KR100800530B1 - Leuconostoc citreum producing mannitol and method for producing mannitol using the same - Google Patents

Abstract

A novel Leuconostoc citreum strain isolated from kimchi is provided to be able to produce mannitol with high yield. A method for producing mannitol using the same strain is provided to be able to obtain highly concentrated mannitol through a fermentation process under an optimum fermentation condition of the strain without isolating dehydrogenase and NADH. A Leuconostoc citreum producing mannitol is deposited as a deposition no. KACC 91264P. A method for producing mannitol comprises the steps of: (a) fermentation culturing the Leuconostoc citreum at a temperature of 20-40 deg.C under pH of 5.5-7.5 in a culture medium with maintaining the concentration of fructose at 50-200g/l and the concentration of an yeast extract at 0.2-1.4 wt/vol.%; and (b) isolating and purifying the generated mannitol from the culture medium.

Description

만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 및 이를 이용하여 만니톨을 생산하는 방법{Leuconostoc citreum producing mannitol and method for producing mannitol using the same} Leukonostock citrium having mannitol producing ability and method for producing mannitol using same {Leuconostoc citreum producing mannitol and method for producing mannitol using the same}

도 1은 생성된 만니톨과 과당의 표준물질을 TLC와 밀도법(densitometry)으로 만니톨을 정량한 결과를 나타낸다. Figure 1 shows the result of quantification of mannitol by TLC and densitometry of the resulting mannitol and fructose standards.

도 2a와 2b는 주사형전자현미경(SEM)을 이용하여 류코노스톡 시트리움 KW39의 세포형태를 관찰한 결과이다.Figures 2a and 2b is the result of observing the cell morphology of leuconosstock citrium KW39 using a scanning electron microscope (SEM).

도 3은 류코노스톡 시트리움 KW39에 대하여 균체지방산의 조성을 분석한 결과이다. Figure 3 is the result of analyzing the composition of the cell fatty acid for leukonostock citrium KW39.

도 4는 류코노스톡 시트리움 KW39의 16S rDNA 전염기서열(1,372bp)이다.Figure 4 shows the 16S rDNA infectious sequence (1,372 bp) of leukonostock citrium KW39.

도 5는 도 4에 기초한 분자계통학적 분석한 결과이다.FIG. 5 shows molecular molecular analysis based on FIG. 4.

도 6은 류코노스톡 시트리움 KW39의 최적 발효 공정 조건에서 10% (w/v)과당으로부터 발효공정을 실시한 결과를 나타낸다.Figure 6 shows the results of the fermentation process from 10% (w / v) fructose at the optimum fermentation process conditions of Leukonostock Citrium KW39.

본 발명은 고수율의 만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 (Leuconostoc citreum ) 및 상기 균주를 발효 배양시켜 만니톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a Leuconostoc citreum having a high yield of mannitol production capacity and a method for producing mannitol by fermenting the strain.

기본적인 영양공급의 개념을 뛰어넘어 건강을 증진시키고, 궁극적으로는 질병을 치료에 기여할 수 있는 기능성 식품(functional foods)과 식품원료 (functional ingredients)에 대한 수요가 급격히 증가하고 있다. 현재 우리나라 및 선진 여러 국가들에게 기능성 식품의 시장은 폭발적으로 성장하고 있다. There is a rapid increase in the demand for functional foods and functional ingredients that go beyond the basic nutritional concept to promote health and ultimately contribute to the treatment of diseases. At present, the functional food market is exploding in Korea and many developed countries.

미국의 경우 현재 기능성 식품의 시장규모는 약 75억 달러 ~ 90억 달러 정도이지만 잠재적으로 250억 달러까지 예상하고 있다. 기능성 식품첨가물 중에서 당 알콜은 최근 이들의 탁월한 기능성이 알려지면서 수요가 증가하고 있는데, 그 중 만니톨은 인체에 독성이 없어 미국 FDA에 의하여 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 승인이 되어 식품, 화장품, 제약산업 등에 매우 광범위하게 이용되고 있다. In the United States, the market for functional foods currently ranges from $ 7.5 billion to $ 9 billion, but potentially up to $ 25 billion. Among functional food additives, sugar alcohols are increasing in demand as their excellent functionality is recently known. Among them, mannitol is not toxic to humans and is approved by the US FDA as Generally Recognized As Safe (GRAS). It is very widely used in industry.

현재까지 만니톨은 대부분 글루코스로부터 촉매나 전기화학적 합성공정에 의해 생산되어 왔으나, 이런 화학적 방법에 따르면 포도당과 만니톨의 분리 정제가 어렵고 고온 고압의 반응이므로 촉매 물질에 의한 위험성과 폐기물 처리 문제가 존재하게 되는 단점이 있다. 더구나 최근 인공 합성 방법으로 제조된 물질에 대한 소비자의 기피 현상과 더불어 상대적으로 천연 원료에 대한 선호도가 급상승하고 있다. Until now, most of mannitol has been produced by glucose or electrochemical synthesis process. However, according to this chemical method, it is difficult to separate and purify glucose and mannitol and reaction at high temperature and high pressure. There are disadvantages. Moreover, in recent years, with the avoidance of consumers for materials manufactured by artificial synthetic methods, the preference for natural raw materials has been rising rapidly.

실제로 FDA(The Food and Drug Administration)와 The code of Ferderal Regulations (21 CFR 101. 22.a.3) 의 규정에 따라 생물체나 생물체의 구성성분을 이용하여 생산되어 지거나 전환된 물질 (bioconversion products)에 대하여 “ 천연(natural)" 이라는 표기 (lable)를 할 수 있도록 명시하게 되었다.Indeed, bioconversion products may be produced or converted using living organisms or their components in accordance with the Food and Drug Administration and the Code of Ferderal Regulations (21 CFR 101.22.a.3). The word "natural" has been made available for this purpose.

만니톨은 식품, 의료, 제약, 화장품의 원료로서 폭 넓게 이용되는 당 알코올이다. 만니톨은 고구마, 버섯, 셀러리 외에, 다시마 등의 갈조류와 만나나무에 많이 함유되어 있으며 화학식은 C6H14O6로, D- 형과 L- 형이 모두 존재하나 자연계에는 D- 형 만니톨이 널리 분포한다. 분자량은 182.17, 비중은 20 ℃에서 1.489, 녹는점은 168 ℃, 끓는점은 3.5 mmHg에서 295℃이다. 물에는 잘 녹으나, 에탄올에는 잘 녹지 않고, 에테르에는 녹지 않는다. 강한 단맛(설탕의 60 % 정도)을 가진다. Mannitol is a sugar alcohol that is widely used as a raw material for food, medicine, pharmaceuticals and cosmetics. Mannitol is rich in sweet potatoes, mushrooms, celery and brown algae such as kelp and manna trees. The chemical formula is C6H14O6, and both D-type and L-type exist, but D-type mannitol is widely distributed in nature. The molecular weight is 182.17, specific gravity is 1.489 at 20 ° C, melting point is 168 ° C, and boiling point is 295 ° C at 3.5 mmHg. It is soluble in water, but insoluble in ethanol and insoluble in ether. Has a strong sweetness (about 60% of sugar).

기능성 식품인 만니톨의 식품첨가물로 사용시 열량은 설탕의 5～15%에 해당하는 저 칼로리이며, 용해열은 설탕의 1.3～10배로 용해 시 흡열량이 높기 때문에 강한 청량감을 줄 수 있다. 만니톨은 항고착제(anticaking and free flow agent), 풍미제(falvoring agent), 물성 안정제 (stabilizer), 감미료(nutritive sweetner) 등의 식품 원료로 이용될 수 있다. When used as a food additive of mannitol, a functional food, calories are 5 to 15% of sugar, and calories are 1.3 to 10 times higher than sugar. Mannitol may be used as a food raw material such as anti-sticking agent (anticaking and free flow agent), flavoring agent (falvoring agent), stabilizer, sweetener (nutritive sweetner).

또한, 만니톨은 다른 당알코올과는 달리 오랫동안 의료와 제약품의 원료로서 사용되어 왔다. 파이로젠이 완전히 제거된 순수 만니톨은 정제용 (tablets)이나 주사용 제재에 이뇨성을 촉진시키는 첨가제로 사용되며, 그 외의 만니톨에 용도에 대한 임상 실험이 실시되어 오고 있다. 만니톨과 디페록사민(deferoxamine)의 혼합물은 신장기능의 문제로 인한 미헤모글로비뉴릭 애큐트 (myohemoglobinuric acute)에 대하여 보호를 하며, 관상동맥 (coronary artery)을 지나 피부이식 수술 (graft surgery)을 수행시 우려되는 혈장의 과산화수소 자유 라디칼(hydrogen peroxide free radical) 발생을 현저하게 감소시킨다. 이외에 만니톨은 고급 생체용 플라스틱 제조시 가소제로서 사용되기도 한다.In addition, mannitol has been used as a raw material for medical and pharmaceutical products for a long time unlike other sugar alcohols. Pure mannitol, from which pyrogen has been completely removed, is used as an additive to promote diuretics in tablets or injectable preparations, and other clinical trials have been conducted on mannitol. A mixture of mannitol and deferoxamine protects myohemoglobinuric acutes due to kidney function problems, and performs graft surgery past the coronary artery. Significantly reduce the generation of hydrogen peroxide free radicals in plasma. Mannitol is also used as a plasticizer in the manufacture of advanced bioplastics.

이런 다양한 기능을 가진 만니톨의 생물학적 생산의 시도는 극히 최근의 일이다. 오래 전부터 외국에서는 와인 (wine) 생산을 위한 발효 공정 상에서 일부 젖산균이 당을 만니톨로 전환시켜 제품의 품질을 떨어뜨리는 현상에 주목해왔다. 이후 락토바실러서 브레비스(Lactobacillus brevis)와 레코노스톡 메세테로이드(Leuconostoc meseteroides)로부터 효소 만니톨 디하이드로지네이즈(mannitol dehydrogenase)가 정제되었는데 조건에 따라 효소 반응을 살펴본 결과 과당에서 만니톨로의 전환이 가역적임을 알아냈다. 또한 혐기상태에서 젖산균들이 유기산 또는 알콜을 생산할 때처럼 이 효소는 NADH나 NADPH 와 같은 조효소를 필요로 한다. 최근 만니톨 디하이드로지네이즈를 과생산시키기 위한 연구가 로도박터 스파로이데스(Rhodobacter sphaeroides)를 이용하여 시도되었지만 이 연구는 만니톨 생산을 위한 것이 아니라 이 효소를 이용하여 혼합물로부터 당 알콜을 감지하는 바이오센서(biosensor)를 개발하기 위한 것이었다. 또한 만니톨을 식품, 플라스틱제조, 의약용 원료로 사용하기 위한 상업적 관점에서의 연구가 최근에 시도되었는데 Groleau 등 (1995)은 지코사카로미스 로우씨(Zycosaccharomyces rouxi)를 이용하여 농축 포도당으로부터 에탄올(ethanol), 글리세롤(glycerol), 아라비톨(arabitol), 만니톨(mannitol)의 혼합물을 생산하였다. 이들이 사용한 이온 교환수지는 아라비톨과 만니톨을 분리하지 못하였을 뿐만 아니라 200 g/l의 포도당 초기농도로부터 비교적 낮은 수율인 50 g/l를 얻었다. 국내에선 Yoon and Song (1995)들이 에로 바시디윰 풀루란스(Aureobasidium pulluans)으로부터 만니톨을 포함한 당알콜을 최대 수율 23% 정도 생산하는 것을 보고하였다. Attempts at biological production of mannitol with these diverse functions are extremely recent. For a long time, foreign countries have noticed the fact that some lactic acid bacteria in the fermentation process for the production of wine (e.g., lactobacillus) degrade the quality of the product by converting sugar to mannitol. Lactobacilli brevis ( Lactobacillus brevis ) and Leuconostoc ( Leuconostoc) The enzyme mannitol dehydrogenase was purified from meseteroides . The enzymatic reactions of the mannitol dehydrogenase were investigated. The results showed that the conversion of fructose to mannitol was reversible. The enzyme also requires coenzymes such as NADH or NADPH, as in lactic acid bacteria produce organic acids or alcohols. Recently, a study to overproduce mannitol dehydrogenase has been attempted using Rhodobacter sphaeroides , but this study is not intended for mannitol production but is a biosensor that detects sugar alcohols from mixtures using this enzyme. It was to develop a biosensor. There has also been recent attempt from a commercial point of view for the use of mannitol as a food, plastics and pharmaceutical ingredient. Groleau et al. (1995) reported Zycosaccharomyces rouxi ) was used to produce a mixture of ethanol, glycerol, arabitol, and mannitol from concentrated glucose. The ion exchange resins used were not able to separate arabitol and mannitol but also obtained a relatively low yield of 50 g / l from an initial concentration of 200 g / l glucose. Yoon in Korea and Song (1995) reported that sugar alcohols, including mannitol, produced a maximum yield of 23% from Aureobasidium pulluans .

그러나 상기 방법들은 순수한 당알콜의 정제시 어려움과 고비용이 수반될 것으로 사료된다. 한편 순수하게 정제된 만니톨 디하이드로지네이즈를 이용하는 이전의 연구에 따르면 과당으로부터 만니톨의 전환율이 90%로 매우 높게 보고 되었지만, 이 방법은 NADH와 같은 고가의 조효소를 별도로 외부로부터 공급하여야 하므로 생산 가격이 상승되어 산업화에 어려움이 있다. However, these methods are expected to involve difficulties and high costs in the purification of pure sugar alcohols. Previous studies using purely refined mannitol dehydrogenase reported a very high conversion of mannitol from fructose to 90%, but this method requires a separate supply of an expensive coenzyme such as NADH from the outside. There is a difficulty in industrialization.

젖산균을 이용하여 설탕으로부터 덱스트란과 만니톨, 올리고당과 만니톨을 생산하는 방법이 처음으로 Yoo 등(2001)에 의하여 최근 보고 되었다. 만니톨 디하이드로지네이즈는 과량의 과당 존재시, 과당이 전자 수용체(elctron acceptor) 역할을 하여 만니톨로 환원되는 현상이 관찰되었다. 또 다른 연구에 의하면, 기질로서 과당만이 존재하는 경우에 과당의 일부를 에너지와 균체 성장에 이용하고 나머지 대부분은 만니톨로 전환하는 균주가 존재함을 발견하였다. A method for producing dextran and mannitol, oligosaccharides and mannitol from sugar using lactic acid bacteria was recently reported by Yoo et al. (2001) for the first time. In the presence of excess fructose, mannitol dehydrogenase was observed to reduce fructose to mannitol by acting as an electron acceptor. Another study found that when only fructose was present as a substrate, there were strains that used some of the fructose for energy and cell growth, while converting most of it to mannitol.

류코노스톡 메세네트로이데스(Leuconostoc mesenetroides)를 이용하여 설탕으로부터 의약용 덱스트란 (dextran)을 생산하는 공정에서 처음 기질양의 약 반 정도로 발생하는 과당이 덱스트란에 비하여 가치가 현저히 낮기 때문에 폐기물로 버려졌으며 이런 현상이 무시되어 왔다. Yoo 등(2001)들은 이와 같은 관찰 결과에 주목하여 덱스트란 제조 공정을 기반으로 하여 덱스트란과 만니톨, 올리고당과 만니톨을 생산하는 회분식 발효 공정을 최적화하는 연구에 대한 결과를 최근에 발표하였다. Leuconostoc In the process of producing medicinal dextran from sugar using mesenetroides , fructose, which is about half of the initial substrate amount, has been discarded as a waste because of its significantly lower value than dextran. Yoo et al. (2001) recently noted the results of a study on optimizing batch fermentation processes that produce dextran, mannitol, oligosaccharides and mannitol based on dextran production.

본 발명의 목적은 고수율의 만니톨 생산 균주를 자연계로부터 선별하고, 분리된 균주의 최적 발효 조건을 밝히고, 이 조건에서 만니톨 디하이드로지네이즈와 NADH를 별도로 분리하지 않고 균체를 이용하는 발효공정을 통하여 고농도의 만니톨을 생산하고자 하는 것이다.An object of the present invention is to select a high yield of mannitol-producing strains from nature, to identify the optimum fermentation conditions of the isolated strain, in this condition high concentration through the fermentation process using the cells without separating mannitol dehydrogenase and NADH separately To produce mannitol.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 김치로부터 고효율의 만니톨 생산 균주를 분리하고 분리된 균주의 생리적 특성을 규명하고 나아가 만니톨의 생산 효율이 최적화된 발효 조건을 규명하였다.In order to achieve the above object, the present inventors have isolated high-efficiency mannitol-producing strains from kimchi, clarified physiological characteristics of the isolated strains, and further identified fermentation conditions with optimized production efficiency of mannitol.

따라서 하나의 양태로서 본 발명은 KACC 91264P로 기탁된, 만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 KW39에 관한 것이다. Thus, as one aspect, the present invention relates to leuconosstock citrium KW39 having mannitol production capacity, deposited as KACC 91264P.

본 발명의 “류코노스톡 시트리움 KW39(Leuconostoc citreum KW39)”는 김치로부터 분리된 0.5× 0.6㎛ ~ 0.6× 1.0㎛ 크기의 균으로, 단독 혹은 쌍을 이룬 구간균 형태를 나타낸다. 16S rRNA 염기 서열 분석 결과, 류코노스톡 속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서, 류코노스톡 시트리움 균주와 99%의 유연관계를 나타내었다. Leuconostocitium KW39 ( Leuconostoc ) of the present invention citreum KW39) ”is a bacterium with a size of 0.5 × 0.6 μm to 0.6 × 1.0 μm separated from kimchi, which shows the form of single or paired interval bacteria. As a result of 16S rRNA sequencing, the strain belonged to a phylogenetic group including a species of the genus Leuconosestock, and showed a flexible relationship of 99% with the Leuconosstock Citrium strain.

이러한 결과를 바탕으로 상기 분리된 류코노스톡 시트리움 KW39 균주를 2006년 10월 11일자로 수원시 권선구 서둔동 225 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 KACC 91264P로 기탁하였다.Based on these results, the isolated leukonostock citrium KW39 strain was deposited on the Korean Agricultural Microbiological Resources Center, 225, Seodun-dong, Gwonseon-gu, Suwon-si, Korea on October 11, 2006 with the accession number KACC 91264P.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 KACC 91264P로 기탁된, 만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 KW39를 발효 배양시키는 단계; 및 배지로부터 생성된 만니톨을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 만니톨을 생산하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention comprises the step of fermentation culture of leuconosstock citrium KW39 having mannitol production capacity, deposited with KACC 91264P; And separating and purifying the mannitol produced from the medium.

상기 류코노스톡 시트리움 KW39는 만니톨의 생산을 촉진시킬 수 있는 다양한 배지에서 발효시킬 수 있는데, 류코노스톡 시트리움의 생육에 적합하고 만니톨을 생성할 수 있는 배지면 특별히 제한되지 않는다. 배지는 액체와 고체가 모두 가능하나, 액체배지에 의한 정치배양, 진탕배양 및 통기교반 배양 방식이 바람직하다. The leukonostock citrium KW39 can be fermented in a variety of media that can promote the production of mannitol, is not particularly limited as long as it is suitable for the growth of leukonostock citrium and a medium capable of producing mannitol. The medium may be both a liquid and a solid, but a liquid culture, a static culture, a shaking culture, and an aeration stirring culture method are preferable.

또한, 회분식 배양, 반회분식 배양, 연속식 배양, 유가식 배양 등의 방법으로 배양 될 수 있다. 배지 중에 포함되는 동화성 탄소원으로는 당 및 이들의 중합체, 폴리알콜 등을 사용할 수 있으며, 동화성 질소원으로는 무기 질소 화합물, 동물, 식물 및 미생물 기원의 물질 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 탄소원은 과당, 포도당, 갈락토스, 만니톨, 말토스, 글리세린, 덱스트린, 전분 등의 단독 또는 혼합물을 예로 들 수 있고, 질소원으로서는 효모추출물, 고기추출물, 대두분, 펩톤, 콘·스티프·리카, 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 요소 등의 단독 또는 혼합물을 예로 들 수 있다. 또한, 배지는 류코노스톡 시트리움의 생육이나 만니톨의 생성을 촉진하는 유기물, 무기물, 비타민류 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 발효 중에 발포가 현저하게 나타낼 때는 소포제를 적절히 첨가할 수 있다. 본 발명의 실시예에 사용된 배지 조성은 한 구현예를 보여주는 것이다. In addition, it can be cultured in a batch culture, semi-batch culture, continuous culture, fed-batch culture. Sugars, polymers thereof, polyalcohols, etc. may be used as the assimilation carbon source included in the medium, and as the assimilation nitrogen source, inorganic nitrogen compounds, substances of animal, plant, and microbial origin may be used. Specifically, examples of the carbon source include alone or a mixture of fructose, glucose, galactose, mannitol, maltose, glycerin, dextrin, and starch, and examples of the nitrogen source include yeast extract, meat extract, soybean meal, peptone, corn stiff and rica. And single or mixture of ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea and the like. In addition, the medium may further include components such as organic substances, inorganic substances, vitamins, and the like which promote the growth of leuconosstock citrium or the production of mannitol. In addition, when foaming is remarkable during fermentation, an antifoamer can be added suitably. The medium composition used in the examples of the present invention shows one embodiment.

배양 온도, pH, 배양 시간 등의 배양 조건은 배양의 규모 및 기타 조건에 따라 적절히 조절할 수 있지만, 류코노스톡 시트리움 KW39의 만니톨 수율이 최적화된 발효 조건은 다음과 같다. 배양 온도는 20℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 35℃이고, pH는 5.5 내지 7.5, 보다 바람직하게는 6.0 내지 7.0이고, 효모 추출물의 농도는 0.2 내지 1.4 % (w/v), 보다 바람직하게는 0.3 내지 0.9 %이고, 과당 농도는 50 내지 200 (g/ℓ), 보다 바람직하게는 70 내지 150 (g/ℓ)이다.Culture conditions such as culture temperature, pH, incubation time and the like can be appropriately adjusted according to the scale of the culture and other conditions, but fermentation conditions with optimized mannitol yield of leukonostock citrium KW39 are as follows. The culture temperature is 20 ℃ to 40 ℃, more preferably 25 ℃ to 35 ℃, pH is 5.5 to 7.5, more preferably 6.0 to 7.0, the concentration of the yeast extract is 0.2 to 1.4% (w / v), More preferably, it is 0.3 to 0.9%, fructose concentration is 50-200 (g / l), More preferably, it is 70-150 (g / l).

본 발명의 류코노스톡 시트리움 KW39 균주를 최적 발효 조건, 30℃의 배양 온도, pH 6.5, 0.5%의 효모 추출물 농도 조건으로 5L 회분식 발효조에서 10% (w/v) 과당의 농도를 첨가하여 만니톨의 생산량을 살펴본 결과, 과당은 균체의 성장과 만니톨로의 전환에 따라 급격히 소비되어 발효시간 12시간 후에는 90% 이상이 소비되고 만니톨은 최대 72.4 g/L가 생산되는 것을 확인할 수 있었다. The leukonostock citrium KW39 strain of the present invention was added with mannitol by adding a concentration of 10% (w / v) fructose in a 5 L batch fermenter under optimal fermentation conditions, a culture temperature of 30 ° C., pH 6.5, and a yeast extract concentration of 0.5%. As a result of the production of fructose, fructose was rapidly consumed due to cell growth and conversion to mannitol, and after 12 hours of fermentation, more than 90% was consumed and mannitol was produced up to 72.4 g / L.

배양 후에, 만니톨은 상기 류코노스톡 시트리움 KW39를 분리하고 수득된 배지로부터 통상의 방법, 예를 들어, 각종 흡착제(예, 실리카겔, 알루미나, 활성탄, 이온교환수지 등)에 의한 탈흡착, 크로마토그래피법, 분별결정법, 재결정법 등을 단독 또는 적절히 조합하여 처리하는 방법으로 분리 정제할 수 있다. 필요할 경우, 결정화, 분말화 등의 추가 가공 처리를 거쳐, 식품, 의료, 제약, 화장품 등의 분야에서 다양하게 이용된다. After incubation, the mannitol is isolated from the leukonostock citrium KW39 and obtained by conventional methods such as desorption, chromatography by various adsorbents (e.g., silica gel, alumina, activated carbon, ion exchange resin, etc.). The method, fractional crystallization method, recrystallization method and the like can be separated and purified by a method of treating alone or in combination as appropriate. If necessary, after further processing such as crystallization, powdering, etc., it is variously used in the fields of food, medical, pharmaceutical, cosmetics and the like.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 자세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail by examples. However, the scope of the present invention is not limited to the examples.

실시예Example 1: 숙성김치로부터  1: from aged kimchi 덱스트란Dextran 생성능Generation 류코노스톡 속 미생물 분리 Isolation of Microorganisms in Leukonostock

발명에 사용된 미네랄 배지 (mineral medium; MM)의 기본 구성성분은 다음과 같다. The basic components of the mineral medium (MM) used in the invention are as follows.

KH2PO4 3 g/L; FeSO4?H2O 0.01g/L; MnSO4?4H2O 0.01 g/L; MgSO4?7H2O 0.2 g/l; NaCl 0.01 g/L; CaCl2 0.05 g/L 이고, 한천 배지 (MMA)는 MM에 1.5%의 한천을 넣고 제작하였으며, 염배지에 효묘 추출물 (yeast extract)이 포함되었을 때는 MMY로 표기하였다. 발효공정을 수행하기 위한 스탁 배양(stock culture)는 2% 과당(fructose)과 0.5% 효모 추출물를 포함하고 있는 MMA 배지를 20 x 125 mm 테스트 튜브에 사면배지를 만들어 5oC에 보관하였다. 씨드 배양(seed culture)은 사면배지에서 한 백금이에 해당하는 균체량을 미리 준비된 2% 과당과 0.5% 효묘 추출물을 포함하고 있는 10 ml MMA가 들어 있는 25 x 150 mm 테스트 튜브에 옮기고 30oC, 200 rpm에서 24 hr 배양 후 사용하였다. KH 2 PO 4 3 g / L; FeSO 4 -H 2 O 0.01 g / L; 0.01 g / L MnSO 4 -4H 2 O; 0.2 g / l MgSO 4 -7H 2 O; NaCl 0.01 g / L; CaCl2 was 0.05 g / L, and agar medium (MMA) was prepared by adding 1.5% agar to MM, and when the yeast extract (yeast extract) was included in the salt medium, it was designated as MMY. The stock culture for carrying out the fermentation process was carried out by making MMA medium containing 2% fructose and 0.5% yeast extract in a 20 x 125 mm test tube, making the medium medium at 5oC. Seed cultures were transferred to a 25 x 150 mm test tube containing 10 ml MMA containing 2% fructose and 0.5% yeast seedlings, pre-prepared at one side of a platinum medium, at 30 ° C, 200 rpm. Used after 24 hr incubation.

실시예Example 2:  2: 만니톨Mannitol 생성능Generation 균주들로부터 우수  Excellent from strains 만니톨Mannitol 생성능Generation 균주 분리 Strain isolate

만니톨 발효 젖산균을 배추, 무 또는 파 김치에서 직접 배양법(enrichment culture technique)으로 분리하였다. 김치용기의 하부에 저장된 국물에서 한 백금이를 취하여 MRS(Difco. NJ. USA) 평판배지에 옮겨 48시간 동안 30℃에서 배양하였다. 전형적인 유산균으로 보이는 콜로니들 중 약 100개 이상의 콜로니를 선별하고 단일 콜로니로부터 3% 의 과당을 포함하고 있는 10 mL MMY 배지로 옮겨 24 hr 배양을 하고 계속해서 두 번 더 배양을 한 후에 TLC를 이용하여 만니톨 생성 능력을 비교하는 방법으로 만니톨 생산 여부를 측정하는 방법으로 우수한 만니톨 생산 능력을 보이는 균주를 선택하였다. 이러한 방법을 통해서 가장 우수한 만니톨 생산능력을 보여주는 39번의 균주를 최종 선별하였다. Mannitol fermented lactic acid bacteria were isolated from Chinese cabbage, radish or green onion kimchi by the enrichment culture technique. One platinum was taken from the broth stored at the bottom of the Kimchi container and transferred to MRS (Difco. NJ. USA) plate medium and incubated at 30 ° C. for 48 hours. About 100 or more colonies that appear to be typical lactic acid bacteria were screened, transferred from a single colony to 10 mL MMY medium containing 3% fructose, incubated for 24 hr and continued for two more cultures, followed by TLC. As a method of comparing mannitol production ability, a strain showing excellent mannitol production capacity was selected as a method of measuring mannitol production. Through this method, 39 strains showing the best mannitol production capacity were finally selected.

선별을 위한 생산된 TLC 방법으로 만니톨 생산을 정량은 도 1에서 나타낸 바 와 같았다. HPLC는 전처리 시간이 길고 많은 용매가 소요되며 유지비용이 고가이기 때문에 TLC 방법으로 만니톨 생산을 정량하였다. TLC에 의한 분석방법은 사이온 이미지 코퍼레이션(Scion image corporation)에서 제공을 하는 밀도법(densitometry) 방법에 의하여 정량 및 정성을 재현성 높게 실행할 수 있다. Quantification of mannitol production by the produced TLC method for selection was as shown in FIG. HPLC quantified mannitol production by TLC method because of its long pretreatment time, many solvents, and high maintenance costs. Analysis method by TLC can be performed quantitatively and qualitatively by densitometry method provided by Sion image corporation.

실시예Example 3: 우수  3: excellent 만니톨Mannitol 생성능Generation 분리균주의Isolate 동정 Sympathy

실시예에서 분리된 39번 균자에 대하여 동정을 실시하였다. 분석방법 및 결과는 다음과 같았다.The 39 strain isolated in the Example was identified. The analysis method and results were as follows.

-분석방법-Analysis Method

1) 전자현미경(SEM)을 이용한 형태 관찰1) Morphology observation using electron microscope (SEM)

*균주 배양: 유산균 선택배지 MRS(Lactobacilli MRS Broth, Difco)에 배양* Strain culture: cultured in Lactobacilli MRS Broth, Difco

*글루타르알데하이드(Glutaraldehyed)고정(전공정): 배양된 유산균을 2.5%의 글루타르알데하이드에서 24시간 동안 고정* Glutaraldehyed fixation (pre-process): Cultured lactic acid bacteria are fixed in 2.5% glutaraldehyde for 24 hours

*탈수: 50%, 70%, 80%, 90%, 100% 농도의 에탄올을 순차적으로 처리* Dehydration: 50%, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol concentrations sequentially

*건조: 50%, 100%의 이소아밀아세테이트 처리* Drying: 50%, 100% isoamyl acetate treatment

*골드 코팅(Gold coating)Gold coating

*전자현미경(XL30ESEM, philips)으로 관찰* Observed by electron microscope (XL30ESEM, philips)

2) 균체 지방산 분석2) Cell Fatty Acid Analysis

*균주의 배양: 39번 균주를 TSA(Trypticase Soy Broth Agar, Difco) 배지에 접종 후 30℃에서 2일간 배양Strain culture: 39 strains were inoculated in TSA (Trypticase Soy Broth Agar, Difco) medium and incubated at 30 ° C. for 2 days.

*균체 지방산의 추출 및 정제: 50mg(wet weight)을 Teflon-lined screw cap tube(13x100mm, pyrex)에 옮긴 후 균체 지방산의 메틸 에스터화 및 추출은 IKemoyo & Mihagawa의 방법으로 수행Extraction and Purification of Cell Fatty Acids: Methyl esterification and extraction of cell fatty acids is carried out by IKemoyo & Mihagawa after transferring 50 mg (wet weight) to a Teflon-lined screw cap tube (13x100 mm, pyrex).

*지방산 분석: Microbial Identification System(MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA)을 이용하여 6890N 가스 크로마토그라피(Agilent Tchnologies)로 분석* Fatty Acid Analysis: 6890N Gas Chromatography (Agilent Tchnologies) using Microbial Identification System (MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA)

3) 16S rDNA의 염기서열분석3) Sequence analysis of 16S rDNA

*39번 균주를 TSA 배지에서 진탕배양(150rpm)* Strain 39 was shaken in TSA medium (150 rpm)

*DNA의 추출: QIAGEN사의 QIAamp DNA Mini Kit를 사용하여 DNA 추출DNA extraction: DNA extraction using QIAGEN's QIAamp DNA Mini Kit

*16S rDNA의 PCR 증폭PCR amplification of 16S rDNA

*16S rDNA PCR 증폭산물의 정제: 증폭된 16S rDNA의 부분염기서열을 PCR product purification kit(QIAGEN사)를 사용하여 정제함* Purification of 16S rDNA PCR amplification products: Partial base sequence of amplified 16S rDNA was purified using PCR product purification kit (QIAGEN).

*염기서열분석: PCR 정제산물은 Genetic analyzer 310A(Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석* Base sequencing: PCR purified product is analyzed by nucleotide sequence using Genetic analyzer 310A (Applied Biosystems)

*염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank의 데이터베이스와 상동성을 검색하여 수행하고, CLUSTAL X 프로그램(Thompson et al., 1994) 및 PHYLIP 프로그램(Felsenstein, 1993)을 이용하여 계통학적 위치를 확인함* Base sequence is performed by searching homology with DDBJ / NCBI / Genebank's database, CLUSTAL X program (Thompson et al ., 1994) and the phylogenetic location using the PHYLIP program (Felsenstein, 1993).

-분석결과--Analysis-

1)세포형태관찰1) Cell type observation

도 2a와 2b로 나타낸 바와 같이 0.5× 0.6㎛ ~ 0.6× 1.0㎛ 크기로, 세포는 단독 혹은 쌍을 이루며, 구간균 형태를 나타내었음As shown in Figure 2a and 2b 0.5 × 0.6 ㎛ ~ 0.6 × 1.0 ㎛ size, the cells are singly or in pairs, showing the shape of the interval bacteria

2) 균체 지방산 조성2) Cell Fatty Acid Composition

도 3으로 나타낸 바와 같이 균체지방산의 조성을 분석한 결과, 주요 균체지방산으로 포화지방산 C18:0(11.05%), C16:0(34.73%)와 불포화지방산 C18:1 w7c(16.98%), CYCLO C19:0 w8c(13.06%)와 C14:0, 및 미동정된 Summed Feature 3: C16:1 w7c/iso 2-OH C15:0(7.55%)이 확인되었음As a result of analysis of the composition of the cell fatty acids as shown in Figure 3, the main cell fatty acids, saturated fatty acids C18: 0 (11.05%), C16: 0 (34.73%) and unsaturated fatty acids C18: 1 w7c (16.98%), CYCLO C19: 0 w8c (13.06%) and C14: 0, and unidentified Summed Feature 3: C16: 1 w7c / iso 2-OH C15: 0 (7.55%) were identified

3) 분리균주의 계통학적 위치3) systematic location of the isolate

39번 균주는 도 4로 나타낸 16S DNA 전염기서열(1,372bp)에 기초한 분자계통학적 분석결과 류코노스톡속의 종을 포함하는 계통그룹에 속하는 균주로서 류코노스톡 시트리움 균주와 99%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었음. 따라서 39번 균주는 류코노스톡 스트리움으로 동정되었음(도 5참조).Strain 39 is a strain belonging to the phylogenetic group including the species of the genus Leuconostok, based on the 16S DNA infectious sequence (1,372bp) shown in FIG. It was confirmed to indicate. Therefore, strain 39 was identified as leukonostock strium (see FIG. 5).

상기 실험 결과를 바탕으로 39번 균주를 류코노스톡 시트리움 KW3으로 명명하고, 2006년 10월 11일자로 수원시 권선구 서둔동 225 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 KACC 91264P로 기탁하였다.Based on the experimental results, strain 39 was named leukonostock citrium KW3, and deposited on October 11, 2006, with the accession number KACC 91264P to the Korea Agricultural Microbiological Resource Center, 225, Seodun-dong, Gwonseon-gu, Suwon-si.

실시예Example 4: 배양온도의 영향 4: Effect of incubation temperature

상기 분리된 균주의 만니톨 발효에 대한 최적 온도를 알기 위해서 2.5% 과당, 0.5% 효묘 추출물을 포함하고 있는 50 ml MM를 250 ml 플라스크에 넣고 40% NaOH를 이용하여 pH 6.0 으로 보정하였다. 각각의 배양 플라스크를 증기 멸균기 (121℃, 20 min)를 이용하여 살균 후에 24 hr 배양된 워킹 (working) 배양액을 2% (v/v)접종하였다. 접종된 배양 플라스크들은 진탕기 (shaker)에서 각 20, 25, 30, 35, 40℃의 온도에서 배양하였다. 균체 성장이 정상기(stationery phase)에 도달 하여 평형 (steady state) 을 이룰 때 까지 배양하였다.In order to know the optimal temperature for mannitol fermentation of the isolated strain, 50 ml MM containing 2.5% fructose and 0.5% yeast seedling was placed in a 250 ml flask and calibrated to pH 6.0 using 40% NaOH. Each culture flask was sterilized using a steam sterilizer (121 ° C., 20 min) after 2% (v / v) incubation of the working culture incubated for 24 hr. The inoculated culture flasks were incubated at a temperature of 20, 25, 30, 35, 40 ° C. in shakers. Cultures were incubated until cell growth reached a stationary phase and reached a steady state.

그 결과, 표 1에서 확인할 수 있듯이, 20℃ - 40℃ 온도 범위 내에서는 초기에 유도기를 지나 급격히 성장을 하는 양상을 보여 주었고 이 온도 이상에서는 유도기가 길어졌고 성장 속도가 현저하게 감소하였다. 정상기에 도달하는 시간은 실험 온도 범위 내에서는 비슷한 양상을 보였는데, 최대 균체량은 30oC에서 나타났다. 낮은 온도에서는 대사산물인 젖산 등의 유기산의 축적으로 높은 온도에서는 대사의 제한에 의해서 성장이 멈춘 것으로 생각되어진다. 회분식 만니톨 발효 중 만니톨의 생산과 과당의 소비는 배양온도에 따라서 뚜렷이 차이가 있었다. As a result, as shown in Table 1, within the temperature range of 20 ℃-40 ℃ showed an early growth rapidly after the induction period, the induction period was longer than this temperature and the growth rate was significantly reduced. The time to reach a steady state showed a similar pattern within the experimental temperature range, with the maximum cell mass at 30oC. At low temperatures, it is thought that growth has stopped due to the restriction of metabolism at high temperatures due to the accumulation of organic acids such as lactic acid, which is a metabolite. During batch mannitol fermentation, mannitol production and fructose consumption were clearly different according to the culture temperature.

배양 온도 20℃ 내지 30℃에서 만니톨의 생산량이 계속 증가하였으며, 30℃ 이상의 온도에서는 급격히 감소하였다. 이러한 경향은 과당의 소비량의 변화와도 밀접한 연관이 있으며 25℃와 30℃에서는 약 90% 이상의 과당이 소비되었으나 30℃에서는 약 40%, 35℃에서는 약 30% 정도가 소비되었다. 위의 결과로 만니톨 생산에 대한 최적온도는 30℃ 부근에서 결정되었다. The production of mannitol continued to increase at incubation temperatures of 20 ° C. to 30 ° C., and rapidly decreased at temperatures above 30 ° C. This trend is closely related to the change in the consumption of fructose. More than 90% of fructose was consumed at 25 ℃ and 30 ℃, but about 40% at 30 ℃ and 30% at 35 ℃. As a result, the optimum temperature for mannitol production was determined around 30 ° C.

일반적으로 균체 생산량은 균체를 이용한 생물 전환 공정에서 얻고자하는 최종 생산물의 양과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 균체량에 대한 온도의 영향은 과당의 소비량과 같은 경향을 보였으며, 최대 균체량은 30℃에서 약 2.9 g/l를 나타내었다. 이 온도에서 역시 최대 만니톨의 수율 및 비수율이 결정된 것으로 보아, 생산된 균체량은 직접적으로 만니톨 생산 수율에 영향을 미치는 것으로 보인다. 측정 최대 온도인 40℃에서 만니톨의 수율 (0.54)은 30℃(0.77)에서 약 1.3배 낮았고, 반면에 비수율은 1.9 배 정도 낮은 것으로 보아 높은 온도에서는 균체량당 만니톨 생산 효율이 높다고 할 수 있다. 이러한 현상은 아마 높은 온도에서는 만니톨이 에너지와 빌딩 블락(building blocks)을 생산하기 위한 대사 과정을 수행하는 것이 제한되기 때문으로 보여진다. 만니톨의 생산속도와 비생산 속도는 직접적으로 생산 공정에서의 최종 생산량에 영향을 미치므로, 최적 생산 속도를 결정하는 것은 생물 공정에서 최고의 관심 중의 하나이다. 온도의 변환에 대한 만니톨의 생산속도와 비생산 속도의 변화는 대체로 일치하였는데, 30℃에서 최대 생산 속도는 21.0 g/l-h 는 주변의 온도인 25℃에서 보다 약 1.2 배를 나타내었고 35℃에서 보다는 약 4.3배를 증가함을 보였다.In general, cell production is known to correlate with the amount of final product to be obtained in the bioconversion process using cells. The effect of temperature on cell weight showed the same trend as the consumption of fructose, and the maximum cell weight was about 2.9 g / l at 30 ℃. The maximum and yield of mannitol were also determined at this temperature, so the amount of cells produced seems to directly affect mannitol production yield. The yield of mannitol (0.54) was about 1.3 times lower at 30 ° C (0.77) at the maximum temperature of measurement, while the specific yield was 1.9 times lower, indicating that mannitol production efficiency per cell weight was higher at higher temperatures. This is probably because mannitol is limited to conducting metabolic processes to produce energy and building blocks at high temperatures. Since the production rate and non-production rate of mannitol directly affect the final yield in the production process, determining the optimum production rate is one of the best concerns in biological processes. The change in mannitol production rate and specific production rate for temperature conversion were generally consistent, with the maximum production rate at 30 ° C being about 1.2 times higher than the ambient temperature of 25 ° C, which was 21.0 g / lh. About 4.3-fold increase.

배양온도Incubation temperature 균체량(g/ℓ)Cell weight (g / ℓ) 수율(g/g)Yield (g / g) 생산속도(g/ℓ-hr)Production speed (g / ℓ-hr) 기질소비속도(g/ℓ)Substrate consumption rate (g / ℓ) 20℃20 ℃ 1.51.5 0.600.60 7.17.1 7.67.6 25℃25 ℃ 2.72.7 0.740.74 17.717.7 15.515.5 30℃30 ℃ 2.92.9 0.770.77 21.021.0 17.517.5 35℃35 ℃ 1.31.3 0.780.78 5.55.5 4.64.6 40℃40 ℃ 0.50.5 0.540.54 1.81.8 2.22.2

실시예Example 5: 배양  5: incubation pHpH 의 영향Influence

상기 분리된 균주의 만니톨 발효에 대한 최적 pH를 알기 위해서 2.5% 과당, 0.5% 효묘 추출물을 포함하고 있는 50 ml MM를 250 ml 플라스크에 넣고 40% NaOH를 이용하여 pH를 각각 4.5, 5.5, 6.0. 6.5, 7.5로 보정하였다. 각 배양 플라스크를 증기 멸균기 (121oC, 20 min)를 이용하여 살균 후에 24 hr 배양된 워킹(working) 배양액을 2% (v/v)접종하였다. 접종된 배양 플라스크들은 진탕기 (shaker)에서, 배양 온도는 전 실시예에서 최적 온도로 확인된 30℃로 보정하여 200 rpm으로 배양하였다. 배양시간은 균체 성장이 정상기에 도달하여 평형을 이룰 때 까지 시행하였다.In order to know the optimal pH for the mannitol fermentation of the isolated strain, 50 ml MM containing 2.5% fructose and 0.5% yeast extract was placed in a 250 ml flask and the pH was adjusted to 4.5, 5.5, and 6.0 using 40% NaOH. Corrected to 6.5 and 7.5. Each culture flask was sterilized using a steam sterilizer (121 ° C., 20 min) after 2% (v / v) incubation of the working culture incubated for 24 hr. Inoculated culture flasks were incubated at a shaker, at 200 rpm, with the culture temperature corrected to 30 ° C., which was identified as the optimum temperature in all examples. Incubation time was performed until cell growth reached a steady state and equilibrium.

그 결과를 표 2에 나타내었다. 젖산 및 유기산 발효에서 균체가 성장하면서 발효액 내에 유기산이 증가하게 되는데, 이때 유기산은 배양액의 pH에 따라서 해리된 유기산과 해리되지 않은 유기산으로 존재한다. 해리되지 않은 유기산의 농도가 세포성장 저해를 주로 일으키는데, 이러한 유기산이 능동 확산에 의하여 세포막을 통과할 경우 세포 내.외부의 pH 구배가 바뀌게 되면서 해리되지 않은 유기산에 의하여 세포의 성장 및 탄수화물 대사가 비경쟁적으로 저해를 받는다고 한다. The results are shown in Table 2. As the cells grow in lactic acid and organic acid fermentation, organic acids increase in the fermentation broth, wherein the organic acids are present as dissociated organic acids and undissociated organic acids according to the pH of the culture. The concentration of undissociated organic acids mainly causes cell growth inhibition. When these organic acids pass through the cell membrane by active diffusion, the pH gradient inside and outside the cells changes, and the growth and carbohydrate metabolism of the cells are not affected by the undissociated organic acids. Competitively hampered.

pHpH 균체량(g/ℓ)Cell weight (g / ℓ) 수율(g/g)Yield (g / g) 생산속도(g/ℓ-hr)Production speed (g / ℓ-hr) 기질소비속도(g/ℓ)Substrate consumption rate (g / ℓ) 4.54.5 1,61,6 0.600.60 12.712.7 13.113.1 5.55.5 2.22.2 0.790.79 17.717.7 14.514.5 6.56.5 2.72.7 0.810.81 19.319.3 15.415.4 7.07.0 2.92.9 0.830.83 22.622.6 17.617.6 7.57.5 2.62.6 0.740.74 17.717.7 15.515.5

실험 범위인 pH 4.5 - 7.5에서 유도기 없이 급격히 대수기에 접어드는 양상을 보여 주었는데, 비교적 낮은 pH 인 4.5 - 5.5 에서는 균체의 생산속도가 pH 6.5 이상에서 보다 현저하게 낮은 것으로 보였다. 배양 pH 6.0 - 7.5 사이에서는 비슷한 세포의 성장속도 및 균체량 생산을 보였고, pH 7.0에서 최대 균체 생산량을 보여 주었다. 과당으로부터 만니톨로의 생물 전환 공정에서 최종 만니톨의 농도는 발효공정 전체에 대한 평가를 나타내기 때문에, 이 연구는 균체의 성장이 정상기에 도달할 때까지 배양 pH가 최종 만니톨의 생산과 탄소원인 과당의 소비에 미치는 영향을 알기 위하여 수행하였다. In the experimental range of pH 4.5-7.5, it showed a rapid transition into the logarithmic phase without the induction phase. At the low pH of 4.5-5.5, the production rate of the cells was significantly lower than that of pH 6.5. Similar growth rates and cell mass production were observed between pH 6.0 and 7.5, and maximum cell production at pH 7.0. Since the final mannitol concentration in the bioconversion process from fructose to mannitol represents an evaluation of the entire fermentation process, the study found that the culture pH was increased until the growth of the cells reached a steady state. This was done to know the impact on consumption.

발효 진행중 만니톨의 생산과 과당의 소비는 배양 pH에 따라서 뚜렷이 차이가 있었다. 배양 pH가 4.5 내지 6.5의 범위값에서는 만니톨의 생산량이 계속 증가하였으나, pH 6.5 이상에서는 생산량이 서서히 감소함을 나타내었다. 최대 만니톨의 생산은 pH 6.5에서 13.7 g/l 로 결정이 되었는데, 이는 소비된 과당의 약 55%가 만니톨로 전환이 되었음을 보여준다. During fermentation, mannitol production and fructose consumption were significantly different according to culture pH. The production of mannitol was continuously increased at the culture pH ranged from 4.5 to 6.5, but the production was gradually decreased at pH 6.5 and above. Maximum mannitol production was determined to be 13.7 g / l at pH 6.5, indicating that about 55% of the fructose consumed was converted to mannitol.

과당의 소비는 pH 5.0까지 5%이내의 차이를 보여 만니톨생산에 pH가 미치는 경향과는 다르게 나타났는데, 이러한 경향은 배양 pH에 따라 균주가 에너지와 빌딩 블락을 생산하는 과당 대사과정과 전자수용체 (electron acceptor)로 사용되는 과당을 대사과정의 균형의 차이 때문이라고 생각한다. 초기 배양 pH가 균체의 생산량과 과당으로부터 만니톨의 생물 전환율에 대한 영향을 관찰하고, 균체에 의한 만니톨 발효의 효율성을 평가하였다. 생산된 균체량은 초기 배양 pH 7.5에서 낮아 질수록 큰 차이는 없지만 서서히 줄었다. 최대량 2.9 g/l는 pH 6.5에서 결정이 되었고, pH 5.5에서 6.0까지는 2.2에서 2.7 g/l으로 비교적 큰차이가 없었지만, pH 5.0에서도 비교적 성장을 하여 최종 균체량은 약 1.6 g/l 이었다. 배양 pH의 만니톨 발효 수율에 미치는 영향은 균체량의 생산에 미치는 영향과는 달리 최대 만니톨 수율은 pH 6.5에서 0.83로 결정이 되었고, pH 7.5에서는 0.74이고, pH가 낮아질수록 역시 수율은 낮아져 pH 5.0에서는 0.60로 떨어 졌다. 균체량에 대한 pH의 영향은 보이는 것처럼 과당의 소비량과 같은 경향을 보였으며, pH 6.5에서 역시 최대 만니톨의 수율 및 비수율이 결정된 것으로 보아, 생산 된 균체량은 직접적으로 만니톨 생산 수율에 영향을 미치는 것으로 보인다. 만니톨 생산속도와 비생산 속도는 직접적으로 생산 공정에서의 최종 생산량에 영향을 미치므로, 최적 생산 속도를 결정하는 것은 생물 공정에서 최고의 관심 중에 하나이다. 배양 pH의 변환에 대한 만니톨의 생산속도와 비생산 속도의 변화는 대체로 일치하였는데, 낮은 배양 pH 5.0에서부터 생산속도가 증가하여 pH 6.5에서 최고 (22.6 g/l-hr)에 이르고, 감소하기 시작하여 pH 7.5에서는 17.7 g/l-hr가 되었다. pH 6.5에서의 생산 속도는 pH 4.6보다 2배, 6.0보다는 1.4배정도의 크기를 보였는데, 이러한 경향은 비생산 속도의 경향과 일치하였다. The consumption of fructose differs by less than 5% to pH 5.0, which is different from the pH trend in mannitol production, which is characterized by the fructose metabolism and the electron acceptor process, which produces energy and building blocks depending on the culture pH. The fructose used as an electron acceptor is considered to be due to the balance of metabolic processes. The effect of initial culture pH on the production of cells and the bioconversion rate of mannitol from fructose was evaluated, and the efficiency of mannitol fermentation by the cells was evaluated. The amount of cells produced was lowered at the initial culture pH of 7.5, but gradually decreased. The maximum amount of 2.9 g / l was determined at pH 6.5, and there was no significant difference from 2.2 to 2.7 g / l from pH 5.5 to 6.0, but it grew relatively at pH 5.0 and the final cell weight was about 1.6 g / l. Contrary to the effect of culture pH on mannitol fermentation yield, the maximum mannitol yield was determined to be 0.83 at pH 6.5, 0.83 at pH 7.5, and lower at pH 5.0, 0.60 at pH 5.0. Fell into. The effect of pH on cell mass showed the same tendency as the consumption of fructose, and the maximum mannitol yield and specific yield were also determined at pH 6.5, suggesting that the cell mass produced directly affects mannitol production yield. . Since mannitol production rate and specific production rate directly affect the final yield in the production process, determining the optimum production rate is one of the best concerns in biological processes. Changes in mannitol production rate and specific production rate for the conversion of culture pH were largely consistent, with production rates increasing from low culture pH 5.0 to peak (22.6 g / l-hr) at pH 6.5 and starting to decrease. At pH 7.5, it was 17.7 g / l-hr. The production rate at pH 6.5 was about 2 times higher than pH 4.6 and 1.4 times higher than 6.0, which is consistent with the trend of non-production rate.

pH의 올리고당 발효 수율에 미치는 영향은 균체량의 생산에 미치는 영향과는 달리 최대 만니톨 수율은 pH 6.5에서 0.89로 결정이 되었고, pH 7.5에서는 0.75이고, pH가 낮아질수록 역시 수율은 낮아져 pH 5.5에서는 pH 0.70으로 떨어졌다. 균체량에 대한 pH의 영향은 기질 소비량과 같은 경향을 보였으며, pH 6.5에서 역시 최대 만니톨의 수율 및 비수율이 결정된 것으로 보아, 생산된 균체량은 직접적으로 올리고당 수율에 영향을 미치는 것으로 보인다. 만니톨의 생산속도와 비생산 속도는 직접적으로 생산 공정에서의 최종 생산량에 영향을 미치므로, 최적 생산 속도를 결정하는 것은 생물공정에서 최고의 관심 중에 하나이다. 배양 pH의 변환에 대한 만니톨의 생산속도와 비생산 속도의 변화는 대체로 일치하였는데, 낮은 배양 pH 4.5에서부터 생산속도가 증가하여 pH 6.5에서 최고 (23.5g/ℓ-hr)에 이르고, 감소하기 시작하여 pH 7.5에서는 15.3 g/ℓ-hr가 되었다. pH 6.5에서의 생산 속도는 pH 4.5보다 2.5배, 7.5보다는 약 1.3배 정도의 크기를 보였다.In contrast to the effect on the yield of oligosaccharide fermentation at pH, the maximum mannitol yield was determined to be 0.89 at pH 6.5, 0.75 at pH 7.5, and the yield was lower at pH 5.5 and pH 0.70 at pH 5.5. Fell into. The effect of pH on cell weight tended to be the same as substrate consumption, and at pH 6.5 the maximum mannitol yield and specific yield were also determined, suggesting that the cell weight produced directly affects the oligosaccharide yield. Since the production rate and non-production rate of mannitol directly affect the final yield in the production process, determining the optimum production rate is one of the best concerns in bioprocessing. Changes in mannitol production rate and specific production rate for conversion of culture pH were generally consistent, with production rates increasing from low incubation pH 4.5 to peak (23.5 g / l-hr) at pH 6.5 and starting to decrease. At pH 7.5, it was 15.3 g / l-hr. The production rate at pH 6.5 was about 2.5 times larger than pH 4.5 and about 1.3 times larger than 7.5.

실시예Example 6:  6: 만니톨Mannitol 발효의 효모 추출물( Yeast extract of fermentation ( yeastyeast extractextract ) 농도의 영향) Influence of concentration

효모 추출물은 발효 공정에서 가장 흔하게 쓰이는 질소원 이지만 가격이 비싸 질소원의 투입량을 결정하는 것은 최종 생산물의 가격에 크게 영향을 미치기 때문에 본 연구는 상업적 효모 추출물의 농도에 대하여 균체 생산량, 만니톨의 생산량, 과당의 만니톨로의 생물 변환에 대한 수율, 만니톨의 생산 속도 등에 미치는 영향을 밝히기 위하여 시행하였다. Yeast extract is the most commonly used nitrogen source in the fermentation process, but the high price of nitrogen determines the input of nitrogen source, and this study has shown that the production of bacterial yeast, mannitol, fructose The purpose of this study was to investigate the effects on the yield of mannitol to biotransformation and the production rate of mannitol.

만니톨 발효에 대한 최적 효모 추출물의 농도를 알기 위해서 2.5% 과당 포함하고 있는 50 ml MM를 250 ml 플라스크에 넣고 효모 추출물의 농도를 각각 0.05, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0% (w/v)으로 맞추고 최적 pH 6.5와 최적 배양온도 30oC에서 발효를 시행하였다. 각각의 배양 플라스크를 증기 멸균기 (121oC, 20 min)를 이용하여 살균 후에 24 hr 배양된 워킹 배양액을 2% (v/v)접종하였다. 배양시간은 균체 성장이 정상기에 도달 하여 평형을 이룰 때 까지 시행하였다. To determine the optimal yeast extract concentration for mannitol fermentation, add 50 ml MM containing 2.5% fructose into a 250 ml flask and adjust the yeast extract concentrations to 0.05, 0.2, 0.5, 1.0 and 2.0% (w / v), respectively. The fermentation was carried out at an optimum pH 6.5 and an optimum incubation temperature of 30oC. Each culture flask was inoculated with 2% (v / v) of 24 hr cultured working culture after sterilization using a steam sterilizer (121 ° C., 20 min). Incubation time was performed until cell growth reached a steady state and reached equilibrium.

효모추출 %(v/v)Yeast Extract% (v / v) 균체량(g/ℓ)Cell weight (g / ℓ) 수율(g/g)Yield (g / g) 생산속도(g/l-hr)Production speed (g / l-hr) 기질소비 속도(g/ℓ)Substrate consumption rate (g / ℓ) 0.050.05 0.750.75 0.250.25 2.652.65 8.48.4 0.20.2 2.52.5 0.670.67 12.912.9 15.515.5 0.50.5 3.13.1 0.850.85 19.319.3 18.118.1 1.01.0 3.63.6 0.640.64 13.913.9 17.417.4 2.02.0 3.93.9 0.050.05 0.980.98 15.515.5

균체의 성장의 효모 추출물에 대한 영향을 실험하기 위하여 전 실험에서 얻어진 최적온도 30oC와 pH 6.5에 고정하고 균체의 성장이 뚜렷이 정상기에 도달할 때까지 배양하였다. 발효 진행 중 만니톨의 생산과 과당의 소비는 효모 추출물의 농도에 따라서 뚜렷이 차이가 있었다. 효모 추출물 농도가 0.05% 내지 0.5%의 범위값에서 만니톨의 생산량이 계속 증가함을 보여 주었고, 0.5% 이상에서는 생산량이 서서히 감소하였다. 최대 만니톨의 생산은 0.5% 에서 13.4 g/l 로 결정이 되었는데, 흥미롭게도 2%에서는 만니톨의 양이 0.79 g/l로 나타나 만니톨의 생산과 균체의 성장과는 비례하지 않음을 보여주었다. 또한 0.05%의 낮은 농도에서도 질소원의 대부분이 균체의 성장에 사용되었기 때문에 결과적으로 낮은 만니톨의 생산량을 보여 준 것으로 보인다. In order to test the effect on the yeast extract of the growth of the cells was fixed at the optimum temperature of 30oC and pH 6.5 obtained in the previous experiments and incubated until the growth of the cells reached a distinctly normal phase. During fermentation, mannitol production and fructose consumption were significantly different depending on the concentration of yeast extract. In the range of 0.05% to 0.5% of yeast extract concentration, the production of mannitol was continuously increased, and at 0.5% or more, the yield was gradually decreased. The maximum production of mannitol was determined from 0.5% to 13.4 g / l. Interestingly, at 2%, the amount of mannitol was 0.79 g / l, indicating that it was not proportional to mannitol production and cell growth. In addition, even at a low concentration of 0.05%, most of the nitrogen source was used for the growth of the cells, resulting in low mannitol production.

균체량의 생산은 만니톨 생산 수율과는 전혀 다른 경향을 보여 주었는데, 효모 추출물의 농도가 높을수록 균체량의 생산은 계속 증가함을 보여 주었다. 고농도의 효모 추출물은 대사를 촉진시켜 주로 미생물의 에너지원과 빌딩 블락의 증가에 영향을 준 반면에, 과당의 만니톨로의 전환은 억제된 것으로 보인다. 최고의 만니톨 수율은 효모 추출물 0.5%에서 결정이 되었는데, 이때의 수율은 0.85로서 0.2% 보다는 1.3배, 1.0% 보다는 1.4 배정도 높았는데 2%에서 보다는 무려 20배가 높았다. 일반적으로 발효산업에서 가장 많이 사용하는 것이 효모 추출물이지만 가격이 비싼 점이 단점이기 때문에 이 연구의 결과는 중요한 의미를 시사한다. The production of cell mass showed a completely different trend from the yield of mannitol production. The higher the concentration of yeast extract, the higher the production of cell mass. High concentrations of yeast extract have been shown to stimulate metabolism, mainly affecting the increase of energy sources and building blocks of microorganisms, whereas the conversion of fructose to mannitol is suppressed. The highest mannitol yield was determined at 0.5% of yeast extract. The yield was 0.85, 1.3 times higher than 0.2% and 1.4 times higher than 1.0%, 20 times higher than 2%. Generally, yeast extract is the most commonly used in the fermentation industry, but the price is expensive, so the results of this study suggest an important meaning.

일반적으로 만니톨의 생산속도와 비생산 속도는 직접적으로 발효 생산 공정에서의 최종 생산량에 영향을 미치므로, 최적 생산 속도를 결정하는 것은 생물 공정에서 최고의 관심 중에 하나이다. 이러한 면에서 효모 추출물의 최적 생산속도의 결정은 중요하다. 효모 추출물 농도에 대한 생산속도의 값은 추출물의 농도 0.5%와 1%에서 차이가 없었는데, 만니톨의 수율의 경향과 비슷하게 2%의 농도에서는 현저히 줄어들었다. In general, the rate of production and specific production of mannitol directly affects the final yield in the fermentation production process, so determining the optimum production rate is one of the best concerns in biological processes. In this respect, the determination of the optimum production rate of yeast extract is important. The value of production rate for yeast extract concentration was not different at 0.5% and 1% of extract concentration, but decreased significantly at 2% concentration, similar to the tendency of mannitol yield.

실시예Example 7: 과당 농도가  7: fructose concentration 만니톨Mannitol 생산에 미치는 영향 Production impact

만니톨 발효에 대한 최적의 과당의 농도를 알기 위해서 0.5% 효묘 추출물을 포함하고 있는 50 ml MM를 250 ml 플라스크에 넣고 과당의 농도를 10, 50, 100, 200, 300 (w/v)으로 보정하였다. 각각의 배양 플라스크를 증기 멸균기 (121℃, 20 min)를 이용하여 살균 후에 24 hr 배양된 워킹 배양액을 2% (v/v)접종하였다. 접종된 배양 플라스크들은 진탕기 (shaker)에서 배양되었는데, 배양 조건은 pH 6.5, 200 rpm, 30℃ 이었다. 배양시간은 균체 성장이 정상기에 도달 하여 평형을 이룰 때 까지 시행하였다. In order to know the optimal concentration of fructose for mannitol fermentation, 50 ml MM containing 0.5% yeast extract was placed in a 250 ml flask and the concentration of fructose was corrected to 10, 50, 100, 200, 300 (w / v). . Each culture flask was sterilized using a steam sterilizer (121 ° C., 20 min) and then inoculated with 2% (v / v) of the 24hr cultured working culture. Inoculated culture flasks were incubated in a shaker, the culture conditions were pH 6.5, 200 rpm, 30 ℃. Incubation time was performed until cell growth reached a steady state and reached equilibrium.

기질농도(g/ℓ)Substrate concentration (g / ℓ) 균체량(g/ℓ)Cell weight (g / ℓ) 수율(g/g)Yield (g / g) 생산속도(g/l-hr)Production speed (g / l-hr) 기질소비속도(g/ℓ)Substrate consumption rate (g / ℓ) 1010 1.051.05 0.620.62 3.13.1 5.05.0 5050 2.462.46 0.780.78 28.028.0 31.031.0 100100 2.472.47 0.800.80 54.054.0 67.067.0 200200 0.930.93 0.300.30 18.718.7 61.061.0 300300 0.150.15 0.020.02 2.712.71 12.212.2

균체 성장의 과당 농도에 대한 영향을 실험하기 위하여 다른 배양 조건들을 이미 결정된 최적 조건에 고정하고 균체의 성장이 뚜렷이 정상기를 보일 때까지 배양을 하였다. 10/L 이상 100/L까지는 짧은 유도기를 지나 급격히 성장을 하였다. In order to examine the effect of cell growth on the fructose concentration, different culture conditions were fixed at the optimal optimum condition and cultured until cell growth was clearly normal. From 10 / L to 100 / L, it grew rapidly through the short induction period.

그러나 200g/L 이상의 과당의 농도에서는 균의 성장이 급격히 둔화되었다. 회분식 만니톨 발효 중 만니톨의 생산과 과당의 소비는 과당의 농도에 따라서 뚜렷한 차이를 보여주었는데, 과당의 농도가 증가 할수록 만니톨의 생산이 증가 하였지만 100g/L 이상의 과당의 농도에서는 과당의 소비속도에 비하여 만니톨의 생산은 떨어졌다. 200g/L이상의 고농도에서의 과당의 소비는 균체의 성장이 원활하지 못한 것으로 보아, 균체의 대사유지를 위하여 대부분이 사용이 된 것으로 생각이 된다. 최고의 만니톨의 생산은 100g/L의 과당의 농도에서 58 g/l 이었는데, 이 값은 200g/L의 농도보다 약 3배이고 50g/L의 농도에서 보다 약 두 배 정도 되는 양이다. However, at the concentration of fructose above 200 g / L, the growth of bacteria was slowed down rapidly. During batch mannitol fermentation, the production of mannitol and fructose consumption were clearly different according to the concentration of fructose. As the concentration of fructose increased, the production of mannitol increased. Production fell. Consumption of fructose at high concentrations of 200 g / L or more seems to be inadequate in the growth of the cells, and most of them are thought to be used for maintaining the metabolism of the cells. The highest mannitol production was 58 g / l at a concentration of 100 g / L fructose, about three times the concentration of 200 g / L and about twice the concentration at 50 g / L.

만니톨 생산에 대한 탄소원으로서 과당의 농도는 직접 만니톨의 생산량에 영향을 미치므로 적정량의 최적의 농도를 찾는 것은 중요하다. 일반적으로 당을 이용한 발효공정에서 원하고자 하는 대사산물이 일차 대사산물이라면 비록 적은농도에서 높은 수율을 나타낸다 하더라도 최종 생산물의 양을 최대로 하는 것이 발효의 목적이기 때문에 최적 생산 속도를 기준으로 공정을 수행한다. 하지만 수율은 균체의 생물전환에 대한 효율성을 나타내는 지표이기 때문에, 일반적으로 균체의 생산량은 균체를 이용한 생물 전환 공정에서 얻고자하는 최종 생산물의 양과 상관관계가 있는 것으로 알려져 왔다. 과당의 농도 10 g/L에서 수율은 50 g/L에서보다 2.5배정도 낮았는데, 이는 적은 농도의 과당이 주로 균체의 성장에 이용이 된 것으로 보인다. 최고의 수율이 100 g/L에서 0.80이었고 이후 과당의 농도가 증가 할수록 만니톨 생산 수율은 급격히 떨어지기 시작하여 300 g/L의 과당 농도에서는 0.02정도로 낮아 졌다. 하지만 이 농도에서 균체량의 생산이 역시 최소가 되어 실제 만니톨 생산의 균체 효율성은 최대였다 (18.1 g/g-hr). 만니톨의 생산 속도는 과당의 농도에 따라 상당히 차이가 나는 경향을 보였다. 만니톨의 최대 수율은 과당 농도 100 g/L에서 결정이 되었고 역시 최대 생산속도는 100 g/L에서 결정이 되었다. 이후 역시 감소하기 시작하여 200 g/L, 300 g/L 의 과당 농도에서는 각각 3배, 15 배 정도의 차이를 보였다. 이러한 이유로 해서 실제 생산 공정에서는 최대의 수율과 생산속도는 최대량의 경제적인 생산을 위하여 고려 해할 사항이 된다. 가령 생산품의 기질의 단가가 고가인 경우에는 최적 수율에 고려하여서 공정을 설계하는 반면에, 기질의 가격이 저가인 경우에는 생산속도가 더 중요한 변수가 될 수 있다. 비 수율과 마찬가지로 고 농도에서 높은 비 생산 속도를 나타내었는데, 최대 비생산 속도는 역시 100 g/L 과당 농도에서 결정이 되었다. Since the concentration of fructose as a carbon source for mannitol production directly affects the production of mannitol, it is important to find the optimal concentration of the appropriate amount. In general, if the desired metabolite in the fermentation process using sugar is the first metabolite, the process is performed based on the optimum production rate because the purpose of the fermentation is to maximize the amount of the final product even if the yield is high at a low concentration. do. However, since yield is an indicator of the efficiency of the bioconversion of the cells, the yield of the cells is generally correlated with the amount of the final product to be obtained in the bioconversion process using the cells. At 10 g / L of fructose, the yield was 2.5 times lower than at 50 g / L, indicating that a lower concentration of fructose was mainly used for cell growth. The highest yield was 0.80 at 100 g / L, and as the concentration of fructose increased, the yield of mannitol began to drop sharply and dropped to 0.02 at 300 g / L of fructose. At this concentration, however, the cell mass production was also minimal, and the actual cell efficiency of mannitol production was maximum (18.1 g / g-hr). The production rate of mannitol tended to vary considerably with the concentration of fructose. The maximum yield of mannitol was determined at a fructose concentration of 100 g / L and the maximum production rate was also determined at 100 g / L. Afterwards, it also began to decrease, and the concentration of fructose at 200 g / L and 300 g / L was 3 and 15 times, respectively. For this reason, the maximum yields and production speeds in the actual production process are considered for maximum economical production. For example, if the unit price of the substrate of the product is high, the process is designed in consideration of the optimum yield, while the rate of production may be a more important variable if the substrate price is low. As with specific yield, it showed high specific production rate at high concentration, and the maximum specific production rate was also determined at 100 g / L fructose concentration.

실시예Example 8: 발효 최적조건에서  8: Under fermentation optimum 만니톨의Mannitol 생산  production

만니톨 발효의 최적 조건 실험에서 결정된 배양온도 30℃, pH 6.5, 효모 추출물의 농도 0.5%의 조건으로 5L 회분식 발효조에서 10% (w/v) 과당의 농도를 첨가하여 수행을 하였다. 도 6에서 보면 과당은 균체의 성장과 만니톨로의 전환에 따라 급격히 소비되어 발효시간 12시간 후에는 90% 이상이 소비되었다. 만니톨 생산은 최대 72.4 g/L가 생산이 되었고, 이때의 만니톨 생산 수율은 0.85에서 최대를 이루었고 발효시간 경과에 따라 감소하는 경향을 보여주었다. 생산속도는 최대 6.5에서 결정이 되었다. Optimal conditions of mannitol fermentation were performed by adding a concentration of 10% (w / v) fructose in a 5L batch fermenter under conditions of a culture temperature of 30 ° C., pH 6.5, and a concentration of 0.5% of yeast extract. In FIG. 6, fructose was rapidly consumed according to the growth of cells and conversion to mannitol, and more than 90% was consumed after 12 hours of fermentation time. Mannitol production was up to 72.4 g / L, and the mannitol production yield reached a maximum of 0.85 and decreased with the fermentation time. The production rate was determined at a maximum of 6.5.

본 발명의 방법에 따르면 류코노스톡 시트리움 KW39을 이용하여 당 알콜인 만니톨을 80% 이상의 효율로 생산할 수 있으며 생산된 만니톨은 기능성 식품, 치약 원료, 항산화방지를 위한 식품, 의료, 제약, 화장품 등의 분야 및 원료로 유용하게 사용될 수 있다.According to the method of the present invention, mannitol, a sugar alcohol, can be produced at an efficiency of 80% or more using the leukonostock citrium KW39, and the produced mannitol is a functional food, a toothpaste raw material, an antioxidant food, medical, pharmaceutical, cosmetics, etc. It can be usefully used as a field and raw material of.

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Claims (6)

기탁번호 KACC 91264P로 기탁된, 만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 KW39.Leukonostock Citrium KW39 with mannitol production capacity deposited with accession number KACC 91264P. 기탁번호 KACC 91264P로 기탁된, 만니톨 생산능을 갖는 류코노스톡 시트리움 KW39를 발효 배양시키는 단계; 및 배지로부터 생성된 만니톨을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 만니톨을 생산하는 방법.Fermentation and culturing leuconosstock citrium KW39 having mannitol production capacity, deposited with accession number KACC 91264P; And isolating and purifying the mannitol produced from the medium. 제2항에 있어서, 배양시 배양 온도를 20℃내지 40℃로 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the culture temperature is maintained at 20 ° C. to 40 ° C. during the culture. 제2항에 있어서, 배양시 pH를 5.5 내지 7.5로 유지하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 2, wherein the pH is maintained at 5.5 to 7.5 in culture. 제2항에 있어서, 배양시 과당의 농도를 50 내지 200 (g/ℓ)으로 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the concentration of fructose in culture is maintained at 50 to 200 (g / l). 제2항에 있어서, 배양시 효모 추출물의 농도를 0.2 내지 1.4 % (w/v)로 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the concentration of the yeast extract in culture is maintained at 0.2 to 1.4% (w / v).

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