto. In the present invention, "aspect ratio" means the ratio of the cross-sectional diameter to the height of the column. The pillar structure may be a ratio of the distance between the pillar height and the pillar is 1: 1 to 25: 1. The pillar structure may have a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO₂ 층에 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. The non-planar solid support included in the second container may have hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 °. The hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 ° consists of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS). The compound selected from the group may be coated and given. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° preferably has octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) and tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxy in the SiO ₂ layer of the solid support. Compounds selected from the group consisting of silanes (DFS) may be self-assembled monolayer (SAM) coated.

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO₂ 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.The non-planar solid support included in the second container may have one or more amine-based functional groups on its surface. Surface having at least one functional group of the amine-based may be a polyethyleneimine trimethoxysilane (PEIM) is coated on the surface of the solid support. The coated surface may preferably be a self-assembled monomolecular (SAM) coating of polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM) on the SiO ₂ layer of the solid support. The amine-based functional group has a positive charge in the range of pH 3.0 to 6.0.

상기 제2 용기에 포함되어 있는, 상기 고체 지지체는 상기한 바와 같은 물 접촉각 특성을 갖는 것 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 것이면 어떠한 재질의 지지체도 포함된다. 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 및 플라스틱 물질 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 표면은, 상기 표면을 가진 고체 지지체에 미생물을 포함하는 시료가 접촉되는 경우, 미생물이 부착하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. The solid support included in the second container includes a support of any material as long as it has water contact angle characteristics as described above or one or more amine-based functional groups on its surface. For example, glass, silicon wafers, plastic materials, and the like are included, but are not limited to these examples. The surface having a water contact angle of 70 ° to 95 ° or a surface having at least one amine-based functional group on the surface thereof is considered to be attached to the microorganism when the sample containing the microorganism contacts the solid support having the surface. The present invention is not limited to a specific mechanism.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example

실시예Example 1: 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 고체 지지체를 이용한 뇨 모사 용액 중의 대장균의 농축 : 세포 포획을 방해하는 인자 탐색 1: Concentration of Escherichia Coli in Urine Simulation Solution Using Solid Support with Surface with Pillar Array Formation: Screening for Factors Interfering with Cell Capture

본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm 인 실리콘 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 갖는 유동 장치에 박테리아 세포를 포함한 시료를 흘려주면서 세포를 상기 고체 지지체 상에 부착시키고, 흘러나오는 시료 중의 박테리아 세포의 수를 콜로니 계수 (counting)를 통하여 결정하고, 이로부터 상기 고체 지지체에 의한 박테리아 세포 포획 효율을 계산하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리는 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.In this embodiment, the cells are introduced while flowing a sample including bacterial cells into a flow apparatus having a chamber having an inlet and an outlet and having a surface having an array of pillars formed on a silicon chip having a size of 10 mm x 23 mm. The number of bacterial cells in the sample flowing out and adhered to the solid support was determined via colony counting, from which the bacterial cell capture efficiency by the solid support was calculated. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.

상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 SiO₂ 층 상에 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC)이 SAM 코팅된 표면을 가진다. The surface of the region where the pillar array is formed has a surface coated with octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) on a SiO ₂ layer.

상기 세포 시료는, 0.01 OD₆₀₀의 대장균을 포함하는, 소듐 아세테이트 버퍼에 기초한 용액과 투석된 뇨에 기초한 용액을 사용하였다. The cell sample used a solution based on sodium acetate buffer and a solution based on dialysis urine, including E. coli 0.01 OD ₆₀₀ .

상기 소듐 아세테이트 버퍼에 기초한 용액 (pH 4.0)은 다음과 같다: The solution (pH 4.0) based on the sodium acetate buffer is as follows:

버퍼: 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 4.0).Buffer: 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0).

버퍼+염: 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)에 염의 농도, 88 mM NaCl, 67 mM KCl, 38 mM NH₄Cl 및 18 mM Na₂SO₄가 되도록, NaCl 0.514 g, KCl 0.5 g, NH₄Cl 0.203 g, Na₂SO₄ 0.259 g을 첨가하여 얻어진 용액.Buffer + salt: 100 mM sodium acetate buffer so that the (pH 4.0) to the salt concentration, 88 mM NaCl, 67 mM KCl , 38 mM NH 4 Cl and _{_{18 mM Na 2 SO 4, NaCl}} 0.514 g, KCl 0.5 g, NH 4 A solution obtained by adding 0.203 g of Cl and 0.259 g of Na ₂ SO ₄ .

버퍼+염+요소: 상기 "버퍼+염" 용액에 333 mM 요소를 포함하는 용액.Buffer + Salt + Urea: A solution comprising 333 mM urea in the "Buffer + Salt" solution.

버퍼+염+요소+크레아틴: 상기 "버퍼+염" 용액에 333 mM 요소 및 9.8 mM 크레아틴을 포함하는 용액.Buffer + Salt + Urea + Creatine: A solution comprising 333 mM urea and 9.8 mM creatine in the "Buffer + Salt" solution.

버퍼+염+요소+크레아틴+요산: 상기 "버퍼+염" 용액에 333 mM 요소 및 9.8 mM 크레아틴 및 2.5 mM 요산을 포함하는 용액.Buffer + Salt + Urea + Creatine + Uric Acid: A solution comprising 333 mM urea and 9.8 mM creatine and 2.5 mM uric acid in the "buffer + salt" solution.

버퍼+염+요소+크레아틴+요산+포도당: 상기 "버퍼+염" 용액에 333 mM 요소 및 9.8 mM 크레아틴 및 2.5 mM 요산 및 0.6 mM 포도당을 포함하는 용액.Buffer + Salt + Urea + Creatine + Uric Acid + Glucose: A solution comprising 333 mM urea and 9.8 mM creatine and 2.5 mM uric acid and 0.6 mM glucose in the "buffer + salt" solution.

상기 투석된 뇨에 기초한 용액은 투석된 뇨와 2x상기 소듐 아세테이트 버퍼에 기초한 각 용액을 1:1로 혼합하여 얻어진, 최종 pH가 3.97이다. The dialysis-based solution was obtained by mixing 1: 1 of dialysis urine with each solution based on 2 × the sodium acetate buffer, with a final pH of 3.97.

상기 뇨 시료는 유속 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 200 ㎕를 흘려 주었다. 실험은 각각 3회 반복하였다. 세포 계수는, 상기 고체 지지체에 뇨 시료를 흘려주기 전과 흘려준 후 출구를 통하여 나오는 유출액 중의 세포를 세었다. The urine sample flowed 200 μl from the inlet to the outlet through the chamber at a flow rate of 200 μl / min. The experiment was repeated three times each. The cell count counted the cells in the effluent flowing through the outlet before and after the urine sample was poured into the solid support.

도 1은 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 뇨 중의 대장균을 분리한 결과를 나타내는 것으로, 뇨의 구성성분의 영향을 나타내는 것이다. 뇨 내에 존재하는 염의 농도 및 기타의 물질 (주로 크레아틴)에 의하여 포획 효율이 낮아짐을 알 수 있다. 1 shows the result of separating E. coli in urine using a solid support having a surface on which pillar arrays are formed, and shows the effect of the components of urine. It can be seen that the capture efficiency is lowered by the concentration of salts present in the urine and by other substances (mainly creatine).

실시예Example 2: 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 고체 지지체를 이용한 뇨 중의 대장균의 농축 : 2: Concentration of E. coli in urine using a solid support having a surface on which pillar arrays are formed: 뇨의Urinary 희석 비율 및 유속에 따른 농축 효과 측정 Determination of concentration effect according to dilution rate and flow rate

본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm 인 실리콘 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 갖는 유동 장치에 박테리아 세포를 포함한 시료를 흘려주면서 박테리아 세포를 상기 고체 지지체 상에 부착시키고, 흘러나오는 시료 중의 세포의 수를 콜로니 계수 (counting)를 통하여 결정하고, 이로부터 상기 고체 지지체에 의한 박테리아 세포 포획 효율을 계산하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리는 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.In this embodiment, bacterial cells are introduced while flowing a sample containing bacterial cells into a flow apparatus having a chamber having a surface having an inlet and an outlet and having a surface having an array of pillars formed on a silicon chip having a size of 10 mm x 23 mm. The number of cells in the sample flowing out on the solid support was determined via colony counting, from which bacterial cell capture efficiency by the solid support was calculated. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.

상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 SiO₂ 층 상에 PEIM이 SAM 코팅된 표면을 가진다. The surface of the region where the pillar array is formed has a surface coated with PEIM on the SiO ₂ layer.

시료는 다음과 같이 준비하였다. 버퍼와 뇨를 희석 배율에 맞추면서 최종 부피가 1 ml가 되도록 혼합하였다. 여기에 10 ㎕의 1.0 OD 대장균을 넣었다. Samples were prepared as follows. The buffer and urine were mixed to a final volume of 1 ml while adjusting the dilution scale. 10 μl of 1.0 OD Escherichia coli was added thereto.

상기 희석된 뇨 시료는 유속 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 200 ㎕를 흘려 주었다. 실험은 각각 3회 반복하였다. 박테리아 세포 계수는, 상기 고체 지지체에 뇨 시료를 흘려주기 전과 흘려준 후 출구를 통하여 나오는 유출액 중의 세포를 세었다. The diluted urine sample flowed 200 μl from the inlet to the outlet through the chamber at a flow rate of 200 μl / min. The experiment was repeated three times each. Bacterial cell counts counted the cells in the effluent flowing through the outlet before and after the urine sample was poured into the solid support.

도 2는 기둥 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 뇨 중의 대장균을 농축한 결과를 나타내는 것으로, 뇨의 희석 및 유속에 따른 결과를 나타내는 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 희석 배수가 증가함에 따라 세포 포획 효율이 증가하고, 유속이 증가함에 따라 세포 포획 효율이 감소하였다.Figure 2 shows the result of the concentration of Escherichia coli in the urine using a solid support having a surface on which the column array is formed, showing the result of dilution and flow rate of urine. As shown in FIG. 2, as the dilution fold increased, the cell capture efficiency increased, and as the flow rate increased, the cell capture efficiency decreased.

실시예 1과 2에 나타낸 바와 같이, 뇨 시료 중에는 미생물이 고체 지지체에 부착하는 것을 방해하는 물질, 예를 들면, 이온 물질 및 크레아틴 등이 존재하기 때문에, 뇨 중의 미생물을 고체 지지체를 이용하여 분리하고자 하는 경우에는, 이들을 제거할 필요가 있다. 또한, 뇨 중의 미생물은 높은 희석 비율, 보통 5배 이상으로 희석하여야, 고체 지지체에 부착하는 효율이 높았다. As shown in Examples 1 and 2, there are substances in the urine sample that prevent the microorganisms from adhering to the solid support, for example, ionic substances and creatine. In this case, it is necessary to remove these. In addition, the microorganisms in the urine had to be diluted at a high dilution rate, usually 5 times or more, so that the efficiency of adhesion to the solid support was high.

실시예Example 3: 제올라이트 처리가 고체 지지체에 미생물을 결합하는 것에 미치는 영향 3: Effect of Zeolite Treatment on Binding Microorganisms to Solid Supports

먼저, 제올라이트 Y (Aldrich 사) (NH4-Y 형태)를 550℃에서 2시간 동안 태워 HY (H 형 제올라이트)를 제조하였다. First, zeolite Y (Aldrich) (NH4-Y form) was burned at 550 ° C. for 2 hours to prepare HY (H type zeolite).

다음으로 뇨 30 ㎕를 0.3g의 상기 H 형 제올라이트와 혼합한 다음, 200 mM 아세테이트 버퍼 (pH 3.0)과 혼합 (1:1 v/v)하였다. 여기에 대장균을 OD 0.01이 되도록 첨가하였다. 대조군으로는, 제올라이트를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 동일하게 하였다. 뇨 시료는 2가지 시료를 사용하였다. 그 결과, 상기 뇨 시료의 pH는 5 내지 8 (뇨 1: pH 6.2, 뇨 2: pH 6.8)에서, 제올라이트와 혼합한 후 약 pH 4로 감소하였다. 이는 이온 교환반응이 일어났다는 것을 나타낸다. 대조군의 pH는 뇨 1: pH 6.2, 뇨 2: pH 6.8로 변화가 없었다.Next, 30 μl of urine was mixed with 0.3 g of the H-type zeolite, followed by mixing (1: 1 v / v) with 200 mM acetate buffer (pH 3.0). E. coli was added thereto to an OD of 0.01. The control was the same except that no zeolite was added. Urine samples used two samples. As a result, the pH of the urine sample was reduced to about pH 4 after mixing with zeolite at 5 to 8 (urine 1: pH 6.2, urine 2: pH 6.8). This indicates that an ion exchange reaction occurred. The pH of the control group did not change to urine 1: pH 6.2, urine 2: pH 6.8.

상기와 같이 이온교환된 뇨 시료를 희석하고, 비평면 형상의 고체 지지체에 접촉시켜 미생물을 상기 고체 지지체에 결합시키고, 그로부터 각 시료에 따른 세포 결합 효율을 측정하였다. As described above, the ion exchanged urine sample was diluted and contacted with a non-planar solid support to bind the microorganisms to the solid support, and cell binding efficiency according to each sample was measured therefrom.

입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm 인 실리콘 칩 상에 기둥 의 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 갖는 유동 장치에 상기 이온교환된 대장균 세포를 포함한 뇨 시료를 흘려주면서 세포를 상기 고체 지지체 상에 부착시키고, 흘러나오는 시료 중의 대장균 세포의 수를 광학 밀도 측정을 통하여 결정하고, 이로부터 상기 고체 지지체에 의한 대장균 세포 포획 효율을 계산하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리는 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.Cells were collected by flowing a urine sample containing the ion exchanged E. coli cells into a flow device having an inlet and an outlet and having a chamber having a surface with an array of pillars formed on a silicon chip having a size of 10 mm x 23 mm. The number of Escherichia coli cells in the sample that adhered to the solid support and flowed out was determined by optical density measurement, from which the E. coli cell capture efficiency by the solid support was calculated. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.

상기 뇨 시료는 유속 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 200 ㎕를 흘려 주었다. 실험은 각각 2회 반복하였다 (C1과 C2는 chip 1과 chip 2의 약자로서 반복을 의미한다). 세포 계수는, 상기 고체 지지체에 뇨 시료를 흘려주기 전과 흘려준 후 출구를 통하여 나오는 유출액 중의 세포수를 결정하였다. The urine sample flowed 200 μl from the inlet to the outlet through the chamber at a flow rate of 200 μl / min. The experiment was repeated twice each (C1 and C2 are abbreviations for chip 1 and chip 2). The cell count determined the number of cells in the effluent flowing through the outlet before and after the urine sample was flowed into the solid support.

도 3은 뇨 시료를 제올라이트 처리한 것이, 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 제올라이트 처리한 경우가, 그렇지 않은 경우에 비하여 세포 결합 효율이 현저하게 우수하였다. 특히, 세포 결합 효율이 낮은 뇨 시료의 경우,제올라이트 처리한 것이 세포결합 효율에 미치는 효과가 컸다. 이는 제올라이트 처리를 거침으로써, 뇨 형태에 상관없이 일정수준 이상의 세포 결합효율을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. It is a figure which shows the effect which the zeolite treatment of the urine sample has on the efficiency which a microorganism adheres to a solid support body. As shown in FIG. 3, the cell binding efficiency was remarkably excellent in the case of zeolite treatment than in the case of otherwise. In particular, in the case of urine samples with low cell binding efficiency, the effect of zeolite treatment on the cell binding efficiency was great. This indicates that by zeolite treatment, a certain level of cell binding efficiency can be obtained regardless of urine form.

실시예Example 4: 제올라이트 처리가 고체 지지체에 미생물을 결합하는 것에 미치는 영향: 4: Effect of Zeolite Treatment on Binding Microorganisms to Solid Supports: NaYNaY 및 And NH4YNH4Y 형 제올라이트의 영향 Influence of Type Zeolite

먼저, 소듐 형태 제올라이트인 Na-Y와 암모늄 형태 제올라이트 NH4-Y를 구입하였다 (Aldrich 사). First, sodium-type zeolite Na-Y and ammonium-type zeolite NH4-Y were purchased (Aldrich).

다음으로 뇨 30 ㎕를 0.3g의 상기 소듐 및 암모늄 형 제올라이트와 각각 혼합한 다음, 200 mM 아세테이트 버퍼 (pH 3.0)과 혼합 (1:1v/v)하였다. 여기에 대장균을 OD 0.01이 되도록 첨가하였다. 대조군으로는, 제올라이트을 첨가하지 않는 것을 제외하고는 동일하게 하였다. 뇨 시료는 각각 2가지 시료를 사용하였다. 그 결과, 상기 뇨 시료의 pH는 각각 NaY : pH 6.2, pH 7.0, NH4Y : pH 5.9, pH 6.5로 변화가 없었다. Next, 30 μl of urine was mixed with 0.3 g of the sodium and ammonium zeolite, respectively, followed by mixing (1: 1 v / v) with 200 mM acetate buffer (pH 3.0). E. coli was added thereto to an OD of 0.01. The control was the same except that no zeolite was added. Two samples were used for each urine sample. As a result, the pH of the urine sample did not change to NaY: pH 6.2, pH 7.0, NH4Y: pH 5.9, pH 6.5, respectively.

상기와 같이 뇨 시료와 제올라이트의 혼합물을을, 비평면 형상의 고체 지지체에 접촉시켜 미생물을 상기 고체 지지체에 결합시키고, 그로부터 각 시료에 따른 세포 결합 효율을 측정하였다. As described above, the mixture of the urine sample and the zeolite was contacted with a non-planar solid support to bind microorganisms to the solid support, and cell binding efficiency according to each sample was measured therefrom.

입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm 인 실리콘 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 표면을 갖는 챔버를 갖는 유동 장치에 상기 이온교환된 대장균 세포를 포함한 뇨 시료를 흘려주면서 세포를 상기 고체 지지체 상에 부착시키고, 흘러나오는 시료 중의 대장균 세포의 수를 광학 밀도 측정을 통하여 결정하고, 이로부터 상기 고체 지지체에 의한 대장균 세포 포획 효율을 계산하였다. 상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리는 12 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다.Cells were collected by flowing a urine sample containing the ion exchanged E. coli cells into a flow device having an inlet and an outlet and having a chamber having a surface with an array of pillars formed on a silicon chip of size 10 mm x 23 mm. The number of Escherichia coli cells in the sample that adhered to the solid support and flowed out was determined by optical density measurement, from which the E. coli cell capture efficiency by the solid support was calculated. In the pillar array, the distance between the pillars is 12 µm, the pillar height is 100 µm, and the cross section of each pillar has a square length of 25 µm on one side.

상기 뇨 시료는 유속 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 200 ㎕를 흘려 주었다. 실험은 각각 3회 반복하였다. 세포 계수는, 상기 고체 지지체에 뇨 시료를 흘려주기 전과 흘려준 후 출구를 통하여 나오는 유출액 중의 세포수를 결정하였다. The urine sample flowed 200 μl from the inlet to the outlet through the chamber at a flow rate of 200 μl / min. The experiment was repeated three times each. The cell count determined the number of cells in the effluent flowing through the outlet before and after the urine sample was flowed into the solid support.

도 4와 5는 각각 암모늄 형 및 소듐 형 제올라이트와 각각 혼합된 뇨 시료 중의 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율을 나타내는 도면이다. 도 4와 5에 나타낸 바와 같이, 암모늄 형 및 소듐 형 제올라이트를 사용하는 경우에는, 제올라이트를 사용하지 않은 경우에 비하여 세포 결합 효율의 차이가 없었다. 4 and 5 are diagrams showing the efficiency of microorganisms in urine samples mixed with ammonium and sodium zeolites respectively attached to the solid support. As shown in Figs. 4 and 5, in the case of using the ammonium type and the sodium type zeolite, there was no difference in cell binding efficiency compared with the case in which the zeolite was not used.

이는 수소 형 제올라이트와 뇨 시료의 이온교환 반응에 의하여, 이온교환반응이 일어나는 동시에 교환된 H+ 이온에 의하여 pH가 감소되는 것이, 세포 결합 효율에 유리한 효과를 미친다는 것을 나타낸다. This indicates that the ion exchange reaction between the hydrogen zeolite and the urine sample causes the ion exchange reaction to decrease in pH due to the exchanged H + ions, which has a beneficial effect on cell binding efficiency.

실시예Example 5: 제올라이트 처리가 고체 지지체에 미생물을 결합하는 것에 미치는 영향: 희석한 시료와 희석하지 않고 제올라이트 처리한 시료와의 비교 5: Effect of Zeolite Treatment on Binding of Microorganisms to Solid Supports: Comparison of Diluted and Undiluted Zeolite Samples

다음으로 뇨 30 ㎕를 0.3g의 상기 H 형 제올라이트와 혼합하였다 (희석되지 않은 뇨 시료). 대조군으로는, 뇨 30 ㎕를 200 mM 아세테이트 버퍼 (pH 3.0) 30 ㎕ (1:1 v/v)와 혼합하였다 (2 배 희석된 뇨 시료). 여기에 대장균을 각각 OD 0.01이 되도록 첨가하였다. 뇨 시료는 1가지 시료를 사용하였다. 그 결과, 상기 뇨 시료의 pH는 7.4에서, 제올라이트와 혼합한 후 약 pH 3.8로 감소하였다. 이는 이온 교환반응이 일어났다는 것을 나타낸다. 대조군은 버퍼에 의해 pH 4.2로 감소하였다. Next, 30 μl of urine was mixed with 0.3 g of the H-type zeolite (undiluted urine sample). As a control, 30 μl of urine was mixed with 30 μl of 200 mM acetate buffer (pH 3.0) (1: 1 v / v) (two-fold diluted urine sample). Escherichia coli was added thereto so as to have an OD of 0.01. One sample was used for the urine sample. As a result, the pH of the urine sample decreased from 7.4 to about pH 3.8 after mixing with zeolite. This indicates that an ion exchange reaction occurred. The control was reduced to pH 4.2 by buffer.

상기와 같이 이온교환된 뇨 시료를, 비평면 형상의 고체 지지체에 접촉시켜 미생물을 상기 고체 지지체에 결합시키고, 그로부터 각 시료에 따른 세포 결합 효율을 측정하였다. The urine sample ion-exchanged as described above was contacted with a non-planar solid support to bind microorganisms to the solid support, and cell binding efficiency according to each sample was measured therefrom.

상기 뇨 시료는 유속 200 ㎕/분으로 입구로부터 상기 챔버를 통하여 출구로 200 ㎕를 흘려 주었다. 실험은 각각 3회 반복하였다. 세포 계수는, 상기 고체 지지체에 뇨 시료를 흘려주기 전과 흘려준 후 출구를 통하여 나오는 유출액 중의 세포 수를 결정하였다. The urine sample flowed 200 μl from the inlet to the outlet through the chamber at a flow rate of 200 μl / min. The experiment was repeated three times each. The cell count determined the number of cells in the effluent flowing through the outlet before and after the urine sample was flowed into the solid support.

도 6은 뇨 시료를 희석없이 제올라이트를 통하여 이온교환시킨 것이 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 희석 없이 이온교환반응을 한 것이, 희석시킨 것보다 세포 결합 효율이 우수하였다. 즉, 희석에 의한 시료 부피 증가 없이도 이온교환반응을 통하여 약 25% 정도의 세포 결합 효율을 얻을 수 있었다. FIG. 6 shows the effect of ion exchange of urine samples through zeolite without dilution on the efficiency of microorganism adhesion to a solid support. As shown in FIG. 6, the ion exchange reaction without dilution showed better cell binding efficiency than the dilution. That is, the cell binding efficiency of about 25% was obtained through the ion exchange reaction without increasing the sample volume by dilution.

본 발명의 미생물을 분리하는 방법에 의하면, 시료 중에 존재하는 박테리아 세포, 곰팡이 세포 또는 바이러스를 포함한 미생물 세포를 효율적으로 분리할 수 있다.According to the method for separating the microorganism of the present invention, microbial cells including bacterial cells, fungal cells or viruses present in a sample can be efficiently separated.

본 발명의 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기에 의하면, 시료 중의 미생물이 고체 지지체에 부착하는 효율을 높이는데 사용될 수 있다. According to the container for sample preparation containing the microorganism of the present invention, it can be used to increase the efficiency of the microorganism in the sample adheres to the solid support.

본 발명의 미생물을 분리하기 위한 장치에 의하면, 박테리아 세포, 곰팡이 세포 또는 바이러스를 포함한 미생물 세포를 효율적으로 분리할 수 있다.According to the device for isolating the microorganism of the present invention, it is possible to efficiently separate microbial cells including bacterial cells, fungal cells or viruses.

Claims

미생물을 포함하는 시료를 무기 이온교환물질과 접촉시켜, 상기 시료와 상기 무기 이온교환물질을 반응시키는 단계; 및 Contacting a sample containing microorganisms with an inorganic ion exchange material to react the sample with the inorganic ion exchange material; And

상기 반응된 시료를 미생물 포획 수단과 접촉시키는 단계를 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하는 방법으로서,A method for separating microorganisms from a sample comprising contacting the reacted sample with a microorganism trapping means,

상기 미생물을 포함하는 시료는 미생물을 포함하는 뇨이고, 상기 무기 이온교환물질은 제올라이트이고, 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스이고, 상기 미생물 포획 수단은 표면에 어스팩비가 1:1 내지 20:1인 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 비평면 형상의 고체 지지체, 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 고체 지지체, 및 그 표면에 아미노실란으로 코팅된 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.The sample containing the microorganism is urine containing the microorganism, the inorganic ion exchange material is zeolite, the microorganism is bacteria, fungus or virus, and the means for capturing the microorganism has an earth ratio of 1: 1 to 20: 1 on the surface. From a group consisting of a non-planar solid support having a columnar structure in which a phosphorus pillar is formed, a solid support having a hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 °, and a solid support coated with aminosilane on the surface thereof Method selected.

제1항에 있어서, 상기 반응된 시료를 미생물 포획 수단과 접촉시키는 단계는, 상기 반응된 시료를 상기 미생물 포획 수단과 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시키는 단계를 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein contacting the reacted sample with the microbial capture means comprises contacting the reacted sample with the microbial capture means in a range of pH 3.0 to 6.0. .

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제1항에 있어서, 상기 제올라이트는 H 형 제올라이트인 것인, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the zeolite is an H-type zeolite.

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제1항에 있어서, 상기 기둥은 어스팩비가 1:1 내지 20:1인 것인, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the pillar has an aspect ratio of 1: 1 to 20: 1.

제1항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것인, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the columnar structure has a ratio of column height to column distance between 1: 1 and 25: 1.

제1항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것인, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the columnar structure has a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.

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제1항에 있어서, 상기 소수성은 상기 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 또는 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)의 화합물로 코팅하여 부여되는 성질인 것을 특징으로 하는, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the hydrophobicity is coated on the surface of the solid support with a compound of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) or tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS) A method for separating microorganisms from a sample, wherein the microorganism is characterized in that it is imparted.

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제1항에 있어서, 상기 아미노실란은 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)인 것을 특징으로 하는, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, wherein the aminosilane is polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM).

제1항에 있어서, 상기 접촉단계 전에, 상기 반응 시료를 포스페이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼로 희석하는 단계를 더 포함하는 것인, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 1, further comprising diluting the reaction sample with phosphate buffer or acetate buffer before the contacting step.

제15항에 있어서, 상기 희석은 99:1 내지 1:4의 비율로 된 것인, 시료로부터 미생물을 분리하는 방법.The method of claim 15, wherein the dilution is in a ratio of 99: 1 to 1: 4.

무기 이온교환물질이 포함되어 있는 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기로서, 상기 무기 이온교환물질은 제올라이트이고, 상기 미생물을 포함하는 시료는 뇨이고, 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 용기.A sample pretreatment container including a microorganism containing an inorganic ion exchange material, wherein the inorganic ion exchange material is zeolite, the sample containing the microorganism is urine, and the microorganism is bacteria, fungi or viruses. Vessel.

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제17항에 있어서, 상기 제올라이트는 H 형 제올라이트인 것인, 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기.The container for sample preparation according to claim 17, wherein the zeolite is an H-type zeolite.

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제17항에 있어서, 상기 용기는 튜브 또는 마이크로채널 또는 마이크로챔버인 것인, 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기.18. The container of claim 17, wherein the container is a tube or microchannel or microchamber.

제17항에 있어서, 상기 무기 이온교환물질은 상기 용기에 고정화되어 있는 것인, 미생물을 포함하는 시료 전처리용 용기.The container for sample preparation according to claim 17, wherein the inorganic ion exchange material is immobilized on the container.

무기 이온교환물질이 포함되어 있는 미생물을 포함하는 시료 전처리용 제1 용기; 및 A first container for sample preparation containing microorganisms containing an inorganic ion exchange material; And

상기 제1 용기와 연통되어 있는 미생물 포획 수단이 포함되어 있는 제2 용기를 포함하는, 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치로서,An apparatus for separating microorganisms from a sample containing microorganisms, comprising a second vessel including a microorganism trapping means in communication with the first vessel,

상기 무기 이온교환물질은 제올라이트이고, 상기 미생물을 포함하는 시료는 뇨이고, 상기 미생물을 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스이고, 상기 미생물을 포획하는 수단은, 표면에 어스팩비가 1:1 내지 20:1인 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 비평면 형상의 고체 지지체, 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 고체 지지체, 및 그 표면에 아미노실란으로 코팅된 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 장치.The inorganic ion exchange material is zeolite, the sample containing the microorganism is urine, the microorganism is a bacterium, fungus or virus, and the means for capturing the microorganism has an earth ratio of 1: 1 to 20: 1 on its surface. A non-planar solid support having a pillar structure in which pillars are formed, a solid support having a hydrophobicity with a water contact angle of 70 ° to 95 °, and a solid support coated with aminosilane on the surface thereof Device characterized in that.

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제23항에 있어서, 상기 제올라이트는 H 형 제올라이트인 것인, 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.24. The apparatus of claim 23, wherein the zeolite is an H-type zeolite.

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제23항에 있어서, 상기 제1 및 제2 용기는 튜브 또는 마이크로채널 또는 마이크로챔버인 것인, 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.The apparatus of claim 23, wherein the first and second containers are tubes or microchannels or microchambers.

제23항에 있어서, 상기 무기 이온교환물질은 상기 제1 용기에 고정화되어 있는 것인, 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.The device of claim 23, wherein the inorganic ion exchange material is immobilized in the first container.

제23항에 있어서, 상기 제2 용기는 버퍼 용액 저장부를 더 포함하는 것인 미생물을 포함하는 것인, 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.The apparatus of claim 23, wherein the second container further comprises a microorganism that further comprises a buffer solution reservoir.

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제23항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것인 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.24. The device of claim 23, wherein the columnar structure has a ratio of column height to column distance between 1: 1 and 25: 1.

제23항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것인 미생물을 포함하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.The apparatus of claim 23, wherein the columnar structure has a distance between the pillars in a range of 5 μm to 100 μm.

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제23항에 있어서, 상기 소수성은 상기 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸 (3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 또는 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)의 화합물로 코팅하여 부여되는 성질인 것을 특징으로 하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.The method of claim 23, wherein the hydrophobicity is coated with a compound of octadecyldimethyl (3-trimethoxysilyl propyl) ammonium (OTC) or tridecafluorotetrahydrooctyltrimethoxysilane (DFS). Apparatus for separating microorganisms from a sample, characterized in that the property is given by.

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제23항에 있어서, 상기 아미노실란은 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)인 것을 특징으로 하는 시료로부터 미생물을 분리하기 위한 장치.24. The device of claim 23, wherein said aminosilane is polyethyleneiminetrimethoxysilane (PEIM).