KR100794700B1 - Quantitative Analysis Method for Analyzing Mingled Ratio of Genetically Modified Organisms - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자변형농산물(GMO)에 대한 GMO 혼입률(%)을 분석하기 위한 새로운 유전자변형농산물 정량분석방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 유전자변형농산물에 대한 재조합 유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머의 각 5′말단을 형광표지로 라벨링하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후, 각각의 표준시료에 대한 증폭산물 양을 기준으로 표준정량곡선을 작성하고 표준정량곡선 대비 미지시료에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 미지시료의 GMO 혼입률(%)을 산출하는 단계로 이루어지는 유전자변형농산물에 대한 GMO 혼입률(%)의 정량분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 정량방법과는 달리 보다 정확한 유전자변형농산물의 GMO 혼입률(%)을 정량할 수 있고, 초기 설비투자의 비용이나 기기 유지비용에 있어서도 경제적으로 효율성이 높다.The present invention relates to a new genetically modified agricultural product quantitative analysis method for analyzing the GMO incorporation rate (%) for genetically modified agricultural products (GMO). More specifically, the 5 'ends of the recombinant gene detection primer and the endogenous gene detection primer for the genetically modified agricultural product are labeled with a fluorescent label to perform a polymerase chain reaction, and then the amount of amplification products for each standard sample is determined. A quantitative analysis of GMO incorporation rate (%) for genetically modified agricultural products consisting of preparing a standard quantitative curve and calculating the GMO incorporation rate (%) of the unknown sample by converting the amount of amplified product for the unknown sample to the standard quantitative curve. It is about a method. Unlike the conventional quantitative method, the method of the present invention can quantify the GMO incorporation rate (%) of more genetically modified agricultural products, and is economically efficient even in the cost of initial facility investment or equipment maintenance cost.

유전자변형농산물, GMO, 비유전자변형농산물, Non-GMO, 혼입률GMO, GMO, Non-GMO, Non-GMO, Incorporation Rate

Description

유전자변형농산물에 대한 유전자변형농산물 혼입률(%)의 정량 분석방법{Quantitative Analysis Method for Analyzing Mingled Ratio of Genetically Modified Organisms}Quantitative Analysis Method for Analyzing Mingled Ratio of Genetically Modified Organisms}

도 1은 GMO 콩과 Non-GMO 콩에서 추출한 게놈 DNA를 아가로즈 젤 전기영동한 결과를 나타낸 도.1 is agarose gel electrophoresis of genomic DNA extracted from GMO beans and Non-GMO beans.

도 2는 외부표준검체시료에 대한 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 농도별 DNA 밴드를 나타낸 도.Figure 2 is a diagram showing the DNA bands by concentration by acrylamide gel electrophoresis after PCR reaction on an external standard sample.

도 3은 GMO 콩과 Non-GMO 콩에서 추출한 게놈 DNA에 대한 PCR 반응 후 아가로즈 젤 전기영동한 결과를 나타낸 도.Figure 3 shows the results of agarose gel electrophoresis after PCR reaction on genomic DNA extracted from GMO beans and Non-GMO beans.

도 4는 정량분석을 위한 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 GMO 정량 프로그램을 적용하여 GMO 혼입률(%)에 따른 밴드를 나타낸 도.Figure 4 shows the band according to GMO incorporation rate (%) by applying GMO quantification program after acrylamide gel electrophoresis after PCR reaction for quantitative analysis.

도 5는 정량분석을 위한 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 GMO 정량 프로그램을 적용하여 GMO 혼입률(%)에 따른 밴드를 나타낸 도.Figure 5 shows the band according to GMO incorporation rate (%) by applying GMO quantification program after acrylamide gel electrophoresis after PCR reaction for quantitative analysis.

도 6은 정량분석을 위한 PCR 반응 후 시퀀서를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동한 후 시퀀서의 콜렉터 (collector)상에서 노스 (NOS) 재조합유전자 밴드를 나타낸 도.Figure 6 is a diagram showing the North (NOS) recombinant gene band on the collector (collector) of the sequencer after acrylamide gel electrophoresis using the sequencer after the PCR reaction for quantitative analysis.

도 7은 정량분석을 위한 PCR 반응 후 시퀀서를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동을 하고 GMO 정량 프로그램을 이용하여 각 시료에 대한 레인 트랙킹(tracking)과 분석범위를 선정하여 추출한 이미지 밴드를 나타낸 도.7 is a diagram illustrating an image band extracted by acrylamide gel electrophoresis using a sequencer after PCR reaction for quantitative analysis and selecting lane tracking and analysis range for each sample using a GMO quantitative program.

도 8은 도 7의 각각의 밴드 값을 GMO 정량 프로그램을 이용하여 형광감도 값으로 수치화하여 GMO 혼입률(%)에 따른 정량면적을 나타낸 도.8 is a diagram showing the quantification area according to the GMO incorporation rate (%) by quantifying each band value of FIG.

도 9는 GMO 정량 프로그램을 이용하여 표준시료에 대한 표준정량곡선을 표시하고 표준정량곡선 대비 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 시료에 대한 GMO 혼입률을 %로 계산한 것을 나타낸 도이다.FIG. 9 is a diagram illustrating a standard quantitative curve for a standard sample using a GMO quantification program and calculating the GMO incorporation rate for the sample to quantify the GMO incorporation rate (%) relative to the standard quantitative curve in%.

본 발명은 유전자변형농산물에 대한 GMO 혼입률(%)을 산출하기 위한 새로운 정량분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a new quantitative analysis method for calculating the GMO incorporation rate (%) for genetically modified agricultural products.

유전자변형농산물(Genetically Modified Organism: GMO 이하, GMO라 한다)이란 일반적으로 생산량 증대 또는 유통 가공상의 편의를 위하여 유전공학기술을 이용, 기존의 번식방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 농산물을 말한다.Genetically Modified Organisms (generally called GMOs) are generally developed to have traits or genes that cannot be represented by conventional breeding methods using genetic engineering techniques for increased production or convenience in distribution processing. Refers to agricultural products.

세계 유전자변형농산물의 작부면적이 2001년 5000만 헥타르를 돌파하였고(ISAAA, 국제아그리바이오기술사업단), 국내에서도 총 수요량의 89% 정도를 거의 전량 미국에서 수입하고 있는 가운데 수입콩의 GM 콩 혼입률이 30%를 훨씬 넘는 것으로 추정된다. 콩 뿐만 아니라, 많은 곡물을 미국에서 수입하고 있는 우리나라도 GMO 표시문제는 커다란 문제가 아닐 수 없다. 이처럼 확산되는 유전자변형농산물의 동향과 GMO 검사의 관심이 증가하는 현실에 발맞추어 보다 효율적인 GMO 검사 시스템의 개발이 요구되고 있다.The crop area of the world's genetically modified agricultural products exceeded 50 million hectares in 2001 (ISAAA, International Agribio Technology Division), and GM soybean incorporation rate of imported soybeans came from the United States, with almost 89% of total demand in Korea. This is estimated to be well over 30%. Not only soybeans, but also Korea, which imports a lot of grain from the United States, is a big problem. In line with the growing trend of GM products and the increasing interest in GMO testing, the development of more efficient GMO testing systems is required.

이러한 GMO 표시문제는 1994년 칼진사의 GM 토마토 "Flavr Savr"가 상업화된 이래, EU에서 유전자 변형식품에 대한 표시 문제가 제기되어 1997년 표시 규정이 처음 제정되었으며 우리나라도 농산물의 경우, 농수산물품질관리법 개정(1999.1.21)과 유전자변형농산물표시요령 고시(2000.4.22)에 의거하여 콩, 옥수수, 콩나물에 대하여 표시제를 시행(2001.3.1)하게 되었고, 가공식품의 경우 식품위생법 개정(2000.1.21)과 유전자재조합 식품등의 표시기준 고시(2000.8.30)에 의거하여 "농림부에서 표시하도록 지정한 콩, 옥수수, 콩나물을 주요 원재료로 사용하여 제조 또는 가공한 27개 품목의 가공식품"에 대하여 표시제를 시행(2001.7.13)하도록 하여 비의도적 혼입 허용치(현재와 같은 관리체계 하에서 자연교잡, 수송 또는 보관 등의 과정에서 GMO가 섞일 수 있는 최대 허용량)를 농산물에서는 3% 이하로, 가공식품에 있어서는 최종제품에 대해서 허용치를 설정하지 않고 상기 농산물의 허용치(3%)를 준용하는 규정을 의무사항으로 두고 있다. Since the labeling of GM modified GM tomato "Flavr Savr" was commercialized in 1994, the labeling of genetically modified foods was raised in the EU, and the labeling regulations were first enacted in 1997. In accordance with the amendment (1999.1.21) and the notice on the labeling of genetically modified agricultural products (2000.4.22), labeling was implemented for soybeans, corn and bean sprouts (2001.3.1), and in the case of processed foods, the Food Sanitation Act was amended (2000.1.21). Labeling for "27 processed foods manufactured or processed using soybeans, corn and bean sprouts designated by the Ministry of Agriculture and Forestry as the main raw materials" in accordance with the labeling standards (2000.8.30) Enforce unintentional incorporation (the maximum allowable amount of GMOs mixed in the process of natural hybridization, transport or storage, etc.) under current management. To 3% or less in the water, without setting the limit values for the final product In a processed food with a specified complying (3%) The tolerance of the produce as mandatory.

현재 GMO와 비유전자변형농산물(Non-Genetically Modified Organism, 이하, Non-GMO라 한다)에 대한 표시제 관리에 사용하는 검증방법으로는 도입 유전자를 직접 검출하여 확인하는 중합효소연쇄반응검사법(PCR-based test)과 도입 유전자가 만들어내는 특이 단백질을 검사하는 면역학적 분석법(Immunoassay test)이 있다.As a verification method currently used to manage labeling of GMOs and non-genetically modified organs (Non-Genetically Modified Organism, Non-GMO), the polymerase chain reaction test (PCR-based) which directly detects and confirms the introduced genes. test) and immunoassay tests to test specific proteins produced by the transgene.

면역학적 분석법은 작물에 도입된 유전자가 만들어내는 특이 단백질을 검출 하는 방법으로 생체내의 면역계에서 볼 수 있는 항원항체 반응을 응용한 것으로서, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)는 실험실 수준의 검사법으로서 상당히 숙련된 기술자를 요구하고 실제적으로 많은 시간이 소요된다. 그리고 결과의 신뢰성은 시료의 균일성, 단백질 추출조건, 항체 선택에 의해 결정된다. 일반적으로 단백질을 대상으로 하는 ELISA 법은 검출강도에 있어서 PCR법에 비해 떨어지며 열처리 등으로 단백질의 변성이 생길 수 있는 식품류에서의 검출에 대해서는 한계를 가지고 있다. Strip Test는 일종의 Dip-stick test로 비교적 비숙련자가 빠르고 쉽게 GMO 존재유무를 현장에서 확인할 수 있는 장점을 가지고 있으나 정량이 불가능하다는 점에서 불리하다. 한편, 중합효소연쇄반응검사법(PCR-based Test)은 도입유전자(35S 프로모터나 NOS 터미네이터)의 발현을 위한 유전자 조절부위로부터 유래된 프라이머를 중합효소연쇄반응으로 증폭시켜 검정하는 정성분석방법과 TaqMan chemistry법에 의하여 PCR 증폭과정 중에 발색되는 형광색소의 양을 실시간별로 측정하여 정량하는 정량분석방법이 있다. The immunological assay is a method that detects specific proteins produced by genes introduced into crops, and applies antigen-antibody reactions found in the immune system in vivo. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) is a laboratory-level test. It requires a skilled technician and is practically time consuming. The reliability of the results is determined by sample uniformity, protein extraction conditions, and antibody selection. In general, the ELISA method for protein is less than the PCR method in the detection intensity and has a limitation in the detection in foods that can cause protein denaturation due to heat treatment. Strip test is a kind of dip-stick test, which has the advantage that relatively unskilled people can quickly and easily check the presence of GMO in the field, but it is disadvantageous in that quantification is impossible. On the other hand, PCR-based test is a qualitative analysis method that amplifies primers derived from the gene regulatory region for expression of transgene (35S promoter or NOS terminator) by polymerase chain reaction and TaqMan chemistry There is a quantitative analysis method which measures and quantifies the amount of fluorescent dyes developed during PCR amplification by real time.

현재 이용되는 유전자변형농산물에 대한 정량분석은 각 중합효소연쇄반응(이하, PCR이라 한다)의 대수 증식기(exponential phase) 범위 내에서 측정하고자 매 사이클의 진행상황을 모니터링하는, 젤에서의 분리방법이 아닌 반응 튜브 내 측정수단으로 형광측정방법을 통한 실시간 중합효소연쇄반응(Real Time PCR)을 이용하고 있다. 실시간 중합효소연쇄반응을 통한 정량분석방법에는 SYBRR Green I method, Taqman probe method, Molecular beacon method 그리고 Hybridization probe method의 4가지 방법이 사용되고 있다. The quantitative analysis of the genetically modified agricultural products currently used is a separation method in a gel, which monitors the progress of each cycle to be measured within the exponential phase of each polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR). Rather, real-time polymerase chain reaction (Real Time PCR) using fluorescence measurement method is used as a measuring means in the reaction tube. There are four methods for quantitative analysis through real-time polymerase chain reaction: SYBRR Green I method, Taqman probe method, Molecular beacon method, and Hybridization probe method.                         

SYBRR Green I을 이용한 방법은 위에서 언급한 형광 라벨링된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 방법이 아닌 PCR반응에 의해 생성된 PCR 산물인 DNA의 이중나선의 minor groove에 결합하여 형광을 방출하며 이로 인해 발생하는 형광량을 측정하는 방법으로, 이때 검출된 형광량은 증폭된 DNA의 양에 비례하여 발생하므로 간접적인 정량측정 수단이 될 수 있다. Taqman probe method(5' Nuclease Assay)는 프로브의 5′말단에 리포터형광을 붙이고 3′말단에는 퀀처를 붙여, PCR이 진행될 때 5′ 말단의 리포터형광이 떨어지면서 내는 고유의 형광을 정량하는 방식으로, 이 프로브의 서열은 타겟의 고유한 염기서열로서, 특정 산물에만 붙으며, PCR 반응이 없으면 3′말단의 퀀처에 의해 형광이 억제되도록 디자인된 것이다. PCR 반응이 많으면 비례적으로 형광의 양도 누적 증가하므로 간접적인 정량 측정수단이 될 수 있다. Molecular beacon probe method는 특이한 헤어핀 (hair-pin)의 스템과 루프(stem-and-loop)구조로, 가운데의 루프부분은 타겟에 대해 상보적인 염기서열로 구성되고(10-40 염기) 양 말단은 각각 4-7염기쌍의 상보적인 염기서열로서 스템 구조를 형성한다. 5′말단에는 리포터형광이 붙어있고 3′말단에는 퀀처로 DABSYL이 붙어 있어, 이들 헤어핀 구조가 타겟에 붙어있지 않은 경우에는 구조적으로 리포터가 형광을 내지 못하는 반면, 타겟에 결합하게 되면 PCR의 진행에 따라 증가하는 특정산물에 molecular beacon probe의 루프부위가 붙게 되고 이들 헤어핀구조가 풀어지면서 퀀처의 영향권에서 벗어난 리포터가 발산하는 형광을 측정하여 정량하는 방법이다. Hybridization probe method는 타겟 서열내의 서로 인접한 2개의 프로브를 사용한다. 이 경우, 한 프로브의 3′말단에는 공여체형광 이 붙어 있고 다른 프로브의 5′말단에는 수용체형광이 붙어 있어 이들 프로브가 서로 인접해야만 형광공명에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer;FRET)가 일어나서, 공여체의 방사광(emission light)이 수용체의 여기광(excitation light)으로 작용할 수 있다. 즉, 근접한 공여체형광에서 전달된 에너지에 의해 수용체 형광이 형광을 발하게 되며, 그 형광의 양은 PCR 산물에 붙은 프로브의 양에 비례 증대하여 간접적 정량측정 수단이 될 수 있다.The method using SYBRR Green I emits fluorescence by binding to the minor groove of the double helix of DNA, a PCR product produced by PCR, rather than using the fluorescently labeled oligonucleotide probe mentioned above. As a method of measuring the amount of light, the detected amount of fluorescence is generated in proportion to the amount of DNA amplified and thus may be an indirect quantitative measuring means. Taqman probe method (5 'Nuclease Assay) attaches reporter fluorescence at 5' end of the probe and quencher at 3 'end, and quantifies the intrinsic fluorescence emitted by reporter fluorescence at 5' end when PCR proceeds. The sequence of the probe is a unique nucleotide sequence of the target, which is attached only to a specific product and is designed to suppress fluorescence by the quencher at the 3 'end when there is no PCR reaction. If there are many PCR reactions, the amount of fluorescence may increase proportionally and thus may be an indirect quantitative measuring means. Molecular beacon probe method is a unique hair-pin stem and stem-and-loop structure, with the loop part in the center consisting of base sequences complementary to the target (10-40 bases). Each form a stem structure as complementary sequences of 4-7 base pairs. The 5 'end has a reporter fluorescence and the 3' end has a DABSYL as a quencher. If these hairpin structures are not attached to the target, the reporter does not fluoresce structurally. As a result, the loop portion of the molecular beacon probe is attached to a specific product that increases, and the hairpin structure is released to measure and quantify the fluorescence emitted by the reporter, which is out of the influence region of the quencher. The hybridization probe method uses two adjacent probes in the target sequence. In this case, donor fluorescence is attached at the 3 'end of one probe and acceptor fluorescence is attached at the 5' end of the other probe, and these probes must be adjacent to each other so that Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) occurs. Emission light can act as an excitation light of the receptor. That is, the receptor fluorescence fluoresces by the energy delivered from the adjacent donor fluorescence, and the amount of the fluorescence increases in proportion to the amount of the probe attached to the PCR product, which may be an indirect quantitative measuring means.

이에 본 발명의 목적은 유전자변형농산물에 대한 정량분석을 위하여 유전자변형농산물에 특이적인 재조합유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머를 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 타겟 유전자를 증폭하고 아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동을 진행하여 재조합 유전자 밴드, 내재 유전자 밴드 및 외부표준검체 밴드를 확인한 다음, 정량 프로그램을 통하여 형광감도 값으로 수치화하여 GMO 혼입률에 따른 정량면적을 나타내고, 표준시료의 PCR 증폭산물에 대한 형광 밴드값으로 표준정량곡선을 작성하고, 이들 표준시료에 대한 표준정량곡선을 이용하여 GMO 혼입률(%)을 확인하고자 하는 미지시료의 GMO 혼입률(%)을 정확하게 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to amplify a target gene by polymerase chain reaction (PCR) using a primer for detecting a recombinant gene and a primer for detecting an endogenous gene specific for the genetically modified agricultural product for quantitative analysis of the genetically modified agricultural product. Electrophoresis was carried out on acrylamide gel to confirm the recombinant gene band, the endogenous gene band, and the external standard sample band, and then quantified by fluorescence sensitivity value through the quantitative program to indicate the quantitative area according to the GMO incorporation rate, and the PCR amplification product of the standard sample. A standard quantitative curve is prepared with the fluorescence band values for and a standard quantitative curve for these samples is used to accurately quantify the GMO content (%) of the unknown sample to determine the GMO content (%). It is.

또한 본 발명의 목적은 상기 방법에 사용될 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a primer that can be used in the method.

본 발명은 유전자변형농산물(GMO)에 대한 GMO 혼입률(%)을 분석하기 위한 새 로운 유전자변형농산물의 정량분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for quantitative analysis of new genetically modified agricultural products for analyzing the GMO incorporation rate (%) for genetically modified agricultural products (GMO).

본 발명은 일정한 GMO 혼입률을 갖는 표준시료, 정량하고자하는 미지시료의 게놈 DNA를 주형으로 하여 유전자변형농산물(GMO)에 특이적으로 나타나는 재조합 유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 외부표준검체시료의 PCR을 수행하는 단계; 상기 a)와 b)로부터 증폭된 PCR 산물을 혼합하여 아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동하는 단계; 및 외부표준검체로부터 나타나는 형광값을 이용하여 웰사이의 형광값을 보정하고, 표준시료의 증폭산물 양으로 표준정량곡선을 작성하고, 표준정량곡선 대비 미지시료에 대한 증폭산물을 환산하여 미지시료의 유전자변형농산물의 혼입률을 산출하는 단계로 이루어지는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.In the present invention, PCR is carried out using a recombinant sample for detecting a gene and a primer for detecting an endogenous gene, which are specific to a genetically modified agricultural product (GMO) using a standard sample having a constant GMO incorporation rate and a genomic DNA of an unknown sample to be quantified. Performing; Performing PCR of an external standard sample; Mixing the amplified PCR products from a) and b) by electrophoresis on acrylamide gels; And correct the fluorescence value between the wells using the fluorescence value from the external standard sample, prepare a standard quantitative curve using the amount of amplified product of the standard sample, and convert the amplified product for the unknown sample to the standard quantitative curve. It provides a method for quantitatively analyzing the incorporation rate for genetically modified agricultural products comprising the step of calculating the incorporation rate of genetically modified agricultural products.

또한 본 발명은 유전자변형농산물에 특이적인 재조합유전자 검출용 프라이머, 내재유전자 검출용 프라이머, 외부표준검체 검출용 프라이머를 제공한다. In another aspect, the present invention provides a primer for detecting a recombinant gene, a primer for detecting an endogenous gene, a primer for detecting an external standard sample specific to a genetically modified agricultural product.

상기 재조합 유전자 검출용 프라이머는 아그로박테리움 튜머파시엔스 CP4 유래의 NOS 터미네이터 부위에 특이적인 프라이머로서 서열 번호 3 내지 서열번호 6으로 제시되는 프라이머가 바람직하게 사용된다.The primer for detecting the recombinant gene is preferably a primer represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6 as a primer specific for the NOS terminator site derived from Agrobacterium tumerfaciens CP4.

상기 외부표준검체 검출용 프라이머는 pUC19 플라스미드 유래 프라이머로서, 서열번호 1 내지 2로 제시되는 프라이머가 바람직하게 사용된다. The primer for detecting the external standard specimen is a primer derived from pUC19 plasmid, and primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 2 are preferably used.

상기 내재유전자 검출용 프라이머는 렉틴(Lectin) 유전자 유래 프라이머로서, 서열번호 7 내지 10으로 제시되는 프라이머가 바람직하게 사용된다.The primer for detecting the endogenous gene is a primer derived from a lectin gene, and primers represented by SEQ ID NOs: 7 to 10 are preferably used.

본 발명에서 외부표준검체란 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동시 발생되는 시료 전개 시작 웰과 마지막 웰 사이에 발생되는 형광값의 차이를 보정하기 위해 GMO 정량 프로그램 상에서 형광값 차이를 같은 형광값으로 맞추기 위해 사용되는 시료로서, 본 발명의 실시예에서는 pUC19 플라스미드가 사용되고 있다. 상기 외부표준검체로서 사용되는 pUC19 프라스미드를 증폭하기 위한 프라이머로서는 PUC-FP(서열번호1)와 5′말단이 TAMRA로 라벨링된 PUC-RP(서열번호 2)를 사용한다.In the present invention, the external standard sample is used to adjust the fluorescence value to the same fluorescence value in the GMO quantitative program to correct the fluorescence value generated between the sample development start well and the last well generated during electrophoresis on acrylamide gel. As the sample, pUC19 plasmid is used in the Example of this invention. As a primer for amplifying the pUC19 prasmid used as the external standard sample, PUC-FP (SEQ ID NO: 1) and PUC-RP (SEQ ID NO: 2) labeled at 5 'end with TAMRA are used.

본 발명에서 GMO 혼입률(%)이란 미지 시료의 전체 양 대비 유전자변형농산물이 차지하는 양의 비율을 백분율(%)로 환산하여 나타낸 값을 의미한다. In the present invention, the GMO incorporation rate (%) refers to a value expressed as a percentage (%) of the ratio of the amount of genetically modified agricultural products to the total amount of the unknown sample.

본 발명에서 표준시료라 함은 유전자변형농산물(GMO) DNA 혼입률(%)이 각각 일정조건으로 조성된 시료들을 말하는데, 본 실시예에서는 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5% GMO 혼입율을 갖는 시료들을 의미한다. In the present invention, the standard sample refers to samples in which genetically modified agricultural product (GMO) DNA incorporation rate (%) is formed under a predetermined condition, respectively. In this embodiment, 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25% and 1.5% GMO incorporation rate. Means having a sample.

따라서, 본 발명의 방법에 의하면 더욱 정확하고 효과적으로 유전자변형농산물의 혼입률(%)을 산출할 수 있다. Therefore, according to the method of the present invention, the incorporation rate (%) of genetically modified agricultural products can be calculated more accurately and effectively.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.

실시예 1: 외부표준검체 DNA의 추출 및 정제Example 1 Extraction and Purification of External Standard Sample DNA

외부표준검체라 함은 하기 실시예 7에서 전기영동시 발생되는 시료 전개가 시작되는 웰(well)과 마지막 웰(well)사이에서 전기영동시 발생하는 웰간의 형광값의 차이를 보정하기 위해 아크릴아마이드 젤 전기영동시 각 웰 마다 동일량을 첨가하여, GMO 정량 프로그램 상에서 확인되는 웰사이의 형광값 차이를 같은 형광값으로 보정하기 위해 넣어주는 시료를 의미한다. 본 실시예에서 외부표준검체로는 pUC 19 플라스미드 DNA를 이용하였다. pUC19 플라스미드가 형질전환된 E, coli 균주 DH5α를 AccuPrep TM Plasmid Extraction Kit (바이오니아사 제품)를 이용하여 다음과 같이 추출 및 정제하였다. 먼저 상기 세포를 LB 액체배지 10㎖에 접종한 후 37℃에서 300 rpm으로 진탕배양기에서 16시간 배양한 후 2.0㎖ 튜브에 세포배양액 1.5ml를 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버리고 다시 세포배양액 1.5㎖을 넣고 8,000 rpm에서 1분동안 원심분리하여 다시 상등액을 버리고, 여기에 현탁완충액(Resuspension buffer; 1M Tris-HCl, 0.5M EDTA, pH8.0) 250㎕를 넣고 강하게 섞어주어 침전된 세포들을 풀어주었다. 여기에 다시 용해완충액(Lysis buffer; 10M NaOH, 10% SDS) 250㎕를 넣고 약하게 흔들어 준 후, 상온에서 5분 동안 방치한 후, 중화완충액(Neutralization buffer; potassium acetate, glacial acetic acid, Guanidine HCl) 350㎕를 넣고 약하게 흔들어 준 후, 4℃에서 5분 동안 방치하였다. 그 후 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 바인딩 칼럼이 끼워진 2.0㎖ 튜브의 바인딩 칼럼 내에 옮겨 놓고, 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 바인딩 칼럼을 새로운 2.0㎖ 튜브 상에 올려 놓고, 바인딩 칼럼 내에 80% 에탄올을 700㎕ 넣어주고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 바인딩 칼럼을 씻어주었다. 그리고 바인딩 칼럼 내에 남겨진 에탄올을 제거하기 위해 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다. 다시 바인딩 칼럼을 새로운 1.5㎖ 튜브 상에 옮겨 놓고, 바인딩 칼럼 내에 용리완충액(Elution buffer:10mM Tris-HCl, pH 8.5)을 200㎕ 넣고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 200㎕의 추출된 플라스미 드 DNA가 포함된 용리완충액을 회수하여 흡광광도계로 정량하여 실시예 3에서 사용하였다. The external standard specimen is acrylamide in order to correct the difference in fluorescence value between the wells generated during electrophoresis between the wells at which sample development occurs during electrophoresis and the last well in Example 7 below. In gel electrophoresis, the same amount is added to each well, and the sample is added to correct the difference in fluorescence values between the wells identified on the GMO quantification program. In this Example, pUC 19 plasmid DNA was used as an external standard sample. E, coli strain DH5α transformed with pUC19 plasmid was extracted and purified using the AccuPrep ™ Plasmid Extraction Kit ( Bionia ). First, the cells were inoculated in 10 ml of LB liquid medium and incubated for 16 hours in a shaker at 300 ° C. at 37 ° C., followed by 1.5 ml of the cell culture solution in a 2.0 ml tube, and centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute. Discard the supernatant again by adding 1.5 ml of cell culture medium and centrifuging at 8,000 rpm for 1 minute, and adding 250 μl of suspension buffer (1M Tris-HCl, 0.5M EDTA, pH8.0) The precipitated cells were released. Add 250 μl of Lysis buffer (Lysis buffer; 10M NaOH, 10% SDS), shake gently, and leave it at room temperature for 5 minutes, then neutralize buffer (Neutralization buffer; potassium acetate, glacial acetic acid, Guanidine HCl). After 350 µl of the solution was gently shaken, the mixture was left at 4 ° C. for 5 minutes. After centrifugation at 12,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was transferred into a binding column of a 2.0 ml tube fitted with a binding column and centrifuged at 12,000 rpm for 1 minute. The binding column was put on a new 2.0 ml tube, 700 µl of 80% ethanol was added to the binding column, and the binding column was washed by centrifugation at 12,000 rpm for 1 minute. And centrifuged for 1 minute at 12,000 rpm to remove the ethanol remaining in the binding column. Again, the binding column was transferred to a new 1.5 ml tube, and 200 µl of elution buffer (Elution buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 8.5) was added to the binding column and centrifuged at 12,000 rpm for 1 minute. Elution buffer containing 200 μl of extracted plasmid DNA was recovered and quantified by an absorbance spectrophotometer and used in Example 3.

실시예 2 : 유전자변형농산물 혼입률(%) 분석을 위한 특이적 프라이머 설계Example 2 Specific Primer Design for Analysis of Genetically Modified Agricultural Products Incorporation Rate (%)

유전자변형농산물 혼입률(%) 분석을 위해 프라이머를 제조하는데 있어서, 아그로박테리움 튜머파시엔스 CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4)유래의 NOS 터미네이터 부위(Nophaline synthase gene terminator)를 (주)바이오니아의 한국특허출원 2000-0013464 내용에 근거하여 조작된 유전자 및 조작된 터미네이터에 대한 서열을 확보하였다. 그 후, 상기 조작된 유전자 및 조작된 터미네이터 염기서열을 바탕으로 하여 조작/변형된 재조합 유전자를 검출할 수 있는 특이적 프라이머를 Primer3이라는 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 설계하였다.(서열번호 3 내지 6) 그리고 내부 유전자인 렉틴(Lectin) 유전자 유래의 프라이머는 BioTechniques 31: 426-429 내용에 근거하여 상기와 같은 방법으로 설계 및 제작하였다.(서열번호 7 내지 10) 이의 결과는 표1에 제시되어 있다.In preparing primers for analysis of the% of the genetically modified agricultural product, a Nophaline synthase gene terminator derived from Agrobacterium tumefaciens CP4 was obtained from Korean Patent Application No. 2000-Bionic. Sequences for engineered genes and engineered terminators were obtained based on 0013464 content. Subsequently, specific primers capable of detecting engineered / modified recombinant genes based on the engineered genes and engineered terminator sequences were designed using a primer design program called Primer3 (SEQ ID NOS: 3 to 6). And primers derived from the internal gene lectin (Lectin) gene was designed and produced in the same manner as described on the basis of BioTechniques 31: 426-429 (SEQ ID NOS: 7 to 10). The results are shown in Table 1.

프라이머 염기서열Primer Sequence 서열번호 SEQ ID NO: 프라이머  primer 서 열             Standing column 비 고     Remarks                                              1    One PUC-FP   PUC-FP 5'-GCC TTT TTA CGG TTC CTG GC-3' 5'-GCC TTT TTA CGG TTC CTG GC-3 ' 2    2 PUC-RP   PUC-RP 5'-TTC CGC TTC CTC GCT CAC T-3' 5'-TTC CGC TTC CTC GCT CAC T-3 ' 5'-TAMRA labeled 5'-TAMRA labeled                                              3    3 NOS-FP1   NOS-FP1 5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3' 5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3 ' 4    4 NOS-RP1   NOS-RP1 5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3' 5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3 ' 5    5 NOS-FP2   NOS-FP2 5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3' 5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3 ' 5'-TAMRA labeled 5'-TAMRA labeled                                              6    6 NOS-RP2   NOS-RP2 5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3' 5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3 ' 7    7 Lectin-FP1  Lectin-FP1 5'-ACC AAA TCC ACA CAT CGG AAT-3' 5'-ACC AAA TCC ACA CAT CGG AAT-3 ' 8    8 Lectin-RP1  Lectin-RP1 5'-GAA GCA AAA GAC CAA GAA AGC A-3' 5'-GAA GCA AAA GAC CAA GAA AGC A-3 ' 9    9 Lectin-FP2  Lectin-FP2 5'-GCC AAC AAT AAA GTA GCC AAG G-3' 5'-GCC AAC AAT AAA GTA GCC AAG G-3 ' 10   10 Lectin-RP2  Lectin-RP2 5'-AGA ACC CTA TCC TCA CCC ACT C-3' 5'-AGA ACC CTA TCC TCA CCC ACT C-3 ' 5'-TAMRA labeled 5'-TAMRA labeled                                             

실시예 3 : 외부표준검체시료의 PCR 반응Example 3 PCR Reaction of External Standard Specimen

AccuPower PCR PreMix((주)바이오니아사 제품)튜브에 상기 실시예 1에서 정제된 pUC19 DNA를 각각 1ng(/20㎕/1회 PCR 반응 부피/1 튜브반응시) 넣어준 후, 표1에 제시된 PUC-FP(5′-GCCTTTTTACGGTTCCTGGC-3′) 프라이머와 5′말단이 TAMRA로 라벨링된 PUC-RP(5'-TTCCGCTTCCTCGCTCACT-3′) 프라이머를 각각 10pmol씩 넣고 각 튜브의 20㎕ 반응부피에 대한 나머지 잔량으로 멸균 증류수를 넣어주었다. 이들을 잘 섞은 후 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 증폭조건은 초기변성을 94도에서 5분간 한 후, 94℃에서 50초간 변성(denaturation), 57℃에서 50초간 어닐링(annealing), 72℃에서 50초간 익스텐션(extension)을 30 사이클 실시하고 후기 익스텐션(extension)을 72℃에서 5분간 실시하였다. 반응종료 후 PCR 반응물에 대해 아크릴아마이드 젤 전기영동을 수행하여 크기(165bp)를 확인하였다. After each 1ng (/ 20μl / 1 PCR reaction volume / 1 tube reaction) of the pUC19 DNA purified in Example 1 to the AccuPower PCR PreMix (manufactured by Bioneer Corporation) tube, the PUCs shown in Table 1 Add 10 pmol of each -FP (5'-GCCTTTTTACGGTTCCTGGC-3 ') primer and 5'-terminal PUC-RP (5'-TTCCGCTTCCTCGCTCACT-3') primer, and the remaining amount for each 20 µl reaction volume of each tube. Sterile distilled water was added. After mixing well, the PCR reaction was performed as follows. The amplification condition is performed after the initial denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, denaturation at 94 ° C. for 50 seconds, annealing at 57 ° C. for 50 seconds, and extension for 30 seconds at 72 ° C. for 30 cycles. (extension) was performed at 72 degreeC for 5 minutes. After completion of the reaction, acrylamide gel electrophoresis was performed on the PCR reaction to check the size (165 bp).

도 2는 외부표준검체를 PCR 반응시킨 후 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 DNA 농도별 밴드양상을 나타내고 있는데, 레인1은 1,470pg, 레인 2는 735pg, 레인 3은 368 pg, 레인 4는 184pg, 레인 5는 92pg, 레인 6은 46pg, 레인 7은 23pg의 외부표준검체를 나타낸다. Figure 2 shows the band pattern according to the DNA concentration by acrylamide gel electrophoresis after PCR reaction of the external standard sample, lane 1 is 1,470pg, lane 2 is 735pg, lane 3 is 368 pg, lane 4 is 184pg, lane 5 Shows 92 pg, lane 6 is 46 pg and lane 7 is 23 pg.

실시예 4: 유전자변형콩, 비유전자변형콩 및 GMO 혼입률(%)을 확인하고자 하는 미지검체로부터 게놈 DNA 추출Example 4 Genomic DNA Extraction from Unknown Specimen to Determine Transgenic Soybean, Non-GMO, and GMO Incorporation Rate (%)

유전자변형콩, 비유전자변형콩(재래콩) 및 유전자변형여부를 알고자하는 검체로부터 게놈 DNA를 AccuPrep GMO DNA Extraction kit((주)바이오니아사 제품)를 사용하여 다음과 같이 추출하였는데 이 추출 키트는 분리 정제를 위한 필요한 모든 시약을 함유하고 있고, 칼럼 타입의 정제 시스템을 사용하여 빠른 시간 내에 간편하게 고순도의 DNA를 분리 정제할 수 있는 제품이다. 우선, 상기 시료들을 파쇄하여 튜브에 약 50mg씩 넣어준 후 여기에 식물용해완충액(Plant Lysis buffer; 100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 50mM EDTA, 2% SDS) 400㎕와 Proteinase K(10㎎/㎖)10㎕를 첨가하여 60℃에서 10분간 반응시키고 여기에 결합완충액(Binding buffer; 7M Guanidine-HCl, 100mM Tris-HCl, 20mM Urea, 10% Triton X-100, pH4.5) 400㎕를 넣고 섞어준 후, 60℃에서 10분간 반응시켰다. 그 다음 12,000rpm에서 10 분간 원심분리하고 상층액을 새로운 collection tube에 장착된 spin-column 튜브로 옮겨 놓고, 이소프로판올 100㎕을 넣고 섞어준 후, 이를 다시 10초 동안 원심분리하여, 상층액을 바인딩 칼럼에 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 그 후, 바인딩칼럼을 새로운 2.0㎖튜브 상에 올려놓고, 바인딩 칼럼 내에 세척완충액 1(Washing buffer 1; 5M Guanidine-HCl, 20mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 6.6, 44% EtOH)을 500㎕ 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 바인딩 칼럼을 씻어주고 다시 바인딩 칼럼을 새로운 2.0㎖ 튜브 상에 옮겨 놓고, 바인딩 칼럼 내로 세척완충액 2 (20mM NaCl, 2mM Tris-HCl, 80% EtOH)를 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 바인딩 칼럼을 씻어주었다. 이를 다시 새로운 1.5㎖ 튜브상에 옮겨 놓고, 바인딩 칼럼 내로 용리완충액(Elution buffer; 10mM Tris-HCl, pH 8.5) 200㎕를 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 게놈 DNA를 회수하였다. 200㎕의 정제된 게놈 DNA를 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동하였는데, 먼저 유리병에 1g 아가로스((주)바이오니아사 제품)를 넣고, 100㎖ 되게 TBE 전기영동용 완충액을 넣은 다음, 완전히 용해되도록 가열, 교반시켰다. 60℃정도로 식힌 후, 4㎕ 에티듐 브로마이드 염색시약(EtBr, 10㎎/㎖)를 넣은 후, 콤(comb)이 삽입된 캐스팅 트레이에 젤을 붓고 30분간 실온에서 방치하여 젤을 굳힌 후, 굳힌 젤을 AgaroPowerTM 전기영동 챔버((주)바이오니아사 제품)에 넣고, 0.5X TBE 전기영동용 완충액을 젤이 잠기도록 넣어주었다. PCR 반응물 5㎕에 로딩 완충액 (loading buffer) 1㎕를 섞어준 후 피펫을 이용하여 아가로스 젤의 웰에 넣어주었다. 그 다음 AgaroPowerTM 전기영동 챔버((주) 바이오니아사 제품)에 전압을 걸어 전기영동을 한 후 UV 투사기(UV transilluminator)에 전기영동한 젤을 올려 놓고 Imager IIITM 디지털 카메라((주) 바이오니아사 제품)로 결과를 촬영하였다.Genomic DNA was extracted from genetically modified soybeans, non-genetically modified soybeans (traditional soybeans), and samples to be genetically modified using the AccuPrep GMO DNA Extraction kit (manufactured by Bioneer Corporation) as follows. It contains all the necessary reagents for separation and purification, and it is a product that can easily separate and purify high purity DNA using a column type purification system in a short time. First, the samples were crushed and placed in a tube of about 50 mg, and then 400 μl of plant lysis buffer (Plant Lysis buffer; 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 2% SDS) and Proteinase K (10 mg / ml). 10 μl was added and reacted at 60 ° C. for 10 minutes. Add 400 μl of binding buffer (Binding buffer; 7M Guanidine-HCl, 100 mM Tris-HCl, 20 mM Urea, 10% Triton X-100, pH4.5) After the reaction, the reaction was carried out at 60 ° C. for 10 minutes. Then, centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was transferred to a spin-column tube mounted in a new collection tube, mixed with 100 µl of isopropanol, followed by centrifugation for 10 seconds, and the supernatant bound to the binding column. And centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute. The binding column is then placed on a fresh 2.0 ml tube and washed buffer 1 (5M Guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 6.6, 44% EtOH) in a binding column. 500 μl of the solution was centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute to wash the binding column, and again, the binding column was transferred to a new 2.0 ml tube, and the wash buffer 2 (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, 80% EtOH) was added into the binding column. To wash the binding column by centrifugation for 1 minute at 8,000 rpm. This was again transferred to a new 1.5 ml tube, 200 μl of Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) was added to the binding column and centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute to recover genomic DNA. 200 μl of purified genomic DNA was electrophoresed on a 1% agarose gel. First, 1 g agarose (Bionia Co., Ltd.) was placed in a glass bottle, and TBE electrophoresis buffer was added to 100 ml, and then completely dissolved. It was heated and stirred as much as possible. After cooling to about 60 ° C., 4 μl of ethidium bromide staining reagent (EtBr, 10 mg / ml) was added, the gel was poured into a casting tray with a comb, and left at room temperature for 30 minutes to harden the gel. The gel was placed in AgaroPowerTM electrophoresis chamber (Bionia Co., Ltd.), and 0.5X TBE electrophoresis buffer was added to submerge the gel. 5 μl of the PCR reaction was mixed with 1 μl of loading buffer and loaded into a well of agarose gel using a pipette. Then, electrophoresis was performed by applying voltage to AgaroPower TM electrophoresis chamber (manufactured by Bioneer Co., Ltd.), and then electrophoretic gel was placed on a UV transilluminator. Imager III TM digital camera (manufactured by Bioneer Co., Ltd.) The results were taken with.

도 1은 유전자변형콩과 비유전자변형콩에서 추출한 게놈 DNA를 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는데, M은 마커를, 레인 1과 2는 유전자변형콩의 게놈 DNA를, 레인 3과 4는 비유전자변형콩의 게놈 DNA를 나타낸다. Figure 1 shows the results of agarose gel electrophoresis of genomic DNA extracted from transgenic soybeans and non-genetically modified soybeans, M is a marker, lanes 1 and 2 genomic DNA of transgenic beans, lanes 3 and 4 analogy It shows genomic DNA of electron modified soybean.

실시예 5: 정성분석을 위한 유전자변형농산물의 PCRExample 5 PCR of Genetically Modified Agricultural Products for Qualitative Analysis

실시예 4에서 추출한 유전자변형콩과 비유전자변형콩(재래콩)의 게놈 DNA를 정성분석 하기 위해 PCR 반응을 수행하였다. AccuPower PCR PreMix((주)바이오니아사 제품)튜브에 상기 실시예 4에서 정량된 게놈 DNA 100ng(/20㎕/1회 PCR 반응부피/1 튜브반응시)를 넣어준 후, 재조합유전자 검출용 NOS-FP1(5′-GAATCCTGTTGCCGG TCTTG-3′)프라이머와 NOS-RP1(5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′)프라이머를 20pmol씩, 내재유전자 검출용 Lectin-FP1(5′-ACCAAATCCACACATCGGAAT-3′)프라이머와 Lectin-RP1(5′-GAAGCAAAAGACCAAGAAAGCA-3′)프라이머를 20pmol씩 넣은 후 20㎕ 반응부피에 대한 나머지 잔량으로 멸균수를 넣어주었다. 이를 잘 섞은 후, PCR 반응을 수행하였다. 증폭조건은 초기변성을 94℃에서 5분간 한 후, 94℃에서 50초간 변성, 55℃에서 50초간 어닐링, 72℃에서 50초간 익스텐션을 35사이클 실시하고 후기 익스텐션을 72℃에서 5분간 실시하였다. 그 후 실시예 4에 제시된 방법으로 제조된 아가로스 젤 상에서 PCR산물의 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 유전자변형콩의 경우에는 내재 유전자인 렉틴 유전자 밴드(318bp)와 재조합 유전자인 NOS 터미네이터 유전자밴드(180bp)가 확인되었고, 비유전자변형콩의 경우에는 내재유전자인 렉틴 유전자밴드(318bp)만을 확인할 수 있었다. 도 3은 GMO 콩과 Non-GMO 콩(재래 콩)에서 추출한 게놈 DNA에 대한 PCR 수행 후, 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 것으로, M은 마커를, 레인 1은 GMO 콩을, 레인 2는 Non-GMO 콩(재래 콩)을, 밴드 a는 내재유전자 PCR 증폭 밴드 (318bp)를, 밴드 b는 재조합유전자 PCR 증폭 밴드 (180bp)를 나타낸다.PCR reactions were performed to qualitatively analyze the genomic DNA of GM soybeans extracted from Example 4 and non-GMO soybeans (traditional soybeans). After inserting 100 ng of genomic DNA quantified in Example 4 (at the time of / 20 μl / 1 PCR reaction volume / 1 tube reaction) into AccuPower PCR PreMix (manufactured by Bioneer Co., Ltd.) tube, NOS- for recombinant gene detection 20 pmol of FP1 (5′-GAATCCTGTTGCCGG TCTTG-3 ′) primers and NOS-RP1 (5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 ′) primers, Lectin-FP1 (5′-ACCAAATCCACACATCGGAAT-3 ′) primers and Lectin- 20 pmol of RP1 (5′-GAAGCAAAAGACCAAGAAAGCA-3 ′) primers were added, and sterile water was added to the remaining amount of the 20 μl reaction volume. After mixing well, a PCR reaction was performed. In the amplification conditions, the initial denaturation was performed at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 50 seconds of denaturation at 94 ° C., annealing at 55 ° C. for 50 seconds, and 35 cycles of extension at 72 ° C. for 50 seconds, and late extension at 72 ° C. for 5 minutes. Thereafter, electrophoresis of the PCR product on the agarose gel prepared by the method shown in Example 4 was performed and the results are shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, in the case of transgenic soybeans, the lectin gene band (318bp) as an endogenous gene and the NOS terminator gene band (180bp) as a recombinant gene were identified, and in the case of non-transgenic soybeans, the lectin gene band as an endogenous gene ( 318bp) was confirmed only. Figure 3 shows the results of electrophoresis on agarose gel after PCR on genomic DNA extracted from GMO beans and Non-GMO beans (conventional beans), M is a marker, lane 1 is GMO beans, lane 2 Denotes Non-GMO soybean (traditional soybean), band a represents the endogenous PCR amplification band (318 bp), and band b represents the recombinant gene PCR amplification band (180 bp).

실시예 6: 정량분석을 위한 유전자변형농산물의 PCRExample 6 PCR of Genetically Modified Agricultural Products for Quantitative Analysis

유전자변형농산물을 정량분석하기 위해 표준시료와 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 미지시료의 PCR 반응을 수행하였다. In order to quantitate genetically modified agricultural products, PCR reactions of standard samples and unknown samples to quantify GMO content (%) were performed.

본 발명에서 표준시료라 함은 유전자변형농산물(GMO) DNA 혼입률(%)이 각각 일정조건으로 조성된 시료들을 말하는데, 예를들면, 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5% GMO 혼입율을 갖는 시료들을 말하는데 실시예 5에서 정성분석을 통하여 확인하였다. In the present invention, the standard sample refers to samples in which genetically modified agricultural product (GMO) DNA incorporation rate (%) is formed under a certain condition, for example, 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, and 1.5% GMO incorporation rate. It refers to the sample having a was confirmed through qualitative analysis in Example 5.

표준시료를 위한 AccuPower PCR PreMix((주)바이오니아사 제품) 튜브 5개에 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5%의 GMO 혼입율을 갖는 유전자변형콩 DNA를 각각 10㎕ (/20ul/PCR 반응 부피/1 튜브), GMO혼입률(%)을 정량하고자 하는 튜브에 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 시료로부터 추출한 게놈 DNA 50ng( /20ul/PCR 반응 부피/1 튜브)을 넣어주었다. 이어서 각각의 반응 튜브에 준비된 프라이머 혼합물을 10㎕ ( /튜브)씩 분주하였다. 여기서 프라이머 혼합물은 재조합유전자 검출용 프라이머로 5′말단이 TAMRA로 라벨링된 프라이머 NOS-FP2(5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′)와 프라이머 NOS-RP2(5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′)이 15pmol 씩, 내재유전자 검출용 프라이머로 Lectin-FP2(5′-GCCAACAATAAAGTAGCCAAGG-3′)와 5′이 TAMRA로 라벨링된 프라이머 Lectin-RP2(5′-AGAACCCTATCCTCACCCACTC-3′)이 각 2.5pmol 씩 혼합되어 있는 조성물이다. 그 후 잘 섞어준 후, 상기 실시예 5와 같은 PCR 증폭 조건으로 PCR을 25 사이클을 실시하였다. 그리고 상기 PCR 반응에 대한 음성대조군으로는 게놈 DNA 대신에 10㎕의 멸균수를 넣어준 후 동일하게 PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행후, 반응산물을 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하였다.10 μl (/ 20ul) of transgenic soybean DNA with GMO incorporation rates of 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25% and 1.5% in five A ccuPower PCR PreMix ( Bionia ) tubes for standard samples. 50 ng of genomic DNA (/ 20 ul / PCR reaction volume / 1 tube) extracted from the sample to quantify GMO incorporation rate (%) was added to the tube to quantify the% / PCR reaction volume / tube). Subsequently, 10 μl (/ tube) of the prepared primer mixture was dispensed into each reaction tube. Here, the primer mixture is a primer for detection of the recombinant gene, and primers NOS-FP2 (5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 ') and primer NOS-RP2 (5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3'), each labeled 5 'at the end of TAMRA, are embedded therein. As a primer for gene detection, Lectin-FP2 (5′-GCCAACAATAAAGTAGCCAAGG-3 ′) and 5 ′ primer Lectin-RP2 (5′-AGAACCCTATCCTCACCCACTC-3 ′) labeled with TAMRA are mixed. After mixing well, PCR was carried out 25 cycles under the same PCR amplification conditions as in Example 5. As a negative control group for the PCR reaction, 10 μl of sterile water was added instead of genomic DNA, and the PCR reaction was performed in the same manner. After PCR, the reaction product was electrophoresed on acrylamide gel.

도 4 및 5 는 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동을 통하여 GMO 혼입률(%)에 따른 밴드를 타나내는데, 도 4의 레인1은 GMO 혼입률(%) 100%, 레인2는 50%, 레인3은 25%, 레인4는 12.5%, 레인5는 6.3%, 레인6은 3.15%, 레인7은 1.58%, 레인8은 0.79%, 레인9는 0% 를 나타낸 것이고, 도 5의 레인1은 6.0%, 레인 2는 4.5%, 레인3은 3.0%, 레인4는 2.25%, 레인5는 1.5%를 나타내고, a는 NOS 터미네이터 재조합 유전자밴드, b는 외부표준검체 DNA 밴드, c는 렉틴 내재유전자 밴드를 나타낸 것이다.4 and 5 shows the band according to the GMO mixing rate (%) through acrylamide gel electrophoresis after PCR reaction, lane 1 of Figure 4 is 100% GMO content (%), lane 2 50%, lane 3 is 25%, lane 4 is 12.5%, lane 5 is 6.3%, lane 6 is 3.15%, lane 7 is 1.58%, lane 8 is 0.79%, lane 9 is 0%, lane 1 is 6.0% in FIG. , Lane 2 is 4.5%, lane 3 is 3.0%, lane 4 is 2.25%, lane 5 is 1.5%, a is a NOS terminator recombinant gene band, b is an external standard DNA band, c is a lectin endogenous band. It is shown.

실시예 7: 유전자변형농산물에 대한 혼입률(%) 분석Example 7 Analysis of% Mixing of Genetically Modified Agricultural Products

유전자변형콩에 대해 정량분석하기 위해 상기 실시예3에서 증폭된 외부표준검체(820pg/㎕) 2㎕와 염색시약 Auto dye10.9㎕를 0.2㎖튜브에 넣어 혼합하고 여기에 실시예 6에서의 PCR 반응산물 2.1㎕를 넣어준 다음 이를 섞은 후, 튜브를 94℃에서 2분 동안 변성시키고 5초간 8,000 rpm에서 원심분리하였다. 그 후 아크릴아마이드 젤 전기영동을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 유리판 1(시료 전개를 위한 요철부분을 만든 유리판)과 유리판 2(직사각형의 일반 유리판)를 준비하고 이들 유리판 1과 2사이에 스페이서 1(길이가 짧은 것)과 2(길이가 긴 것)를 끼워 넣어주는데 이때, 유리판 1은 위쪽으로, 유리판 2는 유리판 1의 아래쪽으로 향하게 맞추어 놓은 상태에서 스페이서 1을 정면에서 보았을 때 왼쪽 위쪽으로, 스페이서 2는 오른 쪽 아래쪽으로 향하도록 끼워 넣은 다음, 유리 커플러는 왼쪽 아래쪽에 끼워 넣었다. 그 다음에는 유리판을 4 등분하여 좌측과 우측에 각각 4개의 집게를 끼워서 고정시킨 후, Accu-UV gel Mix 29.4㎖와 광개시제((주)바이오니아사 제품) 0.6㎖를 스퀴즈 병(squeeze bottle)에 넣어 섞어주고, 혼합된 젤 용액을 캐스팅된 유리판에 부어준 후, 콤(comb)을 유리판에 5㎜정도로 꽂아주었다. UV gel Maker((주)바이오니아사 제품)에 아크릴아마이드 젤이 담긴 유리판을 수평이 되도록 장착한 후, 30분 동안 젤을 굳히고, 굳힌 젤에서 콤(comb)을 조심스럽게 빼내고는 HT-GeneAnalyzerTM 시퀀서((주)바이오니아사 제품)를 이용하여 전기영동을 진행하였다. 먼저 준비된 아크릴아마이드 젤에 한 웰당 2㎕씩 로딩 (loading)하고 HT-GeneAnalyzerTM 시퀀서((주)바이오니아사 제품)를 이용하여 전기영동 하였는데, 운용조작(Engineerimg setting) 조건은 sampling time 2000ms와 shutter time 1200ms로 진행하였고, Running 조건은 1350V와 42℃에서 1시간 40분 동안 전기영동하였다. 그 결과, 165bp의 외부표준검체 밴드, 157bp의 렉틴 내재성 유전자 밴드, 및 180bp의 노스 (NOS terminator) 재조합 유전자 밴드를 전기영동 상에서 육안으로 확인할 수 있었다. 이어서 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용하여 각 시료밴드에 대한 레인 트랙킹 (lane tracking)을 실시하고 최소/최대 분석범위를 선정하고 나서, 선정된 범위를 추출하였다. 각각의 웰(well)에서의 외부표준검체 DNA 형광값에 대한 보정(normalization)을 진행하고 상기 표준시료 조건에 대한 정보를 입력한 다음, 이에 대한 노스 (Nos terminator) 재조합유전자 밴드들 의 형광측정 면적에 대한 표준정량곡선을 작성하고 표준정량곡선 대비, 미지시료의 측정면적 값에 대한 혼입률(%)을 정량하였다. In order to quantitate the genetically modified soybean, 2 μl of the external standard sample (820 pg / μl) amplified in Example 3 and 1 μl of the dye reagent Auto dye were mixed in a 0.2 ml tube, and the PCR of Example 6 2.1 μl of the reaction product was added thereto, followed by mixing. The tube was denatured at 94 ° C. for 2 minutes and centrifuged at 8,000 rpm for 5 seconds. Then acrylamide gel electrophoresis was performed as follows. First, prepare glass plate 1 (glass plate with concave-convex parts for sample development) and glass plate 2 (ordinary glass plate of rectangular shape), and place spacers 1 (short length) and 2 (long length) between these glass plates 1 and 2. Insert the glass plate 1 upward, glass plate 2 toward the bottom of glass plate 1, and insert spacer 1 toward the top left when viewed from the front and spacer 2 toward the bottom right. Sandwiched in the lower left corner. After that, the glass plate is divided into 4 equal parts, and each of the four tongs is fixed on the left and the right sides. Then, 29.4 ml of Accu-UV gel Mix and 0.6 ml of photoinitiator (Bionia Co., Ltd.) are placed in a squeeze bottle. After mixing, the mixed gel solution was poured into the cast glass plate, and the comb was inserted into the glass plate to about 5 mm. After mounting the glass plate containing acrylamide gel in UV gel maker (Bionia Co., Ltd.) to be horizontal, hardening the gel for 30 minutes, carefully removing the comb from the hardened gel and then HT-GeneAnalyzer TM sequencer Electrophoresis was performed using (Bionia Co., Ltd.). First, 2 μl per well was loaded onto the prepared acrylamide gel and electrophoresed using a HT-GeneAnalyzer TM sequencer (manufactured by BIONIA Co., Ltd.). The operating conditions (Engineerimg setting) were set to sampling time 2000 ms and shutter time. It proceeded to 1200ms, running conditions were electrophoresed for 1 hour 40 minutes at 1350V and 42 ℃. As a result, 165 bp external standard sample band, 157 bp lectin endogenous gene band, and 180 bp North (NOS terminator) recombinant gene band was visually confirmed on electrophoresis. Subsequently, lane tracking was performed on each sample band using a GMO quantitative program (manufactured by Bioneer Co., Ltd.), the minimum / maximum analysis range was selected, and then the selected range was extracted. Normalization of the external standard DNA fluorescence values in each well is performed, information on the standard conditions is input, and then the fluorescence area of the Nos terminator recombination gene bands for the standard sample conditions. A standard quantitative curve for the sample was prepared, and the mixing rate (%) of the measured area of the unknown sample was quantified compared to the standard quantitative curve.

도 6은 PCR 반응후 HT-GeneAnalyzerTM 시퀀서((주)바이오니아사 제품)를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 HT-GeneAnalyzerTM 시퀀서((주)바이오니아사 제품) 콜렉터(collector)상에서의 NOS 재조합유전자 밴드를 나타내는데 레인1은 12.0%, 레인2는 6.0%, 레인3은 3.0%, 레인4는 1.5% GMO 혼입률의 시료 밴드를 나타낸다. Figure 6 shows the NOS recombination gene on the collector (collector) after the HT-GeneAnalyzer TM sequencer (Bionia Co., Ltd.) after acrylamide gel electrophoresis using HT-GeneAnalyzer TM sequencer (Bionia Co., Ltd.) after PCR reaction. Lane 1 represents 12.0%, Lane 2 represents 6.0%, Lane 3 represents 3.0%, and Lane 4 represents a sample band with 1.5% GMO incorporation.

도 7은 PCR 반응 후 HT-GeneAnalyzerTM 시퀀서((주)바이오니아사 제품))를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용한 각 시료에 대한 레인 트랙킹(lane tracking)과 분석범위를 선정한 후 추출한 이미지 밴드 양상을 나타낸다. 레인1부터 레인6은 순서대로 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5%, 0% GMO 혼입률을 함유한 표준시료, 레인 7, 8, 9는 GMO 혼입률(%)을 정량하고자하는 미지시료를 나타내고, 밴드 a는 NOS 재조합 유전자 밴드, 밴드 b는 외부표준검체 DNA 밴드, 밴드 c는 렉틴 내재유전자 밴드를 나타낸다.7 is a lane tracking (lane) for each sample using a GMO quantification program (Bionia Co., Ltd.) after acrylamide gel electrophoresis using the HT-GeneAnalyzer TM sequencer (manufactured by Bioneer) after PCR reaction. It shows the extracted image band pattern after selecting tracking) and analysis range. Lanes 1 through 6 are the standard samples containing 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5%, and 0% GMO incorporation rates, and lanes 7, 8, and 9 are unknown to quantify the percentage of GMO incorporation. A sample is shown, band a represents a NOS recombinant gene band, band b represents an external standard sample DNA band, and band c represents a lectin endogenous gene band.

도 8은 도 7의 각각의 밴드 값을 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용하여 형광감도 값으로 수치화하여 GMO 혼입률(%)에 따른 정량면적으로서 나타낸 것으로 표준시료로 이용된 조건들 중 6.0%와 2.25%는 정량 프로그램 적용에서 배제하였고, 레인 1,2,3은 4.5%, 3.0%, 1.5% GMO 혼입률에 대한 피크 값을 나타내고, 레인 4, 5, 6은 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 미지시료들에 대한 피크 값 을 나타내며, 피크 a는 NOS 재조합 유전자 밴드에 대한 피크 값, 피크 b는 외부표준검체 DNA 밴드에 대한 피크 값, 피크 c는 렉틴 내재유전자 밴드에 대한 피크 값을 나타낸 것이다. FIG. 8 shows the values of the bands in FIG. 7 as quantitative areas according to the GMO incorporation rate (%) by quantifying the fluorescence sensitivity values using a GMO quantification program (manufactured by Bioneer Co., Ltd.). 6.0% and 2.25% were excluded from quantitative program application, lanes 1,2,3 represent peak values for 4.5%, 3.0% and 1.5% GMO incorporation rates, and lanes 4, 5 and 6 were in percent GMO incorporation (%). Represents a peak value for the unknown samples to be quantified, peak a is the peak value for the NOS recombinant gene band, peak b is the peak value for the external DNA sample band, peak c is the peak value for the lectin endogenous band It is shown.

도 9는 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용하여 표준시료들에 대한 표준정량곡선을 작성하고 표준정량곡선 대비 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 미지시료에 대한 GMO 혼입률을 %로 계산한 것을 나타낸 것이다.9 is a GMO mixing rate for the unknown sample to prepare a standard quantitative curve for the standard samples using the GMO quantitative program (product of Bioneer Co., Ltd.) and to quantify the GMO content (%) compared to the standard quantitative curve It shows the calculation.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용함으로써 기존의 실시간(Real time) PCR을 이용한 GMO 정량분석방법에 비하여 재조합 유전자 밴드와 내재 유전자 밴드를 보다 정확하고 높은 효율성의 결과로 정량적으로 확인할 수 있으며, 육안으로 직접 확인하여 정량할 수 있는 장점이 있다. 초기 설비투자 비용이나 기기 유지비용 및 경제성에 있어서도 더욱 더 효율성을 기대할 수 있게 되었다.As described above, by using the method of the present invention, the recombinant gene band and the endogenous gene band can be quantitatively identified as a result of more accurate and higher efficiency than the conventional GMO quantitative analysis method using real time PCR. There is an advantage that can be directly quantified by visual confirmation. Efficiency can be expected even more in terms of initial equipment investment, equipment maintenance costs and economics.

<110> PARK Han Oh;BIONEER CORPORATION <120> Quantative analysis method using in analyzing mingled ratio of genetically modified organisms and thereof primers <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on pUC 19 <400> 1 gcctttttac ggttcctggc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on pUC 19 <400> 2 ttccgcttcc tcgctcact 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline synthase gene <400> 3 gaatcctgtt gccggtcttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline synthase gene <400> 4 ttatcctagt ttgcgcgcta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline synthase gene <400> 5 gaatcctgtt gccggtcttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline synthase gene <400> 6 ttatcctagt ttgcgcgcta 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterim tumefaciens CP4 lectin gene <400> 7 accaaatcca cacatcggaa t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 lectin gene <400> 8 gaagcaaaag accaagaaag ca 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 lectin gene <400> 9 gaaaacaata aagtagccaa gg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 lectin gene <400> 10 agaaccctat cctcacccac tc 22 <110> PARK Han Oh; BIONEER CORPORATION <120> Quantative analysis method using in analyzing mingled ratio of          genetically modified organisms and Julia primers <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on pUC 19 <400> 1 gcctttttac ggttcctggc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on pUC 19 <400> 2 ttccgcttcc tcgctcact 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline          synthase gene <400> 3 gaatcctgtt gccggtcttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline          synthase gene <400> 4 ttatcctagt ttgcgcgcta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline          synthase gene <400> 5 gaatcctgtt gccggtcttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 nophaline          synthase gene <400> 6 ttatcctagt ttgcgcgcta 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterim tumefaciens CP4 lectin gene <400> 7 accaaatcca cacatcggaa t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 lectin          gene <400> 8 gaagcaaaag accaagaaag ca 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 lectin          gene <400> 9 gaaaacaata aagtagccaa gg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer based on Agrobacterium tumefaciens CP4 lectin          gene <400> 10 agaaccctat cctcacccac tc 22

Claims (5)

a) 일정한 유전자변형농산물 혼입률을 갖는 표준시료, 정량하고자하는 미지시료의 게놈 DNA를 주형으로 하여 유전자변형농산물에 특이적으로 나타나는 재조합 유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;a) PCR is carried out using a standard sample having a constant genetically modified agricultural product incorporation rate, a genomic DNA of an unknown sample to be quantified as a template, and a primer for detecting a recombinant gene and a primer for detecting an endogenous gene, which are specific to the genetically modified agricultural product. step; b) 상기 단계 a)와는 별도로 외부표준검체시료의 PCR을 수행하는 단계; b) performing PCR of an external standard sample separately from step a); c) 상기 a)와 b)로부터 증폭된 PCR 산물을 혼합하여 아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동하는 단계;c) mixing the PCR products amplified from a) and b) and electrophoresing on acrylamide gels; d) 외부표준검체로부터 나타나는 형광값을 이용하여 웰 사이의 형광값을 보정하고, 표준시료의 증폭산물 양으로 표준정량곡선을 작성하고, 표준정량곡선 대비 미지시료에 대한 증폭산물을 환산하여 미지시료의 유전자변형농산물의 혼입률을 산출하는 단계로 이루어지는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법. d) Correct the fluorescence value between the wells using the fluorescence value from the external standard sample, prepare a standard quantitative curve using the amount of amplified product of the standard sample, convert the amplified product for the unknown sample to the standard quantitative curve, and then unknown sample. Method of quantitatively analyzing the incorporation rate for genetically modified agricultural products comprising the step of calculating the incorporation rate of genetically modified agricultural products of. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 검출용 프라이머는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) CP4 유래의 NOS 터미네이터(nophaline synthase terminator) 유전자로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.The method of claim 1, wherein the recombinant detection primers are quantitatively analyzed for the incorporation rate for GM crops, characterized in that derived from the NOS terminator (NOphaline synthase terminator) gene derived from Agrobacterium tumefaciens CP4 How to. 제 1 항에 있어서, 상기 내재유전자 검출용 프라이머는 렉틴 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.The method of claim 1, wherein the endogenous gene detection primer is derived from a lectin gene. 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 유전자 검출용 프라이머는 서열번호 5(NOS-FP2) 와 6(NOS-RP2)인 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.The method of claim 2, wherein the recombinant gene detection primers are SEQ ID NOs: 5 (NOS-FP2) and 6 (NOS-RP2). 제 3 항에 있어서, 상기 내재 유전자 검출용 프라이머는 서열번호 9(Lectin-FP2)와 10(Lectin-RP2)인 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.The method of claim 3, wherein the primers for detecting the endogenous gene are SEQ ID NOs: 9 (Lectin-FP2) and 10 (Lectin-RP2).
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