KR100807108B1 - Preparation method of porous ?-tricalcium phosphate granules - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다공성의 β-인산삼칼슘 과립의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 인산삼칼슘 전구체, 기공전구체, 젤라틴 용액 및 분산매를 이용하여 구형의 다공성 β-인산삼칼슘 구형 과립을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법은 기존의 β-인산삼칼슘 과립을 제조하는 방법과는 달리, 과립을 형성하고, 겔화를 촉진시켜주기 위해 분산매를 이용하며, 제조된 과립은 마크로 크기의 기공을 포함하므로 생체 이식시 골 형성을 촉진시키므로 골이식재 또는 골세포지지체로 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a method for producing porous β-tricalcium phosphate granules, and more particularly, to prepare spherical porous β-tricalcium phosphate spherical granules using a tricalcium phosphate precursor, a pore precursor, a gelatin solution and a dispersion medium. It is about how to. Unlike the conventional method for producing β-tricalcium phosphate granules, the production method of the present invention uses a dispersion medium to form granules and promote gelation, and the prepared granules contain macropore pores. Since it promotes bone formation during transplantation, it can be usefully used as a bone graft or bone cell support.
인공골, 골이식재, 베타-인산삼칼슘, β-TCP, 다공성, 구형 Artificial bone, Graft material, Beta-tricalcium phosphate, β-TCP, Porous, Spherical
Description
도 1은 본 발명의 β-인산삼칼슘 구형 과립을 분쇄한 분말의 X-선 회절도를 나타낸 도이다. 1 is a diagram showing an X-ray diffraction diagram of a powder obtained by grinding the β-tricalcium phosphate spherical granules of the present invention.
도 2는 본 발명의 β-인산삼칼슘 구형 과립의 표면을 × 100배의 배율로 관측한 전자현미경 사진을 나타낸 도이다. 2 is a diagram showing an electron micrograph of the surface of the β-tricalcium phosphate spherical granules of the present invention observed at a magnification of 100 times.
도 3은 본 발명의 β-인산삼칼슘 구형 과립을 절단한 절단면을 × 100배의 배율로 관측한 전자현미경 사진을 나타낸 도이다. 3 is a diagram showing an electron micrograph of the cut surface of the β-tricalcium phosphate spherical granules of the present invention observed at a magnification of 100 times.
도 4는 본 발명의 β-인산삼칼슘 구형 과립을 흰쥐의 피하에 이식 후 1주차의 조직 절편 사진을 나타낸 도이다. Figure 4 is a diagram showing a tissue section photograph of the first week after β- tricalcium phosphate spherical granules of the present invention subcutaneously implanted in rats.
도 5는 본 발명의 β-인산삼칼슘 구형 과립을 흰쥐의 두개골 정중부에 매식한 후 4주차의 조직 절편 사진을 나타낸 도이다. FIG. 5 is a diagram showing a tissue section photograph of the fourth week after the β-tricalcium phosphate spherical granules of the present invention were embedded in the median of a skull.
본 발명은 다공성의 β-인산삼칼슘 과립의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing porous β-tricalcium phosphate granules.
일반적으로 외상, 종양, 기형 혹은 생리학적 현상 등에 의해 뼈조직이 손상된 경우, 그 부위에 골을 채워서 신생골을 생성시킨다. 골 결손부의 회복을 위한 가장 보편적인 방법은 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가골 이식방법, 다른 사람의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 동종골 이식방법, 동물의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 이종골 이식방법 등이 있다. 일반적으로 가장 좋은 이식물 방법인 자가골 이식방법은 이차적인 수술이 필요하고, 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들며, 일반 개인의원에서 시행하기가 어렵다는 단점이 있다. 동종골 이식방법은 면역 반응이 일어날 수 있고, 확률은 낮지만 AIDS나 간염과 같은 바이러스를 환자 내로 도입할 수 있는 위험이 있다. 이종골 이식 방법 역시 면역 반응의 문제점과 광우병 등의 문제가 발생할 경우 사용에 문제가 발생하게 되는 단점이 있다. 이에 충분한 양의 골을 쉽게 얻을 수 있으며, 질병에 대한 전염 가능성이 없고, 기존 이식재를 대체할 만한 성능을 갖는 생체 친화성이 우수하고 이식시 적절히 흡수되어 재생골로 치환될 수 있는 생분해성 골이식재가 요구되고 있다. In general, when bone tissue is damaged by trauma, tumors, malformations or physiological phenomena, new bone is generated by filling bones in the area. The most common methods for the recovery of bone defects include autologous bone grafts, which are obtained by transplanting some bones from other sites, allogeneic bone grafts by chemically treating the bones of others, and chemical bone grafts of animals. Xenograft transplantation. In general, autologous bone graft, which is the best implant method, requires secondary surgery, it is difficult to obtain the required amount, and it is difficult to perform in a general medical clinic. Allogeneic bone grafts can produce an immune response and are unlikely, but present a risk of introducing viruses such as AIDS or hepatitis into the patient. Xenograft transplantation method also has a disadvantage in that the use of the immune response and problems such as mad cow disease occurs. Biodegradable bone graft material that can easily obtain a sufficient amount of bone, has no potential for disease transmission, has excellent biocompatibility that can replace existing implants, and can be properly absorbed and replaced with regenerated bone during transplantation. It is required.
대표적인 인공골 물질로 수산화아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산삼칼슘(Tricalcium phosphate, TCP) 등의 인산칼슘계 화합물, 바이오글래스(Bioglass), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate) 등이 있다. Representative artificial bone materials include calcium phosphate compounds such as hydroxyapatite (HA), tricalcium phosphate (TCP), bioglass, calcium carbonate, and the like.
상기의 인공골 물질 가운데, 인산칼슘계 화합물인 수산화아파타이트와 인산 삼칼슘(TCP)은 대표적인 생체재료로서 인공골의 원료로서 각광받는 재료이다. 수산화아파타이트는 실제 뼈를 구성하는 무기성분과 결정학적, 화학적으로 유사하고 뼈와 직접 결합하는 특성이 있으나, 생체 내 낮은 용해성으로 인하여 계면에서 결합한 뼈가 더 이상 안으로 자라 들어가지 못해 완전히 뼈로 치환되지 못하고 끝까지 남아있는 단점이 있다. 인산삼칼슘은 뼈와 직접 결합한다는 특성은 수산화아파타이트와 비슷하지만 생체 내에서 점점 용해되어 결국 없어지는 특성을 지니고 있다. 인산삼칼슘은 수산화아파타이트와 같이 인공골 재료, 상세하게는 골수복재(골의 결손 부위를 채워주는 골이식재; Bone filler)로 주로 이용된다. 최근에는 골수복재의 생체 흡수속도 조절을 위해 수산화아파타이트/인산삼칼슘을 복합화하기도 한다. 골수복재용 인산삼칼슘은 치밀한 벌크 형태로 이용하기도 하고, 열린 기공으로 연결된 다공성 구조나 과립의 형태로 이용하고 있다. 과립형 외 치밀한 벌크(Bulk) 형태나 다공성 구조의 인산삼칼슘을 인공골로 이용하기 위해서는 충분한 강도를 유지해야하므로 높은 상대밀도를 갖도록 소결시켜야 한다.Among the artificial bone materials, calcium phosphate-based compounds such as apatite hydroxide and tricalcium phosphate (TCP) are representative biomaterials, which are spotlighted as raw materials of artificial bone. Apatite hydroxide is crystallographically and chemically similar to the inorganic constituents of actual bones and has direct binding properties with bones, but due to its low solubility in vivo, bones bound at the interface can no longer grow inside and cannot be completely replaced with bones. There is a downside to the end. Tricalcium phosphate binds directly to bone, which is similar to apatite hydroxide, but it dissolves in vivo and eventually disappears. Tricalcium phosphate is mainly used as an artificial bone material such as apatite hydroxide, and more specifically, a bone marrow restoration (bone filler for filling bone defects). Recently, apatite hydroxide / tricalcium phosphate has been complexed to control bioabsorption rate of bone marrow restorations. Tricalcium phosphate for bone marrow restorations is used in the form of dense bulk or in the form of porous structures or granules connected by open pores. In addition to granules, the bulk bulk or porous tricalcium phosphate must be sintered to have a high relative density in order to maintain sufficient strength to be used as artificial bone.
인산삼칼슘은 수산화아파타이트보다 소결시키기 어려운데, 그 이유는 다음과 같다. 인산삼칼슘은 동질이형이 없는 수산화아파타이트와는 달리 크게 β상과 α상의 동질이형을 갖는다. β상은 저온상으로 육방정계 결정을 갖고, 이 저온상 β상을 1100 ~ 1180℃의 온도에서 열처리하면 단사정계를 갖는 고온상 α상으로 상전이한다. 이 고온형 α상은 물과 격렬히 반응하기 때문에 생체 이식체로 쓰기에는 부적합하다. 또한, 밀도가 높은 β상에서 밀도가 낮은 α상으로의 상전이는 소결체의 미세한 균열을 유발하여 전체적인 재료의 강도 저하를 초래한다. 상기의 이 유로 인공골 재료로는 β상의 인산삼칼슘이 선호되고 있다. 그러나 β상의 인산삼칼슘이나 수산화아파타이트와 β상의 인산삼칼슘 복합체의 소결체를 얻기 위해서는 인산삼칼슘의 상전이 온도인 1180℃ 이하에서 소결시켜야 하나, 이 온도에서는 보통 90% 이하의 상대밀도를 보이므로 고밀도 소결체를 얻기 힘들다는 문제점이 있다. 따라서, 생체 흡수성이 뛰어난 인산삼칼슘의 β상을 생체재료로 응용하기 위해서는 고밀도의 소결체를 얻는 것이 필수적이며, 이를 해결하기 위해 여러 소결방법이 시도되고 있다.Tricalcium phosphate is more difficult to sinter than apatite hydroxide, for the following reasons. Tricalcium phosphate has large β and α phase homomorphisms, unlike apatite hydroxides without homomorphisms. The β phase has a hexagonal crystal as a low temperature phase, and when the low temperature phase β phase is heat-treated at a temperature of 1100 to 1180 ° C., the β phase is phase-transformed to a high temperature phase α phase having a monoclinic system. This high temperature α phase reacts violently with water and is therefore not suitable for use as a living implant. In addition, the phase transition from the high density β phase to the low density α phase causes fine cracking of the sintered body, resulting in a decrease in the strength of the overall material. Β-tricalcium phosphate is preferred as the artificial bone material. However, in order to obtain a sintered compact of β-phase tricalcium phosphate or apatite hydroxide and β-phase tricalcium phosphate complex, it must be sintered below 1180 ° C, which is the phase transition temperature of tricalcium phosphate, but at this temperature, since it shows a relative density of 90% or less, There is a problem that it is difficult to obtain a sintered body. Therefore, in order to apply the β phase of tricalcium phosphate having excellent bioabsorbability as a biomaterial, it is essential to obtain a high density sintered body, and various sintering methods have been attempted to solve this problem.
인산삼칼슘을 이용한 종래기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허 제26686호에는 다공성의 뼈 부착부를 지닌 기재 및 피복 물질을 준비하고, 열에너지가 인가되는 동안 피복물질을 뼈 부착부의 일부 또는 전체에 피복하는 단계로 구성되는 신체삽입용 보철부품의 제조방법이 기재되어 있다. 이 방법은 피복물질로서 수산화아파타이트 및 β-인산삼칼슘을 사용하며, 피복시 1350℃ 이상의 온도로 가열시키며, 가열에 의해 피복물질을 흡수성의 α-인산삼칼슘으로 변환시켜 신체삽입용 보철부품을 제조하는 방법이다.Looking at the prior art using tricalcium phosphate, Korean Patent No. 26686 is to prepare a substrate and a coating material having a porous bone attachment portion, and to coat the coating material on all or part of the bone attachment portion while the heat energy is applied The manufacturing method of the prosthetic component for body insertion comprised is described. This method uses apatite hydroxide and β-tricalcium phosphate as the coating material, and when it is coated, it is heated to a temperature of 1350 ℃ or more, and the coating material is converted into absorbent α-tricalcium phosphate by heating to insert the prosthetic component for body insertion. It is a method of manufacturing.
또한, 대한민국 등록특허 제95872호에는 고강도이며, 생체 안정성이 높은 재료로 이루어지는 입자의 표면에 생체 친화성이 높은 재료를 피복고정한 복합화 입자로 이루어지는 층을, 기공(氣孔)을 개재시키면서 고강도이며 생체 안정성이 높은 재료의 표면에 용착시키는 것을 특징으로 하는 의용재료 및 그 제조방법이 기재되어 있다. 여기에서 고강도이며 생체안정성이 높은 재료는 금속, 세라믹스 등이 될 수 있으며, 생체 친화성이 높은 재료는 수산화아파타이트, 인산삼칼슘 또는 바이오유리 등이 될 수 있다.In addition, Korean Patent No. 95872 discloses a layer of composite particles having high strength and high biocompatibility on the surface of particles made of a material having high bio stability and having high strength and bio stability through pores. The medical material and its manufacturing method which are welded on the surface of this high material are described. Herein, the material having high strength and high biostability may be metal, ceramics, or the like, and the material having high biocompatibility may be apatite hydroxide, tricalcium phosphate or bioglass.
또한, 대한민국 공개특허 제2003-6787호에는 인산삼칼슘이 함유된 골대체제용 키토산 비드가 기재되어 있는데, 인산삼칼슘은 키토산의 중량에 대해 0.1 ~ 0.8 중량부의 양으로 함유되는 것이 바람직하다.In addition, Korean Patent Publication No. 2003-6787 describes chitosan beads for bone substitutes containing tricalcium phosphate, and tricalcium phosphate is preferably contained in an amount of 0.1 to 0.8 parts by weight based on the weight of chitosan.
또한, 미합중국 등록특허 제5,017,518호에는 다공성 표면을 갖는 인산칼슘 세라믹 제조방법이 기재되어 있다. 구체적으로는, 1) 수산화아파타이트와 인산삼칼슘의 혼합물을 포함하는 인산칼슘 세라믹을 제조하고, 2) 이 인산칼슘 세라믹을 산 용액으로 처리하여 세라믹 표면의 인산삼칼슘을 선택적으로 용해하여 제조한다.In addition, US Pat. No. 5,017,518 describes a method for preparing calcium phosphate ceramics having a porous surface. Specifically, 1) a calcium phosphate ceramic comprising a mixture of apatite hydroxide and tricalcium phosphate is prepared, and 2) the calcium phosphate ceramic is treated with an acid solution to selectively dissolve tricalcium phosphate on the ceramic surface.
한편, 골이식재를 이식하는 방법 외에, 최근 들어서 재생을 원하는 조직으로부터 세포를 분리하여 배양하고, 이를 적절한 생체재료에 접종하여 증폭 배양함으로서 인공적으로 조직을 형성하는 조직 재생 시술이 제안되고 있다. 이러한 조직 재생 시술에서 해당 조직 세포를 접종·배양하기 위해서는 세포 지지체가 필요하며, 이 세포 지지체 역시 조직적합성과 세포접착성이 우수한 생체재료이어야 한다.On the other hand, in addition to the method of transplanting bone graft material, recently, tissue regeneration procedures for artificially forming tissues by separating and culturing cells from tissues to be regenerated, inoculating them on appropriate biomaterials, and amplifying cultures have been proposed. In order to inoculate and culture the tissue cells in such a tissue regeneration procedure, a cell support is required, and the cell support must also be a biomaterial having excellent tissue compatibility and cell adhesion.
상기 조직 재생 시술을 이용하여 뼈를 재생하는 경우, 세포 지지체로는 현재 교원질 매트릭스(matrix), 폴리글리콜산 메시[poly(glycolic acid) mesh, PGA], 폴리 락트-CO-글리콜산 폼[poly(lactic-co-glycolic acid) foam, PLGA], 칼슘 포스페이트 세라믹스(calcium phosphate ceramics), 폴리 락티드-CO-글리콜산/하이드록시 아파타이트 복합체[poly(lactide-co-glycolic acid)/hydroxyapatite, PLGA/HA] 및 폴리포스파젠(polyphosphazennes)등이 연구되고 있지만, 생체 내로 응용하기 위해서는 아직 해결하여야 할 문제점들이 산재해 있는 실정이다.When bone is regenerated using the tissue regeneration procedure, the cell support is currently a collagen matrix, a poly (glycolic acid) mesh (PGA), a polylactic-CO-glycolic acid foam [poly ( lactic-co-glycolic acid foam, PLGA], calcium phosphate ceramics, polylactide-CO-glycolic acid / hydroxyapatite complex [poly (lactide-co-glycolic acid) / hydroxyapatite, PLGA / HA ] And polyphosphazennes (polyphosphazennes) and the like are being studied, there is a situation that there is still a problem to be solved for application in vivo.
상기 세포 지지체들이 가지는 문제점을 각각 살펴보면, 교원질의 경우, 강도가 약하며 흡수 속도를 조절하기 어렵고, 보통 이종 또는 동종 개체로부터 추출하여 사용하기 때문에 면역 반응을 야기할 소지가 있다. PGA 메시의 경우, 판상이 약 100 ㎛ 정도로 매우 얇아 골 결손부가 클 경우 사용이 곤란할 뿐 아니라 강도 또한 약하다는 단점이 있다. PLGA 코폴리머(copolymer)의 경우, 소수성이 커서 세포 지지체 심부까지 배지의 침투 및 확산이 어렵다는 단점이 있다. 또한 기존에 사용되었던 세라믹스의 경우, 자연골과 유사한 화학조성 때문에 생체 친화성은 우수하지만 분해속도가 너무 느려, 이식 부위에서 형성된 골 조직에 장애요인이 될 소지가 있으며, 폴리포스파젠의 경우는 현재 시험 단계로 아직 연구가 더 필요한 실정이다.Looking at each of the problems of the cell support, collagen, the strength is weak, difficult to control the rate of absorption, because it is usually used to extract from heterogeneous or homologous individuals, there is a possibility of causing an immune response. In the case of PGA mesh, the platelets are very thin, such as about 100 μm, so that the bone defects are not only difficult to use, but also have a weak strength. In the case of PLGA copolymers, the hydrophobicity is so large that it is difficult to penetrate and diffuse the medium to the deep part of the cell support. In addition, the ceramics used in the past have excellent biocompatibility due to the chemical composition similar to that of natural bone, but the degradation rate is too slow, which may cause obstacles to the bone tissue formed at the transplantation site, and polyphosphazene is currently tested. At this stage, more research is still needed.
이에 본 발명자들은 다공성의 생체 친화성이 좋은 골이식재에 관해 연구하던 중, 분산매를 이용하여 인산삼칼슘(TCP) 과립을 형성하고, 겔화를 촉진하는 제조 방법으로 다공성의 β-인산삼칼슘 과립을 제조하여 신생골의 형성을 촉진시키는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention, while studying a porous bio-friendly bone graft material, using a dispersion medium to form tricalcium phosphate (TCP) granules, and to promote the gelation of the porous β- tricalcium phosphate granules The present invention was completed by confirming the effect of promoting the formation of new bone.
본 발명은 다공성의 β-인산삼칼슘 과립의 제조 방법을 제공하고자 한다.The present invention is to provide a method for producing porous β-tricalcium phosphate granules.
또한, 본 발명은 다공성 β-인산삼칼슘 과립을 포함하는 골이식재 또는 골세포지지체를 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a bone graft material or bone cell support comprising a porous β- tricalcium phosphate granules.
본 발명은 다공성의 β-인산삼칼슘 과립의 제조 방법을 제공하며, 보다 상세하게는,The present invention provides a method for producing porous β-tricalcium phosphate granules, and more specifically,
(a) 물에 젤라틴 분말을 혼합하여 젤라틴 용액을 준비하는 단계; (a) mixing gelatin powder with water to prepare a gelatin solution;
(b) 인산삼칼슘(이하, 'TCP'로 기재함) 전구체 분말과 기공전구체를 혼합한 후, 상기 젤라틴 용액을 첨가하여 TCP 슬러리를 준비하는 단계;(b) mixing the tricalcium phosphate (hereinafter referred to as 'TCP') precursor powder with the pore precursor, and then adding the gelatin solution to prepare a TCP slurry;
(c) 상기 혼합된 TCP 슬러리를 교반중인 분산매에 첨가하여 구형의 과립을 형성하여 겔화시키는 단계;(c) adding the mixed TCP slurry to a stirring dispersion medium to form spherical granules and gelling them;
(d) 상기 겔화된 구형의 과립 표면을 유기용매로 분리, 세척하는 단계; 및(d) separating and washing the gelled spherical granule surface with an organic solvent; And
(e) 상기 세척된 구형 과립을 하소 및 소결하여 TCP 이외의 첨가물을 제거하는 단계를 포함한다.(e) calcining and sintering the washed spherical granules to remove additives other than TCP.
또한, 본 발명은 다공성 β-TCP 과립을 포함하는 골이식재 또는 골세포지지체를 제공한다.In addition, the present invention provides a bone graft material or bone cell support comprising a porous β-TCP granules.
이하 본 발명을 각 공정 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail for each process step.
단계 (a)에서는, 물, 바람직하게는 증류수에 젤라틴 분말을 혼합하여 젤라틴 용액을 준비한다.In step (a), the gelatin solution is prepared by mixing the gelatin powder in water, preferably distilled water.
젤라틴 분말은 돼지피부나 소피부로 만들어진 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 젤라틴 수용액은 고온에서는 졸 상태로 존재하나 온도가 떨어지게 되면 겔화되는 성질이 있으므로, 물 100 ㎖에 대해 6 ~ 20 중량부, 바람직하게는 6 ~ 10 중량부, 가장 바람직하게는 8 중량부의 젤라틴 분말을 첨가하여 30℃ ~ 80℃의 온도로 가열을 하면서 교반하여 젤라틴 용액을 준비한다.Gelatin powder can be purchased and used commercially made of pig skin or cow skin, gelatin aqueous solution exists in a sol state at high temperature, but gelling properties when the temperature drops, 6 ~ 20 weight per 100 ml of water Part, preferably 6 to 10 parts by weight, most preferably 8 parts by weight of gelatin powder is added and stirred while heating to a temperature of 30 ℃ to 80 ℃ to prepare a gelatin solution.
단계 (b)에서는, TCP 전구체 분말과 기공전구체를 혼합한 후, 상기 젤라틴 용액을 첨가하여 TCP 슬러리를 준비한다.In step (b), after mixing the TCP precursor powder and the pore precursor, the gelatin solution is added to prepare a TCP slurry.
TCP 전구체 분말은 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용하거나 통상의 방법을 이용하여 제조하여 사용할 수 있다. 기공전구체로서는 크기가 대략 90 ~ 110 ㎛인 고분자들을 사용할 수 있고, 기공전구체는 후술하는 하소과정에서 탈지(열처리를 통해 제거)될 수 있는, 200 ~ 600℃에서 기화되거나 기체로 분해되어 기공전구체가 차지하고 있던 공간에 기공을 형성할 수 있는 물질이면 어느 것이나 관계없으나, 바람직하게는 중공구형 고분자, 나프탈렌, 전분 등의 유기물을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 밀도가 0.1 g/㎤ 이하이고, 평균 입경이 60 ~ 90 ㎛이며, 외벽의 두께가 약 0.5 ~ 1.5 ㎛인 비닐리덴 클로라이드/아크릴로니트릴(PVDC) 공중합체의 중공구형 고분자 분말을 사용한다.The TCP precursor powder can be purchased and used commercially, or can be prepared and used using conventional methods. As the pore precursor, polymers having a size of about 90 to 110 μm may be used, and the pore precursor may be degassed (removed through heat treatment) during calcination, which will be described later. The pore precursor may be vaporized or decomposed into gas at 200 to 600 ° C. Any material that can form pores in the occupied space may be used. Preferably, organic materials such as hollow spherical polymer, naphthalene, and starch may be used. Most preferably, the density is 0.1 g / cm 3 or less, and the average particle diameter is used. The hollow spherical polymer powder of vinylidene chloride / acrylonitrile (PVDC) copolymer having a thickness of 60 to 90 µm and an outer wall thickness of about 0.5 to 1.5 µm is used.
TCP 전구체 분말에 100 g에 대해 1 ~ 5 중량부의 기공전구체를 첨가하는 것이 바람직하며, 균일하게 혼합한 후, 상기 젤라틴 용액 100 ㎖에 대해 TCP 전구체 분말 및 기공전구체의 혼합물을 바람직하게는 12 ~ 17 중량부로 첨가하고, 교반하여 TCP 슬러리를 준비한다. 이때, 교반 속도는 200 ~ 600 rpm이 바람직하며, 가장 바람직하게는 400 rpm으로 한다.It is preferable to add 1 to 5 parts by weight of the pore precursor with respect to 100 g of the TCP precursor powder, and after mixing uniformly, a mixture of the TCP precursor powder and the pore precursor with respect to 100 ml of the gelatin solution is preferably 12 to 17 Add by weight and stir to prepare TCP slurry. At this time, the stirring speed is preferably 200 to 600 rpm, most preferably 400 rpm.
단계(c)에서는, 상기 혼합된 TCP 슬러리를 교반 중인 분산매에 첨가하여 구형의 과립을 형성하여 겔화시킨다.In step (c), the mixed TCP slurry is added to the stirring dispersion medium to form spherical granules and gelate.
분산매로는 물과 반응을 하지 않는 용매가 사용 가능하며, 바람직하게는 미네랄 오일(mineral oil) 또는 일반 식용유(corn oil)를, 가장 바람직하게는 일반 식용유를 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 또한 슬러리의 점도와 분산매의 교반속도에 따라 구형 과립의 크기가 조절이 가능하므로, 두 조건을 변화시켜 구형 과립의 직경을 조절할 수가 있다. 본 발명에서는 과립의 크기를 이식재로서 사용하기에 적당한 크기인 1.4 ㎜ ~ 2.0 ㎜, 1 ㎜ ~ 0.6 ㎜, 0.6 ㎜ ~ 0.4 ㎜ 또는 0.4 ㎜ ~ 0.25 ㎜의 크기로 제조하기 위하여 상기 조건을 조절한다. As a dispersion medium, a solvent that does not react with water may be used. Preferably, a mineral oil or a corn oil may be used, and most preferably, a commercial oil may be purchased. . In addition, since the size of the spherical granules can be adjusted according to the viscosity of the slurry and the stirring speed of the dispersion medium, the diameter of the spherical granules can be adjusted by changing two conditions. In the present invention, the conditions of the granules are adjusted to produce a size of 1.4 mm to 2.0 mm, 1 mm to 0.6 mm, 0.6 mm to 0.4 mm or 0.4 mm to 0.25 mm, which is a size suitable for use as an implant.
TCP 슬러리를 과립화시키기 위하여 1차로 상온의 분산매를 이용하고, 이를 겔화시키기 위하여 2차로 냉장 보관된 분산매를 이용한다. 상온의 분산매는 100 ~ 1000 rpm으로 교반하면서, TCP 슬러리를 주입하여 TCP 슬러리가 분산매 내에서 구형으로 분산이 되도록 계속적으로 교반한다. 구형으로 분산된 TCP 슬러리의 빠르게 겔화를 시켜 주기 위해서 상온보다 낮은 온도(0 ~ 20℃)를 갖는 분산매를 첨가하여 최종적으로 겔화된 구형 과립을 얻는다. 이때, 상기 1차 상온 분산매는 TCP 슬러리의 1 ~ 3배의 부피로 첨가하고, 2차 냉장 보관된 분산매는 TCP 슬러리의 4 ~ 5배의 부피로 첨가하는 것이 바람직하다.In order to granulate the TCP slurry, a dispersion medium at room temperature is used first, and a dispersion medium stored in a second refrigerator is used to gel it. While the dispersion medium at room temperature is stirred at 100 to 1000 rpm, the TCP slurry is injected and continuously stirred so that the TCP slurry is spherically dispersed in the dispersion medium. In order to gel rapidly the spherical dispersed TCP slurry, a dispersion medium having a temperature lower than room temperature (0 to 20 ° C.) is added to obtain a finally gelled spherical granule. At this time, the primary room temperature dispersion medium is preferably added in a volume of 1 to 3 times the TCP slurry, the secondary cold storage dispersion medium is preferably added in a volume of 4 to 5 times the TCP slurry.
단계(d)에서는, 상기 겔화된 구형의 과립 표면을 유기용매를 사용하여 세척하여 과립 표면의 수분 및 분산매 등을 제거한다.In step (d), the gelled spherical granule surface is washed with an organic solvent to remove moisture, dispersion medium, etc. on the surface of the granules.
상기 겔화된 구형의 과립을 유기용매를 사용하여 분산매로부터 분리, 세척한다. 분산매로부터 구형 과립을 분리하기 위해서 오일류와 반응하여 섞이게 되는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름(chloroform), 에테르(ether), 헥산(hexane), 에탄올(ethanol), 아세톤(acetone) 또는 이들의 혼합용매이며, 가장 바람직하게는 헥산 및 아세톤이다. 수류 감압 장치를 이용하여 과립의 표면에 있는 분산매를 빠르게 세척할 수 있다. 상기와 같이 유기용매를 사용하게 되면, 분산매의 제거뿐만 아니라, 구형 과립의 겔화를 더욱 촉진하고, 남아있는 수분을 증발시켜 수분의 양을 감소시킬 수 있다. The gelled spherical granules are separated and washed from the dispersion medium using an organic solvent. In order to separate the spherical granules from the dispersion medium, an organic solvent may be used which is mixed with the oils, preferably chloroform, ether, hexane, ethanol, acetone or these. Mixed solvents, most preferably hexane and acetone. A water flow decompression device can be used to quickly wash the dispersion medium on the surface of the granules. When the organic solvent is used as described above, as well as the removal of the dispersion medium, it is possible to further promote the gelation of the spherical granules, and to reduce the amount of moisture by evaporating the remaining moisture.
단계(e)에서는, 상기 세척된 구형 과립을 하소(calcine) 및 소결(sintering)하여 구형 과립의 수분, 유기용매 및 잔여 유기물을 제거하고, TCP 전구체를 β-TCP로 상전이 시킨다.In step (e), the washed spherical granules are calcined and sintered to remove water, organic solvent and residual organics of the spherical granules, and the TCP precursor is phase-transferred to β-TCP.
상기 구형 과립을 승온 속도를 0.15℃/분 ~ 1.10℃/분으로 하여 1000 ~ 1180℃에서 열처리하여 TCP 전구체를 β-TCP로 상전이시키며, 1000 ~ 1180℃에서 열처리 단계 이전에The spherical granules were heat-treated at 1000 to 1180 ° C. with a temperature increase rate of 0.15 ° C./min to 1.10 ° C./min to phase-transfer the TCP precursor to β-TCP, before the heat treatment step at 1000 to 1180 ° C.
30 ~ 50℃에서 수분을 제거하는 단계;Removing water at 30 to 50 ° C .;
250 ~ 350℃에서 수분 및 유기 용매를 제거하는 단계; 및Removing water and organic solvent at 250-350 ° C .; And
570 ~ 670℃에서 잔여 유기물 성분들을 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.It may further comprise the step of removing residual organic components at 570 ~ 670 ℃.
우선, 구형 과립에 남아있는 수분을 상온이나 건조기(dry oven)를 이용하여 30 ~ 50℃에서 건조하여 제거하며, 바람직하게는 3 ~ 5시간 동안 실시한다. 다음으로, 구형 과립에 남아 있는 젤라틴, 기공전구체 및 유기용매들을 제거하기 위하여, 승온 속도를 0.15℃/분 ~ 1.10℃/분으로 하여 250 ~ 350℃ 및 570 ~ 670℃까지 온도를 높여 소성하며, 바람직하게는 승온 속도를 0.25℃/분으로 하여 300℃까지 승온하여 2 ~ 4시간 동안 소성한 후, 승온 속도를 0.25℃/분으로 하여 620℃까지 승온하여 4 ~ 6시간 동안 유지한다. 다음으로, TCP 전구체를 β-TCP로 상전이 시키기 위하여 1000 ~ 1180℃까지 승온시켜 하소하며, 바람직하게는 승온 속도를 1℃/분로 하여 1000 ~ 1180℃까지, 더욱 바람직하게는 1080℃까지 승온시켜 하소한다. 최종 하소 온도 및 시간은 β-TCP가 α-TCP로 상전이 되는 온도 이하의 온도와 시간으로 β-TCP 과립 내에 미세다공성이 존재하는 온도와 시간으로 하소할 수 있으며, 바람직하게는 11 ~ 13시간, 가장 바람직하기로는 12시간 동안 수행한다.First, the moisture remaining in the spherical granules is removed by drying at 30 to 50 ° C. using room temperature or a dryer (dry oven), preferably 3 to 5 hours. Next, in order to remove gelatin, pore precursors and organic solvents remaining in the spherical granules, the temperature is raised to a temperature of 250 to 350 ° C. and 570 to 670 ° C. at a heating rate of 0.15 ° C./minute to 1.10 ° C./minute, and then calcined. Preferably, the temperature increase rate is 0.25 ° C./min, the temperature is raised to 300 ° C. and calcined for 2 to 4 hours, and the temperature increase rate is 0.25 ° C./min, the temperature is raised to 620 ° C. and maintained for 4 to 6 hours. Next, in order to phase-transfer the TCP precursor to β-TCP, the temperature is raised to 1000 to 1180 ° C and calcined, and preferably, the temperature is raised to 1000 to 1180 ° C, more preferably 1080 ° C at a heating rate of 1 ° C / min. do. The final calcination temperature and time can be calcined at a temperature and time below which the β-TCP phase transitions to α-TCP at a temperature and time at which microporosity exists in the β-TCP granules, preferably 11 to 13 hours, Most preferably, it is carried out for 12 hours.
본 발명에 따른 β-TCP 과립을 관찰 및 분석한 결과, 미세다공성과 거대다공성이 모두 존재하며, 또한 구형 입자 내 탄소, 수소, 질소, 황 또는 어떠한 유기물도 함유되어 있지 않다. 또한, β-TCP 과립의 안전성을 마우스의 결합조직으로부터 분리된 섬유모세포종을 대상으로 측정한 결과, 세포 증식 저해율이 -10%로 나타 나 안전성에 문제가 없을 뿐만 아니라, 실험 동물에 이식하였을 때, 육안적으로나 현미경 관찰 상에서 염증 소견이 발견되지 않아 면역학적으로 문제없이 이식할 수 있다. 또한, 실험 동물의 두개골 봉합선 사이에 결손부를 형성시키고 본 발명에 따른 β-TCP 과립을 이식하면, 결손부 내에는 교원성 섬유으로 채워지며 매식물 주위 및 결체조직 내에 신생 모세혈관들이 증식하고, 다공성을 가진 매식물 내부에는 골아세포의 분열과 골양조직, 미성숙골이 형성되며, 매식체와 직접 접촉하는 신생골의 형성이 증가되는 양상을 보인다. 뿐만 아니라, 신생골과 매식체 사이에는 결체조직이 잔존하는 부위도 보여 신생골, 매식체, 그리고 결체조직이 혼재되어 있는 양상을 나타낸다. 또한, 유전독성을 나타내지 않으므로, 본 발명에 따른 β-TCP 과립은 골재생을 촉진시키기 위해 사용되는 골이식재 또는 골세포지지체로 유용하게 사용될 수 있다.As a result of observing and analyzing the β-TCP granules according to the present invention, both microporosity and macroporosity are present, and no spherical particles contain carbon, hydrogen, nitrogen, sulfur or any organic matter. In addition, as a result of measuring the safety of β-TCP granules in fibroblastoma isolated from connective tissue of mouse, cell proliferation inhibition rate was -10%, and there was no safety problem, and when transplanted into experimental animals, Inflammatory findings were not detected visually or microscopically and can be transplanted immunologically without problems. In addition, when a defect is formed between the cranial sutures of the experimental animal and the β-TCP granules according to the present invention are implanted, the defect is filled with collagen fibers and proliferates new capillaries around the plant and within the connective tissue, and porous Osteoblasts and osteoblasts, immature bone is formed in the medium with the bone, and the formation of new bone in direct contact with the medium is increased. In addition, between the new bone and the coronary body shows the region where the connective tissue remains, showing that the new bone, the coronary body, and the connective tissue is mixed. In addition, because it does not exhibit genotoxicity, β-TCP granules according to the present invention can be usefully used as a bone graft material or bone cell support used to promote bone regeneration.
본 발명의 골이식재 또는 골세포지지체는 본 발명에 따른 β-TCP 과립에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 성분을 1종 이상 포함시켜 제조할 수 있다.The bone graft material or osteocyte support of the present invention can be prepared by including at least one component exhibiting the same or similar function in the β-TCP granules according to the present invention.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, preferred examples and experimental examples are presented to help understand the present invention. However, the following Examples and Experimental Examples are provided only to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the Examples.
실시예Example 1: 본 발명의 β- 1: β- of the present invention 인산삼칼슘Tricalcium phosphate (TCP) 과립 제조(TCP) Granules Manufacturing
1-1: TCP 전구체 합성1-1: TCP precursor synthesis
본 발명의 β-TCP 과립을 제조하기 위하여, 1단계로 TCP 전구체를 하기와 같이 합성하였다.To prepare β-TCP granules of the present invention, TCP precursors were synthesized in one step as follows.
칼슘의 공급원으로 770 ㎖의 0.4 M 칼슘 니트레이트(calcium nitrate, Ca(NO3) 2 ·4H2O) 용액을 제조하였다. 상기 용액을 교반하면서 포스페이트(phosphate)의 공급원으로서 0.154 M 암모늄 포스페이트(Ammonium phosphate, (NH4)2HPO) 2000 ㎖을 연동 펌프를 이용하여 일정한 속도로 떨어뜨리면서 침전이 생성되도록 하였다. 이 때 pH를 7.4로 유지하기 위해서 염기성 용액으로서 염화나트륨(NaOH) 용액과 산성용액으로서 염산(HCl) 용액을 사용하였다. 반응이 끝난 후, 혼합 용액은 37℃의 고온실(warm room)에서 24시간 동안 숙성시켰다. 숙성시킨 혼합 용액은 수류 감압장치를 이용하여 침전물과 용액을 분리하였고, 3차 증류수로 세척 및 여과하여 최종 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 완전히 건조, 분쇄한 후 체가름하여 TCP 전구체 분말을 제조하였다. 0.4 M calcium nitrate in 770 ㎖ as a source of calcium (calcium nitrate, Ca (NO 3 ) 2 · 4H 2 O) to prepare a solution. While stirring the solution, 2000 ml of 0.154 M ammonium phosphate (NH 4 ) 2 HPO as a source of phosphate was dropped at a constant rate using a peristaltic pump to cause precipitation. At this time, sodium chloride (NaOH) solution as the basic solution and hydrochloric acid (HCl) solution as the acid solution were used to maintain the pH at 7.4. After the reaction, the mixed solution was aged for 24 hours in a warm room at 37 ℃. The aged mixed solution was separated from the precipitate and the solution using a water flow decompression device, washed with tertiary distilled water and filtered to obtain a final precipitate. The obtained precipitate was dried completely, pulverized and sieved to prepare a TCP precursor powder.
1-2: TCP 전구체 구형 과립 제조1-2: TCP Precursor Spherical Granules Preparation
상기 실시예 1-1에서 제조한 TCP 전구체 분말을 이용하여 하기와 같이 TCP 전구체 구형 과립을 제조하였다.TCP precursor spherical granules were prepared using the TCP precursor powder prepared in Example 1-1 as follows.
실시예 1-1에서 제조한 TCP 전구체 분말 100 g에 기공전구체로서 평균 입경 이 약 80 ㎛이며, 외벽의 두께가 약 1 ㎛인 비닐리덴 클로라이드/아크릴로니트릴(PVDC) 공중합체(익스팬슬; 익스팬슬(expancel)사, 스웨덴)의 중공구형 고분자 분말을 30 ㎖을 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 또한 8%의 젤라틴 용액을 대략 60℃의 온도가 유지되게 제조하였다. TCP 전구체 분말와 기공전구체가 균일하게 혼합된 분말에 준비한 젤라틴 용액을 700 ㎖ 첨가, 혼합하여 TCP 전구체 슬러리를 제조하였다.A vinylidene chloride / acrylonitrile (PVDC) copolymer (expand; expand) having an average particle diameter of about 80 μm and a thickness of about 1 μm as a pore precursor in 100 g of the TCP precursor powder prepared in Example 1-1. 30 ml of the hollow spherical polymer powder of Expensel, Sweden) was added and mixed uniformly. 8% gelatin solution was also prepared to maintain a temperature of approximately 60 ° C. A TCP precursor slurry was prepared by adding 700 ml of a gelatin solution prepared in a powder in which the TCP precursor powder and the pore precursor were uniformly mixed.
1500 ㎖ 가량의 상온의 식용유를 400 rpm으로 교반하면서 상기의 TCP 전구체 슬러리를 첨가하여 구형의 과립을 제조한 후, 과립의 겔화를 촉진하기 위하여 3500 ㎖ 가량의 냉장 보관된 식용유를 상기와 같은 교반 조건에서 첨가하였다. 식용유 내에서 겔화된 TCP 전구체 구형 과립을 여과기를 이용하여 일부 분리한 후, 수류 감압 장치를 이용해 TCP 전구체 구형 과립과 표면에 남아있는 식용유를 헥산으로 여과, 세척하였다. 또한, TCP 전구체 구형 과립의 겔화 촉진 및 수분 제거를 위하여 아세톤을 이용하여 재차 여과, 세척하여 TCP 전구체 구형 과립을 얻었다. 구형 과립에 남아있는 수분은 상온에서 건조하여 제거하였다. After stirring 1500 mL of room temperature cooking oil at 400 rpm, the above-mentioned TCP precursor slurry was added to prepare spherical granules, and then 3500 mL of refrigerated oil stored in refrigerated oil in order to promote gelation of the granules was stirred as described above. Was added. The gelled TCP precursor spherical granules in the cooking oil were partially separated using a filter, and then the TCP precursor spherical granules and the cooking oil remaining on the surface were filtered and washed with hexane using a water flow decompression device. Further, in order to promote gelation of the TCP precursor spherical granules and to remove water, the TCP precursor spherical granules were again filtered and washed with acetone. Water remaining in the spherical granules was removed by drying at room temperature.
1-3: 하소 및 소결1-3: Calcination and Sintering
상기 실시예 1-2에서 얻은 TCP 전구체 구형 과립을 최종 TCP 구형 과립을 얻기 위하여 전기로에서 하소하였다. 하소의 승온 속도에 따라 TCP 구형 과립 제조에 사용된 첨가제들이 잔존하게 되므로 여러 단계를 거쳐 하소를 하였다. The TCP precursor spherical granules obtained in Example 1-2 above were calcined in an electric furnace to obtain the final TCP spherical granules. Since the additives used in the manufacture of TCP spherical granules remained according to the heating rate of the calcining, the calcining was performed through several steps.
수분과 유기용매를 제거하기 위해서 300℃에서 소성을 하였고, 젤라틴과 구 형 전구체를 제거하기 위해서 620℃에서 분해시켰다. 또한, 분자량이 큰 젤라틴을 완전히 제거하기 위하여 승온 속도를 0.25℃/분으로 하였으며, 620℃에서 5시간 동안 유지하여 잔여 유기물 성분들을 완전히 제거하였다. TCP 전구체가 완전하게 TCP로 합성될 수 있고, 골격의 치밀화를 이루되 미세다공성이 완전히 없어지지 않도록 1℃/분의 승온 속도로 1080℃까지 올려 12시간 동안 유지한 후, 서서히 냉각시켜 최종 TCP 구형 과립을 얻을 수 있었다. The mixture was calcined at 300 ° C. to remove moisture and organic solvents, and decomposed at 620 ° C. to remove gelatin and spherical precursors. In addition, the temperature increase rate was 0.25 ℃ / min to completely remove the high molecular weight gelatin, and was maintained at 620 ℃ for 5 hours to completely remove the remaining organic components. The TCP precursor can be completely synthesized by TCP, and maintained at 12 ° C. at a temperature rising rate of 1 ° C./min for 12 hours so as to achieve densification of the skeleton but not completely eliminate microporosity, and then gradually cool the final TCP spherical granules. Could get
합성된 TCP은 X-선 회절을 통한 분석을 통하여 확인하였으며(도 1), 상기에서 얻은 본 발명의 TCP 구형 과립의 표면 및 절단면을 전자현미경(SEM)으로 관찰하였다(도 2, 도 3). 또한, 구형 입자내의 유기물 함량을 원소 분석기(Elemental Analyser)를 이용하여 측정하였다(표 1). The synthesized TCP was confirmed by analysis through X-ray diffraction (FIG. 1), and the surface and cut surface of the TCP spherical granules of the present invention obtained above were observed by electron microscopy (SEM) (FIGS. 2 and 3). In addition, the organic content in the spherical particles was measured using an elemental analyzer (Table 1).
도 1에 나타난 바와 같이, 2차 상이 나타나지 않는 X-선 회절 패턴을 나타내어 완전한 TCP가 합성되었음을 확인 할 수 있었다.As shown in Figure 1, it was confirmed that the complete TCP was synthesized by showing an X-ray diffraction pattern does not appear in the secondary phase.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 전자현미경 관찰을 통해 구형의 과립이 생성되었음을 확인 할 수 있었고, 도 3에 나타난 바와 같이, 구형 과립의 절단면에서 미세다공성 및 거대다공성이 모두 존재함을 확인할 수 있었다.In addition, as shown in Figure 2, it was confirmed that the spherical granules were produced through the electron microscope observation, as shown in Figure 3, it was confirmed that both the microporous and macroporous in the cutting surface of the spherical granules. .
또한, 표 1에 나타난 바와 같이, 구형 과립 내에 탄소(C), 수소(H), 질소(N), 황(S) 및 어떠한 유기물도 함유되지 않았음을 알 수 있었다.In addition, as shown in Table 1, it was found that the spherical granules did not contain carbon (C), hydrogen (H), nitrogen (N), sulfur (S) and any organic matter.
실시예Example 2 내지 9: β- 2 to 9: β- 인산삼칼슘Tricalcium phosphate (TCP) 구형 과립 제조(TCP) Spherical Granules Manufacturing
실시예 1-2의 β-TCP 전구체 구형 과립 제조 단계에서 조건을 달리하여 실시예 2 내지 9을 제조하였다. Examples 2 to 9 were prepared by changing conditions in the β-TCP precursor spherical granule preparation step of Example 1-2.
젤라틴 용액의 농도, 젤라틴 용액의 양 및 교반 속도를 달리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 각 실시예에 따른 조건을 표 2에 나타내었다.It was prepared in the same manner as in Example 1 except for changing the concentration of the gelatin solution, the amount of the gelatin solution and the stirring speed. The conditions according to each example are shown in Table 2.
표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2 및 실시예 3은 실시예 1과 젤라틴 용액의 농도만을 다르게 하였고, 실시예 4 내지 7은 실시예 1과 젤라틴 용액의 양을 다르게 하였고, 실시예 8 및 9는 실시예 1과 교반 속도를 다르게 하였다.As shown in Table 2, Examples 2 and 3 differed only in the concentration of the gelatin solution from Example 1, Examples 4 to 7 varied the amounts of the gelatin solution from Example 1, Examples 8 and 9 Was different from the stirring speed of Example 1.
각 경우에 대하여 β-TCP 구형 과립을 제조해 본 결과, 실시예 4 및 실시예 8의 경우를 제외하고 구형 과립 입자의 직경이 큰 차이를 나타내지는 않았다. 그러나, 실시예 4의 경우는 젤라틴 용액의 양이 적어 TCP 슬러리의 점도가 높아져 입자 크기가 증가되었으며, 실시예 8의 경우는 교반 속도가 느려 과립 입자의 크기가 증가되었다.As a result of producing β-TCP spherical granules in each case, the diameters of the spherical granule particles did not show a big difference except in the case of Examples 4 and 8. However, in the case of Example 4, the amount of the gelatin solution was small, so that the viscosity of the TCP slurry was increased, and the particle size was increased.
따라서, TCP 슬러리의 점도와 교반 속도를 조절하여 구형 과립 입자의 크기를 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.Therefore, it was confirmed that the size of the spherical granule particles could be adjusted by adjusting the viscosity and the stirring speed of the TCP slurry.
실험예Experimental Example 1: 본 발명의 β- 1: β- of the present invention 인산삼칼슘Tricalcium phosphate (TCP) 구형 과립의 안전성 검사(TCP) Safety check of spherical granules
상기 실시예 1에서 제조된 β-TCP 구형 과립의 안전성을 세포 증식 시험을 통해 확인하고자 하기와 같은 시험을 실시하였다.The following test was performed to confirm the safety of the β-TCP spherical granules prepared in Example 1 through a cell proliferation test.
1-1: 세포 배양1-1: Cell Culture
본 시험에서 사용한 세포는 독성 시험에 적합한 마우스의 결합 조직으로 부터 분리한 섬유아세포인 L929 세포(ATCC No. CCL-1™)를 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 통상적인 방법에 의해 10% FBS가 포함된 최소 필수 배지(MEM)를 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 세포는 75 ㎠ 배양 플라스크에서 배양하였으며, 배양액은 일주일에 2회 교환하였고, 세포가 단층을 이룰 정도로 충분히 배양되면 1:10으로 계대 배양하였다.The cells used in this test were obtained from ATCC with L929 cells (ATCC No. CCL-1 ™), fibroblasts isolated from connective tissues of mice suitable for toxicity testing. Culture was carried out in an incubator at 37 ° C., 95% humidity, 5% CO 2 conditions using a minimum essential medium (MEM) containing 10% FBS by conventional methods. Cells were cultured in 75
1-2: 세포 증식 억제 시험1-2: cell proliferation inhibition test
상기 실시예 1에서 제조한 β-TCP 구형 과립을 과립 4g 당 20 ㎖의 생리 식염수를 첨가하여 37℃ 항온수조에서 72시간 동안 진탕함으로써 β-TCP 구형 과립의 검액을 만들었다. 실험예 1-1에서 플라스크를 이용하여 단층 배양한 세포에 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)을 처리하여 세포를 수집한 후, 혈구계수기(haemocytometer)로 세포수를 계측한 다음 배양액 ㎖ 당 106개의 세포가 되도록 세포 현탁액을 만들었다. 또한, 상기에서 제조한 β-TCP 구형 과립의 검액과 배양액을 동량 혼합하여 β-TCP 구형 과립 처리 배양액으로 하였으며, 증류수와 배양액을 동량 혼합하여 대조 배양액으로 하였다.The β-TCP spherical granules prepared in Example 1 were added with 20 ml of physiological saline per 4 g of granules and shaken for 72 hours in a constant temperature water bath at 37 ° C. to prepare a sample solution of the β-TCP spherical granules. Then by using a flask in Experimental Example 1-1, the single-layer process Trypsin -EDTA (trypsin-EDTA) in the cultured cells collect the cells, one measuring the number of cells in blood cell counter (haemocytometer) and then the culture of ㎖ 10 6 per Cell suspensions were made to become cells. In addition, the same amount of the test solution and the culture medium of the β-TCP spherical granules prepared above were mixed to obtain a β-TCP spherical granule-treated culture solution, and distilled water and the culture solution were mixed in the same amount to form a control culture medium.
상기에서 제조한 세포 현탁액을 0.2 ㎖(2 × 105개 세포)씩을 15개의 시험관에 넣고, 그 중 5개에는 β-TCP 구형 과립 처리 배양액을 2 ㎖씩 넣었으며(실험군), 다른 10개의 시험관에는 대조 배양액을 2 ㎖씩(반응 개시시의 대조군 5개 및 72시간 대조군 5개) 넣었다. 이 때, 대조 배양액을 넣은 시험관 중 5개를 원심분리하여 배양액을 제거한 후, 세포를 pH 7.0의 인산완충 생리식염수에 재현탁시켰다. 이 현탁액을 다시 두 번 원심분리하여 세포를 세척한 후, 4℃에서 보존하여 반응 개시시의 대조군으로 하였다.0.2 mL (2 × 10 5 cells) of the cell suspension prepared above were placed in 15 test tubes, 5 of which contained 2 mL of β-TCP spherical granule culture medium (experimental group), and another 10 test tubes. 2 ml of control culture (5 controls at the start of the reaction and 5 controls for 72 hours) were added to the flask. At this time, five of the test tubes containing the control culture solution were centrifuged to remove the culture solution, and the cells were resuspended in phosphate buffered saline at pH 7.0. The suspension was centrifuged twice again to wash the cells, and then stored at 4 ° C to serve as a control at the start of the reaction.
처리군 및 72시간 대조군의 10개 시험관 내의 세포들을 24-웰 배양 플래이트로 옮긴 후, 5% CO2 배양 장치에서 72시간 동안 배양하였다. Cells in 10 test tubes of treatment group and 72 hour control group were transferred to 24-well culture plate and incubated for 72 hours in 5% CO 2 culture apparatus.
처리군 및 대조군의 세포를 파괴한 후, 로우리(Lowry)변색법으로 총 단백질 함량을 측정하였고, 각 군의 평균 흡광도를 구한 후 세포 증식저해율을 하기 수학식에 의하여 계산하였다.After breaking the cells of the treated group and the control group, total protein content was measured by Lowry's discoloration method, and after calculating the average absorbance of each group, cell proliferation inhibition rate was calculated by the following equation.
결과를 표 3에 나타내었다.The results are shown in Table 3.
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 β-TCP 구형 과립은 L929 세포에 대해 세포 증식 저해 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Table 3, it was confirmed that the β-TCP spherical granules of the present invention had no cell proliferation inhibitory effect on L929 cells.
실험예 2: 본 발명의 β-TCP 구형 과립의 이식 시험Experimental Example 2: Transplantation Test of β-TCP Spherical Granules of the Present Invention
본 발명의 β-TCP 구형 과립을 생체 내에 이식하였을 때, 생체 내에서 주위조직과의 국소적 반응을 알아보기 위해 하기와 같이 육안적, 현미경적으로 관찰하였다.When the β-TCP spherical granules of the present invention were implanted in vivo, they were visually and microscopically observed as follows to determine local reactions with surrounding tissues in vivo.
2-1: 실험 동물 사육2-1: breeding experimental animals
본 시험에 사용한 동물은 몸무게 250g 내외의 건강한 스프라그-다울레이(Sprague-Dawley)종 수컷 흰쥐를 사용하였다. 통상적인 고형 사료로 사육하였으며 식수는 무제한 공급하였다.Animals used in this study were healthy Sprague-Dawley male rats weighing about 250 g. It was raised on a regular solid feed and had unlimited drinking water.
2-2: 이식 시험2-2: transplantation test
이식 시험에 사용된 골편은 높이×지름을 1 ㎜×10 ㎜ 규격으로 제작하였고, 방사선 멸균 소독을 하였다. 또한, 실시예 1에서 제조한 β-TCP 구형 과립을 실험예 1-2에서와 동일한 방법으로 처리하였다.The bone fragments used for the implantation test were produced in a size of 1 mm × 10 mm in height × diameter and subjected to radiation sterilization. In addition, the β-TCP spherical granules prepared in Example 1 were treated in the same manner as in Experimental Example 1-2.
흰쥐를 케타민(Ketamine; Ketara 10㎎/㎏)과 2% 럼푼(Xylazine; Rompun 0.15㎖/㎏)으로 전신마취 시킨 후, 등쪽 피부의 털을 제거하고 소독액으로 피부를 소독하였다. 5 ㎜ 가량 피부를 절개하고 피하조직을 언더마이닝(undermining)하여 이식골편이 들어갈 위치를 확보한 후, 상기에서 준비해 놓은 골편을 절개 부위에서 1㎝이상 떨어지도록 이식하고 봉합하였다. 이식 1주, 2주, 8주에 각각 3마리씩 경부염전으로 희생시킨 후, 즉시 이식 골편을 포함한 주위 조직을 채취하여 10% 중성완충 포르말린에 고정하였다. 2일간 동일 고정액에서 고정한 후 3일간 5% 질산으로 탈회하고, 이식 골편을 통상적인 방법에 따라 에틸알콜(ethylalcohol)로 탈수하고 자이렌(xylene)으로 치환한 후 파라핀(paraffin)에 포매(embeding)하였다.Rats were subjected to general anesthesia with ketamine (Ketamine; Ketara 10mg / kg) and 2% lump (Xylazine; Rompun 0.15ml / kg), and then the hair of the dorsal skin was removed and the skin was disinfected with an antiseptic solution. After cutting the skin about 5 mm and submining the subcutaneous tissue (undermining) to secure the position to enter the bone graft, the bone fragment prepared above was implanted and sutured at least 1 cm away from the incision site. After sacrificing cervical torsion, three rats each at 1, 2, and 8 weeks of transplantation, peripheral tissues including graft bone were immediately collected and fixed in 10% neutral buffered formalin. After fixation in the same fixation solution for 2 days, demineralization with 5% nitric acid for 3 days, dehydration of the transplanted bone with ethylalcohol, replacement with xylene, and embedding in paraffin after 3 days It was.
상기 포매된 조직은 박절기를 이용하여 4 ㎛ 두께로 잘라 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-eosin) 염색을 시행하였다. 1주 경과 후, 시험 결과를 육안, 광학 현미경으로 관찰하였다.The embedded tissue was cut into 4 μm thickness using a thin section and subjected to Hematoxylin-eosin staining. After 1 week, the test result was visually observed with an optical microscope.
결과를 도 4에 나타내었다.The results are shown in FIG.
육안적 관찰 결과, 조직에서 특별한 염증 소견이 관찰되지 않으며 이식 골편이 얇고 투명한 조직에 의해 둘러싸여 있었다.Visual observation showed no specific inflammatory findings in the tissue and the graft fragment was surrounded by thin transparent tissue.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 광학 현미경적 관찰 결과, 이식된 골편의 표면이 육아조직성의 주위 조직들로 싸여져 있었으며, 섬유조직은 미약하였으며, 혈관과 많은 수의 세포들이 이식 골편 주변과 내부를 채우고 있었다. 또한, 이식 골편에 근접해서는 일부 다핵거대세포들이 관찰되는 부분도 있었다. 대부분의 이식 골편들은 표면이 탈회되고 있었으며, 조직 표본 제작시 질산에 탈회되어 그 크기가 감소되어 있었다.In addition, as shown in FIG. 4, as a result of optical microscopic observation, the surface of the implanted bone fragment was enclosed with the surrounding tissues of granulation tissue, the fibrous tissue was weak, and blood vessels and a large number of cells were moved around and inside the bone fragment. Was filling. In addition, some of the multinucleated giant cells were observed near the bone fragments. Most of the graft fragments had surface demineralization and reduced in size due to demineralization with nitric acid during tissue specimen preparation.
실험예Experimental Example 3: 본 발명의 β-TCP 구형 과립의 3: of β-TCP spherical granules of the present invention 골이식재로서의As a bone graft material 효능 시험 Efficacy test
본 발명의 β-TCP 구형 과립의 효능 실험은 TCP에 대한 골조직의 생물학적 반응을 분석하였으며, 골이식재로서 임상적 효능을 알아보기 위한 실험을 하였다. Efficacy experiment of β-TCP spherical granules of the present invention analyzed the biological response of bone tissue to TCP, and experimented to determine the clinical efficacy as a bone graft material.
3-1: 실험 동물 사육3-1: breeding experimental animals
본 시험에 사용한 동물은 몸무게 250g 내외의 건강한 스프라그-다울레이(Sprague-Dawley)종 수컷 흰쥐를 사용하였다. 통상적인 고형 사료로 사육하였으며 식수는 무제한 공급하였다.Animals used in this study were healthy Sprague-Dawley male rats weighing about 250 g. It was raised on a regular solid feed and had unlimited drinking water.
3-2: 동물에의 이식3-2: Transplantation into Animals
흰쥐를 케타민(Ketamine (Ketara 10㎎/㎏))과 2% 럼푼(Xylazine (Rompun 0.15㎖/㎏))으로 전신마취 후, 통법에 따라 제모 및 술 전 무균처리(10% 포비돈-아이오딘(povidone-iodine)으로 문지르고 70% 알코올로 닦아냄)를 시행하였다. 다음으로, 흰쥐의 두개부 정중부를 절개하여 전층막을 거상하였으며, 다시 하방의 골막에 조심스럽게 절개를 가하여 두개골 표면에서 분리하였다. 직경 6 ㎜의 핸드 트레핀 바(hand trephin bur)로 두개골 봉합선 사이에 한개의 결손부를 형성하였다. 결손부 형성시 열 발생을 방지하기 위해 식염수를 주사하면서 수술을 시행하였다. 이때, 음성대조군은 결손부를 형성하고 아무것도 채워넣지 않고 그대로 봉합하였고, 실험군은 방사선 멸균한 TCP(0.4 ~ 0.6 ㎜)를 각각 이식하여 골막과 피부를 층별 봉합하였다. Rats were subjected to general anesthesia with ketamine (Ketamine (10 mg / kg)) and 2% lump (Xylazine (Rompun 0.15mL / kg)), followed by conventional hair removal and aseptic treatment (10% povidone-iodine (povidone). -iodine) and scrubbed with 70% alcohol). Next, the medial membrane of the head of the rat was incised to elevate the penetrating membrane. Then, the lower periosteum was carefully removed to separate from the skull surface. One defect was formed between cranial sutures with a hand trephin bur of 6 mm in diameter. Surgery was performed by injecting saline to prevent heat generation during formation of the defect. At this time, the negative control group formed a defect and was sealed without filling anything, and the experimental group was implanted with radiation sterilized TCP (0.4 ~ 0.6 ㎜) respectively to seal the periosteum and skin layer by layer.
3-3: 조직표본 제작3-3: Organizational Sample Production
각 군은 매식 후, 1주 및 4주 후에 흰쥐를 희생시켜 측두골을 채취하여 보우인스 용액(Bouin's Solution)에 고정하고, 5% 질산(Nitric acid)으로 탈회하였다. 충분하게 탈회가 이루어지면, 통법에 따라 에틸 알코올(ethyl alcohol)로 탈수하고 자이렌(xylene)으로 치환하여 파라핀 포매하였다. 포매된 조직은 박절기로 4 ㎛ 두께로 잘라 절편으로 만들고, 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-eosin)과 고모리(Gomori's trichrom)염색을 시행하였다. After each meal, each group was sacrificed to rats at 1 and 4 weeks, and the temporal bones were collected, fixed in Bowin's Solution, and demineralized with 5% nitric acid. After sufficient deliming, dehydrated with ethyl alcohol according to the conventional method and substituted with xylene to embed paraffin. The embedded tissues were cut into thin sections with a thickness of 4 μm, sections were made, and hematoxylin-eosin and Gomori's trichrom staining were performed.
1주 후의 관찰 결과, 음성대조군의 결손부 내에는 섬유성 결체조직의 증식과 활성화된 섬유아세포 및 혈관 내피세포들의 증식이 관찰되었으며, 염증성 세포가 산재하고 있음을 확인하였다. 반면, 실험군의 결손부 내에는 섬유성 결체조직의 증식과 신생혈관들의 증식이 관찰되었다. 또한, 매식물 주위로 염증성 세포의 침윤이 관찰되고 있으며, 매식물 내부에도 섬유세포의 출현이 확인되었다.One week later, the proliferation of fibrous connective tissue and the activation of activated fibroblasts and vascular endothelial cells were observed in the defects of the negative control group, and the inflammatory cells were scattered. On the other hand, proliferation of fibrous connective tissue and neovascularization were observed in the defects of the experimental group. In addition, infiltration of inflammatory cells around the plant was observed, and the appearance of fibroblasts was also observed inside the plant.
또한, 4주 후의 시험 결과는 도 5에 나타난 바와 같이, 음성대조군에는 결손부 내에는 염증성 세포의 침윤상은 관찰되지 않았고 전반적으로 섬유성 결합조직으로 채워져 있었으며, 모세혈관이 결체조직 내에 광범위하게 분포되어 있었다. 결손부 변연에서 신생골 형성이 증가되었으며, 극히 일부이기는 하지만 골양조직이 결손부 가장자리에서부터 중앙으로 확장되는 양상이 확인되었다. 반면, 실험군의 결손부 내에는 교원성 섬유로 채워져 있었으며, 매식물 주위 및 결체조직 내에 신생 모세혈관들의 증식이 확인되었다. 결손부 변연에서는 신생골 형성이 대조군과 유사하게 증식되었으며, 다공성을 가진 매식물 내부에는 골아세포의 분열과 골양조직, 미성숙골의 형성을 볼 수 있었다. 매식물 주위에서 염증성 세포의 양이 많이 감소하였으며, 매식체와 직접 접촉하는 신생골의 형성이 증가되는 양상을 확인하였다. 신생골과 매식체 사이에는 결체조직이 잔존하는 부위도 보여, 신생골, 매식체 및 결체조직이 혼재되어 있는 양상이 확인되었다.In addition, as shown in FIG. 5, the test result after 4 weeks showed no invasion of inflammatory cells in the defect, and was generally filled with fibrous connective tissue, and capillaries were widely distributed in the connective tissue. there was. New bone formation increased at the margin of the defect and, although only a small portion, the bone tissue expanded from the edge of the defect to the center. On the other hand, the defects of the experimental group were filled with collagen fibers, and proliferation of new capillaries was observed around the plants and in the connective tissues. In the margin of defect, new bone formation proliferated similarly to the control group, and osteoporotic division, bone marrow tissue, and immature bone formation were observed inside the porous plants. The amount of inflammatory cells was decreased around the plants, and the formation of new bone in direct contact with the plants was increased. In the new bone and the carcass, there was also a region where the connective tissue remained, and the new bone, the carcass and the connective tissue were mixed.
실험예Experimental Example 4: 4: 유전독성Genotoxicity 시험(AMES TEST) AMES TEST
본 발명의 β-TCP 구형 과립의 유전독성 유발 가능성을 측정하기 위하여, 에임즈 시험을 하기와 같이 수행하였다.In order to determine the genotoxic potential of the β-TCP spherical granules of the present invention, the Ames test was performed as follows.
에임즈 시험은 비교적 유전독성의 검색 감도가 높은 평판(plate)법(ISO 10993-3)으로 수행하였다. The Ames test was performed by the plate method (ISO 10993-3), which has a relatively high sensitivity for detection of genotoxicity.
살모넬라 균주 TA98, TA100, TA102(우정 bsc로부터 구입)을 영양배지(nutrient broth)에 접종하여 37℃에서 약 15시간 배양하였다. 상기 균주의 각각의 배양액 0.1 ㎖, 시험 물질인 β-TCP 과립의 0.5 g/㎖ 농도 용액 0.1 ㎖ 및 인산완충용액(Phosphate buffered solution) 0.5 ㎖ 및 대사 활성화법에서는 S-9 혼합물 0.5㎖을 유리 시험관(13 X 100 mm, Corning)에 첨가한 후, 상층 한천(Top agar) 2 ㎖을 첨가하여 혼합하였다. 이때, β-TCP의 0.5 g/㎖ 농도 용액은 β-TCP 4 g을 생리식염수(0.9% NaCl 용액) 20 ㎖에 넣고 37℃에서 72시간 동안 방치한 후, 0.8 ㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 제조하였다. 상기의 혼합액을 한천배지(agar plate)에 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하고 복귀변이집락수를 측정하였다. 결과는 음성대조군의 평균값에 대한 시험물질의 평균값의 비인 F값으로 나타내었으며, 양성대조군으로 돌연변이 물질인 덱손을 TA98에 처리한 군 및 소듐 아지드를 TA100에 처리한 군으로 하였다.Salmonella strains TA98, TA100, TA102 (purchased from friendship bsc) were inoculated in nutrient broth and incubated at 37 ° C. for about 15 hours. 0.1 ml of each culture of the strain, 0.1 ml of 0.5 g / ml concentration solution of β-TCP granules as a test substance, 0.5 ml of Phosphate buffered solution and 0.5 ml of S-9 mixture in the metabolic activation method were used in a glass test tube. After addition to (13 × 100 mm, Corning) 2 ml of Top agar was added and mixed. At this time, 0.5 g / mL solution of β-TCP was added 4 g of β-TCP in 20 mL of physiological saline solution (0.9% NaCl solution) and left at 37 ° C. for 72 hours, followed by 0.8 μm syringe filter. It was prepared by filtration. The mixed solution was plated on an agar plate and incubated in a 37 ° C. incubator for 72 hours to measure the number of return mutants. The results were expressed as the F value, which is the ratio of the average value of the test substance to the average value of the negative control group. The positive control group was treated with mutant dexone in TA98 and sodium azide in TA100.
결과는 표 4에 나타내었다.The results are shown in Table 4.
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 β-TCP는 양성대조군의 F(시험물질평균/음성대조평균)값이 2 이상을 나타내어 시험이 정상적으로 진행되었음을 알 수 있으며, TCP 용출액의 F값이 모든 군에서 2 이하를 나타내어 이 물질은 유전독성에 대해 안전함을 알 수 있다.As shown in Table 4, β-TCP of the present invention indicates that the F (test material average / negative control average) value of the positive control group was 2 or more, indicating that the test proceeded normally, and the F value of the TCP eluate was in all groups. Indicates that the substance is safe for genotoxicity.
본 발명의 제조 방법은 기존의 β-TCP 과립을 제조하는 방법과는 달리, 과립을 형성하고, 겔화를 촉진시켜주기 위해 분산매를 이용하며, 본 발명에 따른 β-TCP 과립은 미세다공성과 거대다공성을 모두 포함하므로 생체적합성이 있어 생체의 뼈 속에 이식하면 면역반응을 일으키지 않으면서 주변에서 새로운 골조직이 쉽게 자라 들어올 수 있는 뼈대 역할을 함으로써 신생골의 형성을 촉진시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 β-TCP 과립은 골이식재 또는 골세포지지체로 유용하게 사용될 수 있다. Unlike the conventional method for producing β-TCP granules, the production method of the present invention uses a dispersion medium to form granules and promote gelation, and the β-TCP granules according to the present invention are microporous and macroporous. Since it contains all of the biocompatibility is implanted into the bones of the living body does not cause an immune response by acting as a skeleton that can easily grow new bone tissue from the surroundings has the effect of promoting the formation of new bone. Therefore, β-TCP granules according to the present invention can be usefully used as a bone graft or bone cell support.
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