KR100789272B1 - - - A microorganism of corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 불활성화되어 있고, 라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다. The present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium in which the intrinsic NCBI grant No. NCgl2567 gene is inactivated and produces lysine, and a method for producing L-lysine using the same.
코리네박테리움, 라이신 Corynebacterium, Lysine
Description
도 1은 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자 단편이 클로닝된 pCR-△2567 벡터를 나타내는 도면이다. 1 is a diagram showing a pCR-Δ2567 vector in which the NCBI grant number NCgl2567 gene fragment was cloned.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5113의 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 한 결과를 나타내는 도면이다.Fig. 2 is a diagram showing the results of PCR using oligonucleotides having nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 as primers, using the chromosome of Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5113 as a template.
본 발명은 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a microorganism of the genus Corynebacterium having improved L-lysine production capacity and a method for producing L-lysine using the same.
코리네박테리움 속 균주 (Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 약 제산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주의 발효에 의해 생성되고 있다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.The genus Corynebacterium strain (Corynebacterium), in particular Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum ) is a gram-positive microorganism that is widely used for L-amino acid production. L-amino acids, in particular L-lysine, are used in animal feed, human medicine and drug industry and are produced by fermentation of Corynebacterium strains. Thus, since the production of L-amino acid using the Corynebacterium strain is important, many attempts have been made to improve the production method thereof.
그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정유전자를 파괴시키거나 감쇠발현시킴으로써 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 예를 들면, 미국특허 제6,872,553호에는 a) 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나제 (pck)를 코딩하는 DNA가 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 넌센스 돌연변이의 삽입을 갖는 전이 (transition) 또는 전환 (transversion) 돌연변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 돌연변이 방법 중 하나의 방법에 의하여 감쇄되어 있거나, 감쇄되지 않은 코리네박테리움에 비하여 상기 폴리펩티드의 활성이 감소된 코리네박테리움을 성장시키는 단계; b) 배지 또는 상기 박테리아의 세포 중에 원하는 L-아미노산 산물을 농축하는 단계; 및 c) 상기 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움의 L-라이신을 발효에 의하여 제조하는 방법이 개시되어 있다. Among them, there has been a study to improve L-amino acid producing Corynebacterium strain by destroying or attenuating specific genes using recombinant DNA technology. For example, US Pat. No. 6,872,553 discloses a) a deletion mutation in which a DNA encoding phosphoenolpyruvate (PEP) carboxykinase (pck) has an insertion mutation by insertion of one or more base pairs, a deletion of one or more base pairs. And activity of the polypeptide relative to Corynebacterium attenuated or undamped by one of the mutation methods selected from the group consisting of transition or transversion mutations with insertion of nonsense mutations. Growing this reduced Corynebacterium; b) concentrating the desired L-amino acid product in the medium or cells of said bacteria; And c) separating the L-amino acid, a method of producing L-lysine of Corynebacterium by fermentation is disclosed.
또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다 (Eggeling, Amino Acids 6, 261-272 (1994)). 또한, 다른 박테리아 유래의 외래 유전자를 도입하는 경우도 있다. 예를 들면, 일본 특개평 제7-121228호에는 미생물의 시트르산 신타제의 합성에 관여하는 유전 정보를 갖는 DNA 단편과 벡터 DNA의 재조합체 DNA를 보유하는 코리네박테리움 속 또는 브레비박 테리움 속에 속하는 미생물을 배양하고, 배양물 중에 L-글루타민산 및 L-프롤린산을 제조하는 방법이 개시되어 있다. In addition, many studies have been conducted to amplify genes related to L-amino acid biosynthesis and to study the effects on L-amino acid production and to improve L-amino acid producing Corynebacterium strains (Eggeling,
그러나, 상기한 종래 방법에 의하더라도 여전히 L-라이신의 생산능이 향상된 균주는 여전히 요구되고 있다.However, even by the conventional method described above, there is still a need for strains with improved production capacity of L-lysine.
본 발명의 목적은 L-라이신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium with improved production capacity of L-lysine.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing L-lysine using the microorganism.
본 발명은 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 불활성화되어 있고, 라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다. The present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium in which the endogenous NCBI license number NCgl2567 gene is inactivated and produces lysine.
본 발명에 있어서, 상기 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 유전자로서, 전사조절인자로 알려져 있다. 상기 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈의 완전한 서열 분석으로부터 그 활성이 예측된 것이다. In the present invention, the endogenous NCBI grant No. NCgl2567 gene is a gene inherently present in a microorganism of the genus Corynebacterium, and is known as a transcriptional regulator. The gene is predicted for its activity from the complete sequence analysis of the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
본 발명에 있어서, "NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자"란 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주 유래의 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것뿐만 아니라, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물에 존재하는 유전자로서 상기 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자 산물과 실질적으로 동일한 산물을 발현하는 유전자를 말한 다. 본 발명에 있어서, "실질적으로 동일"이란 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자 산물과 동일한 종류의 활성 및 조절 기작을 갖는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는, NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자이다. In the present invention, the "NCBI grant number NCgl2567 gene" is a gene present in the microorganism belonging to the genus Corynebacterium, as well as having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from the Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain. NCBI Grant No. NCgl2567 refers to a gene that expresses a product that is substantially the same as the gene product. In the present invention, "substantially identical" refers to having the same kind of activity and regulatory mechanisms as the NCBI license number NCgl2567 gene product. In the present invention, preferably, the NCBI grant No. NCgl2567 gene is a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에 있어서, 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 불활성화된 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the microorganism of the genus Corynebacterium in which the endogenous NCBI granting number NCgl2567 gene is inactivated is Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium Glutamicum KFCC 10881, and Corynebacterium glutamicum KFCC 11001, but is not limited to these examples.
본 발명에 있어서, 상기 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 불활성화란 상기 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 유전자 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미한다. In the present invention, the deactivation can be made by any deactivation method known in the art. In the present invention, inactivation means that the expression of the NCBI license number NCgl2567 gene is reduced to a lower level than that of the wild strain, or a gene which is not expressed at all, or a gene having no activity or a reduced expression, even when expressed. .
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 상기 불활성화는 상기 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이 (transition) 또는 전환 (transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 의하여 불활성화된 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, in the microorganism of the present invention, the inactivation is an insertion mutation by insertion of one or more base pairs into the NCBI grant number NCgl2567 gene, a deletion mutation having a deletion of one or more base pairs in the gene, and It may be inactivated by one or more mutations selected from the group consisting of transition or transition mutations of base pairs that introduce nonsense codons in the gene.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 상기 불활성화는 상기 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자의 일부분과 항생제 마커를 포함하는 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시키고, 상기 항생제의 존재하에서 배양하여 선발되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 서열번호 2의 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자 단편을 포함하는 pCR-△2567 벡터이다. 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 상기 미생물에 형질전환하고, 선발 마커 산물의 존재 하에서 배양하는 경우 상기 유전자의 일부 서열과 상기 미생물 내의 내재적 유전자와 상동 재조합을 일으킨다. 상기 상동 재조합에 의하여 상기 미생물 내의 상기 내재적 유전자는 재조합되고, 재조합된 유전자 중에서 상기 마커를 포함하는 재조합체만이 선발 마커에 의하여 선발되게 된다. 그 결과, 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 얻을 수 있다. 그러나, 본원의 균주를 얻는 방법은 이러한 상동 재조합 방법에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the inactivation in the microorganism of the present invention transforms a vector comprising a portion of the NCBI license number NCgl2567 gene and an antibiotic marker to a microorganism of the genus Corynebacterium, in the presence of the antibiotic Can be selected by culturing. Preferably, the vector is a pCR-Δ2567 vector comprising the NCBI clearance number NCgl2567 gene fragment of SEQ ID NO: 2. When a vector comprising a partial sequence of the gene is transformed into the microorganism and cultured in the presence of a selection marker product, homologous recombination occurs with a partial sequence of the gene and an endogenous gene in the microorganism. The endogenous gene in the microorganism is recombined by the homologous recombination, and only the recombinant including the marker among the recombinant genes is selected by the selection marker. As a result, it is possible to obtain a microorganism of the genus Corynebacterium in which the endogenous NCBI grant number NCgl2567 gene is inactivated. However, the method of obtaining the strains herein is not limited to such homologous recombination methods, and any method known in the art may be used.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5113 (KCCM-10704P)이다. In one embodiment of the invention, the microorganism of the invention is Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5113 (KCCM-10704P).
본 발명은 또한, 본 발명의 미생물을 배양하여 배양물 또는 세포 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및 The present invention also comprises the steps of culturing the microorganism of the present invention to produce L-lysine in culture or cells; And
배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.Provided is a method for producing L-lysine, comprising recovering L-lysine from the culture.
본 발명의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알 려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 코리네박테리아 균주 배양을 위하여 사용될 수 있는 배지로는 예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개시된 배지가 사용될 수 있다. 배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.In the method of the present invention, the culture of the microorganism of the genus Corynebacterium may be used any culture conditions and culture methods known in the art. As a medium that can be used for culturing Corynebacteria strains, for example, a medium disclosed in Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) can be used. Sugar sources that may be used in the medium include glucose and saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, sugars and carbohydrates such as cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil and the like, palmitic acid, stearic acid Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture. Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture. Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or salts containing the corresponding sodium. In addition, the culture medium should contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth. Finally, in addition to the above substances, essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used. In addition, suitable precursors to the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 바람직하게는, 10 내지 160 시간이다.Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture. In addition, antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation. Inject oxygen or oxygen-containing gas (eg, air) into the culture to maintain aerobic conditions. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C. Incubation time may continue until the desired amount of L-amino acid is obtained, but is preferably 10 to 160 hours.
본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. In the method of the present invention, the culturing may be continuous or batchwise, such as batch processes, infusion batches and repeated infusion batch processes. Such cultures are well known in the art, and any method may be used.
L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의하여 분리되고 분석될 수 있다. L-amino acids can be separated and analyzed by anion exchange chromatography and subsequent ninhydrin derivatization.
본 발명자들은 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 라이신 생산 균주가 라이신을 생합성하는 데 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물 중의 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자를 불활성화시켜 라이신 생산량을 측정하였으며, 실제로 라이신 생산성이 향상되는 것을 확인하였다. The inventors have identified how the NCBI license number NCgl2567 gene affects the biosynthesis of lysine producing strains. The present inventors inactivated the intrinsic NCBI grant No. NCgl2567 gene in Corynebacterium sp. Microorganisms to measure lysine production and confirmed that lysine productivity was improved.
본 발명의 균주가 증가된 라이신 생합성 능력을 갖는 것은 다음과 같은 기작에 의한 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명이 이러한 특정한 기작에 의한 것에 한정되는 것은 아니다.It is believed that the strain of the present invention has increased lysine biosynthesis capacity due to the following mechanism. However, the present invention is not limited to this specific mechanism.
대장균의 아미노산, 단백질, 펩티드 등의 구성 물질 중 가장 많은 비율을 차지하는 아미노산은 루신이다. 이 루신에 의해 세포 내의 아미노산 생합성에 관련된 신호를 인지하고, 그에 따라 대장균 유전자의 10%에 달하는 유전자들의 전사를 조절하는 루신 반응성 조절 단백질 (leucine responsive regulatory protein: lrp)이 존재한다는 것이 알려져 있다. 상기 lrp는 대사과정의 상위 조절인자로서, 아미노산 생합성과 분해, 필리 (pili) 합성, 대산 산물의 수송, 및 탄소 대사 과정 등에 관련하는 유전자와 오페론의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Molecular Microbiology, 48(2003), 287-294). 본 발명에서 불활성화된 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자는 상기 대장균의 lrp 단백질과 약 33%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것으로, NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자는 라이신의 생합성에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 과정의 상위 조절인자로서 기능할 것이라는 추정하였다. 따라서, 라이신의 생합성에 관련되는 상위 조절인자인 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자를 불활성화시킴으로써, 본 발명의 균주는 라이신 생합성 능력이 향상된 것으로 여겨진다. Leucine is the most common amino acid among the components of E. coli amino acids, proteins, peptides and the like. It is known that leucine has a leucine responsive regulatory protein (lrp) that recognizes signals related to amino acid biosynthesis in cells and thus regulates transcription of genes up to 10% of the E. coli gene. The lrp is a higher regulator of metabolism, and it is known to regulate the expression of genes and operons related to amino acid biosynthesis and degradation, pili synthesis, product transport, and carbon metabolism processes (Molecular Microbiology, 48). (2003), 287-294). The NCBI licensed NCgl2567 gene inactivated in the present invention has an amino acid sequence homology of about 33% with the lrp protein of E. coli, and the NCBI licensed NCgl2567 gene differs from the process of regulating the expression of genes related to the biosynthesis of lysine. It was assumed that it would function as a regulator. Thus, by inactivating the NCBI clearance number NCgl2567 gene, a higher regulator involved in the biosynthesis of lysine, the strain of the present invention is believed to have enhanced lysine biosynthetic capacity.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
이하의 실시예에서는 상기한 바와 같은, 라이신의 존재하에서 발현이 유도되는 것으로 밝혀진 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 라이신의 생산에 미치는 영향을 확인하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자를 불활성화시키고, 배양하여 라이신의 생산량을 측정하였다. In the following examples, the intrinsic NCBI permission number of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 to confirm the effect of the NCBI license number NCgl2567 gene, which was found to be induced in the presence of lysine, to the production of lysine as described above. The NCgl2567 gene was inactivated and cultured to determine the amount of lysine produced.
실시예Example 1: One: 코리네박테리움 속In the Corynebacterium 미생물의 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자를 불활성화시키기 위한 벡터 제작 Construction of a vector to inactivate the intrinsic NCBI clearance number NCgl2567 gene of a microorganism
본 실시예에서는 상기 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자의 일부 서열 및 항생제 마커를 포함하는 벡터를 제조하고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환하고, 항생제의 존재하에서 배양하여 상동 재조합에 의하여 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자를 불활성화시켰다.In this embodiment, a vector comprising a partial sequence of the NCBI license number NCgl2567 gene and an antibiotic marker is prepared, transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, cultured in the presence of antibiotics, and intrinsic by homologous recombination. NCBI clearance number NCgl2567 gene was inactivated.
(1) NCBI 허가번호 (1) NCBI clearance number NCgl2567NCgl2567 유전자의 증폭 Gene amplification
먼저, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여, 서열번호 1의 501bp의 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자를 증폭하였다. PCR은 변성 96℃에서 30초, 어닐링 48℃에서 30초, 중합 72℃에서 30초를 30회 반복하였다. 증폭된 산물을 TOPO 클로닝 키트 (Invitrogen 사, 미국)를 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1 (Invitrogen 사, 미국)에 라이게이션하여 pCR-2567 벡터를 제작하였다. First, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4 were used as primers, and PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template to amplify the NCBI clearance number NCgl2567 gene of 501 bp of SEQ ID NO: 1. . PCR was repeated 30 times at denaturation 96 degreeC, 30 second at annealing 48 degreeC, and 30 second at 72 degreeC of polymerization. The amplified product was ligated to E. coli plasmid pCR2.1 (Invitrogen, USA) using the TOPO cloning kit (Invitrogen, USA) to prepare a pCR-2567 vector.
(2) NCBI 허가번호 (2) NCBI license number NCgl2567NCgl2567 유전자의 단편 및 그를 포함하는 벡터의 제작 Fragments of genes and construction of vectors comprising them
다음으로, NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자의 양끝 부위가 제거된 유전자 단편, 즉 14번 뉴클레오티드 내지 493 뉴클레오티드 영역인 △NCgl2567 단편을 제작하기 위하여 서열번호 5와 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 다음으로, 서열번호 5와 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 위에서 제작된 pCR-2567 벡터를 주형으로 한 PCR을 통하여 △NCgl2567 단편을 증폭하였다. PCR은 변성 96℃에서 30초, 어닐링 48℃에서 30초, 중합 72℃에서 30초를 30회 반복하였다. 증폭된 △NCgl2567 단편을 TOPO 클로닝 키트 (Invitrogen 사, 미국)를 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1 (Invitrogen 사, 미국)에 라이게이션하여 pCR-△2567 벡터를 제작하였다. Next, oligonucleotide primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 5 and 6 were designed to produce gene fragments in which both ends of the NCBI granting number NCgl2567 gene were removed, that is, the ΔNCgl2567 fragment, which is a region of 14 to 493 nucleotides. Next, ΔNCgl2567 fragments were amplified by PCR using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 as primers and the pCR-2567 vector prepared above as a template. PCR was repeated 30 times at denaturation 96 degreeC, 30 second at annealing 48 degreeC, and 30 second at 72 degreeC of polymerization. The amplified ΔNCgl2567 fragment was ligated to E. coli plasmid pCR2.1 (Invitrogen, USA) using the TOPO cloning kit (Invitrogen, USA) to prepare a pCR-Δ2567 vector.
도 1은 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자 단편이 클로닝된 pCR-△2567 벡터를 나타내는 도면이다. 1 is a diagram showing a pCR-Δ2567 vector in which the NCBI grant number NCgl2567 gene fragment was cloned.
실시예Example 2: 2: 코리네박테리움Corynebacterium 글루타미쿰Glutamicum KFCC10881KFCC10881 의 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 Of the inherent NCBI clearance number NCgl2567 불활성된Deactivated L-라이신 L-lysine 생산균주Production strain 제작 making
Appl. Microbiol. Biotechnol.(1999) 52:541-545에 개시된 형질전환법을 이용하여, 실시예 1에서 제작한 pCR-△2567 플라스미드를 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 전기펄스법으로 형질전환하였다. Appl. Microbiol. Using the transformation method disclosed in Biotechnol. (1999) 52: 541-545, the pCR-Δ2567 plasmid prepared in Example 1 was transferred to L-lysine producing strain Corynebacterium glutamicum KFCC10881 by electric pulse method. Transformed.
다음으로, 형질전환된 균주를 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 배양하였다. 그 결과, 상동 재조합에 의한 교차 (cross-over)에 의하여 pCR-△2567 플라스미드가 게놈상으로 삽입되어 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자의 기능이 상실된 형질전환 균주를 획득하고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5113으로 명명하였다. Next, the transformed strains were cultured in selection medium containing 25 mg / L of kanamycin. As a result, a pCR-Δ2567 plasmid was inserted into the genome by cross-over by homologous recombination to obtain a transformed strain in which the function of the intrinsic NCBI grant number NCgl2567 gene was lost, and this was corynebacterium glutami Qum KFCC10881-CJP5113.
KFCC10881-CJP5113 균주를 확인하기 위해 균주 내 염색체를 주형으로 한 PCR을 통해서 변성 96 ℃에서 30초, 어닐링 48 ℃에서 30초, 중합 72 ℃에서 30초를 30 회 반복하였다. pCR2.1 (Invitrogen 사, 미국) 플라스미드 영역에 대한 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 NCgl2567 유전자 영역에 대한 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 프라이머로 사용하였으며, 상동 재조합에 의해 pCR-△2567 플라스미드가 게놈상으로 삽입된 균주만이 500 bp의 크기를 갖는 PCR 산물이 증폭되었다. 도 2는 코 리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5113의 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에서, M은 크기 마커이며, 1, 5, 6, 7 및 8 레인은 KFCC10881-CJP5113에 대한 결과이며, 2, 3 및 4 레인은 pCR-△2567 플라스미드가 게놈상으로 삽입되지 않은 위 양성 KFCC10881-CJP5113에 대한 결과이며, 9 레인은 KFCC10881에 대한 결과이다. In order to identify the KFCC10881-CJP5113 strain, 30 seconds at denaturation 96 ° C., 30 seconds at annealing 48 ° C., and 30 seconds at 72 ° C. were repeated 30 times by PCR using a chromosome as a template. Oligonucleotide primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 for the plasmid region of pCR2.1 (Invitrogen, USA) and oligonucleotide primers having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 for the NCgl2567 gene region were used as primers. Only the strain into which the pCR-Δ2567 plasmid was inserted into the genome was amplified by a PCR product having a size of 500 bp. Fig. 2 is a diagram showing the results of PCR using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 as primers using the chromosome of Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5113 as a template. In FIG. 2, M is the size marker,
실시예Example 3: 3: 코리네박테리움Corynebacterium 글루타미쿰Glutamicum KFCC10881KFCC10881 -- CJP5113CJP5113 을 이용한 라이신 생산Production of Lysine
실시예 2에서 얻어진 코리네박테리아 글루타니쿰 KFCC10881-CJP5113 균주를 배양하여 L-라이신을 생산하였다. L-lysine was produced by culturing the Corynebacterium glutanicum KFCC10881-CJP5113 strain obtained in Example 2.
먼저, 하기의 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC10881과 KFCC10881-CJP5113을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 얻어진 종 배양액 1 mL를 하기의 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 접종하고 30 ℃에서 120 시간 동안 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 및 KFCC10881-CJP5113 균주의 상대적 L-라이신의 염산염의 생산량은 다음 표 1과 같았다. First, Corynebacterium glutamicum parent strains KFCC10881 and KFCC10881-CJP5113 were inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the following species medium, and incubated with stirring at 200 rpm for 20 hours at 30 ° C. 1 mL of the obtained seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the following production medium and incubated with stirring at 200 rpm for 30 hours at 30 ° C. After the incubation, the yield of L-lysine was measured by HPLC (Waters 2478). As a result, the relative L-lysine hydrochloride production of Corynebacterium glutamicum KFCC10881 and KFCC10881-CJP5113 strains were as shown in Table 1 below.
표 1.Table 1.
* 모균주인 KFCC10881의 생산량을 100으로 하였을 때의 상대적 생산량임.* Relative yield when the yield of parent strain KFCC10881 is set at 100.
종 배지 (Species badge ( pHpH 7.0): 7.0):
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO47H2O 0.5 g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (공정수 1 리터 기준)20 g raw sugar, 10 g peptone, 5 g yeast extract, 1.5 g urea, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, biotin 100 μg, thiamine HCl 1000 μg, calcium- 2000 μg pantothenic acid, 2000 μg nicotinamide (based on 1 liter of process water)
생산 배지 (Production badges ( pHpH 7.0): 7.0):
원당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5g, 콘스팁 고체 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO47 H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (공정수 1리터 기준)100 g per crude, 40 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.5 g soy protein, 5 g Corn Steep Solids, 3 g Urea, 1 g KH 2 PO 4 , 0.5 g MgSO 4 7 H 2 O, 100 μg biotin, 1000 μg thiamine hydrochloride, 2000 μg calcium-pantothenic acid, 3000 μg nicotinamide, 30 g CaCO 3 (based on 1 liter of process water)
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KFCC10881-CJP5113 균주는 모균주인 KFCC10881에 비하여 라이신 생산성이 더 우수함을 알 수 있다. As shown in Table 1, the KFCC10881-CJP5113 strain of the present invention can be seen that the lysine productivity is superior to the parent strain KFCC10881.
본 발명자들은 상기한 실시예에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5113 균주를 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2005년 11월 16일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCCM-10704P). The present inventors deposited the Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5113 strain produced in the above-mentioned example on November 16, 2005 to the Korea Microorganism Conservation Center, an international depository institution under the Budapest Treaty (Accession No. KCCM-10704P). .
본 발명의 미생물에 의하면, 내재적 NCBI 허가번호 NCgl2567 유전자가 불활 성화되어 있어 L-라이신 생산 능력이 향상되어 있다.According to the microorganism of the present invention, the intrinsic NCBI permission number NCgl2567 gene is inactivated, thereby improving L-lysine production ability.
본 발명의 방법에 의하면, L-라이신을 높은 생산성으로 생산할 수 있다. According to the method of the present invention, L-lysine can be produced with high productivity.
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