KR100807196B1 - Pharmaceutical composition comprising blood shell extract - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 HL-60 세포 분화에 미치는 피조개로부터 제조된 에탄올 분획의 영향을 나타내는 도면.1 shows the effect of an ethanol fraction prepared from clams on HL-60 cell differentiation.
도 2는 피조개의 에탄올 분획 (SIII) 단독 또는 1,25-(OH)2D3 또는 all-trans RA와 조합으로 처리한 HL-60 세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 사진.Figure 2 is a photograph showing the results of morphological analysis of HL-60 cells treated with ethanol fraction (SIII) alone or in combination with 1,25- (OH) 2 D 3 or all- trans RA of the clam shell.
도 3은 분화 마커 CD11b에 대한 mAb를 사용한 세포 형광분석법에 의해 결정된 바의 피조개의 에탄올 분획(SIII)-매개 HL-60 세포 분화의 결과를 나타내는 그라프도.FIG. 3 is a graph showing the results of the ethanol fraction (SIII) -mediated HL-60 cell differentiation of crude cells as determined by cell fluorescence analysis using mAb against the differentiation marker CD11b.
도 4는 LPS-활성화된 단핵구 RAW264.7 세포주에서 피조개의 에탄올 분획(SIII)에 의한 IL-12 발현의 억제를 나타내는 도면.FIG. 4 shows inhibition of IL-12 expression by ethanol fraction (SIII) of clam in LPS-activated monocytes RAW264.7 cell line.
도 5는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화된 IL-12 p40 프로모터 구조물에서 피조개의 에탄올 분획-매개된 전사단계의 억압의 분석을 나타내는 도면.FIG. 5 shows an analysis of the suppression of the ethanol fraction-mediated transcriptional stage of the cochlea in the IL-12 p40 promoter construct activated by lipopolysaccharide.
도 6은 피조개의 에탄올 분획(SIII)-매개된 NF-κB에 의한 NF-κB 결합의 억제를 나타내는 도면.FIG. 6 shows inhibition of NF-κB binding by ethanol fraction (SIII) -mediated NF-κB in clam shells. FIG.
도 7은 피조개의 알코올 분획에 의한 EL4 흉선종 세포에서 IL4 생성의 촉진 을 나타내는 도면. FIG. 7 shows the promotion of IL4 production in EL4 thymoma cells by alcoholic fractions of clams.
도 8은 피조개의 알코올 분획(SIII 및 AII)에 의한 EL4 T 세포에서 IL-4 mRNA 발현의 증가를 나타내는 도면.FIG. 8 shows an increase in IL-4 mRNA expression in EL4 T cells by alcoholic fractions (SIII and AII) of clams.
도 9는 피조개의 알코올 분획에 의한 증가된 NF-AT DNA 결합 활성을 나타내는 도면. 9 shows increased NF-AT DNA binding activity by alcohol fraction of clam shells.
본 발명은 피조개의 근육을 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 피조개의 알코올 분획 추출물 및 그의 제조방법, 상기 추출물을 유효 성분으로 포함하는 전골수구성 백혈병 치료제 및 면역-매개 질환의 치료제에 관한 것이다. The present invention relates to an alcohol fraction extract of the shellfish obtained by treating the muscle of the shellfish with an organic solvent and activated carbon, a preparation method thereof, a promyelocytic leukemia treatment comprising the extract as an active ingredient and a therapeutic agent for immune-mediated diseases.
피조개(Blood shell 또는 blood ark shell, Scapharca broughtonii)는 경제적으로 중요한 식용 조개류로서 한국의 남부 해안에서 널리 양식되고 있다. 또한, 피조개는 이들의 근육에서 다양한 D-아미노산 및 D-아미노산 유도체의 발견에 기인하여 약리학적 연구에서 주목을 받고 있다. N-메틸-D-글루타메이트(NMDG) 및 N-메틸-L-글루타메이트(NMLG)의 존재가 피조개의 조직에서 입증되었는 바, 이는 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA)를 함유하는 것으로 알려져 있다. 이들 화합물은 이미 포유류에서 운동과다증(hypermotility)을 포함하는 신경흥분작용(neuroexcitatory activity) 및 혈청 황체형성 호르몬의 강력한 방출 작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 산성 오파인류의 하나로서 해양 동물에서 유인제 및 동해방지제로서 작 용하는 베타-알라노핀이 피조개의 내전근(adductor muscle)에서 관찰되었다. 최근, 항응고제 단백질이 피조개의 식용부에서 단리되었다. The shellfish (Blood shell or blood ark shell, Scapharca broughtonii ) is an economically important edible shellfish that is widely farmed on the southern coast of Korea. In addition, clams are attracting attention in pharmacological studies due to the discovery of various D-amino acids and D-amino acid derivatives in their muscles. The presence of N-methyl-D-glutamate (NMDG) and N-methyl-L-glutamate (NMLG) has been demonstrated in the tissue of the clam, which is known to contain N-methyl-D-aspartate (NMDA). . These compounds are already known to have neuroexcitatory activity, including hypermotility, and potent release of serum luteinizing hormone in mammals. In addition, beta-alaninopine, which acts as an attractant and anti-freeze in marine animals as one of the acidic opines, was observed in the adductor muscle of the clam shell. Recently, anticoagulant proteins have been isolated from the edible parts of the shells.
그러나, 아직까지 피조개의 추출물의 항암효과 또는 면역 질환의 치료에 가능성이 구체적으로 제시된 바는 없다.However, the possibility of anticancer effect or the treatment of immune diseases of the extract of the shellfish has not been suggested specifically.
본 발명자들은 피조개 추출물이 갖는 약리학적 기능을 탐색하고자 예의 연구한 결과, 피조개의 근육부를 유기 용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 피조개의 알코올 분획 추출물이 미분화된 전골수구세포를 분화시키고, 대식구 세포에서 비정상적으로 증가된 인터루킨-12(IL-12)의 생산을 감소시키고, 인터루킨-4(IL-4)의 생산을 증가시킴으로써 피조개 알코올 추출물이 전골수구성(promyelocytic leukemia) 백혈병 및 타입-1 사이토카인 및 타입-2 사이토카인 응답에 의해 두드러지는 면역-매개 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors earnestly studied to explore the pharmacological function of the clam extract, and the alcohol fraction extract of the clam obtained by treating the muscle part of the clam with organic solvent and activated carbon differentiates the undifferentiated promyelocytic cells and is abnormal in macrophages. By reducing the production of increased interleukin-12 (IL-12) and increasing the production of interleukin-4 (IL-4), the alcoholic extracts of the clamshell promyelocytic leukemia leukemia and
따라서, 본 발명의 목적은 피조개의 알코올 분획 추출물 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an alcoholic fraction extract of a shellfish and a method for producing the same.
본 발명의 다른 목적은 상기 피조개 추출물을 유효성분으로 포함하는 전골수구성 백혈병 치료제를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a promyelocytic leukemia therapeutic agent comprising the shell extract as an active ingredient.
본 발명의 더욱 다른 목적은 상기 피조개 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역-매개 질환의 치료제를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide an agent for the treatment of immune-mediated diseases comprising the shell extract as an active ingredient.
본 발명은, 일면에 있어서, 피조개의 알코올 추출물 및 그의 제조 방법을 제 공한다.The present invention, in one aspect, provides an alcohol extract of the shellfish and a method for producing the same.
본 발명의 피조개의 알코올 분획물의 제조 방법은 The method for producing alcoholic fractions of the clam shell of the present invention
피조개의 조직(근육)을 제거하고 빙냉 식염으로 세척한 후 동결건조시키는 단계; 상기 동결 조직을 잘게 썰어서 실온에서 에탄올/물(60: 40, v/v)에 3~10일 동안 담군 다음, 고상 잔류물을 원심분리하여 제거하고, 얻어진 에탄올-수용액을 감압하에 회전증발기로 증발시켜 에탄올을 제거하는 단계; 상기 수용액에 활성탄을 첨가하고 교반시키는 단계; 활성탄을 여과에 의해 수용액으로부터 분리하고 증류수로 세척하는 단계; 유효 물질들을 각각 80% 아세톤 수용액 및 100% 에탄올을 사용하여 활성탄으로부터 용출시키는 단계; 두 용출물을 합하여 감압하에 건조시키는 단계; 건조 잔류물을 100% 에틸 아세테이트, 100% 에탄올 및 100% 메탄올로 단계적 용출에 의해 분획화하는 단계; 및 얻어진 에탄올 및 메탄올 분획 각각을 농축시켜 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 포함한다.Removing the tissue (muscle) of the clam, washing with ice-cold saline, and lyophilizing; The frozen tissue was chopped and soaked in ethanol / water (60: 40, v / v) for 3-10 days at room temperature, then the solid residue was removed by centrifugation, and the obtained ethanol-aqueous solution was evaporated by a rotary evaporator under reduced pressure. To remove ethanol; Adding and stirring activated carbon to the aqueous solution; Separating the activated carbon from the aqueous solution by filtration and washing with distilled water; Eluting the active materials from the activated carbon using 80% aqueous acetone solution and 100% ethanol, respectively; Combining the two eluates and drying under reduced pressure; Fractionating the dry residue by step eluting with 100% ethyl acetate, 100% ethanol and 100% methanol; And concentrating each of the obtained ethanol and methanol fractions and purifying by silica-gel column chromatography.
본 발명의 피조개의 추출에 사용된 바의 알코올은 특히 제한될 필요는 없으나 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올이 적합하다.The alcohol as used for extraction of the clams of the present invention need not be particularly limited, but lower alcohols such as methanol and ethanol are suitable.
본 발명은, 추가의 일면에 있어서, 상기 피조개의 알코올 추출물의 용도, 특히 전골수구성 백혈병 등의 종양의 치료 용도 및 면역-매개 질환의 치료제로서의 용도를 제공한다. In a further aspect, the present invention provides the use of the alcohol extract of the clam shell, in particular, the use of a tumor such as promyelocytic leukemia and the use as a therapeutic agent for immune-mediated diseases.
본 발명에 따른 전골수구성 백혈병의 치료제는 피조개의 알코올 추출물을 유효 성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.The therapeutic agent for promyelocytic leukemia according to the present invention comprises an alcohol extract of clam shellfish as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명자들은 피조개에서 추출된 물질이 생리활성에 미치는 영향을 연구하 던 중, 상기 알코올 분획 추출물이 백혈병 및 면역계 질환에 영향을 미칠 수 있다는 점에 주목하게 되었는데, 전골수구세포(promyelocyte)의 미분화에 의하여 유발되는 전골수구성 백혈병에 촛점을 맞추어 연구를 진행하던 중, 피조개 추출물이 미분화된 전골수구세포를 분화시킬 수 있음을 알게 되었다. 즉, 전골수구는 정상적으로 분화되어, 단식구세포, 대식구세포, 과립구세포 등으로 분화되는데, 상기 전골수구가 분화되지 못하면, 전골수구성 백혈병을 유발시킬 수 있다. 이에, 본 발명자들은 피조개로 부터 유기용매 및 활성탄을 처리하여 수득한 피조개 추출물을 제조하고, 이를 사람의 전골수구성백혈병 세포주 HL-60에 처리하였다. 그 결과, 피조개 추출물은 단독적으로 상기 세포주의 분화를 유도하지 못하였다. 그러나, 상기 세포주의 분화를 유도하는 물질로 알려진 1,25-디하이드록시 비타민 D3(1,25-(OH)2D3) 또는 레티노인산(all-trans retinoic acid, ATRA)과 피조개 알코올 분획 추출물을 혼합하여 사용할 경우, 1,25-(OH)2D3 또는 ATRA의 분화유도 효과를 증폭시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 피조개 추출물을 1,25-(OH)2D3 또는 ATRA와 함께 HL-60에 처리하면, 분화된 세포의 비율이 급격히 증가되고, 분화된 세포에서 발현되는 세포표면 항원의 발현량이 급격히 증가됨을 알 수 있었다. The inventors of the present invention, while studying the effect on the biological activity of the material extracted from the clam, it has been noted that the alcohol fraction extract may affect the leukemia and immune system diseases, to the differentiation of promyelocytes (promyelocyte) While focusing on the promyelocytic leukemia induced by the study, it was found that the clam extract can differentiate the undifferentiated promyeloid cells. In other words, the promyelocytic differentiation is normally differentiated into single cells, macrophages, granulocyte cells, etc., if the promyeloblasts are not differentiated, can cause promyelocytic leukemia. Therefore, the present inventors prepared the shell extract obtained by treating the organic solvent and activated carbon from the shell, and treated the human promyelocytic leukemia cell line HL-60. As a result, the clam extract alone did not induce differentiation of the cell line. However, 1,25-dihydroxy vitamin D 3 (1,25- (OH) 2 D 3 ) or all-trans retinoic acid (ATRA) and clam alcohol fraction extracts known as substances which induce differentiation of the cell line When used in combination, it was confirmed that the differentiation-inducing effect of 1,25- (OH) 2 D 3 or ATRA can be amplified. That is, when the clam extract is treated with HL-60 together with 1,25- (OH) 2 D 3 or ATRA, the ratio of differentiated cells is rapidly increased, and the expression level of the cell surface antigen expressed in the differentiated cells is rapidly increased. It was found to increase.
인간의 전골수구성 백혈병 HL60 세포들은 각각 1,25-디히드록시비타민 D3[1,25-(OH)2D3] 또는 all-trans RA로 처리했을 때 단구성 계통 및 과립구형 계통으로 분화된다. 이것은 시험관내(in vitro) 세포 분화를 연구하는데 뛰어난 모델 시스템으로 이용되고 있는데, 1,25-(OH)2D3 및 all-transRA를 선택한 이유는 HL-60 세포에서 분화의 내인성 촉진제로서 널리 이용되기 때문이다. 또한, all-trans RA는 급성 전골수구성 백혈병의 치료에 널리 사용되고, 1,25-(OH)2D3을 포함하는 비타민 D3의 유사체는 건선의 치료에 임상적으로 이용되고 있다.Human promyelocytic leukemia HL60 cells differentiate into monocytic and granulocytic lineages when treated with 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25- (OH) 2 D 3 ] or all- trans RA, respectively . It is used as an excellent model system for studying in vitro cell differentiation. The reason for choosing 1,25- (OH) 2 D 3 and all- trans RA is widely used as an endogenous promoter of differentiation in HL-60 cells. Because it is used. In addition, all- trans RA is widely used for the treatment of acute promyelocytic leukemia, and analogs of vitamin D3 including 1,25- (OH) 2 D 3 have been clinically used for the treatment of psoriasis.
MTT 및 설포로다민(sulforhodamine) B 에세이에 의해 입증된 바와 같이, 피조개의 에탄올 분획 2.5~20 ㎍/ml을 HL-60 세포에 72 시간 동안 처리한 결과 세포 증식이 억제되었고 세포분화에서 20%의 증가가 유도되었다. 흥미롭게도, 피조개의 에탄올 분획을 5 nM 1,25-(OH)2D3 또는 50 nM all-trans RA 중의 하나와 혼합하였을 때 HL-60 세포 분화의 상승적 유도가 관찰되었다. 플로우 사이토메트릭 분석 및 형태학적 연구에 의해 피조개의 에탄올 분획과 1,25-(OH)2D3 all-trans RA 중의 하나와의 배합물이 백혈구 세포 분화를 자극하였음이 밝혀졌다. As evidenced by the MTT and sulforhodamine B assays, 2.5-20 μg / ml of the ethanol fraction of the shellfish was treated with HL-60 cells for 72 hours to inhibit cell proliferation and 20% in cell differentiation. An increase was induced. Interestingly, synergistic induction of HL-60 cell differentiation was observed when the ethanol fraction of the shellfish was mixed with either 5
많은 종래의 연구에 의해 일부 화합물 조합이 LH-60 세포 분화에 부가적 또는 상승 작용을 발휘하는 것이 밝혀졌다. 이들 조합은 부티레이트 및 all-trans RA 또는 헥사플루오로-비타민 D3, 비타민 D3 및 인터페론-
본 발명에서 제시된 결과는 피조개 추출물과 1,25-(OH)2D3, 또는 알코올 분획(SIII) 및 all-trans RA의 조합으로 환자를 치료하는 것은 1,25-(OH)2D3 또는 all-transRA 단독에 비해 독성이 적고 더 큰 치료 반응이 초래될 수 있음을 의미한다. 임상적 연구는 특히 공지의 부작용을 유발하지 않는 에탄올 분획(SIII)의 농도에서 이러한 치료제의 가능성을 평가하는데 필요하다. 서컴이노이드류(curcuminoids), 토코페롤류, 카로테노이드류, 및 기타 식용가능한 식물 등의 많은 식품 화합물은, 부분적으로는 RAs 및 비타민 비타민 D3 등의 내인성으로(endogenously) 생성된 분화의 자극인자와 함께 협력함으로써, 인간암을 예방할 수 있다. 피부학적 연구에 의하면 많은 양의 과일 및 야채를 섭취하는 사람들이 수많은 종류의 암에 대한 낮은 위험성이 낮음을 제시한다. The results presented in the present invention indicate that treatment of patients with clam extract and 1,25- (OH) 2 D 3 , or a combination of alcohol fraction (SIII) and all- trans RA, may be described as 1,25- (OH) 2 D 3 or This means less toxicity and greater therapeutic response than all- trans RA alone. Clinical studies are needed to evaluate the likelihood of such therapeutic agents, particularly at concentrations of ethanol fraction (SIII) that do not cause known side effects. Many food compounds, such as circuminoids, tocopherols, carotenoids, and other edible plants, are partly accompanied by endogenously produced differentiation stimulators such as RAs and vitamins vitamin D 3 . By working together, human cancer can be prevented. Dermatological studies suggest that people who eat large amounts of fruits and vegetables have a low risk of many types of cancer.
결론적으로, 피조개의 근육 추출물은 1,25-(OH)2D3- 및 all-trans RA-유발 HL-60 세포 분화를 증강시킨다. 이들 결과는 상기 알코올 추출 분획(SIII)의 항-발암 효과를 포함하는 일부 알려진 작용들을 설명할 수 있으며, 인간의 전골수구성 백혈병 등의 종양성 질환의 치료에 피조개의 알코올 분획의 가능한 용도를 제시한다.In conclusion, muscle extracts of clamshells enhance 1,25- (OH) 2 D 3 -and all- trans RA-induced HL-60 cell differentiation. These results may explain some known actions, including the anti-carcinogenic effect of the alcohol extraction fraction (SIII), suggesting the possible use of the clam alcohol fraction in the treatment of tumorous diseases such as human promyelocytic leukemia. do.
본 발명은 추가의 일면에서 상기 피조개의 알코올 분획의 면역질환, 특히 타입-1 사이토카인 및 타입-2 사이토카인 응답에 의해 우세하게 되는 면역-매개 질환의 치료제로서의 용도를 제공한다.In a further aspect the present invention provides the use of an alcoholic disease of the clam alcohol fraction as an agent for the treatment of immune-mediated diseases, in particular predominantly by
본 발명의 면역-매개 질환의 치료제는 피조개 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.The therapeutic agent of the immune-mediated disease of the present invention comprises a shell extract as an active ingredient, and includes a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명에 따른 연구 결과에 의하면 상기 피조개 추출물이, 대식구 세포에서 비정상적으로 증가된 인터루킨-12(IL-12)의 생산을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다. 지금까지의 연구에 의하면, 대식세포는 일정 수준의 IL-12를 생산하는데, 대식세포에 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하면, IL-12의 생산량이 급격히 증가되고, 과다한 양의 IL-12는 자가면역질환을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, LPS가 처리된 대식구세포에 피조개의 알코올 분획을 처리하면, IL-4의 생산량은 감소되지 않으나, IL-12의 생산량만이 급격히 감소되며, 세포의 활성이 감소되지도 않음을 알 수 있었다. According to the results of the present invention, it was found that the clam extract can reduce the production of abnormally increased interleukin-12 (IL-12) in macrophages. Previous studies have shown that macrophages produce a certain level of IL-12. When LPS (lipopolysaccharide) is treated with macrophages, the production of IL-12 is dramatically increased, and excessive amounts of IL-12 are autoimmune. It is known to cause disease. However, the treatment of the alcoholic fraction of the algae in LPS-treated macrophages did not reduce the production of IL-4, but only reduced the production of IL-12, and did not reduce the activity of the cells. .
인터류킨-12(IL-12)는 두개의 개별 유전자에 의해 암호화되는 35(p35) 및 40(p40) kDa의 두 개의 이황화물-연결된 서브유닛으로 구성된 헤테로다이머형 사이토카인이다. IL-12의 유도 발현(inducible expression)은 다양한 미생물 뿐만 아니라 이들의 생성물에 의한 자극에 반응하여 식세포 및 기타 항원-제시 세포에서 입증된 바 있다. p40 서브유닛의 발현은 고도로 유도가능하며, 일차적으로는 전사 레벨에서 조절된다. 두개의 주된 조절 부위가 동정되었으며, 이들은 전사 인자의 Ets 및 NF-κB 패밀리에 속하는 유도가능한 단백질에 결합한다. Interleukin-12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine consisting of two disulfide-linked subunits of 35 (p35) and 40 (p40) kDa encoded by two separate genes. Inducible expression of IL-12 has been demonstrated in phagocytes and other antigen-presenting cells in response to stimulation by various microorganisms as well as their products. Expression of the p40 subunit is highly inducible and is primarily regulated at the level of transcription. Two major regulatory sites have been identified, which bind to inducible proteins belonging to the Ets and NF-κB family of transcription factors.
IL-12는 이들의 세포독성을 증대시키는 인터페론-γ의 생성을 유도함으로서 및 이들의 증식 잠재력을 증대시킴으로써 주로 T 및 천연 킬러 세포를 통하여 다수의 생물학적 기능을 발휘한다. IL-12 생성은 T 헬퍼 타입 1 세포의 분화 및 세포-매개 면역 반응에 필수불가결하다. 타입-1 당뇨병, 다중 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 보울 질환, 및 급성 이식-대-숙주(graft-versus-host) 등의 Th1-매개 자가면역 질환의 설치류 모델의 발병학에 있어서 IL-12의 결정적인 역할에 대한 최근의 증거들이 주목되고 있다. 따라서, IL-12 생성의 약리학적 제어는 타입-1 사이토카인 응답에 의해 우세한 특정 면역 매개 질환을 조절하는데 있어서 핵심적인 방법론일 수 있다.IL-12 exerts a number of biological functions, primarily through T and natural killer cells, by inducing the production of interferon- [gamma] which enhances their cytotoxicity and by increasing their proliferative potential. IL-12 production is indispensable for the differentiation and T cell-mediated immune response of
본 발명에서는 또한 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극시킨 마우스 대식구로부터 IL-12의 생성에 미치는 피조개의 에탄올 분획의 영향을 조사한 결과, 피조개로부터 제조된 에탄올 분획(SIII)은 RAW264.7 단핵구 세포주로부터 LPS-유도 IL-12 생성을 투여량 의존 방식으로 강력히 억제하였다. 이 억제는 적어도 부분적으로는 NF-κB 결합 활성의 하향조절(down regulation)에 의존한다. The present invention also examined the effect of ethanol fraction of clam shellfish on IL-12 production from mouse macrophages stimulated with lipopolysaccharide (LPS). As a result, ethanol fraction (SIII) prepared from clamshell shells was isolated from RAW264.7 monocyte cell line. LPS-induced IL-12 production was strongly inhibited in a dose dependent manner. This inhibition depends at least in part on down regulation of NF-κB binding activity.
IL-12 유전자 프로모터 활성화에 미치는 에탄올 분획(SIII)의 영향을 RAW264.7 세포를 IL-12 유전자 프로모터/루시퍼라제(luciferase) 구조물로 형질감염시킴으로써 분석하였다. 이 억압효과는 NF-κB에 대한 결합 부위를 포함하는 IL-12 유전자 프로모터 내의 영역에 위치하였다(mapped). 더욱이, LPS에 의한 대식구의 활성화는 NF-κB 부위에 대한 현저히 증가된 결합 활성을 초래하였으며, 피조개의 에탄올 분획의 첨가시 상당히 증가하였는데 이는 피조개의 에탄올 분획이 NF-κ B 결합 활성의 억제를 통하여 LPS-활성화된 대식구에서 IL-12 생성을 억제하였음을 의미한다.The effect of ethanol fraction (SIII) on IL-12 gene promoter activation was analyzed by transfecting RAW264.7 cells with IL-12 gene promoter / luciferase constructs. This suppressive effect was mapped to a region within the IL-12 gene promoter that contains a binding site for NF-κB. Moreover, activation of macrophages by LPS resulted in significantly increased binding activity to the NF-κB site, and significantly increased upon the addition of the crude ethanol fraction, through which inhibition of the crude ethanol fraction by the inhibition of NF-κB binding activity. Inhibition of IL-12 production in LPS-activated macrophages.
결론적으로, 이들 결과는 피조개의 에탄올 추출물이 IL-12 p40-κB 부위에 대한 NF-κB-매개된 결합의 하향조절을 통하여 LPS-자극된 대식구에서 IL-12 생성을 억제하는 것을 의미한다. 대식구에서 IL12 생성의 에탄올 분획(SIII) 매개된 억제는 타입-1 사이토카인 반응에 의해 두드러지는 특정 면역-매개 질환을 치료함에 있어서 피조개의 가능한 용도를 제시한다.In conclusion, these results indicate that crude ethanol extracts inhibit IL-12 production in LPS-stimulated macrophages through downregulation of NF-κB-mediated binding to IL-12 p40-κB sites. Ethanol fraction (SIII) mediated inhibition of IL12 production in macrophages suggests possible uses of clams in treating certain immune-mediated diseases that are prominent by
추가의 실시 형태에 있어서, 본 발명자들은 마우스 EL4 T 세포로부터 IL-4 생산에 미치는 피조개의 알코올 분획의 영향을 연구하였다. 이 실시형태에서 피조개의 두 알코올 분획(SIII 및 AII)은 농도 의존적인 방식으로 IL-4 생성에 자극 효과를 갖는다. 이 자극은 적어도 부분적으로는 NF-AT DNA 결합 활성에 의존한다.In a further embodiment, we studied the effect of the clam alcohol fraction on IL-4 production from mouse EL4 T cells. In this embodiment the two alcohol fractions (SIII and AII) of the clam have a stimulatory effect on IL-4 production in a concentration dependent manner. This stimulation depends at least in part on NF-AT DNA binding activity.
상기 SIII 분획 그 자체는 EL4 T 세포에 의해 IL-4 생성 및 IL-4 mRNA 발현을 투여량 의존 방식으로 상당히 유도하였다. 한편, 상기 AII 분획은 PMA-활성화된 EL4 T 세포에서 IL-4 발현을 증대시킨 반면에, AII 분획 그 자체는 증대 시키지 않았다. 더욱이, IL-4 생산에 대한 알코올 분획의 자극 효과는 NF-AT 결합 활성의 증가와 상당히 밀접하게 관련되었는데, 이는 피조개의 알코올 분획물이 EL4 T 흉선종(thymoma) 세포에서 증가된 NF-AT DNA 결합 활성을 통하여IL-4 생성을 자극하였음을 나타낸다.The SIII fraction itself induced significantly IL-4 production and IL-4 mRNA expression by EL4 T cells in a dose dependent manner. On the other hand, the AII fraction increased IL-4 expression in PMA-activated EL4 T cells, while the AII fraction itself did not. Moreover, the stimulatory effect of the alcohol fraction on IL-4 production was closely related to the increase in NF-AT binding activity, in which alcoholic fractions of the clam shellfish increased NF-AT DNA binding activity in EL4 T thymoma cells. Stimulated IL-4 production.
T 세포 및 비만 세포(mast cell)에 의해 분비되는 20-kDa 폴리펩티드인 인터류킨-4 (IL-4)는 조혈세포 상에 단면발현성 효과를 가지고 있다. 인터류킨-4 (IL- 4)는 유도가능한 일산화질소 합성효소 (iNOS) 유도 등을 포함하는 감마 인터페론 (IFN-γ)에 의해 매개되는 Th2 응답의 발생 및 Th1 효과기(effector) 메카니즘의 블록킹을 포함하여 T-세포 생물학의 일부 영역에서 중요한 역할을 한다. 더욱이, IL-4는 아르기나아제(arginase) 발현을 상향 조절함으로서(upregulating) 질소산화물 생성을 억제함으로서 질소산화물의 전구체인 L-아르기닌의 택일적인 대사 경로를 제공한다. 천식 및 기타 알레르기성 질환에서의 염증은 면역글로불린E (IgE)의 과도한 생성 및 백혈구, 특히 호산구의 유입에 의해 특징화된다. 인터류킨-4 및 IL-5는 각각 생성 및 호산구과다증에 필수적이고, 매스트 세포에 의해 알레르기성 조건에서 생성된다. IL-4는 또한 염증 부위에 호산구를 끌어들이는데 중요하다. 이는 세포 표면 부착 분자 VCAM-1의 국부적 내피 발현을 상향 조절함으로써 또는 호산구 주화성 인자 에오탁신(eotaxin)의 생성을 유도함으로써 얻어질 수 있다.Interleukin-4 (IL-4), a 20-kDa polypeptide secreted by T cells and mast cells, has a cross-sectional effect on hematopoietic cells. Interleukin-4 (IL-4) includes the generation of Th2 responses mediated by gamma interferon (IFN-γ), including the inducible nitric oxide synthase (iNOS) induction, and the blocking of Th1 effector mechanisms. It plays an important role in some areas of T-cell biology. Moreover, IL-4 provides an alternative metabolic pathway of L-arginine, a precursor of nitric oxide, by inhibiting nitric oxide production by upregulating arginase expression. Inflammation in asthma and other allergic diseases is characterized by excessive production of immunoglobulin E (IgE) and influx of leukocytes, in particular eosinophils. Interleukin-4 and IL-5 are essential for production and eosinophilia, respectively, and are produced in allergic conditions by mast cells. IL-4 is also important for attracting eosinophils to the site of inflammation. This can be obtained by upregulating local endothelial expression of the cell surface adhesion molecule VCAM-1 or by inducing the production of eosinophil chemotactic factor eotaxin.
결론적으로, 이들 결과는 피조개의 알코올 분획이 EL4 T 세포에서 IL-4 생성을 촉진함을 의미한다. IL-4 생성에 미치는 알코올 분획의 자극 효과는 NF-AT 결합 활성의 증가와 밀접하게 연관되어 있는데, 상기 피조개의 알코올 분획이 증가된 NF-AT DNA 결합 활성을 거쳐 EL4 T 흉선종에서 IL-4 생성을 촉진하였음을 의미한다. EL4 T 세포에서 IL-4 생성의 피조개-매개 자극은 타입-2 사이토카인 응답에 의해 우세해지는 특정 면역-매개 질환을 조절하는데 있어서 피조개의 가능한 용도를 제시한다.In conclusion, these results indicate that the alcoholic fraction of the shellfish promotes IL-4 production in EL4 T cells. The stimulatory effect of the alcohol fraction on IL-4 production is closely associated with an increase in NF-AT binding activity. The alcoholic fraction of the cohort of seashells undergoes increased NF-AT DNA binding activity to produce IL-4 in EL4 T thymoma. It means that it promoted. Shell-mediated stimulation of IL-4 production in EL4 T cells suggests possible use of shellfish in regulating certain immune-mediated diseases predominantly by type 2 cytokine responses.
본 발명에 따른 전골수구성 백혈병 및 자가면역질환 치료제의 유효성분으로 함유되는 피조개 추출물은 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 비경구제의 형태로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.The shellfish extract as an active ingredient of the pro-myeloid leukemia and autoimmune disease therapeutic agent according to the present invention is a pharmaceutically acceptable binder (eg, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropyl cellulose), disintegrant (eg, carboxymethyl Cellulose calcium, sodium starch glycolate), diluents (e.g. corn starch, lactose, soybean oil, crystalline cellulose, mannitol), glidants (e.g. magnesium stearate, talc), sweeteners (e.g. white sugar, fructose, sorbitol, aspartame), Stabilizers (sodium carboxymethylcellulose, alpha or beta cyclodextrins, vitamin C, citric acid, white lead), preservatives (e.g. methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, sodium benzoate) and flavorings (e.g. ethyl vanillin, masking flavor, Menthol flavono, herbal flavor) can be prepared into pharmaceutical preparations such as tablets, capsules, soft capsules, solutions, ointments or injections. It may be desirable to administer the pharmaceutical compositions of the invention in the form of parenterals.
<피조개 추출물의 급성독성실험><Acute toxicity test of shellfish extract>
6 내지 7주령 된 비설치류 비글견을 대상으로 본 발명의 피조개의 알코올 분획물을 경구 투여하여 24시간 내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 피조개 추출물은 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 전골수구성 백혈병 및 자가면역질환의 치료제로서 생체내에 안전하게 투여할 수 있다. Non-rodent beagle dogs aged 6 to 7 weeks were administered orally with alcohol fractions of the cohort of the present invention and examined for mortality within 24 hours, wherein the females were 6 to 8 kg and the males were 7 to 9 kg. Eight individuals were used each. As a result, dead individuals do not occur up to 5 g / kg, the shellfish extract of the present invention is safe enough to observe acute toxicity even up to 5 g per kg, it is safely administered in vivo as a treatment for promyelocytic leukemia and autoimmune diseases can do.
<유효량><Effective amount>
본 발명에 있어서의 약제조성물 중 유효성분인 피조개 추출물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 10 내지 2,000㎎을 일일 1회 이상 복용할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다. The dosage of the shellfish extract, which is an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention, may be 10 to 2,000 mg / kg body weight or more once per day, depending on the age, sex, symptoms, administration method or prevention purpose of the patient. Dosage levels for patients with specific symptoms may vary by those skilled in the art depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, severity of disease, and the like.
<실시예><Example>
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
본 실시예에서 사용되는 HL-60 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 입수하였고, 10% 태아 송아지 혈청(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 보충한 RPMI-1640 배지에 보관하였다. RAW264.7 세포들은 10% 태아 송아지 혈청(GIBCO BRL, Grand Island, NY)으로 보충한 RPMI 1640에서 37℃에서 5% CO2 습도가 있는 공기 중에 배양하였다. 마우스로부터 비장 세포 집단 및 대식구는 10% 태아 송아지 혈청 및 항생물질을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 유지시켰다. EL4 흉선종 세포의 배양물은 10% 태아 송아지 혈청(GIBCO BRL, Grand Island, NY) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640 배지 중에서 37℃에서 5% CO2 습기의 공기 분위기 중에 보관하였다. 재조합 IL-4는 PharMingen(Sandiego, CA)로부터 구매하였다. 1,25-디히드록시비타 민 D3, all-trans RA, Giemsa 염색용액, 에탄올, 무메탄올 파라포름알데히드, LPS (E. coli 0111:B4 유래), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 기타 모든 시약은 시그마사(Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. The HL-60 cell line used in this example was obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, and RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) Stored in medium. RAW264.7 cells were cultured in air with 5% CO 2 humidity at 37 ° C. at RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum (GIBCO BRL, Grand Island, NY). Spleen cell populations and macrophages from mice were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum and antibiotics. Cultures of EL4 thymoma cells were stored in an air atmosphere of 5% CO 2 humidity at 37 ° C. in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (GIBCO BRL, Grand Island, NY) and 1% penicillin / streptomycin. Recombinant IL-4 was purchased from PharMingen (Sandiego, Calif.). 1,25-dihydroxyvitamin D3, all- trans RA, Giemsa staining solution, ethanol, methanol paraformaldehyde, LPS (from E. coli 0111: B4), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA ) And all other reagents were purchased from Sigma (Sigma, St. Louis, MO, USA).
후술하는 실시예에서 사용된 방법 및 절차를 간단히 설명한다.The method and procedure used in the following examples are briefly described.
<분화유도제의 제조><Production of Differentiation Inducing Agent>
1 mM 1,25-(OH)2D3 및 1 mM all-trans RA의 원액을 순수한 에탄올(Hayman, UK)에 녹여서 -70℃에서 저장하였다. 피조개의 에탄올 분획 또한 에탄올에 녹여 40 mg/ml의 원액으로 만들었다. 이 용액을 성장배지로 최소 1000배 희석하여 에탄올의 최종 농도가 HL-60 세포의 분화 및 증식에 영향을 미치지 않도록 하였다. 모든 조작은 부드러운 빛에서 수행하였다.Stock solutions of 1
<세포 생존능 및 증식의 결정>Determination of Cell Viability and Proliferation
세포 생존능은 트립판 블루 배제 에세이에 의해 결정하였다(참조문헌: COLIGAN, J.E., KRUISBECK, A.M., MARGULIES, D.H., SHEVACH, E.M, and STROBER, W. 1995. Current Protocols in Immunology (2nd ed.) Wiley, New York.). 생존능은 전체 세포 집단 중의 살아있는 세포의 백분율로 계산하였다. 세포 증식은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl-tetrazolium) 에세이를 사용하여 결정하였다. 이를 간단히 요약하자면, 각각의 처리 후, MTT (5 mg/ml) 10 ㎕을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션시킨 후 생존 세포의 결정을 이소프로판올 중의 0.04N HCl 100 ㎕에 녹였다. 각 웰의 흡광도는 카이네틱 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 판독하였다.Cell viability was determined by trypan blue exclusion assays (COLIGAN, JE, KRUISBECK, AM, MARGULIES, DH, SHEVACH, EM, and STROBER, W. 1995. Current Protocols in Immunology (2nd ed.) Wiley, New York.). Viability was calculated as the percentage of viable cells in the total cell population. Cell proliferation was determined using an MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium) assay. To summarize this briefly, after each treatment, 10 μl of MTT (5 mg / ml) was added to each well of a 96-well plate. After incubation at 37 ° C. for 4 hours, the crystals of viable cells were dissolved in 100 μl of 0.04N HCl in isopropanol. The absorbance of each well was read at 540 nm using a kinetic micro plate reader.
<면역형광염색 및 세포형광분석법><Immunofluorescence Staining and Cellular Fluorescence>
정량적 면역형광 측정은 공지된 바의 다변수 데이터 습득(multi-parameter data acquisition) 및 디스플레이 시스템 (MDADS)이 장착된 플로우 사이토플로우 그래프(Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA)에서 수행하였다(참조문헌: KIM, T.S., XU, W.S., SUN, T. and COHEN, E.P. 1995. Immunization with interleukin-2/interferon-gamma double cytokine-secreting allogeneic fibroblasts prolongs the survival of mice with melanoma. Melanoma Res. 5, 217~227). 이를 간단히 요약하자면, 단일 세포 현탁액을 여러 가지 배양물로부터 수집하여 빙냉 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 이어서, 플루오레세인 이소치오시아네이트((FITC)-공액 항-인간 CD11b 단일 클론 항체들(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)을 첨가한 다음 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포들을 PBS로 세척하고 1% 파라포름알데하이드를 함유하는 PBS에 고정하고 세포 형광 분석을 수행하였다. 배경 염색은 특정 항체로 염색된 세포에 대하여 염색된 세포를 FITC-공액 아이소타입 대조군 단일 클론 항체로 대체함으로써 결정하였다. 단일 변수 형광 히스토그램은 최소 1 x 104 세포를 분석함으로써 발생되었다.Quantitative immunofluorescence measurements were performed on flow cytographs (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA) equipped with known multi-parameter data acquisition and display systems (MDADS) (reference: KIM, TS, XU, WS, SUN, T. and COHEN, EP 1995.Immunization with interleukin-2 / interferon-gamma double cytokine-secreting allogeneic fibroblasts prolongs the survival of mice with melanoma.Melanoma Res. 5, 217--227) . To summarize briefly, single cell suspensions were collected from various cultures and washed twice with ice cold phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). Fluorescein isothiocyanate ((FITC) -conjugated anti-human CD11b monoclonal antibodies (Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA) was then added and then incubated at 4 ° C. for 1 hour. Cells were washed with PBS, fixed in PBS containing 1% paraformaldehyde and subjected to cell fluorescence analysis Background staining was performed on cells stained with specific antibodies with FITC-conjugated isotype control monoclonal antibody. Single variable fluorescence histograms were generated by analyzing at least 1 × 10 4 cells.
<세포 분화의 결정>Determination of Cell Differentiation
HL-60 세포 분화는 공지된 바의 니트로블루 테트라졸륨(NBT) 환원 에세이에 의해 산정하였다(참조문헌: COLLINS, S.J., RUSCETTI, F.W., GALLAGHER, R.E. and GALLO, R.C. 1979. Normal functional characteristics of cultured human promyelocytic leukemia cells (HL-60) after induction of differentiation by dimethylsulfoxide. J. Exp. Med. 149, 969~974.). 이 에세이는 조직 플라스미노겐 활성화제로 자극시 식세포가 수퍼옥사이드를 생산하는 능력에 기초한다. 이 에세이를 위하여, 2 x 105 세포를 원심분리에 의해 수확하여 1 ng/ml의 바로 준비한 희석된 플라스미노겐 활성화제를 함유한 PBS에 용해된 0.2% 니트로불루 테트라졸륨 동일 부피로 37℃에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 사이토스핀 슬라이드를 준비하여 PMA-자극시킨 호흡폭발반응(respiratory burst)의 지표인 암청색 니트로불루 디포르마잔 침적물에 대해서 검사하였다. 최소 200개의 세포가 각 시험에서 확인되었다.HL-60 cell differentiation was estimated by known nitroblue tetrazolium (NBT) reduction assays (COLLINS, SJ, RUSCETTI, FW, GALLAGHER, RE and GALLO, RC 1979. Normal functional characteristics of cultured human promyelocytic leukemia cells (HL-60) after induction of differentiation by dimethylsulfoxide.J.Exp. Med. 149, 969-974.). This assay is based on the ability of phagocytes to produce superoxide upon stimulation with tissue plasminogen activator. For this assay, 2 x 10 5 cells were harvested by centrifugation at 37 ° C. in an equal volume of 0.2% nitrobulo tetrazolium dissolved in PBS containing 1 ng / ml of immediately prepared diluted plasminogen activator. Incubate in the dark for 30 minutes. Cytospin slides were prepared and examined for dark blue nitrobulo diformazan deposits, which are indicative of PMA-stimulated respiratory bursts. At least 200 cells were identified in each test.
<IL-12 p40 프로모터 제조 및 일시적인 형질감염><IL-12 p40 Promoter Preparation and Transient Transfection>
pXP2로부터의 쥐의 IL-12 p40 프로모터의 -689/+98 단편(참조문헌: Ma, X., Chow, J. M., Gri ,G., Carra, G., Gerosa, F., Wolf, S. F., Dzialo, R., and Trinchieri, G..,The interleukin 12 p40 gene promoter is primed by interferon-in monocytic cells. J. Exp. Med., 183, 147-157 (1996))을 pGL3-기본 루시퍼라아제 벡터(Promega, Madison, WI)의 KpnI/XhoI 부위 내에 서브클로닝하였다. 모든 결실 돌연변이는 BamHI 부위를 포함하는 상부 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 발생시켰다. 링커-스캐닝 돌연변이는 NF-κB 부위에 대한 돌연변이된 서열을 함유하는 겹침(overlapping) 내부 프라이머를 사용하여 2단계 PCR 절차에 의해 발생시켰다. 형질감염을 위하여, 세포들을 10% 태아 송아지 혈청을 보충한 배지로 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 성장시키고, 제조원의 프로토컬에 따라 수퍼펙트(Superfect)의 존재하에서 상기 제시된 플라스미드로 형질감염시켰다(Qiagen, Valencia, CA). 12시간 후, 세포들을 세척하고 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 DMEM으로 재차 성장시켰다. 24시간 후에 세포들을 수확하고 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 결과는 LacZ 발현으로 표준화시켰다.-689 / + 98 fragments of the mouse IL-12 p40 promoter from pXP2 (Ref. Ma, X., Chow, JM, Gri, G., Carra, G., Gerosa, F., Wolf, SF, Dzialo , R., and Trinchieri, G .., The
<IL-12 에세이><IL-12 essay>
RAW264.7 세포 배양 상층액 중의 IL-12의 양은 IL-12 p40에 대해 특이적인 단일 클론 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정하였다(참조문헌: Kang, B.Y., Chung, S. W., Cho, D., and Kim, T. S., Involvement of p38 mitogen-activated proteinkinase in the induction of interleukin-12 p40 production in mouse macrophages by berberine, a benzodioxoloquinolizine alkaloid. Biochem. Pharmacol. 63, 1901-1910 (2002)). 플레이트 코팅용 단일 클론 항체 및 비오티닐화 2차 단일 클론 항체(PharMingen, San Diego, CA로부터 입수)는 C17.8 및 C15.6이었다. 표준 곡선은 재조합 IL-12를 사용하여 발생시켰고 검출의 하한은 30 pg/ml이었다.The amount of IL-12 in RAW264.7 cell culture supernatants was determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using monoclonal antibodies specific for IL-12 p40 (Kang, BY, Chung, SW, Cho, D., and Kim , TS, Involvement of p38 mitogen-activated proteinkinase in the induction of interleukin-12 p40 production in mouse macrophages by berberine, a benzodioxoloquinolizine alkaloid. Biochem. Pharmacol. 63, 1901-1910 (2002) ). Monoclonal antibodies and biotinylated secondary monoclonal antibodies (from PharMingen, San Diego, Calif.) For plate coating were C17.8 and C15.6. Standard curves were generated using recombinant IL-12 and the lower limit of detection was 30 pg / ml.
<IL-4 에세이><IL-4 Essay>
EL4 흉선종 세포 배양 상층액 중의 IL-4의 양은 공지된 IL-4에 특이적인 단일 클론 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정하였다(참조문헌: Chung, S. W., B. W. Kang & T. S. Kim. 2003. Inhibition of interleukin-4 production in CD4+ T cells by peroxisome proliferators-activated receptor-γ(PPAR-γ) ligands: involvement of physical association between PPAR-γ and the nuclear factor of activated T cells transcription factor. Mol. Pharmacol. 64: 1169-1179). 쥐의 재조합 IL-4는 상층액 중의 IL-4 레벨의 정량화를 위한 표준으로 사용하였다. 플레이트 코팅용 단일 클론 항체 및 비오티닐화 2차 단일 클론 항체(PharMingen, San Diego, CA로부터 입수)는 11B11 및 BDV6이었다. 표준 곡선은 재조합 IL-４를 사용하여 발생시켰고 검출의 하한은 30 pg/ml이었다.The amount of IL-4 in EL4 thymoma cell culture supernatants was determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using known monoclonal antibodies specific for IL-4 (Chung, SW, BW Kang & TS Kim. 2003. Inhibition of interleukin-4 production in CD4 + T cells by peroxisome proliferators-activated receptor-γ (PPAR-γ) ligands: involvement of physical association between PPAR-γ and the nuclear factor of activated T cells transcription factor.Mol Pharmacol. 64: 1169-1179). Rat recombinant IL-4 was used as a standard for quantification of IL-4 levels in supernatants. Monoclonal antibodies and biotinylated secondary monoclonal antibodies (from PharMingen, San Diego, Calif.) For plate coating were 11B11 and BDV6. Standard curves were generated using recombinant IL-4 and the lower limit of detection was 30 pg / ml.
<역전사효소-PCR I>Reverse Transcriptase-PCR I
전체 RNA를 마우스 RAW264.7 세포로부터 준비하여 cDNA로 역전사시키고, 이어서 cDNA의 PCR 증폭을 상기한 바와 같이 수행하였다(Chung et. al., 2003, 상기함). PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다: 마우스 IL-12 p40 (sense, 5'-CAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTG-3'(서열번호 1), antisense, 5'-TCCGGAGTAATTTGGTGCTTCACAC-3'(서열번호 2) 및 β-actin (sense, 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'(서열번호 3), antisense, 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'(서열번호 4)). PCR 반응은 MJ 열 사이클러(Watertown, MA)를 사용하여 35 cycles of 94℃(30 sec), 58℃ (45 sec), 72℃ (30 sec)동안 진행시켰다. 증폭 후, RT-PCR 생성물 6 ㎕를 1.5% (w/v) 아가로오스 겔에서 분리하고 에치듐 브로마이드로 염색하였다.Total RNA was prepared from mouse RAW264.7 cells and reverse transcribed into cDNA, followed by PCR amplification of cDNA as described above (Chung et. Al ., 2003, supra). The sequence of the PCR primers is as follows: mouse IL-12 p40 (sense, 5'-CAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTG-3 '(SEQ ID NO: 1), antisense, 5'-TCCGGAGTAATTTGGTGCTTCACAC-3' (SEQ ID NO: 2) and β-actin (sense) , 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3 '(SEQ ID NO: 3), antisense, 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3' (SEQ ID NO: 4)) PCR reactions were performed using an MJ heat cycler (Watertown, MA) at 35 cycles of 94 ° C. (30 sec), 58 ° C. (45 sec), 72 ° C. (30 sec) After amplification, 6 μl of RT-PCR product was separated on a 1.5% (w / v) agarose gel and treated with ethium bromide. Stained.
<역전사효소-PCR II>Reverse Transcriptase-PCR II
전체 RNA를 EL4 T 세포로부터 준비하여 cDNA로 역전사시키고, 이어서 cDNA의 PCR 증폭을 상기한 바와 같이 수행하였다(Chung et. al., 2003, 상기함). PCR 프라이머의 서열은 다음과 같다: 마우스 IL-４ (sense, 5'-ATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3'(서열번호 5) antisense, 5'-GCTCTTTACGCTTTCCAGGAAGTC-3'(서열번호 6) 및 β-actin (sense, 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'(서열번호 7) antisense, 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'(서열번호 8). PCR 반응은 MJ 열 사이클러(Watertown, MA)를 사용하여 35 cycles of 94℃(30 sec), 58℃ (45 sec), 72℃ (30 sec) 동안 진행시켰다. 증폭 후, RT-PCR 생성물 6 ㎕를 1.5% (w/v) 아가로오스 겔에서 분리하고 에치듐 브로마이드로 염색하였다.Total RNA was prepared from EL4 T cells and reverse transcribed into cDNA followed by PCR amplification of the cDNA as described above (Chung et. Al ., 2003, supra). The sequence of the PCR primers is as follows: mouse IL-4 (sense, 5'-ATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3 '(SEQ ID NO: 5) antisense, 5'-GCTCTTTACGCTTTCCAGGAAGTC-3' (SEQ ID NO: 6) and β-actin (sense, 5) '-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3' (SEQ ID NO: 7) antisense, 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3 '(SEQ ID NO: 8) PCR reactions were performed using an MJ heat cycler (Watertown, MA) at 35 cycles of 94 ° C (30 sec). , 58 ° C. (45 sec), 72 ° C. (30 sec) After amplification, 6 μl of RT-PCR product was separated on a 1.5% (w / v) agarose gel and stained with etchdium bromide.
<전기영동에 의한 운동성 겔 이동 에세이>Mobility gel transfer assay by electrophoresis
핵 추출물은 종래 알려진 바와 같이 RAW264.7 또는 EL 4 T 세포로부터 제조하였다(참조문헌: Dignam, J. D., R. M. Lebovitz & R. G. Roeder. 1993. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res.11: 1475-1489). 면역글로불린 γ-사슬내의 NF-κB-결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 (5'-CCGGTTAACAGAGGGGGCTTTCCGAG-3'(서열번호 9)를 프로브로 사용하였다. 특이적 결합은 과량의 비표지된 동일한 올리고뉴클레오타이드 또는 cAMP 응답 인자 함유 올리고뉴클레오타이드로 경쟁 실험을 함으로써 확인하였다.Nuclear extracts were prepared from RAW264.7 or EL 4 T cells as previously known (Dignam, JD, RM Lebovitz & RG Roeder. 1993. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11: 1475-1489). Oligonucleotides containing the NF-κB-binding site in the immunoglobulin γ-chain (5'-CCGGTTAACAGAGGGGGCTTTCCGAG-3 '(SEQ ID NO: 9) were used as probes. Specific binding was carried out with excess unlabeled identical oligonucleotide or cAMP. It was confirmed by competition experiments with response factor-containing oligonucleotides.
통계적 분석에 관련하여 스튜던트의 t-test 및 일방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 다양한 실험 및 대조군에 대한 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. P- values<0.05 이 유의한 것으로 고려되었다.In relation to statistical analysis, Student's t- test and one-way ANOVA were used to determine the statistical significance of the differences for various experiments and controls. P -values <0.05 were considered significant.
실시예 1: 피조개로부터 알코올 분획의 제조Example 1 Preparation of Alcohol Fractions from Shells
한국의 남해안에서 채취한 피조개(Scapharca broughtonii)의 생물 견본을 국내 광주의 수산 시장에서 구입하였다. 피조개의 조직(근육)을 제거하고 빙냉 식염으로 세척한 후 사용할 때까지 -30℃에 보관하였다. 동결 조직 (500g)을 잘게 썰어서 실온에서 7일 동안 2L 에탄올/물(60: 40, v/v)에 담구었다. 고상 잔류물을 원심분리하여 제거하고, 얻어진 에탄올-수용액을 감압하에 30℃에서 회전증발기로 증발시켜 에탄올을 제거하였다. 결과의 수용액에 활성탄(20 g/ℓ)을 첨가한 후 이것을 2 시간 동안 교반시켰다. 활성탄을 여과에 의해 수용액으로부터 분리하고 증류수로 세척하였다. 유효 물질들을 각각 80% 아세톤 수용액 및 100% 에탄올을 사용하여 활성탄으로부터 용출시켰다. 두 용출물을 합하여 감압하에 30℃에서 회전증발기로 건조시켰다. 건조 잔류물을 100% 에틸 아세테이트, 100% 에탄올 및 100% 메탄올 100 ml로 단계적 용출에 의해 분획화하였다. 얻어진 에탄올 분획(A) 및 메탄올 분획(B) 추가로 정제하였다. 에탄올 분획을 2ml로 농축시킨 후 실리카-겔 (2.5 x 20 cm)의 컬럼에 가하였다. 에틸 아세테이트로 세척한 후, 유효 물질들을 에틸 아세테이트/에탄올 (2:1, v/v)로 용출시키고 회전증발기로 건조시켰다. 건조 잔류물(35mg: SIII)을 -30℃에서 저장하고 후속 실험에 사용하였다. 메탄올 분획(B)은 10ml로 농축시킨 후 실리카-겔 (2.5 x 20 cm)의 컬럼에 가하였다. 에틸 아세테이트로 세척한 후, 유효 물질들을 에틸 아세테이트/메탄올 (9:1, v/v)로 용출시키고 회전증발기로 건조시켰다. 농축물에서 형성된 유적(430mg: AII)을 고체 화합물로부터 분리하여 후속 실시예에 사용하였다.Biological specimens of Scapharca broughtonii from the south coast of Korea were purchased from the fish market in Gwangju, Korea. The tissue (muscle) of the clam was removed, washed with ice-cold saline, and stored at -30 ° C until use. Frozen tissue (500 g) was chopped and soaked in 2 L ethanol / water (60: 40, v / v) for 7 days at room temperature. The solid residue was removed by centrifugation, and the obtained ethanol-aqueous solution was evaporated with a rotary evaporator at 30 ° C. under reduced pressure to remove ethanol. Activated carbon (20 g / L) was added to the resulting aqueous solution, which was then stirred for 2 hours. Activated carbon was separated from the aqueous solution by filtration and washed with distilled water. Active materials were eluted from activated charcoal using 80% aqueous acetone and 100% ethanol, respectively. The two eluates were combined and dried on a rotary evaporator at 30 ° C. under reduced pressure. The dry residue was fractionated by stepwise elution with 100 ml of 100% ethyl acetate, 100% ethanol and 100% methanol. The obtained ethanol fraction (A) and methanol fraction (B) were further purified. The ethanol fractions were concentrated to 2 ml and added to a column of silica-gel (2.5 x 20 cm). After washing with ethyl acetate, the active substances were eluted with ethyl acetate / ethanol (2: 1, v / v) and dried on a rotary evaporator. Dry residue (35 mg: SIII) was stored at −30 ° C. and used for subsequent experiments. Methanol fraction (B) was concentrated to 10 ml and added to a column of silica-gel (2.5 x 20 cm). After washing with ethyl acetate, the active substances were eluted with ethyl acetate / methanol (9: 1, v / v) and dried on a rotary evaporator. The oil residue (430 mg: AII) formed in the concentrate was separated from the solid compound and used in subsequent examples.
실시예 2: HL-60 세포 분화 및 증식에 미치는 피조개의 에탄올 분획 (SIII)의 효과Example 2: Effect of Ethanol Fractions (SIII) of Shellfish on HL-60 Cell Differentiation and Proliferation
HL-60 세포들을 2 x 105 cells/ml의 밀도로 종배양시키고, 세포들을 배지 단독 또는 피조개의 2.5~2.0 ㎍/ml 에탄올 분획(SIII)으로 72시간 동안 처리하였다. HL-60 세포 분화에 미치는 에탄올 분획(SIII)의 효과는 니트로블루 테트라졸륨 환원 (NBT) 에세이로 평가하였다. 도 1은 HL-60 세포 분화에 미치는 피조개로부터 제조된 에탄올 분획의 효과를 나타낸다. 각 데이터는 평균 SEM (n=3)으로 나타냈다. HL-60 cells were seeded at a density of 2 × 10 5 cells / ml and cells were treated for 72 hours with medium alone or with 2.5-2.0 μg / ml ethanol fraction (SIII) of the tide. The effect of ethanol fraction (SIII) on HL-60 cell differentiation was assessed with a nitroblue tetrazolium reduction (NBT) assay. 1 shows the effect of ethanol fractions prepared from clams on HL-60 cell differentiation. Each data is represented by mean SEM (n = 3).
도 1에 나타낸 바와 같이, 2.5 ㎍/ml 이상의 에탄올 분획(SIII)으로 인큐베이션시킨 경우에는 농도가 증가함에 따라 세포 분화가 유도되었다. 20 ㎍/ml의 에탄올 분획(SIII)으로 HL-60 세포를 72시간 동안 처리한 경우에는 세포 증식이 억제되었고 세포 분화가 20% 정도 증가되었다. 이 결과는 상기 에탄올 분획(SIII)이 HL-60세포의 분화에 대한 양호한 유발제임을 의미한다. Giemsa로 세포를 염색한 결과 에탄올 분획 (SIII)은 세포 형태학에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 각 시험군의 세포 증식은 상기한 바와 같이 결정하였다. 5 ㎍/ml의 에탄올 분획(SIII)으로 HL-60 세포를 처리한 결과 세포 증식에는 영향을 미치지 않았다. 5 ㎍/ml 이상의 에탄올 분획(SIII)으로 세포들을 72 시간 동안 처리한 결과 세포 증식을 상당히 억제하였다(데이터는 나타내지 않음).As shown in FIG. 1, incubation with an ethanol fraction (SIII) of 2.5 μg / ml or more induced cell differentiation with increasing concentration. Treatment of HL-60 cells with 20 μg / ml ethanol fraction (SIII) for 72 hours inhibited cell proliferation and increased cell differentiation by 20%. This result means that the ethanol fraction (SIII) is a good trigger for differentiation of HL-60 cells. Staining cells with Giemsa showed that the ethanol fraction (SIII) had little or no effect on cell morphology. Cell proliferation of each test group was determined as described above. Treatment of HL-60 cells with 5 μg / ml ethanol fraction (SIII) did not affect cell proliferation. Cells were treated for 72 hours with ethanol fraction (SIII) of at least 5 μg / ml, significantly inhibiting cell proliferation (data not shown).
실시예 3: 1,25-(OH)Example 3: 1,25- (OH) 22 DD 33 및 all- And all- transtrans RA-유도 HL-60 세포 분화에 미치는 피조개의 에탄올 분획(SIII)의 상승 효과 Synergistic Effects of Ethanol Fraction (SIII) in Shellfish on RA-Induced HL-60 Cell Differentiation
1,25-(OH)2D3- 및 all-trans RA-유도 세포 분회에 미치는 에탄올 분획(SIII)의 효과를 검사하기 위하여, HL-60 세포들을 에탄올 분획 (SIII)들을 1,25-(OH)2D3 또는 all-trans RA와 조합하여 처리하고, 세포 분화를 NBT 에세이에 의해 평가하하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 결과로부터 알수 있는 바와 같이, 에탄올 분획(SIII)은 1,25-(OH)2D3 및 all-trans RA-유도 HL-60 세포 분화를 상승적으로 강화시켰다. 예를 들면, 20 ㎍/ml 에탄올 분획(SIII)과 배합한 5 nM 1,25-(OH)2D3의 관찰된 효과(93.5% 분화된 세포)는 개별 처리 효과의 합(36.6% 분화된 세포) 보다 더 컸다. 유사한 상승 효과가 에탄올 분획 (SIII) 및 all-trans RA에서도 관찰되었다. 20㎍/ml 에탄올 분획 (SIII)와 배합한 50 nM all-trans RA의 효과(91.5% 분화된 세포) 역시 개별 처리한 경우의 효과의 합(38.2% 분화된 세포) 보다 컸다. To examine the effect of ethanol fraction (SIII) on 1,25- (OH) 2 D 3 -and all- trans RA-induced cell fractions, HL-60 cells were treated with ethanol fractions (SIII). OH) 2 D 3 or in combination with all- trans RA and cell differentiation was assessed by NBT assay and the results are shown in FIG. 1. As can be seen from the results of FIG. 1, the ethanol fraction (SIII) synergistically enhanced 1,25- (OH) 2 D 3 and all- trans RA-induced HL-60 cell differentiation. For example, the observed effect (93.5% differentiated cells) of 5
추가로 에탄올 분획(SIII)에 의해 증가된 분화를 결정하기 위하여, HL-60 세포 상의 형태학적 표현형 및 세포 표면 항원의 발현을 분석하였다. 도 2는 피조개의 에탄올 분획 (SIII) 단독 또는 1,25-(OH)2D3 또는 all-trans RA와 조합으로 처리한 HL-60 세포의 형태학적 분석 결과를 나타낸 사진이다. HL-60 세포들은 72 시간 동안 담체 단독(A), 10 ㎕/ml 에탄올 분획(SIII) (B), 5 nM 1,25-(OH)2D3 (C), 10 ㎕/ml 에탄올 분획(SIII) + 5 nM 1,25-(OH)2D3 (D), 50 nM all-trans RA (E) 또는 10 ㎕/ml 에탄올 분획 (SIII) + 50 nM all-trans RA (F)로 72시간 동안 처리하였다. 사이토스핀 슬라이드들은 HL-60 세포(2 x 105 cells/ml)로부터 제조하여, 김사(Giemsa) 염색액으로 염색하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 김사(Giemsa)-염색 미분화 대조군 HL-60 세포(도 2a)은 우세하게 둥글고 규칙적인 세포 가장자리 및 큰 핵을 가진 전골수구화 되었는데, 이는 세포들이 DNA 합성에서 고도로 활성화되어 있고 급속히 증식함을 나타낸다. 10 ㎍/ml 에탄올 분획(SIII)-, 5nM 1,25-(OH)2D3- 또는 50 nM all-trans RA-처리된 세포들(도 2B, 2C 및 2E)은 불규칙한 세포 가장자리 등 세포 형태학에서 비교적 적은 변화를 나타냈다. 5 nM 1,25-(OH)2D3 또는 50 nM all-trans RA + 10 ㎍/ml 에탄올 분획(SIII)로 HL-60 세포의 복합 처리(도 2D 및 2F)는 상당히 감소된 세포 크기, 더 짙은 크로마틴 및 증가된 세포질 대 핵비를 초래하였는데, 이는 DNA 합성이 덜 일어남을 의미한다. 도 2D 및 2F에 나타낸 바와 같이, 일부 세포는 말굽 모양의 핵을 나타내었는데 이는 단핵구 계통으로의 세포분화의 징후이며, 일부 세포는 다엽 핵을 나타내었는데, 이는 과립구 계통으로 세포 분화의 징후를 각각 나타낸다. To further determine the differentiation by ethanol fraction (SIII), the morphological phenotype and expression of cell surface antigens on HL-60 cells were analyzed. Figure 2 is a photograph showing the results of morphological analysis of HL-60 cells treated with crude ethanol fraction (SIII) alone or in combination with 1,25- (OH) 2 D 3 or all- trans RA. HL-60 cells were treated for 72 hours with carrier alone (A), 10 μl / ml ethanol fraction (SIII) (B), 5
또한, 세포형광 분석을 수행하여 HL-60 세포 상의 특정 표면 항원의 발현 여부를 검사하였다. CD11b(Mac-1)은 활성화된 단핵구, 과립구, 임파구 및 NK 세포의 세브세트에서 발현된다. HL-60 백혈구 세포는 고농도의 1,25-(OH)2D3 및 all-trans RA에 의해 단핵구/대식구 및 과립구로 각각 분화될 때 세포 표면 마커, CD11b를 발현한다. 도 3은 분화 마아커 CD11b에 대한 mAb를 사용한 세포 형광분석법에 의해 결정된 바의 피조개의 에탄올 분획(SIII)-매개 HL-60 세포 분화의 결과를 나타내는 그라프도면이다. HL-60 세포들은 담체 단독 (A), 10 ㎍/ml 에탄올 분획 (SIII) (B), 5 nM 1,25-(OH)2D3 (C), 10 ㎍/ml ethanol fraction (SIII) + 5 nM 1,25-(OH)2D3 (D), 50 nM all-transRA (E) 또는 10 mg/ml 에탄올 분획 (SIII) + 50 nM all-trans RA (F)으로 72시간 동안 처리하였다. 세포들은 PE-공역 항-CD11b mAb (그늘없는 영역) 또는 PE-공역 아이소타입 대조군 mAb (그늘 영역)를 사용하여 세포형광분석법에 의해 평가하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 에탄올 분획(SIII)은 5 nM 1,25-(OH)2D3 또는 50 nM all-trans RA와 합했을 때 CD11b-양성 세포의 수를 상승적으로 증가시켰는데, 이로부터 에탄올 분획(SIII)이 1,25-(OH)2D3- 또는 all-trans RA-유발 HL-60 세포 분화를 증대시켰음이 확인된다. In addition, cytofluorescence analysis was performed to examine the expression of specific surface antigens on HL-60 cells. CD11b (Mac-1) is expressed in a subset of activated monocytes, granulocytes, lymphocytes and NK cells. HL-60 leukocyte cells express the cell surface marker, CD11b, when differentiated into monocytes / macrophages and granulocytes, respectively, by high concentrations of 1,25- (OH) 2 D 3 and all- trans RA. FIG. 3 is a graph showing the results of the ethanol fraction (SIII) -mediated HL-60 cell differentiation of crude cells as determined by cell fluorescence assay using mAb against differentiation marker CD11b. HL-60 cells were carrier alone (A), 10 μg / ml ethanol fraction (SIII) (B), 5
이러한 결과는 본 발명에 따른 피조개의 에탄올 추출 분획물이 항암 효과가 있으며 신생물 질환의 치료에 있어서 효과적임을 의미한다.These results indicate that the ethanol extract fraction of the shellfish according to the present invention has an anticancer effect and is effective in the treatment of neoplastic diseases.
실시예 4: LPS-자극 마우스 대식구에 의한 IL-12의 생성에 미치는 피조개의 알코올 추출물의 효과Example 4 Effect of Alcoholic Extracts of Shellfish on Production of IL-12 by LPS-stimulated Mouse Macrophages
본 실시형태에 있어서 본 발명자들은 LPS-자극된 마우스 대식구에 의한 IL- 12의 생성에 미치는 피조개의 에탄올 추출물의 효과를 시험하였다. 도 4는 LPS-활성화된 단핵구 RAW264.7 세포주에서 피조개의 에탄올 분획(SIII)에 의한 IL-12 발현의 억제를 나타낸다. (A) RAW264.7 세포들을 다양한 농도의 에탄올 분획(SIII)의 부재 및 존재하에 LPS (0.5 ㎍/ml)로 48 시간 동안 자극시키고, 배양 상층액에서 IL-12 레벨을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA 데이터는 평균 ± 표준 편차(n=3)로 나타냈다. P < 0.01, 한 군은 LPS와 5 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml 에탄올 분획(SIII)으로 자극시킨 반면 다른 군은 LPS 단독으로 자극시켰다. (B)는 IL-12 mRNA 발현의 억제를 나타낸다. RAW264.7 세포들을 10 ㎍/ml 에탄올 분획 (S3)의 존재 또는 부재하에서 LPS (0.5 ㎍/ml)로 6시간 동안 자극하였고, IL-12 mRNA는 RT-PCR에 의해 조사하였다. IL-12 p40 및 β-actin에 대한 RT-PCR 생성물은 1.5 % 아가로오스 겔에서 분석하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, LPS는 예견한 바와 같이 IL-12의 생성을 용이하게 유도하였다. 그러나, 피조개의 에탄올 추출물(SIII)은 이 LPS-유도 IL-12 생성을 농도 의존적 방식으로 상당히 억제하였다. 더 나아가, IL-12 분비의 억제가 감소된 mRNA 생성의 결과인지를 결정하기 위하여, IL-12 p40 mRNA의 발현에 미치는 에탄올 분획(III)의 효과를 LPS-자극 대식구에서 분석하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, 에탄올 분획(SIII)는 두 IL-12 p40의 mRNA 레벨을 상당히 억제하였는데, 이는 에탄올 분획(SIII)에 의한 IL-12 생성의 억제가 mRNA 레벨에서 일어났음을 의미한다. 대조적으로, 에탄올 분획 (SIII)으로 처리한 결과 LPS-자극 대식구에서 β-actin mRNA 레벨에는 영향을 미치지 않았는데, 이는 에탄올 분획(SIII)에 의한 IL-12 생성의 억제 효과가 세포의 활성화의 일반적인 무력화 의 결과가 아님을 나타낸다. 더욱이, 에탄올 분획(SIII)에 의한 IL-12 생성 억제가 일반적인 세포독성 효과로부터 기인하지 않았는데 그 이유는, 트리판 블루 배제 시험에 의해 입증되는 바와 같이, 모든 배양물에서 대식구의 생존능이 시험에 사용된 에탄올 분획(SIII) 농도의 존재하에 인큐베이션 기간 전체에 걸쳐서 일정하게 남아있기 때문이다(데이터는 나타내지 않음). In this embodiment, we tested the effect of ethanol extract of the shellfish on the production of IL-12 by LPS-stimulated mouse macrophages. Figure 4 shows inhibition of IL-12 expression by ethanol fraction (SIII) of clam in LPS-activated monocytes RAW264.7 cell line. (A) RAW264.7 cells were stimulated with LPS (0.5 μg / ml) for 48 hours in the absence and presence of various concentrations of ethanol fraction (SIII) and IL-12 levels in culture supernatants were assessed by ELISA. ELISA data is expressed as mean ± standard deviation (n = 3). P <0.01, one group was stimulated with LPS and 5 μg / ml or 10 μg / ml ethanol fraction (SIII) while the other group was stimulated with LPS alone. (B) shows inhibition of IL-12 mRNA expression. RAW264.7 cells were stimulated for 6 hours with LPS (0.5 μg / ml) in the presence or absence of 10 μg / ml ethanol fraction (S3) and IL-12 mRNA was examined by RT-PCR. RT-PCR products for IL-12 p40 and β-actin were analyzed on a 1.5% agarose gel. As shown in FIG. 4A, LPS readily induced the production of IL-12 as expected. However, the ethanol extract (SIII) of the shellfish significantly inhibited this LPS-induced IL-12 production in a concentration dependent manner. Furthermore, to determine if inhibition of IL-12 secretion is the result of reduced mRNA production, the effect of ethanol fraction (III) on the expression of IL-12 p40 mRNA was analyzed in LPS-stimulated macrophages. As shown in FIG. 4B, the ethanol fraction (SIII) significantly inhibited the mRNA levels of both IL-12 p40, indicating that inhibition of IL-12 production by the ethanol fraction (SIII) occurred at the mRNA level. In contrast, treatment with ethanol fraction (SIII) did not affect β-actin mRNA levels in LPS-stimulated macrophages, where the inhibitory effect of IL-12 production by ethanol fraction (SIII) was a general neutralization of cell activation. It is not a result of. Moreover, inhibition of IL-12 production by the ethanol fraction (SIII) did not result from the general cytotoxic effect, because the viability of macrophages in all cultures was used for this test, as evidenced by the trypan blue exclusion test. This is because it remains constant throughout the incubation period in the presence of the ethanol fraction (SIII) concentration (data not shown).
최근 일부의 화합물이 단핵구 및 대식구를 포함한 일부 항원 제시 세포에서 IL-12 생성을 억제하는 것으로 보고되고 있다. 코티코스테로이드류는 IL-12 생성을 억제함으로써 CD4+ T 세포에서 IL-4 합성을 유도하는 대식구의 능력을 증강시키는 것으로 나타났다. 또한, 안지오텐신 전환 효소 억제제인 캡토프릴(captopril) 및 리시노프릴(lisinopril)도 마찬가지로 인간 말초 혈액 단핵구 세포로부터 IL-12 생산을 억압하는 것으로 밝혀졌다. 포스포디에스테라제 억제제인 탈리도미드(Thalidomide)는 형질전환 성장 인자-β인 IL-10, 또는 프로스타글란딘 E2 등의 IL-12 생성의 공지된 내재성 억제제와는 무관한 기작에 의해 인체 단핵구로부터 IL-12 생성을 억제하였다. 살부타몰(salbutamol)을 포함하는 β2-아드레날린제 화합물은 세포내 cAMP 레벨을 증가시킴으로써 인간 단핵구 또는 수지상 세포로부터 IL-12 생성을 억제하였으며, 이는 Th1 세포의 발생을 초래하는 반면 반면에 Th2 세포 분화를 촉진한다. Recently, some compounds have been reported to inhibit IL-12 production in some antigen presenting cells, including monocytes and macrophages. Corticosteroids have been shown to enhance macrophages' ability to induce IL-4 synthesis in CD4 + T cells by inhibiting IL-12 production. In addition, angiotensin converting enzyme inhibitors captopril and lisinopril have also been shown to suppress IL-12 production from human peripheral blood monocyte cells. Thalidomide, a phosphodiesterase inhibitor, is derived from human monocytes by a mechanism independent of known endogenous inhibitors of IL-12 production, such as transforming growth factor-β, IL-10, or prostaglandin E2. IL-12 production was inhibited. Β2-adrenergic compounds, including salbutamol, inhibited IL-12 production from human monocytes or dendritic cells by increasing intracellular cAMP levels, which resulted in the development of Th1 cells, while Th2 cell differentiation. To promote.
이들 에탄올 분획(SIII) 작용에 수반되는 영역을 확인하기 위하여, 도 5에 나타낸 바와 같이, 전사 개시부에 상관된 위치 -689 내지 +98 및 -185 내지 +98까 지의 IL-12 p40 프로모터 서열을 함유하는 일련의 루시퍼라아제 리포터 구조물을 생성하였다. IL-12 p40 서브유닛은 인터류킨-12의 고도로 유도적이고 긴밀하게 조절되는 성분인 것으로 알려져 있다. 마우스 RAW264.7 단핵구 세포를 각각의 이들 구조물로 형질감염시키고, 에탄올 분획 (S3)의 부재 또는 존재하에 LPS로 자극시킨 다음 루시페라아제 활성을 검사하였다. 도 5는 리포폴리사카라이드에 의해 활성화된 IL-12 p40 프로모터 구조물에서 피조개의 에탄올 분획-매개된 전사단계의 억압의 분석을 나타낸다. RAW264.7 세포들을 마우스 IL-12 p40 프로모터 구조물 및 NF-κB 부위의 링커 스캐닝 돌연변이로 일시적으로 형질감염시키고, 이어서 에탄올 분획(SIII) (1, 5 및 10 ㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 LPS (0.5 ㎍/ml)로 자극시켰다. 삼중 시료로부터 정규화한 루시페라아제 발현을 LacZ 발현에 관련하여 나타내었다. 이 데이터는 3회 결정하여 평균 +/- SD로 나타냈다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 두 구조물 모두 에탄올 분획(SIII)의 부재하에 LPS를 사용하여 강력한 자극을 나타냈으나, 에탄올 분획(SIII)을 사용한 경우에는 손상된 자극을 나타냈다. 특히, -185 (p40/185) 까지의 결실 서열은 LPS-의존성 프로모터 활성을 손상시키지 않았으며, 에탄올 분획(SIII)의 억제 효과가 여전히 관찰되었는데, 에탄올 분획(SIII)의 표적 부위가 이 영역 내에 존재함을 의미한다. 에탄올 분획 (SIII)-매개 억제 작용에 있어서 p40 프로모터의 -121 및 -131 사이에 발견되는 NF-κB 부위의 기능을 직접 시험하기 위하여, 본 발명자들은 -689/+98 구조물 (p40/LS)의 배경 내에서 NF-κB 내로 링커 스캐닝 돌연변이를 도입시켰다. LPS-의존성 프로모터 활성화는 비록 상당히 감소되었으나 p40/LS에서 여전히 관찰되었는데, 이는 NF-κB 부위가 p40 프로모터의 LPS-매개 유도에 중요한 것으로 밝혀진 이전의 발견 결과와 일치한다. 그러나, 에탄올 분획(SIII)을 LPS-자극시킨 세포에 첨가하는 것은 p40/LS에 단순히 약한 억제 효과를 가졌는데, 확실히 IL-12 생성에 미치는 에탄올 분획의 억제 효과가 상기 κB 부위를 통해 매개되었음을 나타낸다. To identify the regions involved in these ethanol fraction (SIII) actions, IL-12 p40 promoter sequences at positions -689 to +98 and -185 to +98 correlated to the transcription initiation, as shown in FIG. A series of luciferase reporter constructs containing were generated. The IL-12 p40 subunit is known to be a highly inducible and tightly regulated component of interleukin-12. Mouse RAW264.7 monocyte cells were transfected with each of these constructs, stimulated with LPS in the absence or presence of ethanol fraction (S3) and then tested for luciferase activity. FIG. 5 shows an analysis of the suppression of the ethanol fraction-mediated transcriptional stage of the cochlea in the IL-12 p40 promoter construct activated by lipopolysaccharide. RAW264.7 cells are transiently transfected with linker scanning mutations in the mouse IL-12 p40 promoter construct and the NF-κB region, followed by LPS in the presence or absence of ethanol fraction (SIII) (1, 5 and 10 μg / ml). (0.5 μg / ml). Luciferase expression normalized from triplicate samples is shown in relation to Lac Z expression. This data was determined three times and expressed as mean +/- SD. As shown in FIG. 5, both constructs showed strong stimulation using LPS in the absence of ethanol fraction (SIII), but impaired stimulation with ethanol fraction (SIII). In particular, deletion sequences up to -185 (p40 / 185) did not impair LPS-dependent promoter activity, and the inhibitory effect of the ethanol fraction (SIII) was still observed, with the target site of the ethanol fraction (SIII) within this region. It exists. In order to directly test the function of the NF-κB site found between -121 and -131 of the p40 promoter in ethanol fraction (SIII) -mediated inhibitory action, the inventors of the -689 / + 98 construct (p40 / LS) Linker scanning mutations were introduced into NF-κB in the background. Although LPS-dependent promoter activation was significantly reduced, it was still observed in p40 / LS, which is consistent with previous findings that the NF-κB site was found to be important for LPS-mediated induction of the p40 promoter. However, addition of ethanol fraction (SIII) to LPS-stimulated cells had only a weak inhibitory effect on p40 / LS, indicating that the inhibitory effect of the ethanol fraction on IL-12 production was mediated through the κB site. .
p40-κB 기능의 에탄올 분획 (SIII)-매개된 억제의 기작에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위하여, 본 발명자들은 에탄올 분획 (SIII)의 부재 또는 존재하에 미자극되거나 또는 LPS-자극된 초생(primary) 대식구의 핵 추출물에 존재하는 NF-κB 결합 활성을 분석하였다. 도 6은 피조개의 에탄올 분획(SIII)-매개된 NF-κB에 의한 NF-κB 결합의 억제를 나타낸다. 에탄올 분획 (S3) (1, 5 and 10 ㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 LPS로 자극시킨 단핵구 세포로부터 제조된 핵 추출물을 공통의 면역글로불린-kB 부위를 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전기영동에 의한 운동성 쉬프트 에세이에서 NF-κB 결합 활성에 대해 시험하였다. κB 부위에 대한 NF-κB의 특이적 결합은 비표지된 동일한 올리고뉴클에오티드(S) 및 비특이성 올리고뉴클레오티드(NS), 각각의 존재하에 핵 추출물에서 확인하였다. 이 특이적 NF-κB 복합체는 표시된 대로이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, LPS-자극된 대식구로부터의 핵 추출물은 공통(consensus) 면역글로불린-κB 부위를 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한 전기영동에 의한 운동성 쉬프트 에세이에서 강력한 NF-κB-결합 활성을 나타내었다. 이 결합한 특이적인데, 그 이유는 비표지된 동일한 올리고뉴클레오티드로는 억제되었으나, 무관한, 비특이성 올리고뉴클레오티드로는 억제되지 않았으며, 미자극된 세포로부터의 핵 추출물에는 없었기 때문이다. 에탄 올 분획(SIII)의 존재하에 LPS에 의해 자극된 대식구로부터 핵 추출물은 투여량 의존적 방식으로 감소된 NF-κB-결합 활성을 나타냈다. IL-12 생성의 NF-κB-매개 억제는 1,25-디히드록시비타민 D3, 레티노이드류 및 클로로메틸 케톤류가 하양 조절 NF-κB 활성화 및 IL-12 p40 유전자의 NF-κB 서열에 결합함으로써 IL-12 생성을 억제하였다는 이전의 보고와 일치한다. In order to gain deeper insight into the mechanism of ethanol fraction (SIII) -mediated inhibition of p40-κB function, we have unirritated or LPS-stimulated primary in the absence or presence of ethanol fraction (SIII). NF-κB binding activity present in nuclear extracts of macrophages was analyzed. 6 shows the inhibition of NF-κB binding by ethanol fraction (SIII) -mediated NF-κB in the shellfish. Nuclear extracts prepared from monocytes stimulated with LPS in the presence or absence of ethanol fraction (S3) (1, 5 and 10 μg / ml) were prepared using labeled oligonucleotides containing a common immunoglobulin-kB site. NF-κB binding activity was tested in kinetic shift assays by phoresis. Specific binding of NF-κB to the κB site was confirmed in the nuclear extract in the presence of the same unlabeled oligonucleotide (S) and nonspecific oligonucleotide (NS), respectively. This specific NF-κB complex is as indicated. As shown in FIG. 6, nuclear extracts from LPS-stimulated macrophages showed potent NF-κB-binding activity in kinetic shift assays by electrophoresis using labeled oligonucleotides containing consensus immunoglobulin-κB sites. Indicated. This bound is specific because it was inhibited with the same unlabeled oligonucleotide, but not with irrelevant, nonspecific oligonucleotides, and not with nuclear extracts from unstimulated cells. Nuclear extracts from macrophages stimulated by LPS in the presence of ethanol fraction (SIII) showed reduced NF-κB-binding activity in a dose dependent manner. NF-κB-mediated inhibition of IL-12 production was achieved by binding 1,25-dihydroxyvitamin D 3 , retinoids and chloromethyl ketones to white regulatory NF-κB activation and the NF-κB sequence of the IL-12 p40 gene. Consistent with previous reports of inhibition of IL-12 production.
결론적으로 이들 결과는 피조개의 에탄올 추출물이 IL-12 p40-κB 부위에 대한 NF-κB-매개된 결합의 하향조절을 통하여 LPS-자극된 대식구에서 IL-12 생성을 억제하는 것을 의미한다. 대식구에서 IL12 생성의 에탄올 분획(SIII) 매개된 억제는 타입-1 사이토카인 반응에 의해 두드러지는 특정 면역-매개 질환을 제어함에 있어서 피조개의 가능한 용도를 제시한다.In conclusion, these results indicate that the ethanol extract of the shellfish inhibits IL-12 production in LPS-stimulated macrophages through downregulation of NF-κB-mediated binding to IL-12 p40-κB sites. Ethanol fraction (SIII) mediated inhibition of IL12 production in macrophages suggests possible use of clams in controlling certain immune-mediated diseases that are prominent by
실시예 5: 증가된 NF-AT 결합 활성을 경유하는 피조개에 의한 EL4 T 세포에서 인터류킨-4의 생성의 촉진Example 5: Promoting the Production of Interleukin-4 in EL4 T Cells by Shellfish Via Increased NF-AT Binding Activity
실시예 1에 따른 피조개의 두 알코올 분획물(AII 및 SIII)의 IL-4 생성에 미치는 영향을 시험하기 위하여, EL4 T 세포를 두 알코올 분획 (AII 및 SIII)으로 시험관내에서 48 시간 동안 배양하였다. AII 분획을 5 ㎍/ml 이상으로 처리한 EL4 T 세포는 IL-4 생산에 영향을 받지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 도 7은 피조개의 알코올 분획에 의한 EL4 흉선종 세포에서 IL4 생성의 촉진을 나타내는 도면이다. (A) EL4 T 세포는 다양한 농도의 피조개의 AII 분획의 존재 또는 부재하에 PMA (1 ng/ml)로 48 시간 동안 자극시키고, 상층액 중의 IL-4 레벨을 ELISA에 의해 평가하였다. (B) EL4 T 세포들은 다양한 농도의 피조개의 알코올 분획(SIII)으로 48시간 동안 자극시키고, 상층액 중의 IL-4 레벨을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타냈다(n=3). 도 7A에 나타낸 바와 같이, 비록 AII 분획 그 자체는 EL4 T 세포에 의한 IL-4 생성을 증대시키지 않았으나, AII 분획은 PMA-활성화 EL4 T 세포에서 IL-4 의 생성을 투여량 의존적 방식으로 증대시켰다. PMA-활성화 EL4 T 세포를 5 ㎍/ml의 AII 분획으로 처리한 결과, IL-4 생성에 있어서 90%의 증가를 유발하였다. 대조적으로, SIII 분획 그 자체는 EL4 T 세포에 의해 투여량 의존적 방식으로 IL-4 생성을 상당히 증대시켰다(도 7B). 5 ㎍/ml의 SIII 분획으로 EL4 T 세포를 48 시간 동안 배양한 결과 4,000 pg/ml의 IL-4가 생성되었다. 더 나아가, IL-14 분비의 자극이 증대된 mRNA 생성의 결과인지를 결정하기 위하여, IL-4 mRNA의 발현에 미치는 피조개의 두 알코올 분획(AII 및 SIII)의 영향을 분석하였다. 도 8은 피조개의 알코올 분획(SIII 및 AII)에 의한 EL4 T 세포에서 IL-4 mRNA 발현의 증가를 나타내는 도면이다. EL4 T 세포들은 피조개의 AII 분획(0.1, 1, 5 ㎍/ml)을 PMA (1 ng/ml)와 조합하여(A), 또는 SIII 분획(0.1, 1, 5 ㎍/ml)으로 6시간 동안 처리하고(B), IL-4 mRNA를 RT-PCR에 의해 조사하였다. IL-4 및 β-액틴에 대한 RT-PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 두 알코올 분획(AII 및 SIII)은 PMA-활성화 EL4 T 세포 및 EL4 T 세포 각각의 mRNA 레벨을 상당히 증가시켰는데, 이는 피조개의 알코올 분획에 의한 IL-4 생산의 증대가 mRNA 레벨에서 일어났음을 의미한다.To test the effect of two alcoholic fractions (AII and SIII) of the clamshells according to Example 1 on IL-4 production, EL4 T cells were incubated with two alcoholic fractions (AII and SIII) in vitro for 48 hours. EL4 T cells treated with AII fractions above 5 μg / ml were not affected by IL-4 production (data not shown). Fig. 7 shows the promotion of IL4 production in EL4 thymoma cells by the alcoholic fraction of clam shells. (A) EL4 T cells were stimulated with PMA (1 ng / ml) for 48 hours with or without various concentrations of AII fractions of the clam, and IL-4 levels in supernatants were assessed by ELISA. (B) EL4 T cells were stimulated with various concentrations of alcoholic fraction (SIII) for 48 hours, and IL-4 levels in supernatants were assessed by ELISA. ELISA data are expressed as mean ± standard deviation (n = 3). As shown in FIG. 7A, although the AII fraction itself did not enhance IL-4 production by EL4 T cells, the AII fraction increased IL-4 production in PMA-activated EL4 T cells in a dose dependent manner. . Treatment of PMA-activated EL4 T cells with an AII fraction of 5 μg / ml resulted in a 90% increase in IL-4 production. In contrast, the SIII fraction itself increased significantly IL-4 production in a dose dependent manner by EL4 T cells (FIG. 7B). EL4 T cells were incubated for 48 hours with 5 μg / ml SIII fraction, yielding 4,000 pg / ml IL-4. Furthermore, to determine if stimulation of IL-14 secretion is the result of enhanced mRNA production, the effects of two alcoholic fractions (AII and SIII) on the expression of IL-4 mRNA were analyzed. FIG. 8 shows an increase in IL-4 mRNA expression in EL4 T cells by alcoholic fractions (SIII and AII) of clam shells. EL4 T cells were combined with AII fractions (0.1, 1, 5 μg / ml) of the clam shells with PMA (1 ng / ml) (A), or SIII fractions (0.1, 1, 5 μg / ml) for 6 hours. Treatment (B) and IL-4 mRNA were examined by RT-PCR. RT-PCR products for IL-4 and β-actin were analyzed on a 1.5% agarose gel. As shown in FIG. 8, the two alcohol fractions (AII and SIII) significantly increased the mRNA levels of PMA-activated EL4 T cells and EL4 T cells, respectively, indicating that the increase in IL-4 production by the alcoholic fraction of the shellfish was increased. it occurred at the mRNA level.
피조개의 알코올 분획물 (SIII 및 AII)에 의한 IL-4 유전자의 조절에 NE-AT가 수반되는지를 평가하기 위하여, EL4 T 세포를 피조개의 알코올 분획(0.1, 1, 5 ㎍/ml)을 PMA (1 ng/ml)과 조합하여 1시간 동안 처리하고, 각 처리된 세포의 핵 추출물을 단리하여 NF-AT DNA 결합 활성에 대하여 검사하였다. 도 9는 피조개의 알코올 분획에 의한 증가된 NF-AT DNA 결합 활성을 나타내는 도면이다. EL4 T 세포들은 SIII 분획 (0.1, 1, 5 ㎍/ml)으로 처리하거나(오른쪽), 또는 피조개의 AII 분획 (0.1, 1, 5 ㎍/ml) 또는 PMA (1 ng/ml)와 배합하여 1시간 동안 처리하였으며(왼쪽), 각 처리된 세포로부터의 핵 추출물을 단리하여 공통의 NF-AT 부위를 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한 전기영동에 의한 운동성 쉬프트 에세이에서 강력한 NF-AT-결합 활성을 검사하였다. NF-AT의 특이적 결합은 각각 비표지된 동일한 올리고뉴클레오티드(S) 및 비특이적 올리고뉴클레오티드(NS)의 존재하에서 핵 추출물에서 확인하였다. 특이적 NF-AT 복합체는 나타낸 대로이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, PMS-자극된 EL4 T 세포로부터의 핵 추출물(AII 분획 처리) 및 무자극 EL4 T 세포로부터 핵 추출물(SIII 분획 처리)은 공통의 NF-AT 부위를 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한 전기영동에 의한 운동성 쉬프트 에세이에서 강력한 NF-AT-결합 활성을 보였다. 이 결합한 특이적인데, 그 이유는 비표지된 동일한 뉴클레오티드로는 억제되었으나, 무관한 비특이성 올리고뉴클레오티드로는 억제되지 않았고, 무자극된 세포로부터의 핵추출물이 없었기 때문이다(도 9 참조). CD4+ Th2 세포에서 일차적으로 생성되는 IL-4는 마우스 및 사람 모두에서 항체 아이소타입의 IgE로의 스위칭(switching)을 위한 중요한 자극원이다. 증대된 혈청 Ig E 및 호산구 레벨은 간혹 환자가 알레르기성 및(또는) 기생충 감염으로부터 고통을 겪는 환자에서 직면하게 된다.To assess whether NE-AT is involved in the regulation of IL-4 genes by the coarse alcohol fractions (SIII and AII), EL4 T cells were obtained by using PMA (0.1, 1, 5 μg / ml) 1 ng / ml), and the nuclear extract of each treated cell was isolated and tested for NF-AT DNA binding activity. 9 shows increased NF-AT DNA binding activity by alcohol fraction of clam shells. EL4 T cells were treated with SIII fraction (0.1, 1, 5 μg / ml) (right), or in combination with AII fraction (0.1, 1, 5 μg / ml) or PMA (1 ng / ml) Time-treated (left), nuclear extracts from each treated cell were isolated to provide potent NF-AT-binding activity in kinetic shift assays by electrophoresis using labeled oligonucleotides containing a common NF-AT site. Inspected. Specific binding of NF-AT was confirmed in nuclear extracts in the presence of the same unlabeled oligonucleotide (S) and nonspecific oligonucleotide (NS), respectively. Specific NF-AT complexes are as shown. As shown in FIG. 9, nuclear extracts from PMS-stimulated EL4 T cells (treated with AII fractions) and nuclear extracts from non-stimulated EL4 T cells (treated with SIII fractions) were labeled oligos containing a common NF-AT site. The potent NF-AT-binding activity was shown in the kinetic shift assay by electrophoresis with nucleotides. This bound is specific because it was inhibited with the same unlabeled nucleotides, but not with irrelevant nonspecific oligonucleotides, and there was no nuclear extract from unstimulated cells (see FIG. 9). IL-4, produced primarily in CD4 + Th2 cells, is an important stimulus for the switching of antibody isotypes to IgE in both mice and humans. Increased serum Ig E and eosinophil levels are sometimes encountered in patients in which the patient suffers from allergic and / or parasitic infections.
결론적으로, 이들 결과는 피조개의 알코올 분획이 EL4 T 세포에서 IL-4 생성을 촉진함을 의미한다. IL-4 생성에 미치는 알코올 분획의 자극 효과는 NF-AT 결합 활성의 증가와 밀접하게 연관되어 있는데, 상기 피조개의 알코올 분획이 증가된 NF-AT DNA 결합 활성을 거쳐 EL4 T 흉선종에서 IL-4 생성을 촉진하였음을 의미한다. EL4 T 세포에서 IL-4 생성의 피조개-매개 자극은 타입-2 사이토카인 응답에 의해 우세해지는 특정 면역-매개 질환을 조절하는데 있어서 피조개의 가능한 용도를 제시한다.In conclusion, these results indicate that the alcoholic fraction of the shellfish promotes IL-4 production in EL4 T cells. The stimulatory effect of the alcohol fraction on IL-4 production is closely associated with an increase in NF-AT binding activity. The alcoholic fraction of the cohort of seashells undergoes increased NF-AT DNA binding activity to produce IL-4 in EL4 T thymoma. It means that it promoted. Shell-mediated stimulation of IL-4 production in EL4 T cells suggests possible use of shellfish in regulating certain immune-mediated diseases predominantly by type 2 cytokine responses.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 피조개의 알코올 분획은 전골수구성 백혈병의 유발을 억제시킬 수 있고, IL-12 p40 유전자의 과발현에 의한 자가면역질환의 유발을 억제시킬 수 있고, IL-4의 생성을 촉진하므로 항암제 또는 다양한 면역-매개 질환의 치료제에 널리 활용될 수 있다. As described in detail above, the alcohol fraction of the clam shell according to the present invention can suppress the induction of promyelocytic leukemia, can suppress the induction of autoimmune diseases by overexpression of IL-12 p40 gene, IL- Since it promotes the production of 4, it can be widely used in anticancer drugs or in the treatment of various immune-mediated diseases.
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4584197A (en) | 1983-03-04 | 1986-04-22 | Nihon Bussan Kabushiki Kaisha | Process for preparation of fish and shellfish extracts having pharmaceutical functions |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180001345A (en) * | 2016-06-27 | 2018-01-04 | 주식회사 서진바이오텍 | Ishige okamurae extract composition for skin whitening and anti-wrinkling and manufacturing thereof |
| KR101957772B1 (en) * | 2016-06-27 | 2019-03-18 | 주식회사 서진바이오텍 | Ishige okamurae extract composition for skin whitening and anti-wrinkling and manufacturing thereof |
| KR101847452B1 (en) * | 2018-01-09 | 2018-04-10 | 재단법인 전남생물산업진흥원 | Anti-hypertensive composition comprising Scapharca broughtonii extract as effective component |
| KR20200069880A (en) * | 2018-12-07 | 2020-06-17 | 동신대학교산학협력단 | Composition containing extract of mixture of kajime and red shell |
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