KR100789731B1 - 2 617 Methods primers and kits for quantitative detection of JAK2 V617F mutants using pyrosequencing - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 야생형 1849G 및 돌연변이 1849G→T 타입 jak2 유전자의 염기서열을 나타낸 도면이고;1 shows the nucleotide sequences of wild type 1849G and mutant 1849G → T type jak2 genes;
도 2는 파이로시퀀싱을 수행하기 위하여 실시하는 중합효소연쇄반응의 조건을 도식적으로 나타낸 도면이며;2 is a diagram schematically showing the conditions of a polymerase chain reaction carried out to perform pyro sequencing;
도 3은 파이로시퀀싱을 수행하기 위하여 실시한 중합효소연쇄반응의 생성물을 1% 아가로스겔 전기영동하여 EtBr 용액으로 염색한 후 UV광 하에서 관찰한 결과를 보여주는 도면이고;Figure 3 is a view showing the results observed under UV light after staining with EtBr solution of the product of the polymerase chain reaction carried out to perform pyro sequencing 1% agarose gel electrophoresis;
도 4는 정상인 대조군(1849G 타입)을 이용하여 jak2 돌연변이에 대해 파이로시퀀싱을 수행한 결과를 나타낸 도면이며;4 shows the results of performing pyrosequencing on jak2 mutants using a normal control group (1849G type);
도 5는 만성골수증식성질환 환자 샘플(1849G→T 타입)을 이용하여 jak2 돌연변이에 대해 파이로시퀀싱을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.5 is a diagram showing the results of pyro sequencing of the jak2 mutant using a sample of chronic myeloproliferative disease patients (1849G → T type).
본 발명은 JAK2 V617F 돌연변이의 정량적 검출방법, 시발체(primers) 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 만성골수증식성질환(chronic myeloproliferative disorders, CMPD)을 비롯한 다양한 골수구성 혈액종양(myeloid hematological neoplasms)과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 JAK2 V617F 돌연변이를 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 이용하여 정량적으로 검출하는 방법, 시발체 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to quantitative detection methods, primers and kits of JAK2 V617F mutations, and more particularly, to various myeloid hematological neoplasms, including chronic myeloproliferative disorders (CMPD). The present invention relates to methods, primers and kits for quantitatively detecting JAK2 V617F mutations known to be closely associated with pyrosequencing.
야누스 키나아제 2(janus kinase 2; JAK2) 돌연변이는 엑손 12에서 1849G→T변이가 생겨 JAK2라는 신호전달물질의 617번 아미노산이 발린(valine)에서 페닐알라닌(phenylalanine)으로 치환된 V617F라는 돌연변이를 가리킨다. JAK2 돌연변이는 만성골수증식성질환 및 다양한 골수구성 혈액질환에서 유전자 변이의 양과 질환의 진행과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 JAK2 돌연변이의 검출은 상기 질환의 진단, 예후 및 치료경과 추정에 매우 중요하다.Janus kinase 2 (JAK2) mutation refers to a mutation called V617F in which an 1849G → T mutation occurs in exon 12 and 617 amino acid of JAK2 is substituted with phenylalanine in valine. JAK2 mutations are known to be closely related to the amount of genetic variation and disease progression in chronic myeloproliferative diseases and various myeloid blood diseases. Therefore, the detection of JAK2 mutations is very important for the diagnosis, prognosis, and treatment progress of the disease.
만성골수증식성질환 환자에서 JAK2를 검출하기 위한 방법으로는 대부분 다양한 DNA 서열분석 플랫폼을 이용하여 말초혈액 또는 골수의 정제된 과립구 분획 중 돌연변이 대립형질의 존재를 동정하는 것이 알려져 왔다. 나아가, 최근에는 실시간중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)에서 특정 시발체(primers)와 혼성화 탐침(probes)을 설계하여 라이트사이클러(LightCycler, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))에 의해 야생형 및 돌연변이 JAK2 대립형질을 구별하고 대조 세포주, 비분획화된 말초혈액 또는 골수 표본 및 보존된 진단재료로터 JAK2 V617F의 존재를 반정량적으로(semi-quantatively) 검출하는 방법이 제안된 바 있다(문헌 [Olsen et al., Detection of the JAK2 V617F Mutation in Myeloproliferative Disorders by Melting Curve Analysis Using the LightCycler System, Arch. Pathol. Lab. Med. 2006;130:997-1003]). 그러나 상기 방법은 JAK2 V617F의 반정량적 검출만 가능한 것으로서, JAK2 V617F의 정량적 검출에는 미흡한 방법이다. 또한, 정방향(forward) 시발체로서 5'-바이오틴-GAAGCAGCAAGTATGATGAGCA-3'(서열번호 1) 및 역방향(reverse) 시발체로서 5'-TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAA-3'(서열번호 2)를 사용하고 94 ℃ 7 분; 94 ℃ 30 초 변성, 58 ℃ 30 초 어닐링(annealing) 및 72 ℃ 30 초 연장의 50주기; 72 ℃ 7 분 1주기; 및 15 ℃에서 최종 유지의 조건 하에서 PCR을 수행한 후, 일본쇄 바이오티닐화된 PCR 산물을 서열분석(sequencing) 시발체 5'-TCTCGTCTCCACAGA-3'(서열번호 3)를 이용하여 파이로시퀀싱 반응을 수행하여 JAK2 V617F를 유전자형분석(genotyping) 및 대립형질 정량한 결과, 분류되지 않은 골수증식성질환(atypical or unclassified MPD, UC) 20%, 진성적혈구증다증(PV) 81%, 원발성혈소판증다증(ET) 41% 및 골수섬유화증(MF) 43%에서 JAK2 돌연변이를 정량적으로 검출하였다고 보고되어 있다(문헌 [Amy V. Jones et al, Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders, Blood First Edition Paper, prepublished online May 26, 2005]). 이 방법은 특히 진성적혈구증다증에서는 JAK2 돌연변이의 정량비율이 높지만, 분류되지 않은 골수증식성질환 및 골수섬유화증에서는 그 정량비율이 떨어지는 면이 있다.Most methods for detecting JAK2 in patients with chronic myeloproliferative diseases have been known to identify the presence of mutant alleles in purified granulocyte fractions of peripheral blood or bone marrow using various DNA sequencing platforms. Furthermore, in recent years, the design of specific primers and hybridization probes in real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) has led to the development of LightCycler, Roche Applied Science. A method for distinguishing wild-type and mutant JAK2 alleles and detecting the presence of JAK2 V617F from control cell lines, unfractionated peripheral blood or bone marrow specimens, and conserved diagnostic material by)) has been proposed. Olsen et al., Detection of the JAK2 V617F Mutation in Myeloproliferative Disorders by Melting Curve Analysis Using the LightCycler System, Arch. Pathol. Lab. Med. 2006; 130: 997-1003. However, the above method is capable of only semi-quantitative detection of JAK2 V617F, which is insufficient for quantitative detection of JAK2 V617F. Furthermore, 5'-Biotin-GAAGCAGCAAGTATGATGAGCA-3 '(SEQ ID NO: 1) as the forward primer and 5'-TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAA-3' (SEQ ID NO: 2) as the reverse primer were used at 94 DEG C for 7 minutes; 50 cycles of 94 ° C. 30 sec denaturation, 58 ° C. 30 sec annealing and 72 ° C. 30 sec extension; 1 cycle of 7 minutes at 72 ° C .; And performing PCR under conditions of final maintenance at 15 ° C., followed by pyro sequencing reaction using single-chain biotinylated PCR products using
본 발명자들은 JAK2 V617F 돌연변이를 비교적 쉽고, 민감하고 정확하게, 정량적으로 검출할 수 있는 새로운 방법을 개발하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 특정 조건 하에서 PCR을 수행하고 특정 서열의 서열분석 시발체를 이용하여 파이로시퀀싱 반응을 수행함으로써 상기 목적을 성공적으로 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The inventors have carried out ongoing studies to develop new methods that can detect JAK2 V617F mutations relatively easily, sensitively, accurately and quantitatively. As a result, it was confirmed that the above object can be successfully achieved by performing PCR under specific conditions and carrying out a pyro sequencing reaction using a sequencing primer of a specific sequence, thereby completing the present invention.
따라서 본 발명의 목적은 파이로시퀀싱 반응을 이용하여 JAK2 V617F 돌연변이를 정량적으로 검출하는 방법을 제공하기 위하 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a method for quantitatively detecting a JAK2 V617F mutation using a pyro sequencing reaction.
본 발명의 다른 목적은 상기 목적을 위해 사용되는 서열분석 시발체를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a sequencing primer used for this purpose.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열분석 시발체를 포함하는 JAK2 V617F 돌연변이의 정량적 검출키트를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a quantitative detection kit of JAK2 V617F mutation comprising the sequencing primer.
본 발명의 제1면은The first aspect of the present invention
1) 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 4의 역방향 시발체를 이용하여 추출된 총 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하고;1) performing a polymerase chain reaction (PCR) on the total DNA extracted using the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4;
2) 단계 1)에서 얻은 PCR 산물에 대해 서열번호 5의 서열분석 시발체를 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하는:2) Pyro sequencing the PCR product obtained in step 1) using the sequencing primer of SEQ ID NO: 5:
단계를 포함하는, 파이로시퀀싱에 의해 JAK2 V617F 돌연변이를 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, PCR은 95 ℃ 5 분 변성 후, 95 ℃ 15 초 변성, 62 ℃ 30 초 어닐링 및 72 ℃ 15 초 연장의 45주기를 거친 후, 95 ℃ 5 분간 최종 연장반응을 수행하는 것이 바람직하다.It relates to a method for quantitatively detecting a JAK2 V617F mutation by pyro sequencing, comprising the step. In the method according to the present invention, PCR undergoes a final extension reaction at 95 ° C. for 5 minutes after undergoing 45 cycles of 95 ° C. 5 minute denaturation, 95 ° C. 15 seconds denaturation, 62 ° C. 30 seconds annealing, and 72 ° C. 15 seconds extension. It is desirable to.
본 발명의 제2면은 서열번호 4의 염기서열을 갖는, 파이로시퀀싱에 의해 JAK2 V617F 돌연변이를 정량적으로 검출하기 위한 서열분석 시발체에 관한 것이다.The second aspect of the present invention relates to a sequencing primer for quantitatively detecting JAK2 V617F mutation by pyro sequencing, having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
본 발명의 제4면은The fourth aspect of the present invention
1) 각각 서열번호 1 및 4의 염기서열을 갖는, 파이로시퀀싱을 수행하기 위해 실시하는 PCR의 정방향 및 역방향 시발체; 및1) forward and reverse primers of PCR to perform pyro sequencing, having nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 4, respectively; And
2) 서열번호 5의 염기서열을 갖는, 파이로시퀀싱의 서열분석 시발체:2) Sequencing primer of pyro sequencing, having the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
를 포함하는, 파이로시퀀싱에 의해 JAK2 V617F 돌연변이를 정량적으로 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.It relates to a kit for quantitatively detecting a JAK2 V617F mutation by pyro sequencing comprising a.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서는, JAK2 V617F 돌연변이를 파이로시퀀싱에 의해 정량적으로 검출하기 위한 방법, 상기 방법에 사용하기 위한 시발체 및 키트를 제공함으로써, JAK2 유전자의 변이율을 조사하고 환자들의 임상상과 경과를 후향적으로 조사하여 연관관계를 분석하였다.In the present invention, by providing a method for quantitatively detecting a JAK2 V617F mutation by pyro sequencing, a primer and a kit for use in the method, to investigate the mutation rate of the JAK2 gene and to retrospectively examine the clinical course and progress of the patients. The relationship was analyzed by investigating.
본 발명에서는 제1단계로 DNA를 추출 및 시발체를 설계하고, 제2단계로 추출된 DNA 및 시발체를 함유하는 반응혼합물을 이용하여 PCR을 수행하며, 제3단계로 얻어진 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행한다.In the present invention, the DNA is extracted and the primer is designed in the first step, PCR is performed using the reaction mixture containing the DNA and the primer extracted in the second step, and pyro sequencing is performed with the PCR product obtained in the third step. Perform.
먼저, 서열번호 6 및 도 1에 나타낸 JAK2 서열로부터 시발체의 크기와 PCR 산물의 크기, GC 함량, Tm 등을 고려하여 하기 표 1에 나타낸 시발체를 설계하였다.First, the primers shown in Table 1 were designed in consideration of the size of the primers, the size of the PCR product, the GC content, the T m , and the like from SEQ.
또한, 파이로시퀀싱을 위한 PCR의 조성과 조건은 아래 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같다.In addition, the composition and conditions of PCR for pyro sequencing are as shown in Table 2 and FIG. 2 below.
상기 시발체, 및 PCR의 조성 및 조건을 이용하여 추출된 총 DNA에 대해 PCR을 수행하면, 120 bp의 PCR 산물이 생성된다(도 3 참조). 이 PCR 산물에 대해 아래 표 3 및 4에 나타낸 시약을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행한다(도 4 및 5 참조).PCR was performed on the primers and the total DNA extracted using the composition and conditions of the PCR, resulting in a 120 bp PCR product (see FIG. 3). Pyro sequencing is performed on this PCR product using the reagents shown in Tables 3 and 4 below (see FIGS. 4 and 5).
본 발명에 따르면, PCR로 증폭한 주형 DNA를 일본쇄로 만든 후 염기서열분석 시발체를 결합시킨다. 다음으로, DNA 중합효소, ATP 설퓨릴라아제(sulfurylase), 루시페라아제(luciferase) 및 어파이라아제(apyrase)의 4종의 효소와 함께 기질, 아데노신 5'-포스포설페이트(APS) 및 루시페린을 가하여 반응시킨다. 4개의 dNTP를 차례로 반응액에 가하면 그 중 특정 dNTP가 반응에 사용되어 DNA 중합효소에 의해 주형쇄를 따라 합성이 진행된다. 만약 주형에 상보적인 dNTP가 들어오면 혼합이 일어나면서 파이로포스페이트(PPi)가 방출되고, 그 양은 혼합되는 뉴클레오티드와 같은 개수이다. ATP 설퓨릴라아제는 반응액 내에 가한 APS와 PPi를 이용하여 ATP를 만들어내고 이 ATP는 루시페라아제를 활성화하여 루시페린을 옥시루시페린으로 바꾸면서 빛을 방출하게 된다. 이 때 방출되는 빛의 양은 ATP의 양과 비례하며, 결국 혼합에 사용된 dNTP의 양과 비례한다. 방출된 빛은 CCD 카메라에 의하여 검출되어 소프트웨어를 이용하여 프로그램으로 나타나게 된다. 빛 신호의 피크는 혼합된 뉴클레오티드와 비례하므로 혼합된 뉴클레오티드의 종류와 개수를 알아낼 수 있다. 어파이라아제는 뉴클레오티드를 분해하는 효소로서, 혼합되지 않은 dNTP와 ATP를 분해시킨다. 하나의 dNTP가 분해되면 다음의 dNTP를 반응액에 첨가한다. dNTP의 첨가는 한 번에 하나씩 이루어진다. 또한 dATP 대신 데옥시아데노신 알파-티오 트리포스페이트(deoxyadenosine alpha-thio triphosphate, dATPαS)를 사용한다. 그 이유는 DNA 중합효소의 반응에는 사용되면서 루시페라아제의 활성화에는 사용되지 않도록 하기 위함이다. 실험의 과정이 진행되면서 주형 DNA쇄에 상보적인 DNA쇄가 합성되면서 파이로그램(pyrogram)의 신호 피크로 나타나게 되어 각각의 서열을 분석할 수 있다. 파이로시퀀싱법은 15 분내에 시료의 동시 분석이 가능하여, 유전적 변이의 정량측정에 신속한 방법으로 이용될 수 있다.According to the present invention, the template DNA amplified by PCR is made into a Japanese chain, and then the sequencing primer is bound. Next, the reaction is performed by adding a substrate, adenosine 5'-phosphosulfate (APS) and luciferin together with four enzymes of DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, and apyrease. Let's do it. When four dNTPs are sequentially added to the reaction solution, specific dNTPs are used in the reaction, and the synthesis proceeds along the template chain by DNA polymerase. If dNTPs that are complementary to the template come in, mixing occurs to release pyrophosphate (PP i ), the amount of which is equal to the number of nucleotides to be mixed. ATP sulfurylase produces ATP using APS and PP i added to the reaction solution, which activates luciferase and emits light by converting luciferin into oxyluciferin. At this time, the amount of light emitted is proportional to the amount of ATP, which is in turn proportional to the amount of dNTP used for mixing. The emitted light is detected by the CCD camera and displayed as a program using software. Since the peak of the light signal is proportional to the mixed nucleotides, the type and number of the mixed nucleotides can be determined. Apyrase is an enzyme that breaks down nucleotides and breaks down unmixed dNTPs and ATPs. When one dNTP is decomposed, the next dNTP is added to the reaction solution. The addition of dNTPs is made one at a time. In addition, deoxyadenosine alpha-thio triphosphate (dATPαS) is used instead of dATP. The reason is that it is used for the reaction of the DNA polymerase but not for the activation of the luciferase. As the course of the experiment proceeds, the DNA strand complementary to the template DNA chain is synthesized, resulting in a signal peak of a pyrogram, and thus, each sequence can be analyzed. Pyro sequencing allows simultaneous analysis of samples within 15 minutes, which can be used as a rapid method for quantitative determination of genetic variation.
본 발명은 파이로시퀀싱을 통해 JAK2 V617F 돌연변이를 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 제공함으로써, 만성골수증식성질환을 비롯한 골수구성 혈액종양에 있어서 매우 중요한 진단적 의미를 가질 뿐 아니라, 질환의 예후, 치료경과 추정에 매우 중요하다.The present invention provides a method that can quantitatively analyze JAK2 V617F mutation through pyro sequencing, thereby having a very important diagnostic significance in myeloid blood tumors including chronic myeloproliferative diseases, Very important for estimating treatment progress.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples, which are only intended to help the understanding of the present invention, but are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
하기 실시예에서는, 각각 78명의 만성골수증식성질환 환자 및 20명의 건강한 대조군 검체로 파이로시퀀싱을 이용하여 JAK2 V617F 돌연변이를 정량적으로 검출하였다.In the following examples, JAK2 V617F mutations were quantitatively detected using pyro sequencing with 78 chronic myeloproliferative disease patients and 20 healthy control specimens, respectively.
실시예 1: DNA 추출 및 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 수행Example 1: Perform PCR to Perform DNA Extraction and Pyro Sequencing
JAK2 V617F 돌연변이의 정량적 검출을 위하여, 만성골수증식성질환 환자의 말초혈액 검체를 이용하여 DNA를 추출하였다(QIAamp DNA 혈액 미니 키트(QIAamp DNA Blood mini kit)). DNA 추출은 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 추출한 총 DNA의 농도를 20 ng/㎕로 희석하여 서열 5'-GAAGCAGCAAGTATGATGAGCA-3'(서열번호 1)의 정방향 시발체, 서열 5'-TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAA-3'(서열번호 4)의 역방향 시발체를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 10× PCR 완충액 5 ㎕[20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 0.5% 노니뎃(Nonidet) P-40, 50% 글리세롤], dNTP 400 M, 2.5 U Taq 중합효소(솔젠트(Solgent) F-Taq 키트), 시발체 10 pmoles, 3차 증류수 및 게놈 DNA 20 ng으로 총 20 ㎕ 반응으로 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5 분 변성 후 95 ℃ 15 초, 62 ℃ 30 초, 72 ℃ 15 초의 45 주기를 거친 후 최종 연장반응으로 95 ℃에서 5 분 반응시켰다. 반응생성물을 1% 아가로스겔 상에서 전기영동하여 에티디움브로마이드(EtBr) 용액으로 염색시킨 후 UV광 하에서 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었고, 120 bp 크기의 산물을 얻을 수 있었다.For quantitative detection of JAK2 V617F mutation, DNA was extracted using peripheral blood samples from patients with chronic myeloproliferative diseases (QIAamp DNA Blood mini kit). DNA extraction was performed according to the manufacturer's instructions. The concentration of the extracted total DNA was diluted to 20 ng / μl, and the PCR was performed using the forward primer of SEQ ID NO: 5'-GAAGCAGCAAGTATGATGAGCA-3 '(SEQ ID NO: 1) and the reverse primer of SEQ ID NO: 5'-TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAA-3' (SEQ ID NO: 4). The reaction was carried out. PCR was performed with 5 μl of 10 × PCR buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 50% glycerol ], dNTP 400 M, 2.5 U Taq polymerase (Solgent F-Taq kit),
실시예 2: 파이로시퀀싱 수행 Example 2: Performing Pyro Sequencing
PCR 생성물 20 ㎕에 멸균된 3차 증류수 20 ㎕를 첨가하여(총 40 ㎕) 스트렙타비딘 세파로즈 비드(streptavidin sepharose beads)™ 혼합물 40 ㎕와 고정화시켰다. 염기서열분석(sequencing) 시발체 혼합물을 준비하여 40 ㎕씩 플레이트 로우(plate low)에 분주해놓았다. 10 분 경과 후 PCR 생성물이 담긴 플레이트와 플레이트 로우를 PSQ 워크테이블(worktable)로 옮겼다. 스트렙타비딘 비드와 고정된 PCR 생성물을 세정하기 위하여 진공을 이용하여 탐침을 스트렙타비딘 비드와 고정된 생성물, 70% 에탄올, 0.2 N NaOH, 1×PSQ 세척완충액 순으로 5 초씩 담구었다가 5 초씩 들어서 말렸다. 시간 경과 후 PSI를 끈 후 탐침을 플레이트 로우에 놓고 스트렙타비딘 비드와 고정된 생성물을 털어내고, 바로 95 ℃에서 1 분 동안 반응시켰다. 파이로시퀀싱 기계를 켠 후 프로그램을 시작하여 기질 혼합물, 뉴클레오티드(dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP)(키트 바이오티지(kit Biotage))를 확인한 후 카트리지에 분주하여 러닝하였다. 중합반응 시 ４개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs)를 한 번에 하나씩 순차적으로 넣어서 반응시켰다. 중합반응되는 dNTP에 붙어 있는 PPi(inorganic pyrophosphate)는 효소에 의한 반응으로 빛을 발생한다. 발생된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 dNTP의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 그 피크는 각각의 dNTP가 반응한 수에 비례하여 높아지고 낮아지는 패턴을 나타낸다.20 µl of sterile tertiary distilled water was added to 40 µl of PCR product (40 µl total) to immobilize with 40 µl of Strepptavidin sepharose beads ™ mixture. A sequencing primer mixture was prepared and aliquoted into plate low at 40 μl. After 10 minutes the plates and plate rows containing the PCR product were transferred to the PSQ worktable. In order to clean the streptavidin beads and the immobilized PCR product, the probe was immersed in vacuum for 5 seconds in the order of streptavidin beads and the immobilized product, 70% ethanol, 0.2 N NaOH, and 1 × PSQ wash buffer. Lifted up and dried After the passage of time, after turning off the PSI, the probe was placed in a plate row, and the streptavidin beads and the immobilized product were shaken off and immediately reacted at 95 ° C. for 1 minute. After turning on the pyro sequencing machine, the program was started to identify the substrate mixture, nucleotides (dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP) (kit Biotage), and then dispensed into cartridges to run. In the polymerization reaction, four deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) were added one at a time and reacted. PP i (inorganic pyrophosphate) attached to the polymerized dNTP generates light by an enzyme reaction. The generated light shows signal peaks in the order of reaction of each dNTP that is sequentially entered, and the peak shows a pattern of rising and falling in proportion to the number of reactions of each dNTP.
그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다. 78명의 골수증식성질환 환자와 20명의 건강한 대조군 샘플로 상기 실험을 수행한 결과, 진성적혈구증다증에서 77%, 원발성혈소판증다증에서 26%, 골수섬유화증에서 100%, 분류되지 않은 골수증식성 질환에서 67%, 총 53% JAK2 변이를 정량적으로 검출할 수 있었다. 반면에 정상인 대조군에서는 모두 JAK2 돌연변이는 없는 것으로 판명되었다. The results are shown in FIGS. 4 and 5. The test was performed with 78 patients with myeloproliferative disease and with 20 healthy control samples, 77% for true thrombocytopenia, 26% for primary thrombocytopenia, 100% for myelofibrosis, and for unclassified myeloproliferative diseases. 67% and 53% of total JAK2 mutations could be detected quantitatively. In contrast, none of the normal controls were found to have JAK2 mutations.
본 발명에 따르면, 파이로시퀀싱에 의해 JAK2 V617F 돌연변이를 비교적 쉽고, 민감하고 정확하게, 정량적으로 검출할 수 있으며, 재현성이 좋고 시간과 비용이 절약되므로, 만성골수성질환을 비롯한 다양한 골수구성 혈액질환, 특히 분류되지 않은 골수증식성질환 및 골수섬유화증에 있어서 진단, 예후, 치료경과 추정 등에 매우 중요한 의미를 갖는다.According to the present invention, pyro sequencing can detect JAK2 V617F mutations relatively easily, sensitively, accurately and quantitatively, and is reproducible and saves time and money. Therefore, various myeloid blood diseases, including chronic myeloid diseases, particularly In myeloproliferative diseases and myelofibrosis, which have not been classified, they have a very important meaning in diagnosis, prognosis, and treatment history estimation.
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