KR100795100B1

KR100795100B1 - 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화의 영상화를 위한고분자 나노 입자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100795100B1
Application number: KR1020050103563A
Authority: KR
Inventors: 권익찬; 최귀원; 정혜선; 김종호; 김광명; 김성원
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2008-01-17
Also published as: KR20070046681A

Abstract

본 발명은 단백질 키나아제에 의한 인산화 반응에 선택적으로 형광을 나타내는 고분자 나노 입자, 이의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고분자 나노 입자는 단백질 키나아제의 인산화에 따라 선택적으로 형광을 나타내므로, 단백질 키나아제가 과다하게 발현됨으로써 나타나는 여러 질병을 진단할 수 있으며, 단백질 키나아제 저해제로서 개발되는 신약의 효능을 효율적으로 스크리닝 할 수 있다.

고분자 나노 입자, 단백질 키나아제

Description

단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화의 영상화를 위한 고분자 나노 입자 및 그의 용도{POLYMERIC NANO PARTICLES FOR IMAGING OF PHOSPHORYLATION BY PROTEIN KINASE AND USES THEREOF}

도 1은 본 발명에서 제조된 단백질 키나아제에 의한 인산화반응에 선택적으로 형광을 나타내는 고분자 나노 입자가 특이적 형광을 나타내는 방법에 관한 모식도이다

도 2는 실시예 1에서 제조한 PEI-FITC-Kemp와 PAA-RITC를 다양한 조성비로 결합하여 제조한 고분자 나노 입자의 입자경으로, 평균 300 나노미터를 나타내는 그림이다.

도 3은 실시예 1에서 제조한 PEI-FITC-Kemp-Cy5.5와 PAA를 다양한 조성비로 결합하여 제조한 고분자 나노 입자의 입자경으로, 평균 300 나노미터를 나타내는 그림이다.

도 4는 PEI-FITC-Kemp와 PAA-RITC를 다양한 조성비로 결합시킨 경우, PAA-RITC의 양에 따라 변화하는 FITC의 형광 세기를 이미지 박스를 통해 확인한 그림이다.

도 5는 PEI-FITC-Kemp-Cy5.5와 PAA를 다양한 조성비로 결합시킨 경우, PAA의 양에 따라 변화하는 Cy5.5의 형광 세기를 이미지 박스를 통해 확인한 그림이다.

도 6은 PEI-FITC-Kemp와 PAA-RITC을 포함하는 고분자 나노 입자에 PKA를 첨가함으로써 변화하는 FITC의 형광 강도를 나타낸 그림이며, 하단의 숫자는 형광계를 통해 확인한 형광 세기 값이다.

도 7은 PEI-FITC-Kemp-Cy5.5와 PAA를 포함하는 고분자 나노 입자에 PKA를 첨가함으로써 변화하는 Cy5.5의 형광 강도를 나타낸 그림이며, 하단의 숫자는 형광계를 통해 확인한 형광 세기 값이다.

본 발명은 단백질 키나아제 (protein kinase)에 의한 인산화 반응에 선택적으로 형광을 나타내는 고분자 나노 입자, 이의 제조 방법, 이를 이용하여 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화를 영상화하는 방법 및 이를 이용하여 효과적으로 단백질 키나아제 저해제로서 개발되는 신약을 선별할 수 있는 방법 등에 관한 것이다.

단백질 키나아제는 세포 내 또는 세포 사이에서 정보 전달의 제어에 중요한 역할을 담당하고 있으며, 이는 단백질 키나아제가 포스포릴기를 뉴클레오시드 트리포스페이트로부터 신호화 경로에 관계하는 단백질 수용체로 전이시킴으로써 일어난다. 즉, 수많은 단백질 키나아제들이 이들의 경로를 통하여 세포의 자극 및 기타 자극을 줌으로써 각종 세포성 반응이 해당 세포 내부에서 일어나도록 하는 것이다. 많은 질병이 단백질 키나아제 매개된 사건에 의해 촉발된 비정상적인 세포성 반응 과 연관이 있다. 이들 질병으로는 자가 면역 질병, 염증 질병, 신경학적 및 신경변성 질병, 암, 심혈관계 질병, 알레르기 및 천식, 알츠하이머병 또는 호르몬 관련 질병이 있다.

에너지 대사, 유전자 전사, 증식, 분화, 생식 기능, 분비, 신경 활동, 기억, 수축 및 운동성을 포함하는 많은 생명 기능을 조절하는 것으로 알려진 cAMP-의존성 단백질 키나아제 (PKA)는 이량체 조절 서브유닛에 결합하는 2개의 촉매 서브 유닛을 포함하는 사량체 전효소이다. cAMP가 결합하면 촉매 서브 유닛이 조절 서브 유닛으로부터 분리되어 활성 세린/트레오닌 키나아제가 형성된다. 촉매 서브유닛의 3개의 이성체(C-α, C-β, C-γ)가 보고되어 왔으며, 특히 제1기 및 전이 흑생종에서 발현이 증가되는 C-α 서브유닛이 광범위하게 연구되었다. AKT (Rac protein kinase, protein kinase B (PKB)) 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제는 여러 종류의 암에서 과 발현되는 것으로 알려져 있으며, 정상 세포 기능의 매개자이다. 변형된 AKT 조절의 징후는 상해 및 질병 둘 다에서 나타나며, 가장 중요한 역할은 암에 있다. AKT는 사람의 난소 암, 췌장암 등에서 과 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 AKT가 종양 공략과 관련될 수 있음을 암시한다. 로-연관 코일드-코일 형성 키나아제(ROCK)는 소(small) G-단백질 RhoA를 활성화시키는 세린/트레오닌 키나아제로 고혈압, 발기부전, 혈관조성, 신경재생, 전이, 녹내장, 염증, 동맥경화증, 면역억제, 혈관재협착, 천식 및 심장 비대를 포함하는 다수의 질병에 관련되어 있다. 3-포스포이노시티드-의존성 단백질 키나아제-1(PDK-1)은 단백질 키나아제의 AGC 아부류에 속하는 다수의 키나아제의 활성을 조절하는 핵심 역할을 수행한다. PDK1 매개 신호 전달은 인슐린 및 성장 인자에 대한 반응 및 세포의 세포외 매트릭스로의 부착으로서 활성화된다. 일단 활성화된 이들 효소는 세포 생존, 성장, 증식 및 글루코스 조절 등을 통제하는 중요한 역할을 수행하는 핵심 조절 단백질을 인산화시킴으로써 많은 다양한 세포성 사건을 매개한다. 또한, 다양한 범위의 암세포 유전형은 세포 생리학에서 성장 신호 전달에서의 자족성, 세포사멸의 회피, 성장-억제 신호 전달에 대한 탈 감작화, 무제한적 복제 가능성, 고무된 혈관조성 및 전이를 유도하는 조직 침투의 6가지 주요 변형의 징후에 기인하고 있다. PDK1은 PI3K 신호전달 경로의 중요한 매개자이며, 이는 성장, 증식 및 생존을 포함하는 다수의 세포 기능을 조절한다. 따라서 이러한 경로의 억제는 암 진행에 필요하다고 밝혀진 상기 6가지 중 4가지 이상에 영향을 줄 수 있고, 이로서 PDK1 억제제가 매우 넓은 범위의 사람 암의 성장에 영향을 미칠 것으로 예상된다.

따라서, 상기에서 살펴본 PKA, AKT, ROCK 및 PDK1과 같은 단백질 키나아제 활성과 관련된 많은 연구와 함께 이들 단백질 키나아제의 억제제 개발의 필요성이 대두되고 있다. 또한 이들 단백질 키나아제 활성을 영상화하여 단백질 키나아제 관련 질병을 조기 진단할 수 있는 기술 개발과 억제제의 활성을 간편하게 평가하는 기술 개발이 매우 필요하다.

이러한 필요성에 의해 단백질 키나아제에 의한 세포성 반응을 영상화하여 질병을 조기 진단을 하고자 하는 시도가 있어 왔다. 또한 단백질 키나아제로부터 유래한 질병의 치료제로서 유효한 단백질 키나아제 억제제를 밝혀내고자 하였으며, 특히, 비선택성에 의한 예상하지 못한 부작용을 유발하지 않고 선택적으로 작용하 는 단백질 키나아제 억제제를 밝혀내고자 하는 시도 및 새로운 단백질 키나아제 억제제를 개발하기 위해 보다쉽게 억제제의 활성을 확인하고자 하는 노력을 하게 되었다.

최근에 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화를 2차 전달자인 Ca2⁺, cAMP, cGMP 등의 농도변화를 이용하여 영상화하는 기술이 연구되고 있으며, 또한 형광 공명 에너지 전이를 이용하여 세포 내에서 발생하는 단백질의 인산화를 영상화하는 기술도 연구되어 지고 있다. 하지만, 상기의 방식은 실시간 영상화 방식이 아니며, 생체 내 연구에 사용되기 힘든 형광체들을 이용하고 있다. 이에 실시간으로, 또한, 생체 내에서 사용할 수 있는 형광체들을 이용하여, 생체 내에서 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화를 영상화하는 기술 개발이 절실히 요구된다고 할 수 있다.

본 발명은 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화에 선택적으로 나타나는 물리적 구조 변화를 통해 형광 신호를 나타내는, 세포 내 단백질 키나아제의 반응을 실시간 영상화할 수 있는 새로운 고분자 나노 입자, 이의 제조 방법 및 이의 이용을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화에 선택적으로 형광을 나타낼 수 있는 고분자 나노 입자를 제공한다. 본 발명의 고분자 나 노 입자는 양이온성 고분자 복합체와 음이온성 고분자 복합체를 포함하고 있으며, 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화에 의해 선택적으로 물리적 구조 변화를 일으켜 형광 신호를 나타냄으로써 세포내 단백질 키나아제의 반응을 영상화할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 고분자 양이온성 고분자, 형광 공명 에너지 전이가 가능한 형광체 및 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화하는 염기서열을 갖는 펩타이드 유도체가 화학적으로 결합된 양이온성 고분자 복합체와 음이온성 고분자와 형광 공명 에너지 전이가 가능한 형광체가 결합된 음이온성 고분자 복합체를 포함하는 고분자 나노 입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 양이온성 고분자, 소광 효과를 나타내는 형광체 및 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 갖는 펩타이드 유도체가 화학적으로 결합된 양이온성 고분자 복합체와 음이온성 고분자를 포함하는 고분자 나노 입자를 제공한다.

본 발명에 따른 고분자는 생체적합성을 갖는 모든 고분자가 사용될 수 있다.

양이온성 고분자 복합체에 사용되는 고분자로는 바람직하게는 세포 흡수 효율이 높은 양전자를 갖는 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 키토산 등이 있다. 보다 바람직하게는 폴리에틸렌이민이며, 폴리에틸렌이민은 사슬 내에 양전자를 많이 함유하고 있어 세포 흡수율이 매우 높으며, 아민기는 다양한 화학적 개질을 유도할 수 있는 장점이 있다.

양이온성 고분자 복합체와 이온 집합체를 형성하는 음이온성 고분자 복합체 에 사용되는 고분자로는 바람직하게는 폴리아스파라긴산, 폴리글루타민산, 헤파린 등 또는 이들의 화학적 유도체이다. 보다 바람직하게는 폴리아스파라긴산이며, 이는 폴리아스파라긴산은 사슬내에 음전자를 많이 함유하고 있어 세포 흡수율이 매우 높으며, 카르복실기는 다양한 화학적 개질을 유도할 수 있기 때문이다.

상기의 고분자는 소수성과 친수성의 균형과 양이온과 음이온의 작용을 통해 나노 크기의 자기 조립체를 형성시킬 수 있고, 살아있는 세포에 효과적으로 흡수될 수 있다. 또, 세포 내에 흡수된 후에 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화에 민감하게 반응하여 형광을 나타내는, 임의의 작용기와 결합된다.

본 발명에 따른 형광체는 형광 공명 에너지 전이가 발생하는 형광체 또는 소광 효과를 발생시키는 형광체이다. 이러한 형광체들은 고분자 나노 입자 내에서 서로 근접하게 되어, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer) 또는 소광 효과를 나타내며, 따라서 형광체의 형광 세기가 최소가 되게 된다. 특히, 적색이나 근적외선의 형광을 발광하며 양자 효율(quantum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 형광체는 바람직하게 시아닌계, 로드아민계, 플루오레신계 및 보디피계의 형광체이다. 형광 공명 에너지 전이 효과를 나타내는 형광체는 바람직하게는 테트라메틸로드아민과 플루오레신이며, 플루오레신과 시아닌 역시 바람직하다. 예컨대, 플루오레신의 발광 파장대는 테트라메틸로드아민의 여기 파장대와 겹쳐있기 때문에, 플루오레신에 대한 여기 파장을 제공하면 발생하는 플루오레신의 발광 파장이 근접해 있는 테트라메틸로드아민의 여기 파장으로 사용되어, 결국 테트라메틸로드아민도 동시에 발광할 수 있기 때문이다. 또한, 시아닌, 플루오레신, 로드아민, 테트라메틸로드아민, 보다피 등과 같은 각 형광체들은 각각 서로 근접하였을때 광 소광 효과가 발생하므로 소광 효과를 나타내는 형광체로 바람직하다. 특히, 시아닌계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 혹은 흡수가 최소화될 수 있으므로 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 양이온성 고분자 복합체에 포함되는 펩타이드 유도체는 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 가지는 펩타이드 유도체이며, 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열로는 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly(kemptide, 서열번호 1)가 있으며, 이는 단백질 키나아제 A에 의해 선택적으로 인산화가 일어난다. 본 발명은 길이에 상관없이 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 포함하고 있는 모든 펩타이드 유도체를 포함한다.

본 발명에 따른 고분자 나노 입자를 이용해서 영상화할 수 있는 단백질 키나아제는 단백질을 인산화시키는 모든 종류의 단백질 키나아제이다. 이러한 단백질 키나아제로서는 cAMP 의존성 단백질 키나아제(PKA), AKT(PKA), 로-연관 코일드-코일 형성 키나아제(ROCK) 및 3-포스포이노시티드-의존성 단백질 키나아제-1(PDK1) 등이 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 다음 화학식 1의 구조를 가지는 양이온성 고분자 복합체와 다음 화학식 2의 음이온성 고분자 복합체를 포함하는 고분자 나노 입자를 제공한다. 상기의 구성을 가지는 고분자 나노 입자는 형광 공명 에너지 전이 를 이용한 단백질 키나아제에 의한 인산화 반응을 영상화 할 수 있는 하나의 예시이다.

상기 식에서, A는 에틸렌이민이며, B는 에틸렌이민의 아민기에 형광 공명 에너지 전이가 가능한 플루오레신, 로드아민, 테트라메틸로드아민 등의 형광체이며, C는 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 가지는 펩타이드 유도체이며, a는 25 내지 40 사이의 정수이며, b는 5 내지 10 사이의 정수이며, c는 20 내지 35 사이의 정수이다.

상기 식 중, A는 아스파라긴산이며, B는 아스파라긴산의 아민기에 형광 공명 에너지 전이가 가능한 플루오레신, 로드아민, 테트라메틸로드아민 등의 형광체이며, a는 50 내지 150 사이의 정수이며 b는 5 내지 10 사이의 정수이다.

또한, 본 발명은 다음 화학식 3의 구조를 가지는 양이온성 고분자 복합체와 다음 화학식 4의 음이온성 고분자를 포함하는 고분자 나노 입자를 제공한다. 상기의 구성을 가지는 고분자 나노 입자는 형광체의 소광 효과를 이용한 단백질 키나아 제에 의한 인산화 반응을 영상화할 수 있는 하나의 예시이다.

상기 식 중, A는 에틸렌이민이며, B는 에틸렌이민의 아민기에 형광공명에너지전이가 가능한 플루오레신, 로드아민, 테트라메틸로드아민 등의 형광체이며, C는 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 가지는 펩타이드 유도체이며, D는 소광 효과를 나타내는 시아닌 형광체이며, a는 25 내지 40 사이의 정수이며, b는 1 내지 5 사이의 정수이며, c는 20 내지 35 사이의 정수이며, d는 5 내지 10 사이의 정수이다.

상기 식 중, 아스파라긴산이며. a는 50 내지 150 사이의 정수이다.

화학식 3의 형광 공명 에너지 전이가 가능한 형광체는 본 발명의 고분자의 생체내 침투 시 존재 위치를 나타내는 역할을 한다.

단백질 키나아제가 고분자 나노 입자내에 포함되어 있는 펩타이드 유도체를 인산화시킬 때, 양이온성 고분자 복합체에 음이온성이 부가되어 이온 환경이 바뀌게 되어 본 발명의 양이온성 고분자 복합체와 음이온성 고분자 복합체는 서로 해리하게 된다. 고분자 나노 입자가 이온 집합체를 형성할 경우, 나노 입자내의 형광체 들은 매우 근접하게 되어 형광체의 형광 공명 에너지 전이 또는 소광 효과로 인하여 형광을 약하게 나타내거나, 나타내지 않는다. 하지마, 상기와 같이 단백질 키나아제에 의해 이온 집합체가 해리되면, 나노 입자내의 형광체들은 멀리 떨어지게 되어 형광 공명 에너지 전이 또는 소광 효과가 사라지게 된다. 즉, 단백질 키나아제의 인산화에 특이적으로 형광체들은 형광을 나타내게 되어 단백질 키나아제에 의한 인산화의 반응을 선택적으로 영상화할 수 있게 한다.

본 발명에 따른 고분자 나노 입자의 입경은 평균 50 내지 500 나노 미터의 크기를 가지며, 생체적합성이 우수하고 세포내의 흡수 효율의 제어가 가능하며, 또한, 생체 내 특정 조직 또는 세포에 수동적으로 축적 가능하여, 세포 영상, 특정 조직 영상, 약물전달체 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 생체 내 (in vivo) 및 생체 외 (in vitro) 모두 적용이 가능하여, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝 (high-throughput screening) 방법 및 조기 질병 진단 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다.

따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은, 본 발명에 따른 고분자 나노 입자를 이용하여 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화를 영상화하는 방법을 제공한다. 이러한 영상화 방법은 단백질 키나아제의 과다한 발현으로 나타나는 다양한 질병을 진단할 수 있게 할 것이다.

또 다른 양태로서 본 발명은, 본 발명에 따른 고분자 나노 입자를 이용하여 단백질 키나아제 저해 활성이 있는 후보 약물을 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 고분자 나노 입자에 단백질 키나아제 저해 활성이 있는 후보 약물을 첨 가하여 형광의 강도를 확인함으로써 후보 약물의 활성 정도를 확인할 수 있으므로, 신약 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 기술한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이들 실시예들로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 양이온성 고분자 복합체 및 음이온성 고분자 복합체의 제조

양이온성 고분자로서 분자량 25000을 갖는 폴리에틸렌이민을, 음이온성 고분자로서 분자량 10000의 폴리아스파라긴산을, 폴리에틸렌이민에 결합하는 펩타이드로서 단백질 키나아제 A에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 가지는 펩타이드 유도체 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly(kemptide, 서열번호 1)를, 형광 공명 에너지 전이가 가능한 형광체로서 플루오레신 이소치오시아네이트 (fluorescein-isothiocyanate) 및 로드아민 이소치오시아네이드(rhodamine-isothiocyanate)를, 소광 효과를 보일 수 있는 형광체로서 시아닌 5.5를 사용하여 양이온성 고분자 복합체 및 음이온성 고분자 복합체를 제조하였다.

실시예 1-1. PEI - FITC -kemp의 합성

분자량 25000을 갖는 폴리에틸렌이민(PEI) 100mg를 5mL의 소디움바이카보네이트(NaHCO₃)에 완전히 녹인 후, 플루오레신 이소치오시아네이트(FITC)을 1mg 내지 20mg을 0.5mL 다이메틸설포옥사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 상기 폴 레에틸렌이민 용액에 혼합하여 하루 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응물을 아세톤/디에틸에테르(acetone/diethyl ether) 혼합 용액에 두 번 침전하고, 주홍색의 침전물을 원심분리를 통하여 수거하여 건조하여 건조하였다. 건조한 생성물을 증류수에 녹인 후, PD10 컬럼에서 생성물 폴리에틸렌이민-플루오레신 유도체를 분리하고, 동결 건조하여 냉장에서 보관하였다. 제조한 폴리에틸렌이민-플루오레신 유도체는 형광분광기(fluorescence microscopy)를 통하여 확인하였고, PEI-FITC라 명명하였다. FITC의 고유 흡수 파장인 494 nm에서 PEI-FITC의 흡수 파장 세기를 자외선-가시광선 스펙트럼을 통하여 정량 분석하여 5개의 FITC가 화학적으로 개질되어짐을 확인하였다. 합성한 PEI-FITC 10mg를 20ml의 물에 완전히 녹이고, 고형상 합성(solid phase synthesis)방법을 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)으로 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly(kemptide) 순서로 합성한 펩타이드 10mg, 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl- aminopropyl) carbodiimide; EDC) 5mg, 420 mg의 N-하이드로숙시니미드(N-hydrosuccinimide;NHS) 3mg를 넣고 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응 완결 후 반응물을 PD-10 컬럼을 이용하여 분리하였으며, PEI-FITC-kemp라고 명명하였다. Kemptide의 개질양은 MALDI-TOF 질량분석계를 사용하여 PEI-FITC와 PEI-FITC-kemp의 분자량을 비교하여 확인하였으며, 30개가 화학적으로 개질되었다. 상기 반응을 다음과 같은 반응식 1로 나타내었다.

실시예 1-2. PEI - FITC -kemp- Cy5 .5의 제조

실시예 1-1에서 제조된 PEI-FITC-kemp 10mg를 2ml 다이메틸설포옥사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 완전히 녹인 후, 근적외선 시아닌 형광체 Cy5.5를 2mg 넣고 질소를 충전하여 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응 완결 후 반응물을 PD-10 컬럼을 이용하여 분리하고 PEI-FITC-kemp-Cy5.5라고 명명하였다. Cy 5.5의 고유 흡수 파장인 675 nm에서 PEI-FITC-kemp-Cy5.5의 흡수 파장 세기를 자외선-가시광선 스펙트럼을 통하여 정량 분석하여 5개의 Cy 5.5가 화학적으로 개질되어짐을 확인하였다. 상기 반응을 다음과 같은 반응식 2로 나타내었다.

실시예 1-3. PAA - RITC 의 제조

분자량 10000인 폴리아스파라긴산(PAA) 50mg를 25ml DMSO에 완전히 녹인 후 5mg의 로드아민 이소치오시아네이트(RITC)를 넣고 질소 충전하여 실온에서 하루 동안 반응시켰다. 반응 완결 후 반응물을 PD-10 컬럼을 이용하여 분리하고 PAA-RITC라 명명하였다. RITC의 고유 흡수 파장인 570 nm에서 PAA-RITC의 흡수 파장 세기를 자외선-가시광성 스펙트럼을 통하여 정량 분석하여 5개의 RITC가 화학적으로 개질되어짐을 확인하였다. 상기 반응을 다음과 같은 반응식 3으로 나타내었다.

실시예 2. 고분자 나노 입자의 제조

실시예 1에서 제조된 PEI-FITC-kemp와 PAA-RITC를 PBS에 녹여 이온 집합체 고분자 나노 입자를 제조하였다. 두 고분자의 조성비에 따라 150 내지 400 나노미터의 나노 입자가 만들어짐을 광산란(light scattering)장치로 확인하였다.

또한 실시예 1에서 제조된 PEI-FITC-kemp-Cy5.5와 PAA를 PBS에 녹여 이온집합체 고분자 나노 입자를 제조하였다. 고분자의 조성비에 따라 200 에서 500 나노미터의 나노 입자가 만들어짐을 광산란 장치로 확인하였다.

도 2 및 도 3은 상기 두 이온 집합체 고분자 나노 입자의 입경이며, 두 경우 모두 약 300 나노미터의 평균입자를 갖는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3. 고분자 나노 입자 내 형광체의 형광 공명 에너지 전이와 소광 효과 측정

실시예 3-1. 고분자 나노 입자 내 형광체의 형광 공명 에너지 전이 측정

제조된 고분자 나노 입자내 형광체들의 형광 공명 에너지 전이를 관찰하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 PEI-FITC-kemp의 양을 고정하고 표 1에서와 같이 다양한 양의 PAA-RITC를 넣어 고분자 나노 입자를 제조한 후, 형광계(fluorometer)에 FITC 필터를 사용하여 FITC의 형광 광도를 측정하였다. 표 1은 PEI-FITC-kemp와 PAA-RITC의 비에 따광 광도가 낮아짐을 알 수 있다. 그러나 두 물질의 비가 1:1을 넘어서 PAA-RITC의 양이 증가하면 다시 FITC의 형광 광도가 강해짐을 관찰할 수 있었다. 이는 양이온성 고분자인 PEI와 음이온성 고분자인 PAA에 의해 두 물질이 이온 집합체 고분자 나노 입자를 형성하였고, 그 입자 안에서 FITC와 RITC가 형광 공명 에너지 전이 현상을 나타내기 때문이다. 도 4는 웰 플레이트(well plate)에서 그 현상을 유도하고 이미지 박스(imaging box)를 통해 시각적으로 확인한 것이다. 표 1의 결과와 유사하게 PAA-RITC의 양이 증가함에 따라 FITC의 형광 세기의 변화가 관찰되었다.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PEI-FITC-kemp	50	50	50	50	50	50	50	50	50
PAA-RITC	0	5	10	20	30	40	50	75	100
광도 (X1000)	47.3	41.2	36.3	28.4	18.7	7.6	4.3	9.1	15.3

실시예 3-2. 고분자 나노 입자 내 형광체의 소광 효과 측정

제조된 고분자 나노 입자안 형광체들의 소광 효과를 관찰하기 위하여, PEI-FITC-kemp-Cy5.5의 양을 고정하고 다양한 양의 PAA를 넣어 고분자 나노 입자를 제조한 후, 형광계에 NIRF 필터를 사용하여 Cy5.5의 형광 광도를 측정하였다. 표 2는 PEI-FITC-kemp-Cy5.5와 PAA의 비에 따른 Cy5.5의 형광 변화를 나타낸 것으로 PAA의 양이 증가함에 따라 Cy5.5의 형광 광도가 낮아지다 어느 일정 비율이 넘어서면 다시 Cy5.5의 형광 광도가 강해짐을 관찰할 수 있었다. 이는 양이온성 고분자인 PEI와 음이온성 고분자인 PAA에 의해 두 물질이 이온 집합체 고분자 나노 입자를 형성하였고, 그 입자안에서 소광 효과에 의해 Cy5.5의 형광 세기가 감소하였기 때문이다. 도 5는 웰 플레이트에서 그 현상을 유도하고 이미지 박스를 통해 시각적으로 확인한 것이다. 표 2의 결과와 유사하게 PAA의 양이 증가함에 따라 Cy5.5의 형광 세기의 변화가 관찰되었다.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PEI-FITC-kemp-Cy5.5	50	50	50	50	50	50	50	50	50
PAA-RITC	0	5	10	20	30	40	50	75	100
광도 (X1000)	46.9	39.2	29.0	15.3	20.7	30.9	32.9	43.2	45.1

실시예 4. 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화에 따른 고분자 나노 입자의 광학 특성 분석

실시예 3에서 형광 공명 에너지 전이와 소광 효과를 보인 각각의 고분자 나노 입자를 웰 플레이트에 넣고 단백질 키나아제 A를 첨가하여 고분자 나노 입자의 광학 특성의 변화를 관찰하였다.

실시예 4-1. 형광 공명 에너지 전이 광학 특성을 보인 고분자 나노 입자의 단백질 키나아제 에 의한 광학 특성 분석

실시예 2에서 제조된 PEI-FITC-kemp 및 PAA-RITC 나노 입자와 PKA를 아래 표 3과 같은 조건으로 첨가하고 광학적 특성을 관찰하였다.

	1	2	3	4
PEI-FITC-kemp	50	50	50	50
PAA-RITC	50	50	50	0
PKA	0	15nM	30nM	0

도 6은 PKA에 의한 kemptide의 인산화에 따른 실시예 3-1에서 제조된 고분자 나노 입자의 FITC 형광 광도의 변화를 나타낸 것이며, 하단의 숫자는 형광계(fluorometer)를 이용하여 측정한 형광 세기의 값을 나타낸다. PKA가 용액에 첨가된 고분자 나노 입자의 형광 세기가 많이 증가된 것이 관찰되었다. 이는 PKA가 kemptide를 인산화시킴으로써 양이온성 고분자 복합체 PEI-FITC-kemp에 음이온성이 부가되어져 PAA-RITC와의 이온균형이 무너지고, 따라서 두 물질이 이온 집합체 고분자 나노 입자를 형성하지 않고 서로 해리되어짐으로써 FITC와 RITC간의 형광 공명 에너지 전이가 사라졌음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 PEI-FITC-kemp와 PAA-RITC를 포함하는 고분자 나노 입자가 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화에 따른 특이적 영상을 나타낼 수 있음을 증명하는 것이다.

실시예 4-2. 소광 효과 광학 특성을 보인 고분자 나노 입자의 단백질 키나아제에 의한 광학 특성 분석

실시예 2에서 제조된 PEI-FITC-kemp-Cy 5.5 및 PAA 나노 입자와 PKA를 아래 표 4과 같은 조건으로 첨가하고 광학적 특성을 관찰하였다.

	1	2	3	4
PEI-FITC-kemp-Cy 5.5	50	50	50	50
PAA-RITC	50	50	50	0
PKA	0	15nM	30nM	0

도 7은 PKA에 의한 kemptide의 인산화에 따른 실시예 3-2에서 제조된 나노입자의 Cy5.5 형광 강도의 변화를 나타낸 것이며, 하단의 숫자는 형광계(fluorometer)를 통한 형광 세기의 값을 나타낸다. PKA가 용액에 첨가되어진 나노입자의 형광세기는 많이 증가되어진 것이 관찰되었다. 이는 PKA가 kemptide를 인산화시킴으로써 양이온성 고분자 복합체 PEI-FITC-kemp-Cy 5.5에 음이온성이 부가되어져 PAA와의 이온균형이 무너지고, 따라서 두 물질이 이온 집합체 고분자 나노 입자를 형성하지 않고 서로 해리되어짐으로써 Cy5.5의 소광 효과가 사라졌음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 PEI-FITC-kemp-Cy 5.5와 PAA를 포함하는 고분자 나노 입자가 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화에 따른 특이적 영상을 나타낼 수 있음을 증명하는 것이다.

상기 살펴본 바와 같이, 본 발명의 양이온 고분자 복합체와 음이온 고분자 복합체를 포함하는 고분자 나노 입자는 단백질 키나아제에 의한 인산화 반응에 선택적으로 형광을 나타내는 특징을 갖는다. 이러한 고분자 나노 입자는 세포 침투성이 뛰어나 세포 내에서도 형광의 변화가 용이하여 실험 동물 모델이나 인체에 제조된 입자를 주입할 수 있으며, 다양한 조직에서 일어나는 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화를 실시간 영상화함으로써 암과 치매 등의 다양한 난치병의 조기 진단에 사용될 수가 있다. 또한, 단백질 키나아제 억제제와 같은 신약의 스크리닝에도 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신 및 키토산으로 구성된 군에서 선택되는 양이온성 고분자; 플루오레신, 로드아민 및 테트라메틸로드아민으로 구성된 군에서 선택되는 형광 공명 에너지 전이가 가능한 형광체; 및 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 갖는 펩타이드 유도체가 결합된 양이온성 고분자 복합체와;

폴리아스파라긴산, 폴리글루타민산 및 헤파린으로 구성된 군에서 선택되는 음이온성 고분자; 및 플루오레신, 로드아민 및 테트라메틸로드아민으로 구성된 군에서 선택되는 형광 공명 에너지 전이가 가능한 형광체가 결합된 음이온성 고분자 복합체를 포함하는 고분자 나노 입자.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열은 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly 인 것인 고분자 나노 입자.
삭제
제1항에 있어서, 다음의 화학식 1의 구조를 갖는 양이온성 고분자 복합체 및 다음의 화학식 2의 구조를 갖는 음이온 고분자 복합체를 포함하는 고분자 나노 입자.

[화학식 1]

상기 식 중, A는 에틸렌이민이며, B는 형광 공명 에너지 전이가 가능한 플루오레신, 로드아민 및 테트라메틸로드아민으로 이루어진 군에서 선택된 형광체이며, C는 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 갖는 펩타이드 유도체이며, a는 25 내지 40 사이의 정수이며, b는 5 내지 10 사이의 정수이며, c는 20 내지 35 사이의 정수이고,

[화학식 2]

상기 식 중, A는 아스파라긴산이며, B는 형광 공명 에너지 전이가 가능한 플루오레신, 로드아민 및 테트라메틸로드아민으로 이루어진 군에서 선택된 형광체이며, a는 50 내지 150 사이의 정수이며 b는 5 내지 10 사이의 정수이다.
제6항에 있어서, 상기 화학식 1의 A는 에틸렌이민이며, 화학식 1의 B는 플루 오레신이며, 화학식 1의 C는 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly이고, 상기 화학식 2의 A는 아스파라긴산이며, 화학식 2의 B는 로드아민인 고분자 나노 입자.
제1항에 있어서, 상기 단백질 키나아제는 cAMP 의존성 단백질 키나아제(PKA), AKT(PKA), 로-연관 코일드-코일 형성 키나아제(ROCK) 및 3-포스포이노시티드-의존성 단백질 키나아제-1(PDK1)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 고분자 나노 입자.
폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신 및 키토산으로 구성된 군에서 선택되는 양이온성 고분자; 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 갖는 펩타이드 유도체; 및 시아닌이 결합된 양이온성 고분자 복합체와;

폴리아스파라긴산, 폴리글루타민산 및 헤파린으로 구성된 군에서 선택되는 음이온성 고분자를 포함하는 고분자 나노 입자.
삭제
제9항에 있어서, 상기 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열은 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly 인 것인 고분자 나노 입자.
삭제
삭제
제9항에 있어서, 다음 화학식 3의 구조를 갖는 양이온성 고분자 복합체 및 다음 화학식 4의 구조를 갖는 음이온성 고분자를 포함하는 고분자 나노 입자.

[화학식 3]

상기 식 중, A는 에틸렌이민이며, B는 형광공명에너지전이가 가능한 플루오레신, 로드아민 및 테트라메틸로드아민으로 이루어진 군에서 선택된 형광체이며, C는 단백질 키나아제에 의해 선택적으로 인산화가 일어나는 염기서열을 가지는 펩타이드 유도체이며, D는 시아닌 형광체이며, a는 25 내지 40 사이의 정수이며, b는 1 내지 5 사이의 정수이며, c는 20 내지 35 사이의 정수이며, d는 5 내지 10 사이의 정수이고;

[화학식 4]

상기 식 중, A는 아스파라긴산이며. a는 50 내지 150 사이의 정수이다.
제14항에 있어서, 상기 화학식 3의 A는 에틸렌이민이며, 화학식 3의 B는 플루오레신이며, 화학식 3의 C는 Leu-Arg-Arg-Asp-Ser-Leu-Gly이며, 화학식 3의 D는 시아닌이며, 상기 화학식 4의 A는 아스파라긴인 고분자 나노 입자.
제9항에 있어서, 상기 단백질 키나아제는 cAMP 의존성 단백질 키나아제(PKA), AKT(PKA), 로-연관 코일드-코일 형성 키나아제(ROCK) 및 3-포스포이노시티드-의존성 단백질 키나아제-1(PDK1)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 고분자 나노 입자.
제1항, 제4항, 제6항 내지 제9항, 제11항, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 키나아제에 의한 단백질의 인산화를 영상화하기 위한 고분자 나노 입자.
제1항, 제4항, 제6항 내지 제9항, 제11항, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 고분자 나노 입자를 이용하여 단백질 키나아제에 의한 단백질 인산화를 영상화하는 방법.
제1항, 제4항, 제6항 내지 제9항, 제11항, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 고분자 나노 입자를 이용하여 단백질 키나아제 저해 활성이 있는 후보 약물을 선별하는 방법.