KR100797912B1 - -1 Promoters Originated from Chlorella Virus HS-1 and Use Thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 국내에서 분리한 클로렐라 바이러스 균주 HS-1 유래의 프로모터 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이러스의 복제에 필요한 단백질을 코딩하고 있고 숙주의 전사 기관에 의하여 바이러스가 복제되기 이전에 발현하는 초기 발현 유전자로부터 분리한 프로모터와 이를 함유하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a promoter derived from chlorella virus strain HS-1 isolated from Korea and its use, and more particularly, to encode a protein necessary for the replication of the virus and to express it before the virus is replicated by the host transcriptional organ. The present invention relates to a promoter isolated from an initially expressed gene, a vector containing the same, and a method for producing a target protein using the microalgae transformed with the vector.

본 발명에 따른 초기 발현 유전자 프로모터는 클로렐라에서 외래 유전자를 강력하게 발현하는 기능을 가지고 있어, 클로렐라 및 식물에서 고농도의 재조합단백질을 제조할 수 있다.The early expression gene promoter according to the present invention has a function of strongly expressing a foreign gene in chlorella, thereby producing a high concentration of recombinant protein in chlorella and plants.

클로렐라 바이러스, 초기 발현 유전자 프로모터, 형질전환 식물, 형질전환 미세조류 Chlorella virus, early expression gene promoter, transgenic plant, transgenic microalgae

Description

클로렐라 바이러스 에이치에스-1 유래의 프로모터 및 그 용도 {Promoters Originated from Chlorella Virus HS-1 and Use Thereof}Promoters Originated from Chlorella Virus HS-1 and Use Thereof}

도 1은 클로렐라 바이러스로부터 초기발현 유전자 프로모터를 증폭하기 위하여 국내의 담수로부터 분리된 8종의 클로렐라 바이러스의 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 DNA 중합효소(polymerase) 유전자 프로모터(A), DNA 리가아제(ligase) 유전자 프로모터(B), 키티나제(chitinase) 유전자 프로모터(C)를 전기 영동한 사진으로, 레인7은 클로렐라 바이러스 HS-1을 나타낸다. 1 is a DNA polymerase gene promoter (A) and DNA ligase by PCR amplification of genomic DNA of eight chlorella viruses isolated from freshwater in Korea in order to amplify the early expression gene promoter from chlorella virus. Gene promoter (B), chitinase gene promoter (C) is a picture of the electrophoresis, lane 7 represents Chlorella virus HS-1.

도 2는 클로렐라 바이러스 HS-1 유래 초기 발현 유전자로부터 분리한 DNA 중합효소(polymerase) 유전자 프로모터의 핵산 염기 서열과 각 염기 서열을 분석한 모식도이다. Figure 2 is a schematic diagram analyzing the nucleic acid base sequence and each base sequence of the DNA polymerase gene promoter isolated from the early expression gene of Chlorella virus HS-1.

도 3은 클로렐라 바이러스 HS-1 유래 초기 발현 유전자로부터 분리한 DNA 리가아제(ligase) 유전자 프로모터의 핵산 염기 서열과 각 염기 서열을 분석한 모식도이다. Figure 3 is a schematic diagram of the analysis of the nucleic acid base sequence and each base sequence of the DNA ligase gene promoter isolated from the early expression gene of Chlorella virus HS-1.

도 4는 클로렐라 바이러스 HS-1 유래 초기 발현 유전자로부터 분리한 키티나제 (chitinase) 유전자 프로모터의 핵산 염기 서열과 각 염기 서열을 분석한 모식도이다. Figure 4 is a schematic diagram of the analysis of the nucleic acid base sequence and each base sequence of the chitinase gene promoter isolated from the early expression gene of Chlorella virus HS-1.

도 5는 클로렐라 형질 전환 벡터인 pCTV의 모식도이다. 5 is a schematic diagram of pCTV, a chlorella transformation vector.

도 6은 재조합 벡터 pMinGFP, pPGFP, pLGFP 및 pCGFP의 모식도이다. 6 is a schematic diagram of recombinant vectors pMinGFP, pPGFP, pLGFP and pCGFP.

도 7은 야생형의 클로렐라와 형질전환된 클로렐라에서 녹색 형광단백질(GFP)의 발현을 형광현미경으로 관찰한 사진이다. 7 is a photograph of fluorescence microscopy of expression of green fluorescent protein (GFP) in wild type chlorella and transformed chlorella.

도 8은 형질전환된 클로렐라에서 녹색 형광단백질(GFP)의 발현세기를 형광 분광계로 측정하고 그 값을 상대적인 수치로 표현하여 비교한 모식도이다. FIG. 8 is a schematic diagram comparing the expression intensity of green fluorescent protein (GFP) in a transformed chlorella using a fluorescence spectrometer and expressing the values in relative values.

본 발명은 클로렐라 바이러스 HS-1 균주 유래의 프로모터 및 그 용도에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 바이러스의 복제에 필요한 단백질을 코딩하고 있고 숙주의 전사 기관에 의하여 바이러스가 복제되기 이전에 발현하는 초기 발현 유전자로부터 분리한 DNA 중합효소(polymerase) 유전자 프로모터, DNA 리가아제(ligase) 유전자 프로모터, 키티나제(chitinase) 유전자 프로모터와 이를 함유하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a promoter from the Chlorella virus HS-1 strain and its use. More specifically, the DNA polymerase gene promoter, DNA ligase, which encodes a protein necessary for the replication of the virus and is isolated from the initial expression gene expressed before the virus is replicated by the host's transcriptional organs. The present invention relates to a gene promoter, a chitinase gene promoter, a vector containing the same, and a method for preparing a protein of interest using the microalgae transformed with the vector.

형질전환 식물을 이용하여 단백질을 생산하는 것은 응용식물 생명공학의 새로운 분야로서 분자유전학, 식물세포생리학, 식물형질전환 기법을 이용한 분자농업이라고 할 수 있다. 형질전환 기술의 발전으로 1980년대부터 형질전환 식물의 조직으로부터 외래 단백질의 생산과 정제에 관한 보고가 있었으며(참조: Hiatt, A. et al., Nature., 76-78, 1989; Salmon, V. et al., Protein Expr Purif., 127-135, 1998), 형질전환 식물을 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법은 기존의 다른 단백질 발현 시스템보다 이용 가능성이 높은 고가의 단백질을 산업화 수준으로 생산할 수가 있다(참조: Zhong, R. et al., Plant Physiol., 53-64, 1999). Producing proteins using transgenic plants is a new field in applied plant biotechnology that can be called molecular agriculture using molecular genetics, plant cell physiology, and plant transformation techniques. Advances in transformation technology have led to the production and purification of foreign proteins from tissues of transgenic plants since the 1980s (Hiatt, A. et al., Nature., 76-78, 1989; Salmon, V. et al., Protein Expr Purif., 127-135, 1998), using a transgenic plant to produce foreign proteins can produce industrially expensive proteins that are more available than other protein expression systems. (See Zhong, R. et al., Plant Physiol., 53-64, 1999).

이중에서도 최근 단세포 진핵 녹조류인 클로렐라가 생물반응기로서의 활용이 각광받고 있는데, 이는 클로렐라가 이종 단백질의 발현에 적합한 시스템을 지녔기 때문이다. 일정량의 빛과 탄소원만 있으면 값싸게 대량 배양이 가능하며 하루에 2~9번 분열하기 때문에 성장속도가 빠르다 (참조: Sorokin, C. et al., Plant Physiol., 179-183, 1958). 또한 진핵생물인 클로렐라는 일반 진핵생물들과 마찬가지로 유전자를 전사한 후 변형 과정을 거치므로, 이종 진핵생물의 유전자로 형질전환시킬 경우, 생물학적 활성을 지닌 단백질을 만들 수 있는 등의 이점이 있다. 클로렐라에서의 동종 또는 이종 구성형 단백질의 일시적인 발현은 1990년대부터 보고되었으며(참조: Javis, E. E. et al., Curr Genet., 317-321. 1991; Dowson, H.N. et al., Curr Microbiol., 356-362. 1997; Hawkins, R.L. et al., Curr Microbiol., 335-341, 1999), 최근에는 클로렐라에서 넙치 성장 호르몬을 안정적으로 발현시킨 연구가 보고되었다 (참조: Kim, D.H. et al., Mar. Biotechnol., 63-73, 2002).Among them, chlorella, a single-cell eukaryotic green alga, has recently been used as a bioreactor because chlorella has a system suitable for the expression of heterologous proteins. With a certain amount of light and a carbon source, it can be inexpensively mass cultivated and grow fast because it splits 2-9 times a day (see Sorokin, C. et al., Plant Physiol., 179-183, 1958). In addition, eukaryotic chlorella, like other eukaryotes, is transcribed and then modified, thus transforming genes of heterologous eukaryotes, such as producing proteins with biological activity. Transient expression of homologous or heterologous constitutive proteins in chlorella has been reported since the 1990s (Javis, EE et al., Curr Genet., 317-321. 1991; Dowson, HN et al., Curr Microbiol., 356 -362. 1997; Hawkins, RL et al., Curr Microbiol., 335-341, 1999). Recently, studies have been reported on the stable expression of halibut growth hormone in chlorella (Kim, DH et al., Mar. Biotechnol., 63-73, 2002).

개발가능성을 가진 유전자의 수는 엄청나며 앞으로는 이들의 분리 및 구조해석과 더불어 삽입 유전자를 어떤 생물체에서 어느 시기 또는 어떤 조직에서 발현시키느냐가 중요한 과제이다. 하지만 외래 유용 유전자의 발현은 목적유전자를 분리하고, 적합한 형질전환 식물체를 선택하는 것만으로 충족될 수 없다. 형질전환 식물을 이용하여 저비용으로 부가가치가 높은 단백질을 대량으로 생산하기 위해서, 우선적으로 고려되어야 할 여러 조건 가운데 하나가 식물에서 높은 활성을 가지는 프로모터를 개발하는 것이다 (참조: Norre, F. et al., Plant Mol Biol., 699-712, 2002). The number of genes that can be developed is enormous, and in the future, the separation and structural analysis of these genes, as well as the expression of the inserted genes in which organisms at what time or in which tissues, is an important task. However, expression of foreign useful genes cannot be satisfied simply by isolating the gene of interest and selecting a suitable transgenic plant. In order to produce large quantities of high value added proteins at low cost using transgenic plants, one of several conditions that should be considered first is the development of high activity promoters in plants (Norre, F. et al. , Plant Mol Biol., 699-712, 2002).

지금까지 개발된 프로모터 가운데 식물에서 기원한 프로모터의 수는 많지 않기 때문에 과학자들은 식물 바이러스와 뿌리혹박테리아 Ti플라스미드의 프로모터에 많은 관심을 가져왔다. 식물 단백질 발현 분야에서 최초이자 가장 중요한 발명 중의 하나는 유전자 변형 식물에서 이종 유전자를 강력하고 구성적으로 발현시키는 식물 바이러스 유래의 프로모터를 사용하게 된 것이다. 콜리플라워 모자이크 바이러스[Cauliflower mosaic virus(CaMV)]로 부터의 35S 및 19S 프로모터가 분리되어 널리 이용되고 있으며(유럽특허 제0131623호), 그 밖에 아그로박테리움의 T-DNA에서 유래한 노파린 합성 유전자(nos), 만노핀 합성 유전자(mas)및 옥토핀 합성 유전자(cos) (유럽특허 제0122791호, 유럽특허 제0126546호, 유럽특허 제0145338호), 그리고 식물 유래 유비퀴틴 프로모터가 이용되고 있다 (유럽특허 제342926호). Since few promoters have been plant-derived among the promoters developed so far, scientists have been very interested in the promoters of plant viruses and the root-knot bacterium Ti plasmid. One of the first and most important inventions in the field of plant protein expression is the use of plant virus-derived promoters that potently and constitutively express heterologous genes in genetically modified plants. 35S and 19S promoters from Cauliflower mosaic virus (CaMV) have been isolated and widely used (European Patent No. 0131623), and other noparin synthetic genes derived from Agrobacterium T-DNA. (nos), mannopine synthesis genes (mas) and octopin synthesis genes (cos) (European Patent No. 022791, European Patent No. 026546, European Patent No. 0145338), and plant-derived ubiquitin promoters are used (Europe) Patent 342926).

이중 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터는 식물에서 도입시킨 유전자를 지속적이고 효율적으로 발현시키기 위해 가장 널리 사용되고 있는 프로모터 중의 하나로 상기 기재된 외래 유용 단백질의 생산에 대부분 이용되었다. 하지만 이 프로모터는 모든 숙주식물에서 상시 강력한 발현을 유도하는 것은 아니어서, 쌍떡잎식물에서 보다 유용하게 사용되고 있으며 프로모터의 염기서열 중 21bp가 뿌리에 집중적인 조직발현을 유도한다고 보고되고 있다 (참조: Lam, E. et al., PANS, 7890-7894, 1989). 이에, 이들 프로모터의 발현 수준을 높이기 위한 시도가 있어 왔는데, 그에 대한 예로는 두 배로 강화된 35S 프로모터(미국특허 제5,164,316) 및 아그로박테리움 프로모터의 부분들을 결합시킨 수퍼프로모터(유럽특허 제729514호)가 있다.The 35S promoter of double mosaic virus (CaMV) is one of the most widely used promoters for the continuous and efficient expression of genes introduced in plants and has been used mostly for the production of foreign useful proteins described above. However, this promoter does not always induce strong expression in all host plants, so it is more useful in dicotyledonous plants, and it is reported that 21bp of promoter sequence induces intensive tissue expression in the roots (see Lam, E. et al., PANS , 7890-7894, 1989). Thus, attempts have been made to increase the expression levels of these promoters, examples of which include a double promoter 35S promoter (US Pat. No. 5,164,316) and a part of the Agrobacterium promoter (European Patent No. 729514). There is.

또한, 최근에는 빛이나 온도, 스트레스에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 프로모터들이 분리, 보고되고 있으며, 대표적으로 퍼옥시다제의 유전자 프로모터가 식물에서 보고되었다 (참조: Kwak, S.S. et al., Plant Mol. Biol., 831-838, 2003.). 퍼옥시다제는 노화와 질병의 원인이 되는 활성산소를 제거하는 항산화물질의 일종으로 특히 상처나 저온, 자외선, 오존 등에 의하여 강하게 발현된다. 이 프로모터의 경우 항암제인 택솔 등 고부가가치의 치료용 단백질 및 약리활성물질 등을 생산하는데 활용되며 장기적으로 환경스트레스 조건에서도 잘 자라는 환경내성 식물 개발에도 활용될 전망으로 있다.Recently, promoters that regulate gene expression in response to light, temperature, and stress have been isolated and reported. Typically, gene promoters of peroxidase have been reported in plants (Kwak, SS et al., Plant Mol). Biol ., 831-838, 2003.). Peroxidase is a type of antioxidant that removes free radicals that cause aging and disease, and is particularly strongly expressed by wounds, low temperatures, ultraviolet rays, and ozone. This promoter is used to produce high value-added therapeutic proteins and pharmacologically active substances such as anticancer drug Taxol, and is expected to be used to develop environmentally resistant plants that grow well under environmental stress conditions in the long term.

그러나 상기 기재된 모든 프로모터들은 분명한 형태의 조직, 또는 생장 특이적인 발현은 나타내지만, 넓은 범위에서 동일한 발현률을 나타내지는 못하므로 각각의 경우 특이적인 프로모터 개발을 필요로 하기 때문에 이상적인 프로모터의 기준을 충족시키지는 못한다. 따라서, 식물뿐만 아니라 형질전환된 미세조류를 이용하여 유용 단백질을 생산하려는 노력이 시도되고 있는 시점에서, 이에 적합한 프로모터의 개발이 동시에 수반되어야한다. However, all of the promoters described above do not meet the criteria of ideal promoters because they exhibit clear tissue or growth-specific expression, but do not exhibit the same expression rates over a wide range, and in each case require specific promoter development. . Therefore, at the time when efforts are being made to produce useful proteins using not only plants but also transformed microalgae, the development of suitable promoters for this should be accompanied.

이에, 본 발명자들은 형질전환 미세조류에서 이종유전자를 강력하게 발현할 수 있는 프로모터를 개발하고자 예의 노력한 결과, 국내에서 분리된 클로렐라 바이러스 균주 HS-1의 초기 발현 유전자의 프로모터를 분리하고, 이를 이용한 벡터를 제작하여 클로렐라에서 외래 유전자를 강력하게 발현하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have made intensive efforts to develop a promoter capable of expressing a heterologous gene strongly in a transgenic microalgae, as a result of separating the promoter of the initial expression gene of Chlorella virus strain HS-1 isolated in Korea, and using the vector It was confirmed that the strong expression of foreign genes in Chlorella to complete the present invention.

결국, 본 발명의 주된 목적은 클로렐라 바이러스 균주 HS-1 유래의 신규 프로모터를 제공하는 것이다. After all, the main object of the present invention is to provide a novel promoter from chlorella virus strain HS-1.

본 발명의 다른 목적은 상기 초기 발현 유전자 프로모터를 포함하는 벡터 및 상기 초기 발현 유전자 벡터로 형질전환된 미세조류를 이용한 목적단백질의 제조방법을 제공하고, 상기 재조합 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환 미생물과 식물체 및 그들을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a method comprising preparing a target protein using a vector comprising the initial expression gene promoter and the microalgae transformed with the initial expression gene vector, and the recombinant vector comprises a group consisting of bacteria, fungi and yeast. It is to provide a method for producing a target protein, characterized in that the transformed microorganisms and plants obtained by introducing into any one of the host selected from the culturing and cultivating them.

본 발명자들은 클로렐라 바이러스 균주 HS-1 으로부터 DNA의 복제에 필수적인 것으로 알려진 초기 발현 유전자, 특히 DNA polymerase, ATP-dependent DNA　ligase 그리고 chitinase 유전자의 프로모터를 제공하며, 이들 프로모터의 분석을 통하여 TATA 박스, CAAT 박스, NTBBF1 박스 그리고 CCAAT 박스를 포함하여 전사에 영향을 미칠 것으로 보이는 시스 활성 요소(cis-acting element)가 존재한다는 것을 확인하였다.The present inventors provide promoters of early expression genes, particularly DNA polymerase, ATP-dependent DNAligase and chitinase genes, which are known to be essential for the replication of DNA from the Chlorella virus strain HS-1, and through analysis of these promoters, TATA boxes, CAAT boxes We have identified cis-acting elements that appear to affect transcription, including the NTBBF1 box and the CCAAT box.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

클로렐라 바이러스는 330kb이상의 선형 DNA를 지니고 200-300개의 단백질을 코딩하고 있으며, 피코드나비리대(Phycodnaviridae)에 속하는 대표적인 바이러스인 PBCV-1이 코딩하고 있는 유전자는 그것의 발현 시작 시간에 따라 초기 발현 유전자와 후기 발현 유전자로 나뉘어 질 수 있다. 초기 발현 유전자는 바이러스의 복제에 필요한 단백질을 코딩하고 있고 숙주의 전사 기관에 의하여 바이러스가 복제되기 이전에 발현하며, 이러한 이유로 클로렐라의 형질전환 벡터를 구축함에 있어 이들 유전자의 프로모터들이 이용될 수 있는 가능성을 제공한다. PBCV-1은 자체 DNA 의존형 RNA 중합효소를 코딩하지 않고 있어 숙주로부터의 효소를 이용할 것으로 알려져 있다. 이로 인하여, 바이러스의 초기 발현 유전자 중에서도 DNA의 복제에 필수적인 유전자로 알려진 DNA polymerase, ATP-dependent DNA ligase 그리고 chitinase 유전자의 프로모터가 클로렐라를 이용한 이종 구성유전자의 발현을 가능하게 할 것이라고 예상되었다. Chlorella virus encodes 200-300 proteins with more than 330kb of linear DNA. Genes encoded by PBCV -1, a representative virus belonging to Phycodnaviridae , can be divided into early and late expression genes according to their expression start time. Initially expressed genes encode proteins necessary for the replication of the virus and are expressed before the virus is replicated by the host's transcriptional organs, which is why the promoters of these genes can be used to construct chlorella's transformation vectors. To provide. PBCV-1 does not encode its own DNA dependent RNA polymerase and is known to utilize enzymes from the host. Therefore, it is expected that the promoters of DNA polymerase, ATP-dependent DNA ligase and chitinase genes, which are known as essential genes for DNA replication among early expression genes of the virus, will enable the expression of heterologous genes using chlorella.

본 발명에서는 한국 담수에서 8종의 클로렐라 바이러스를 분리하였으며, 이들 클로렐라 바이러스의 게놈 DNA로부터 클로렐라 바이러스 PBCV-1의 게놈 DNA를 기본으로 하여 초기 발현 유전자 프로모터를 분리하였다. 그 중에서도 상기 초기 발현 유전자 프로모터들이 모두 분리되었으며, PBCV-1과 염기 서열의 상동성이 가장 높은 HS-1의 초기 발현 유전자 프로모터를 선택하였다. 상기 초기 발현 유전자 프로모터의 분석을 통하여 DNA polymerase 유전자 프로모터에서는 2개, DNA ligase 유전자 프로모터에서는 3개 그리고 chitinase 유전자 프로모터에서는 4개의 TATA 박스가 존재하였고, 이와 더불어 CAAT 박스, NTBBF1 박스, GATA 박스 그리고 CCAAT 박스를 포함하여 많은 전사 요소가 결합할 수 있는 부위가 존재한다는 것을 확인하였다. In the present invention, eight chlorella viruses were isolated from freshwater in Korea, and the initial expression gene promoter was isolated based on the genomic DNA of chlorella virus PBCV-1 from the genomic DNA of these chlorella viruses. Among them, all of the initial expression gene promoters were isolated, and the initial expression gene promoter of HS-1 having the highest homology with PBCV-1 was selected. The analysis of the initial expression gene promoter revealed that there were two TATA boxes in the DNA polymerase gene promoter, three in the DNA ligase gene promoter and four in the chitinase gene promoter, as well as the CAAT box, NTBBF1 box, GATA box and CCAAT box. It was confirmed that there is a site to which many transcription elements can bind, including.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are only for illustrating the present invention in detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art and the art that the scope of the present invention is not limited by these examples. .

특히, 하기 실시예에서는 목적단백질로 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)만을 예시하였지만, GFP 대신에, 효소, 효소저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 항체, 신호전달단백질, 단일사슬항체, 항원, 펩타이드, 폴리펩타이드, 결합단백질, 결합도메인, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 각종 조절 인자 및 그들의 일부분 등을 포함하는 목적단백질을 본 발명의 프로모터를 이용하여 발현시키는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.In particular, the following examples illustrate only green fluorescence protein (GFP) as the protein of interest, but instead of GFP, enzymes, inhibitors, hormones, hormone analogs, antibodies, signaling proteins, single chain antibodies, antigens, peptides It is known to those skilled in the art to express a target protein using a promoter of the present invention, including a polypeptide, a binding protein, a binding domain, an adhesion protein, a structural protein, a regulatory protein, a toxin protein, a cytokine, various regulatory factors, and a part thereof. It will be self explanatory.

또한, 하기 실시예에서는 본 발명의 벡터를 클로렐라에 형질전환시켜 재조합 단백질의 발현을 확인하였지만, 그 외의 담배, 애기장대, 토마토 등의 식물체에 형질전환시켜 재조합 단백질을 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다. In addition, in the following examples, the vector of the present invention was transformed into chlorella to confirm the expression of the recombinant protein. However, it will be apparent to those skilled in the art that the recombinant protein can be produced by transforming other plants such as tobacco, Arabesque, tomato, etc. Will do.

실시예 1: 클로렐라 바이러스의 분리Example 1 Isolation of Chlorella Virus

본 발명에 사용된 클로렐라 바이러스는 한국의 9개 도시에서 수집된 담수를 클로렐라 바이러스의 숙주인 클로렐라에 적용한 후, 감염된 클로렐라 세포를 용해시켜 분리하였다. 먼저, 수집된 민물을 0.22 ㎛의 Al₂O₃ 필터(Whatman, 미국)를 사용하여 약 20 kPa의 압력으로 여과시켰다. 본 실시예에서는 클로렐라(Chlorella) NC64A를 MBBM배지(modified Bold's basal medium)(참조: Van Etten, J.L. et al., Virology, 126:117, 1983)에서 배양하였다. The chlorella virus used in the present invention was isolated by applying fresh water collected in nine cities in Korea to chlorella, which is a host of chlorella virus, and then lysing the infected chlorella cells. First, the collected fresh water was filtered at a pressure of about 20 kPa using an Al ₂ O ₃ filter (Whatman, USA). In this embodiment, Chlorella (Chlorella) medium to NC64A MBBM (modified Bold's basal medium ) and incubated (see: 117, 1983.: Van Etten , JL et al, Virology, 126).

상기 여과시킨 민물시료 5 ㎖을 100 ㎖의 클로렐라(Chlorella) NC64A 배양액 100 ㎖에 첨가하고, 25℃, 광조건에서 5일간 진탕 배양하였다. 클로렐라 배양액이 완전히 용해된 후, 상층액을 10^-6~ 10^-7배 희석한 후 5 ㎕를 취하여, 4 ㎖의 클로렐라 (4.0x10⁸cells/㎖), 2 ㎖의 0.75% (in MBBM 배지) 아가(agar)와 혼합한 후 1.5% 아가가 첨가된 MBBM 배지가 들어있는 배양접시 위에 깔았다. 배양접시에 형성된 단일 플라크(plaque)를 취하여 100 ㎖ 새로운 클로렐라 배양액에 접종하였다. 상기 클로렐라의 용해액을 새로운 배양접시에 접종하고 단일 플라크를 얻는 과정을 3회 반복하여 순수한 클로렐라 바이러스를 분리하여, 8종의 클로렐라 바이러스를 얻었다.5 ml of the filtered freshwater sample was added to 100 ml of 100 ml Chlorella NC64A culture solution, followed by shaking culture at 25 ° C. for 5 days under light conditions. After the chlorella culture was completely dissolved, the supernatant was diluted 10 ^-6 to 10 ^-7 times, and then 5 µl was taken. 4 ml of chlorella (4.0x10 ⁸ cells / ml), 2 ml of 0.75% (in MBBM medium) After mixing with agar (agar) was placed on a culture dish containing MBBM medium added 1.5% agar. A single plaque formed on the culture dish was taken and inoculated into 100 ml fresh chlorella culture. The chlorella lysate was inoculated into a new culture dish and a single plaque was repeated three times to isolate pure chlorella virus, thereby obtaining eight chlorella viruses.

실시예 2: 클로렐라 바이러스의 정제Example 2: Purification of Chlorella Virus

실시예 1에서 분리한 바이러스를 포함한 클로렐라 NC64A가 완전히 용해될 때까지 배양한 후, 용해액을 5000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮겨, 트리톤(Triton) X-100을 최종농도 0.1%가 되도록 첨가한 후, 4℃에서 20분간 섞어주었다. 섞어진 용액을 20,000 rpm에서 60분간 원심분리하여, 바이러스 입자를 침전시켰다. 상기 과정에서 얻어진 침전물을 50 mM Tris-버퍼(buffer)(pH 7.8)에 현탁시켜, 10~40% 비연속 슈크로오스(sucrose) 그래디언트용액에서 4℃, 20,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 바이러스가 포함된 30~40% 구간의 분획을 수득하여, 27,000 rpm에서 3 시간 동안 원심분리하여 침전시킨 후, 50 mM Tris-HCl 버퍼에 현탁시켜 게놈 DNA 분리에 사용하였다.After culturing until the Chlorella NC64A containing the virus isolated in Example 1 was completely dissolved, the lysate was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The supernatant was transferred to a new tube, Triton X-100 was added to a final concentration of 0.1%, and mixed at 4 ° C. for 20 minutes. The mixed solution was centrifuged at 20,000 rpm for 60 minutes to precipitate virus particles. The precipitate obtained in the above procedure was suspended in a 50 mM Tris-buffer (pH 7.8), and centrifuged at 4 ° C. and 20,000 rpm for 20 minutes in a 10-40% discontinuous sucrose gradient solution. Fractions containing 30-40% of the virus were obtained, precipitated by centrifugation at 27,000 rpm for 3 hours, and then suspended in 50 mM Tris-HCl buffer for use in genomic DNA separation.

실시예 3: 클로렐라 바이러스 게놈 DNA의 분리Example 3: Isolation of Chlorella Virus Genomic DNA

정제된 클로렐라 바이러스 400 ㎕에 60 ㎕의 10× TEN 버퍼[100 mM Tris-HCl(pH7.4), 10 mM EDTA, 1 M NaCl], 60 ㎕의 1% Na-살코실(salcosyl), 0.6 ㎕의 60%(w/w) CsCl 및 소량의 EtBr을 첨가하고, 75℃에서 15분간 반응시킨 후, 반응용액을 40~60%(w/w) CsCl 그래디언트 용액 위에 첨가한 후, 25℃, 35,000 rpm에서 18시간 동안 원심분리 하였다. EtBr로 표지된 바이러스 게놈 DNA를 포함한 부분을 수득한 후, 부탄올을 사용하여 EtBr을 추출하여 제거하였다. 바이러스 게놈 DNA는 에탄올로 침전시켜, 1× TE 버퍼[10 mM Tris-HCl(pH8.0), 1 mM EDTA]에 현탁시켰다. 60 μl of 10 × TEN buffer [100 mM Tris-HCl (pH7.4), 10 mM EDTA, 1 M NaCl], 60 μl of 1% Na-salcosyl, 0.6 μl in 400 μl of purified Chlorella virus 60% (w / w) of CsCl and a small amount of EtBr were added and reacted at 75 ° C. for 15 minutes, and then the reaction solution was added over a 40-60% (w / w) CsCl gradient solution, followed by 25 ° C., 35,000. Centrifugation for 18 hours at rpm. After obtaining portions containing viral genomic DNA labeled with EtBr, EtBr was extracted and removed using butanol. Viral genomic DNA was precipitated with ethanol and suspended in 1 × TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA].

실시예 4: 클로렐라 바이러스의 초기 발현 유전자 프로모터의 분리 및 분석Example 4 Isolation and Analysis of Initial Expression Gene Promoters of Chlorella Virus

본 발명에서 분리한 클로렐라 바이러스 HS-1의 초기 발현 유전자 프로모터를 분리하기 위하여 DNA polymerase, DNA ligase 그리고 chitinase 유전자의 상류 부분의 약 420 bp를 포함하는 DNA 단편이 증폭될수 있도록 PBCV-1의 염기 서열을 기본으로 하여 제작한 프라이머로 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)하였다. DNA 단편은 PCR 증폭 혼합액 (50~100 ng DNA, 10× 버퍼 (100 mM Tris-Cl(pH8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 2.5 mM dNTP, 4 ㎕ Taq polymerase (5 u/㎕) 그리고 100 pmol의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머)을 PCR 기기에 넣고 35회의 PCR 반응을 수행하였으며 PCR 반응은 94℃에서 10분간의 predenaturation, 94℃에서 1분간 denaturation, 50℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 그리고 72℃에서 7분간의 postextension을 수행하였다. PCR 결과물은 1.2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 확인하였다. PCR 결과물은 각 프로모터 부분에서 예상한 크기대로 확인되었지만 PCR 수행시 사용한 8종의 클로렐라 바이러스 모두에서 확인되지는 않았다 (참조: 도1). 8종의 클로렐라 바이러스 중 HS-1은 3개의 초기 발현 유전자 프로모터가 모두 증폭되었으며 염기 서열상에서 PBCV-1의 염기 서열과 가장 높은 상동성을 보였고, 그 결과 HS-1 으로부터 확인한 프로모터를 선택하여 분석하였다. HS-1 으로부터 분리한 초기 발현 유전자 프로모터는 데이터베이스, 식물 시스 활성조절 DNA 요소(plant cis-acting regulatory DNA element, PLACE)를 이용하여 분석하였다. DNA polymerase 유전자 프로모터(도2:서열번호1)에서는 2개의 TATA 박스, 3개의 CAAT 박스 그리고 5개의 GATA 박스가 확인되었다 (참조: 도2). DNA ligase 유전자 프로모터(도3:서열번호2)에서는 1개의 CCAAT 박스, 3개의 TATA 박스, 5개의 CAAT 박스와 4개의 GATA 박스가 확인되었다 (참조: 도3). Chitinase 유전자 프로모터(도4:서열번호3)에서는 한개의 CCAAT 박스와 NTBBF1 박스, 4개의 TATA 박스, 5개의 CAAT 박스 그리고 4개의 GATA 박스가 확인되었다 (참조: 도4). HS-1으로부터 분리한 세 개의 초기 발현 유전자 프로모터간에는 상동성을 가지는 염기 서열이 발견되지 않았다. In order to isolate the early expression gene promoter of the chlorella virus HS-1 isolated in the present invention, the DNA sequence including about 420 bp upstream of the DNA polymerase, DNA ligase and chitinase genes can be amplified. Polymerase chain reaction (PCR) was carried out with the primers prepared as a basis. DNA fragments were PCR amplified mixture (50-100 ng DNA, 10 × buffer (100 mM Tris-Cl (pH8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl ₂ ), 2.5 mM dNTP, 4 μl Taq polymerase (5 u / 35 μl) and 100 pmol forward primer and reverse primer) were placed in a PCR device and subjected to 35 PCR reactions.The PCR reactions were predenaturation at 94 ° C. for 10 minutes, denaturation at 94 ° C. for 1 minute, and annealing at 50 ° C. for 1 minute. Extension was carried out for 1 minute at ℃ and postextension for 7 minutes at 72 ℃. PCR results were confirmed by electrophoresis on 1.2% agarose gel. PCR results were confirmed to the expected size in each promoter portion, but not in all eight chlorella viruses used to perform PCR (see Figure 1). Of the eight chlorella viruses, HS-1 was amplified by all three early expressed gene promoters and showed the highest homology with the nucleotide sequence of PBCV-1 on the nucleotide sequence. As a result, the promoter identified from HS-1 was selected and analyzed. . Initially expressed gene promoters isolated from HS-1 were analyzed using a database, plant cis-acting regulatory DNA element (PLACE). In the DNA polymerase gene promoter (FIG. 2: SEQ ID NO: 1), two TATA boxes, three CAAT boxes, and five GATA boxes were identified (see FIG. 2). In the DNA ligase gene promoter (FIG. 3: SEQ ID NO: 2), one CCAAT box, three TATA boxes, five CAAT boxes, and four GATA boxes were identified (see FIG. 3). In the Chitinase gene promoter (FIG. 4: SEQ ID NO: 3), one CCAAT box, an NTBBF1 box, four TATA boxes, five CAAT boxes, and four GATA boxes were identified (see FIG. 4). No homology was found between the three early expressed gene promoters isolated from HS-1.

실시예 6. 클로렐라 형질전환 벡터의 제작Example 6 Construction of Chlorella Transformation Vectors

실시예 5에서 수득한 클로렐라 바이러스 유래의 프로모터가 형질전환 벡터에 사용가능한지를 확인하기 위하여, 상기 HS-1의 초기 발현 유전자 프로모터 부위를 가지는 형질전환 벡터를 제작하였다. 본 실시예의 형질전환 벡터는 도 5에 나타낸 pCTV 벡터(참조: Kim, D.-H. et al., Mar. Biotechnol. 4(1):63-73)를 변형하여 제작하였다. 상기 pCTV 벡터는 식물 형질전환 벡터를 변형한 것으로, 클라미도모나스 유래의 RBCS2 프로모터를 가지고, 넙치 성장 호르몬 유전자(fGH)와 선택마커로 플레오마이신 저항성 유전자(sh ble)가 삽입되어 있다. 먼저 pCTV 벡터를 제한효소 BamHI/XhoI로 처리하여 fGH 유전자를 제거하고, 상기 제거 위치에 GFP 유전자를 삽입하여 pMinGFPble를 제작하였다. 상기 벡터는 CaMV35S 프로모터의 조절 하에 GFP 유전자를 발현하게 되는데, 이 벡터를 제한효소 HindIII/BamHI로 절단하여 CaMV35S 프로모터 부위를 제거하고, 상기 제거 위치에 HS-1의 초기 발현 유전자 프로모터를 삽입하여 pPGFPble, pLGFPble 및 pCGFPble를 제작하였다 (참조: 도6).In order to confirm whether the promoter derived from chlorella virus obtained in Example 5 can be used in the transformation vector, a transformation vector having the promoter region of the initial expression gene of HS-1 was prepared. The transformation vector of this Example was prepared by modifying the pCTV vector (see: Kim, D.-H. et al., Mar. Biotechnol. 4 (1): 63-73) shown in FIG. The pCTV vector is a modified plant transformation vector, which has a RBCS2 promoter derived from Chlamydomonas, and has a pleomycin resistance gene (sh ble) inserted into the flounder growth hormone gene (fGH) and a selection marker. First, the pCTV vector was treated with the restriction enzyme Bam HI / Xho I to remove the fGH gene, and the GFP gene was inserted into the removal position to prepare pMinGFPble. The vector expresses the GFP gene under the control of the CaMV35S promoter, which is cleaved with the restriction enzyme Hin dIII / Bam HI to remove the CaMV35S promoter site, and inserts the initial expression gene of HS-1 into the removal site. pPGFPble, pLGFPble and pCGFPble were constructed (see Figure 6).

실시예 7. 클로렐라 형질전환 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조Example 7 Preparation of Recombinant Protein Using Chlorella Transformation Vector

실시예 6에서 제작한 클로렐라 바이러스의 초기 발현 유전자 프로모터를 가지는 벡터는 클로렐라 불가리스 (한국해양미세조류은행 KMCC FC-001)에 형질전환시켰다. 클로렐라 불가리스의 원형질체(1×10⁸)를 400 xg에서 5분 동안 원심분리하여, 0.6 M 소르비톨/만니톨이 함유된 MBBM 배양액(배지조성 또는 제조사)으로 침전물을 재현탁시켰다. 클로렐라가 현탁된 튜브는 다시 400 xg에서 5분동안 원심분리하고, 0.05 M CaCl₂가 함유된 0.6 M 소르비톨/만니톨 용액 1 ㎖로 침전물을 재현탁시켰다. 그런 다음, 1×10⁸ 세포수의 원형질체를 각각 0.4 ㎖씩 4개의 새 튜브로 옮기고, 상기 튜브에 각각 4 ㎍의 클로렐라 형질전환 벡터와 담체로써 송아지 흉선세포 DNA(Sigma Chemicals) 25 ㎍을 첨가하였다. 상기 튜브를 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, 200 ㎕의 PNC(0.8 M NaCl, 0.05 M CaCl₂, 40% PEG 4000(Sigma))을 첨가하고, 상온에서 30분 동안 혼합하였다. A vector having a gene promoter for initial expression of chlorella virus prepared in Example 6 was transformed into chlorella vulgaris (Korea Maritime Microalgae Bank KMCC FC-001). Protoplasts of Chlorella vulgaris (1 × 10 ⁸ ) were centrifuged at 400 × g for 5 minutes to resuspend the precipitate in MBBM culture (medium composition or manufacturer) containing 0.6 M sorbitol / mannitol. The tube in which the chlorella was suspended was again centrifuged at 400 xg for 5 minutes and the precipitate was resuspended in 1 ml of 0.6 M sorbitol / mannitol solution containing 0.05 M CaCl ₂ . Then, 1 × 10 ⁸ cell number of protoplasts were transferred to four new tubes, each 0.4 ml, and 4 µg of chlorella transformation vector and 25 µg of calf thymic cell DNA (Sigma Chemicals) were added as carriers. . After the tube was reacted at room temperature for 15 minutes, 200 μl of PNC (0.8 M NaCl, 0.05 M CaCl ₂ , 40% PEG 4000 (Sigma)) was added, and mixed at room temperature for 30 minutes.

그 후, 0.6 M 소르비톨/만니톨, 1% 효모추출액 및 1% 글루코오즈가 함유된 MBBM 배양액 0.6 ㎖를 첨가하고, 25℃의 암조건 하에서 12시간 동안 배양하여, 클로렐라의 세포벽을 재형성시켰다. 세포들을 선택마커인 플레오마이신(1 ㎍/㎖)이 함유된 신선한 MBBM 배지에 옮기고, 25℃의 암조건 하에서 배양하였다. 배양 5일 경부터, 클로렐라의 성장을 관찰할 수 있었으며, 15일 경에 세포성장은 정지기(stationary phase)에 도달하였다. 반대로, 형질전환되지 않은 원형질체에서는 성장을 관찰할 수 없었다. Thereafter, 0.6 ml of MBBM culture solution containing 0.6 M sorbitol / mannitol, 1% yeast extract and 1% glucose was added, and cultured for 12 hours under dark conditions at 25 ° C. to re-form the cell wall of chlorella. Cells were transferred to fresh MBBM medium containing pleomycin (1 μg / ml), the selection marker, and incubated under dark at 25 ° C. From day 5 of culture, the growth of chlorella was observed, and by day 15, cell growth reached stationary phase. In contrast, no growth was observed in the untransformed protoplasts.

상기 배양된 pMinGFPble, pPGFPble, pLGFPble 및 pCGFPble로 형질전환된 클로렐라 불가리스에서 생성되는 GFP의 형광을 측정하여, 본 발명의 초기 발현 유전자 프로모터에 의한 GFP 유전자의 발현능을 확인하였다(참조: 도7). 이는 클로렐라 바이러스 유래의 초기 발현 유전자 프로모터를 가지는 pPGFPble, pLGFPble 및 pCGFPble로 형질전환된 클로렐라가 CaMV35S 프로모터를 가지는 pMinGFPble로 형질전환된 클로렐라와 마찬가지로 GFP를 생성하는 것을 확인할 수 있었고 형광 분광계를 이용하여 GFP의 발현 세기를 측정하여 그 값을 상대적인 수치로 비교하여 보았을 때, pCGFPble가 가장 높은 발현율을 나타내었다 (참조: 도8).The fluorescence of GFP produced in the chlorella vulgaris transformed with the cultured pMinGFPble, pPGFPble, pLGFPble and pCGFPble was measured to confirm the expression ability of the GFP gene by the early expression gene promoter of the present invention (see Fig. 7). It was confirmed that chlorella transformed with pPGFPble, pLGFPble and pCGFPble having an early expression gene promoter derived from chlorella virus produced GFP like chlorella transformed with pMinGFPble having a CaMV35S promoter and expression of GFP using a fluorescence spectrometer. When the intensity was measured and compared with the relative values, pCGFPble showed the highest expression rate (see FIG. 8).

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 목적 유전자를 강력하게 발현하는 클로렐라 바이러스 유래의 신규 초기 발현 유전자 프로모터와 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미세조류를 이요한 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 프로모터를 이용하면, 클로렐라 및 식물에서 고농도의 재조합 단백질을 제조할 수 있어, 저 비용으로 고부가 가치의 단백질을 대량으로 생산하는 분자농업과 식물에 특정기능을 첨가 또는 개선시키고자 하는 유전공학분야에도 사용될 수 있을 것이다. As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a novel initial expression gene promoter derived from Chlorella virus that strongly expresses a gene of interest, a recombinant vector comprising the promoter, and a target protein using a microalgae transformed with the recombinant vector. It provides a method for producing. In addition, by using the promoter of the present invention, it is possible to produce high concentration of recombinant protein in chlorella and plants, so that the genetics to add or improve specific functions to the molecular agriculture and plants that produce a large amount of high value protein at low cost It can also be used in engineering.

서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file  

Claims (7)

서열번호 1 내지 3의 염기서열을 각각 가지는 클로렐라 바이러스 HS-1 유래 초기 발현 유전자로부터 분리한 DNA 중합효소(polymerase) 유전자, DNA 리가아제(ligase) 유전자, 및 키티나제(chitinase) 유전자군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터.  Selected from the group of DNA polymerase gene, DNA ligase gene, and chitinase gene, isolated from chlorella virus HS-1-derived initial expression genes each having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 Promoter characterized in that. 제 1항의 프로모터를 삽입하여 제작한 pPGFPble, pLGFPble 및 pCGFPble로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 재조합 벡터.The recombinant vector of any one selected from the group consisting of pPGFPble, pLGFPble and pCGFPble prepared by inserting the promoter of claim 1. 제 2항의 재조합 벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환 미생물. The transformed microorganism obtained by introducing the recombinant vector of claim 2 into any one host selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeasts. 제 2항의 재조합 벡터로 형질전환된 미세조류.Microalgae transformed with the recombinant vector of claim 2. 제 4항의 형질전환된 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조 방법. Method for producing a target protein, characterized in that the culture of the transformed microalgae of claim 4. 삭제delete 삭제delete

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