KR100788439B1 - A New Gene Controlling the Development and Growth of Root and Root Hairs and A Transformed Plant by the Gene - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뿌리털의 발달을 유도하는 유전자 및 상기 유전자를 이용한 형질전환 식물체가 뿌리 및 뿌리털의 생장이 촉진되며 양분의 흡수 능력을 향상 시킨다는 것이다. 상기 유전자는 식물체의 뿌리에서만 발현되고 뿌리 및 뿌리털의 신장을 유도하는 기능을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.The present invention is a gene that induces the development of root hairs and transgenic plants using the genes promote the growth of roots and root hairs and improve the absorption ability of nutrients. The gene is expressed only in the root of the plant and has a function of inducing elongation of the root and root hair, and relates to a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a gene encoding the same.
본 발명을 통하여 뿌리 및 뿌리털의 발달과 생장을 촉진하여 식물체의 양분의 흡수 능력이 월등히 향상된 식물체를 개량할 수 있다.Through the present invention, by promoting the development and growth of roots and root hairs can be improved plants with significantly improved absorption ability of the nutrients of the plant.
OsCSLD1, 뿌리털, 벼, cellulose synthase D group OsCSLD1, root hair, rice, cellulose synthase D group
Description
도 1a 및 b는 본 발명에 의한 OsCSLD1의 cDNA 염기서열 및 단백질 아미노산 서열.1a and b are cDNA nucleotide sequence and protein amino acid sequence of OsCSLD1 according to the present invention.
도 2는 본 발명에 의한 변이체 OsCSLD1::Ds 대립인자의 염색체상의 구조를 보여주는 개념도.Figure 2 is a conceptual diagram showing the chromosome structure of the variant OsCSLD1 :: Ds allele according to the present invention.
도 3은 식물체의 각 조직에서 본 발명에 의한 유전자가 발현되는 양상을 보여주는 Northern hybridization 결과사진.Figure 3 is a picture of Northern hybridization results showing the expression of the gene according to the invention in each tissue of the plant.
도 4는 본 발명에 의한 유전자가 뿌리털에서 발현됨을 간접적으로 보여주는 GUS 염색 결과사진.Figure 4 is a GUS staining results indirectly showing that the gene according to the present invention is expressed in the root hair.
도 5는 본 발명에 의한 유전자가 세포 수준에서 발현되는 양상을 보여주는 현미경 사진.5 is a micrograph showing the expression of the gene according to the present invention at the cellular level.
도 6은 정상 식물체와 본 발명에 의한 변이체의 뿌리발달을 보여주는 비교사진.Figure 6 is a comparison picture showing the root development of the normal plant and the variant according to the present invention.
도 7은 정상 식물체와 본 발명에 의한 변이체의 뿌리털 발달을 보여주는 비 교사진.7 is a non-teacher showing the development of the root hair of the normal plant and the variant according to the present invention.
도 8은 정상 식물체와 본 발명에 의한 변이체의 뿌리털 발달을 보여주는 전사전자현미경 사진.8 is a transcription electron micrograph showing the root hair development of the normal plant and the variant according to the present invention.
도 9은 본 발명에 의한 과발현 벡터의 개념도.9 is a conceptual diagram of an overexpression vector according to the present invention;
도 10은 OsCSLD1 과발현 형질전환체가 정상적인 식물체에 비해 뿌리털 길이가 훨씬 길어진 것을 보여 주는 사진.Figure 10 is a photograph showing that the root hair length is much longer than the normal plants OsCSLD1 overexpressing transformants.
도 11은 OsCSLD1 과발현 형질전환체가 양분 특히 미량원소의 흡수능력이 향상되는 것을 보여주는 도표.11 is a diagram showing that the OsCSLD1 overexpressing transformant improves the ability to absorb nutrients, especially trace elements.
본 발명은 뿌리털의 발달을 유도하는 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 식물체에서 뿌리 및 뿌리털의 신장과 양분과 수분의 흡수 능력을 향상 시킬 수 있는 방법 및 그에 의해 제작된 식물체에 관한 것이다.The present invention relates to a gene for inducing the development of root hairs and a method for improving the ability to absorb the nutrients and moisture of the roots and root hairs in plants using the genes and plants produced therefrom.
뿌리의 1차 조직은 가장 바깥에서부터 가장 안쪽으로 표피·피층·관다발의 순으로 이루어져 있다. 표피는 얇은 세포벽이 있는 세포로 이루어져 있으며 대개 하나의 세포층으로 되어 있다. 물과 무기염류의 흡수는 표피를 통해 일어나며 땅 위에 사는 대부분의 식물들에는 뿌리털(毛根)이 발달해 물과 물에 녹아 있는 무기 염류 등 영양성분의 흡수를 훨씬 더 효율적으로 수행한다. 이러한 뿌리털은 표피 세포벽이 가느다란 원통처럼 길게 늘어난 성숙부위에만 나타난다. 뿌리에서 물의 흡수는 주로 삼투현상에 의해 일어나는데, 삼투현상은 ① 여러 가지 염류, 당류, 그밖에 물에 녹아 있는 유기물질을 함유하는 표피세포의 안보다 토양 속의 물의 활동도가 더 높고, ② 표피세포의 막이 물은 통과시키나 세포 내에 녹아 있는 대부분의 물질들은 통과시키지 않으므로 일어난다. 물과 용해된 무기염류 등은 뿌리를 가로질러 표피에서 관다발로 이동되어 식물의 다른 부분으로 운반되어 식물체의 생리활동에 이용되는 것이다.Primary tissue of root consists of epidermis, cortex and vascular bundle from outermost to innermost. The epidermis is composed of cells with thin cell walls and usually consists of one cell layer. Absorption of water and inorganic salts occurs through the epidermis, and most of the plants living on the ground develop root hairs to carry out the absorption of nutrients such as water and inorganic salts dissolved in water much more efficiently. These root hairs appear only at mature sites with elongated, thin epidermal cell walls. Absorption of water from the roots is mainly caused by osmotic phenomena. ① Osmotic phenomena are more active in water than in epidermal cells containing various salts, sugars, and other organic substances dissolved in water. This occurs because the membrane passes water but does not pass most of the material dissolved in the cell. Water and dissolved inorganic salts are transported from the epidermis to the vascular bundle across the root and transported to other parts of the plant for use in the physiological activity of the plant.
한편, 벼는 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나로 최근 몇 년간 전체 유전자 서열이 밝혀짐으로써 유용유전자를 대량으로 확보하고 이를 선점하고자 하는 많은 노력이 행해지고 있다. 식물의 무기양분 흡수와 관련된 연구는 재배학적 측면의 연구와 식물생리학적 측면의 연구가 오래 전부터 이루어져 왔으나, 최근에는 무기양분 흡수에 대한 분자수준의 기초연구를 토대로 무기양분 흡수와 관련한 유전자들을 이용하여 작물의 생육과 수량을 증가시키고 극도로 양분이 제한된 조건에서도 생장이 가능한 작물을 육종하기 위한 연구들이 세계적으로 활발히 진행되고 있다.On the other hand, rice is one of the most important crops in the world, and in recent years, since the entire gene sequence has been revealed, many efforts have been made to secure a large number of useful genes and preoccupy them. Research on the absorption of inorganic nutrients from plants has been done for a long time in cultivation and plant physiological aspects, but recently, based on the molecular-level basic research on the absorption of inorganic nutrients, In order to increase the growth and yield of crops and to grow crops that can grow under extremely limited nutrients, research is being actively conducted worldwide.
벼에는 37개의 cellulose synthase-like 유전자가 존재하고 있을 것으로 보고(Hazen et al., Plant physiology, 2002, 128:336-340, Cellulose Synthase-Like Genes of Rice)되고 있으며, 이 유전자들에 대한 명명은 cellulose synthase-like 유전자의 아미노산 분석상의 유사성을 바탕으로 Cellulose Synthase-Like Genes of Rice (Hazen et al., 위 문헌)에 준한다. 쌍자엽식물인 애기 장대에서는 cellulose synthase-like subfamily D group 중 AtCSLD3(KOJAK)이 뿌리털 발달에 관련된다고 보고(Favery et al., Genes & Development, 2001, 15:79-89, KOJAK encodes a cellulose synthase-like protein required for root hair cell morphogenesis in Arabidopsis) 되었으나 아직까지 단자엽 식물에서는 뿌리털 발달을 저해하는 유전자는 보고된 바가 없다. 더욱이 쌍자엽 식물의 뿌리와 단자엽 식물의 뿌리는 해부학적, 형태학적인 구조가 매우 다르기 때문에 단자엽 식물에서의 뿌리에 관련된 특이적 유전자의 기능 구명은 단자엽 식물의 뿌리발달에 매우 중요한 정보가 될 것이다.It is reported that 37 cellulose synthase-like genes exist in rice (Hazen et al., Plant physiology, 2002, 128: 336-340, Cellulose Synthase-Like Genes of Rice). Based on the similarity of amino acid analysis of cellulose synthase-like genes, it is based on Cellulose Synthase-Like Genes of Rice (Hazen et al., supra). AtCSLD3 ( KOJAK ) of the cellulose synthase-like subfamily D group has been reported to be involved in root hair development (Favery et al., Genes & Development, 2001, 15: 79-89, KOJAK encodes a cellulose synthase-like) protein required for root hair cell morphogenesis in Arabidopsis. However, no genes have been reported to inhibit root hair development in monocotyledonous plants. Moreover, since the roots of dicotyledonous and monocotyledonous plants differ in anatomical and morphological structures, the function of specific genes related to the roots of monocotyledonous plants will be very important information for root development of monocotyledonous plants.
본 발명자들은 식물체의 유전자 변이체에 대한 연구과정에서 뿌리털 발달이 저해된 변이체를 발견하고 이로부터 뿌리털 발생에 관여하는 유전자를 탐색하기 위한 연구를 수행한 결과, 이 유전자를 분리하고 이것이 Cellulose Synthase-Like Genes 중에서 cellulose synthase-like subfamily D group에 속하는 4개의 유전자 중 하나(Hazen et al., 위 문헌; 분류 방식은 http://cellwall.stanford.edu/ 참조)인 OsCSLD1(Oryza sativa Cellulose Synthase-Like D1) 유전자임을 확인하고, 그 구조와 작용 및 식물체 내에서의 기능을 밝히어 그 유용성을 제시함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.In the course of research on plant genetic variants, the present inventors have found a variant that inhibited root hair development and conducted a search for a gene involved in root hair development. As a result, the gene is isolated and it is cellulose synthase-like genes. Among them, OsCSLD1 (Oryza sativa Cellulose Synthase-Like D1), one of four genes belonging to the cellulose synthase-like subfamily D group (Hazen et al., Supra; see http://cellwall.stanford.edu/). The present invention was completed by identifying the gene, revealing its structure, function, and function in the plant, and presenting its usefulness.
본 발명은, 식물체에 뿌리털 발생을 촉진하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a gene for promoting root hair development in a plant.
또한 본 발명은, 상기 유전자로 형질 전환된 뿌리털 발생이 우수한 식물체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.In another aspect, the present invention, to provide a plant excellent in the generation of root hair transformed with the gene.
또한 본 발명은, 상기 유전자로 형질 전환된 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a plant transformed with the gene.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 식물체의 뿌리에서만 발현되고 뿌리털의 발생을 유도하는 기능을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명에 의한 상기 단백질 및 유전자는 벼에서 유래한 OsCSLD 단백질 및 그를 코딩하는 서열번호 2의 OsCSLD 유전자일 수 있다.The present invention for achieving the above object, relates to a protein and a gene encoding the same, which is expressed only in the root of the plant and has a function of inducing the development of root hair, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The protein and gene according to the present invention may be an OsCSLD protein derived from rice and an OsCSLD gene of SEQ ID NO: 2 encoding the same.
또한 본 발명은, 상기 유전자를 함유하는 뿌리털 과발현용 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 뿌리 신장 촉진 및 뿌리털 과발생 형질전환 식물체를 제공한다. 하기 실시예에서는 벼를 대상으로 형질전환체를 얻었으나, 유사한 유전학적, 생리학적 특성을 가지는 다른 단자엽 식물체에서도 뿌리 신장 촉진 및 뿌리털의 길이 생장을 유도할 수 있을 것이다. The present invention also provides a root hair overexpression vector containing the gene and a root elongation promoting and root hair over-transformed transgenic plant transformed with the vector. In the following examples, a transformant was obtained from rice, but other monocotyledonous plants having similar genetic and physiological characteristics may induce root elongation and length of root hair growth.
본 발명에 의한 뿌리털 과발현 식물체는 정상체에 비해 우수한 양분 흡수 능력을 나타낸다.Root hair overexpressing plants according to the present invention exhibits superior nutrient absorption capability compared to normal.
본 발명은 삽입변이 유도 체계인 Ac/Ds tagging system을 통하여 벼에서의 뿌리털에 생성 및 성장에 연관된 유전자를 선발하였고, 유전자에 대한 분자학적 연구를 통하여 유전자의 뿌리털 특이적 발현 특성을 구명함으로써 완성된 것이다. According to the present invention, a gene related to generation and growth of root hairs in rice was selected through the Ac / Ds tagging system, which is an induction mutation system, and it was completed by investigating the gene expression characteristics of the root hairs through molecular studies on the genes. will be.
전술한 바와 같이, 본 발명은 벼에서의 뿌리털에 생성 및 성장에 연관된 단백질 및 OsCSLD 유전자에 관한 것이다. 즉, 본 발명자들이 개발한 벼에서의 삽입 변이 유도체계인 Ac/Ds tagging system (Chin HG, et al.. 1999 Plant J 19, 615-623 ; Kim et al., 2004 Plant J 39: 252-263)을 통해 식물 변이체를 얻었으며 그로부터 기능 분석을 실시하였다. Ac/Ds tagging system은 옥수수의 전이인자인 Ac와 Ds를 유전자조작한 후 벼의 genome 상에 형질전환 방법으로 삽입시켜 확립했다. Ds는 Ac가 같은 게놈 상에 존재할 때 전이된다는 사실에 착안하여 system을 구축하였다. 상기 시스템은 Ds 안에 reporter gene이 설치되어 Ds가 염색체상의 유전자 부근 또는 내부에 삽입되었을 때 host 유전자에 의해 reporter gene의 형질이 발현되도록 고안된 것이다. 이 tagging system은 유전자의 기능을 변이를 통해 동정하고 동시에 형질발현을 reporter gene을 통해 관찰 할 수 있는 매우 강력한 연구 방법이다. 상기 논문 및 본 발명에서 reporter gene으로는 GUS를 사용하였지만, 적절한 표시기능이 있는 유전자라면 reporter gene으로 활용할 수 있을 것이다. As mentioned above, the present invention relates to proteins and OsCSLD genes involved in the production and growth of root hairs in rice. In other words , Ac / Ds tagging system (Chin HG, et. al .. 1999 Plant J 19, 615-623; Kim et al., 2004 Plant J 39: 252-263) obtained plant variants and functional analysis was performed therefrom. Ac / Ds tagging system was established by genetically engineering the trans transfer factors Ac and Ds and inserting them into the rice genome by transformation method. Ds built the system, taking note of the fact that Ac is transferred when present on the same genome. The system is designed such that the reporter gene expression of the transfected gene by the host when the reporter gene is installed in the Ds Ds is inserted into the vicinity of or inside the gene on the chromosome. This tagging system is a very powerful method for identifying gene function through mutations and observing expression through reporter genes. In the above paper and the present invention, GUS was used as a reporter gene, but a gene having an appropriate display function may be used as a reporter gene.
Ac/Ds tagging system을 이용하여 얻어진 본 발명에 의한 상기 변이체 (OsCSLD1::Ds)는 OsCSLD1 유전자에 Ds가 삽입된 것이다. 상기 변이체에 대한 연구를 통하여 OsCSLD1 유전자가 식물체 뿌리에서 뿌리털의 생성 및 성장을 유도하는데 관련된 유전자임을 확인하고 본 발명을 완성한 것이다.The variant (OsCSLD1 :: Ds) according to the present invention obtained using the Ac / Ds tagging system is a Ds inserted into the OsCSLD1 gene. The study of the above variants confirmed that OsCSLD1 gene is a gene involved in inducing the production and growth of root hairs in plant roots and completed the present invention.
이하 단계별로 본 발명을 상세히 설명한다.The present invention will be described in detail below step by step.
(1) 뿌리털의 발달이 미숙한 변이체의 선별 및 변이된 유전자의 분석(1) Selection of variants with immature root hair development and analysis of mutated genes
본 발명자들이 개발한 삽입 변이 유도체계인 Ac/Ds tagging system을 이용하여 벼의 변이체를 다량 제작하고, 특이 표현형질을 나타내는 변이체로부터 변이된 유전자를 분석하였다. Ac/Ds tagging system의 Ds안에는 GUS coding region이 존재하므로 상기 시스템에 의해 변이된 변이체들은 정상 식물체와는 달리 특정 부위에서 GUS가 발현될 수 있으며, GUS staining을 통하여 GUS가 발현되는 부위를 확인할 수 있다. 또한 상기 시스템을 이용하는 경우 TAIL-PCR을 통하여 Ds flanking DNA를 얻을 수 있으므로 염색체 상의 Ds가 삽입된 부위(유전자)를 용이하게 분리할 수 있는 특성이 있다.Using the Ac / Ds tagging system, which is an insertion-derived derivative system developed by the present inventors, a large amount of rice variants were prepared, and the mutated genes were analyzed from the variants showing specific phenotypes. Since the GUS coding region exists in the Ds of the Ac / Ds tagging system, the mutants modified by the system can express GUS at a specific site, unlike normal plants, and the GUS expression can be identified through GUS staining. . In addition, when using the system, since Ds flanking DNA can be obtained through TAIL-PCR, there is a characteristic of easily separating a region (gene) into which Ds is inserted on a chromosome.
본 발명에서는 전이인자 Ds가 삽입된 다양한 벼 변이체 중에서 특히 뿌리털의 발달이 저해되어 있고 뿌리털이 발생될 부위에 GUS가 발현되는 변이체를 분리하고 DNA를 추출하여 변이와 관련된 유전자를 분석하였다.In the present invention, among the various rice mutants in which the transfer factor Ds is inserted, the growth of the root hair is inhibited and the GUS-expressing variant is isolated at the site where the root hair is to be generated, and the DNA is extracted to analyze genes related to the mutation.
변이 (Ds tagging line) 식물체 종자의 발아 후 잎에서 DNA를 얻었고, 염색체 상의 Ds가 삽입된 곳(유전자)에 대한 정보를 얻기 위하여 추출된 DNA를 주형으로하고 Ds의 말단에 상보적인 3개의 프라이머 (3 종의 TAIL3 프라이머)와 하나의 프라이머 (W4 프라이머)를 이용하여 3차에 걸친 TAIL-PCR을 수행하였다. 이어서 3차가 2차보다 50 bp 짧은 PCR 산물인 Ds flanking DNA (Ds와 접해 있는 벼의 게놈 DNA)를 얻었다. 얻어진 Ds flanking DNA의 염기서열을 또 다른 프라이머(Ds3-4)를 이용하여 분석하여 돌연변이체의 flanking sequence를 얻을 수 있었다. Ds tagging line After germination of plant seeds, DNA was obtained from the leaves, and three primers (complementary to the ends of Ds) were used as a template to obtain information about where the Ds on the chromosome was inserted (gene). TAIL-PCR was performed three times using three TAIL3 primers) and one primer (W4 primer). Subsequently, Ds flanking DNA (rice genome DNA in contact with Ds ) was obtained, which was a 50-bp shorter PCR product than the second. The nucleotide sequence of the obtained Ds flanking DNA was analyzed using another primer (Ds3-4) to obtain the flanking sequence of the mutant.
이렇게 서열분석된 Ds flanking DNA는 이미 밝혀진 벼의 전체 염기서열 DB을 통하여 Ds가 삽입된 유전자가 세포벽의 cellulose 합성에 관련될 것으로 예상되는 cellulose synthase family 중 subfamily D에 속하는 유전자임을 확인하고 이를 OsCSLD1 라 명명하였다. Ds가 삽입되어 생긴 대립인자를 OsCSLD1::Ds라 명하였다. OsCSLD1 유전자 (서열번호 2)는 3471 bp의 염기로 이루어져 있고, 2개의 exon 과 1개의 intron을 가지고 있으며, 1127개의 아미노산으로 이루어지는 단백질(서열번호 1)을 코딩하고 있음을 알 수 있었다. This sequencing the Ds flanking DNA is referred to through the already full nucleotide sequence DB of the identified rice confirm that Ds is the gene that cellulose synthase family of genes belonging to the subfamily D which are expected to be involved in cellulose synthesis in the cell wall insert and this OsCSLD1 named It was. The allele resulting from the insertion of Ds was named OsCSLD1 :: Ds . The OsCSLD1 gene (SEQ ID NO: 2) consists of a base of 3471 bp, has two exons and one intron, and encodes a protein consisting of 1127 amino acids (SEQ ID NO: 1).
본 발명에서의 변이체 (OsCSLD1::Ds)는 OsCSLD1 유전자의 첫 번째 exon의 뒤쪽에 reporter 유전자가 발현하는 방향으로 Ds가 위치하고 있음을 flanking sequence 분석과 GUS의 발현을 통하여 확인하였다. The variant ( OsCSLD1 :: Ds ) in the present invention was confirmed by flanking sequence analysis and GUS expression that Ds is located in the direction of reporter gene expression behind the first exon of OsCSLD1 gene.
실시예 1은 OsCSLD1 유전자의 Ds 변이(서열번호 3) 선발 과정, OsCSLD1의 염기서열, 그리고 OsCSLD1::Ds의 유전자에 대한 기술이다.Example 1 is a description of the genetic variation of the Ds (SEQ ID NO: 3) selection process, the base sequence of OsCSLD1, and OsCSLD1 OsCSLD1 :: Ds gene.
(2) (2) OsCSLD1 OsCSLD1 유전자의 형질 발현 분석Gene expression analysis
정상적 벼 식물체에서 상기 OsCSLD1 유전자의 발현양상을 분석하였다.The expression patterns of the OsCSLD1 gene were analyzed in normal rice plants.
RNA Northern hybridization을 수행하여 OsCSLD1 유전자가 뿌리에서 특이하게 발현하는 것을 확인하였으며, 또한 Ds 안에 존재하는 GUS coding region을 통하여 OsCSLD1이 발현하는 것을 GUS staining을 통하여 관찰하여 역시 상기 유전자가 뿌리에서 특이하게 발현하는 것을 재확인하였다. RNA Northern hybridization was performed to confirm that the OsCSLD1 gene was specifically expressed in the roots. Also, the expression of OsCSLD1 through GUS coding region in Ds was observed through GUS staining. It was confirmed again.
나아가, 변이체 식물의 뿌리 중 뿌리털이 발생하는 표피 세포에만 강하게 GUS가 발현되는 것으로 보아 OsCSLD1 유전자가 뿌리털이 발생하는 세포에서만 발현되는 것을 알 수 있었다. 세포내의 OsCSLD1 mRNA를 직접 관찰할 수 있는 in-situ hybridization을 통하여 뿌리털이 발생하는 표피 세포에서 유전자가 발현되는 것을 재확인하였다. Furthermore, GUS was strongly expressed only in the epidermal cells of the root hairs of the roots of the mutant plants, indicating that the OsCSLD1 gene was expressed only in the cells of the root hairs. Through in-situ hybridization, which allows direct observation of intracellular OsCSLD1 mRNA, gene expression was reconfirmed in epidermal cells with root hairs.
실시예 2는 위에 기술한 OsCSLD1 유전자의 발현 양상에 대한 실험 결과이다.Example 2 is an experimental result of the expression pattern of the OsCSLD1 gene described above.
(3) (3) OsCSLD1OsCSLD1 변이체 ( Variant ( OsCSLD1::DsOsCSLD1 :: Ds )를 통한 유전자의 기능 검증Verification of gene function
OsCSLD1 유전자의 변이체 (OsCSLD1::Ds)가 정상 식물체와 어떤 형태학적 차이점을 나타내는지 재확인하였다. We reconfirmed the morphological differences of OsCSLD1 gene variants ( OsCSLD1 :: Ds ) with normal plants.
OsCSLD1 유전자의 세포학적 측면에서 관찰한 결과 변이체에서 뿌리털의 성장이 저해됨을 확인하였다. 주사전자현미경(SEM: Scanning Electronic Microscope)으로도 정상적인 식물체에 비해 변이체에서 뿌리털의 발달이 저해되는 것으로 나타났다. As a result of observation in the cytological aspect of the OsCSLD1 gene, it was confirmed that root hair growth was inhibited in the variant. Scanning Electronic Microscope (SEM) also inhibited the development of root hairs in mutants compared to normal plants.
실시예 3은 OsCSLD1 유전자의 뿌리 신장과 뿌리털 생장에 관련된 기능을 구명한 실험 결과이다.Example 3 is an experimental result which investigated the functions related to root elongation and root hair growth of OsCSLD1 gene.
(4) (4) OsCSLD1OsCSLD1 유전자를 이용한 과발현 벡터 구축 및 과발현 형질전환체의 제작 Construction of overexpression vector and production of overexpressing transformant using gene
OsCSLD1을 과발현시키기 위해서 OsCSLD1 cDNA를 과발현시킬 수 있도록 벡터를 구축하였다. 구축된 벡터를 이용하여 OsCSLD1이 과발현된 형질전환 식물체를 획득하였다.To overexpress OsCSLD1, a vector was constructed to overexpress OsCSLD1 cDNA. Using the constructed vector, transgenic plants overexpressing OsCSLD1 were obtained.
실시예 4는 OsCSLD1 과발현 형질전환 식물체를 제작하는 과정에 관한 것이다.Example 4 relates to a process for preparing OsCSLD1 overexpressing transgenic plants.
(5) (5) OsCSLD1OsCSLD1 과발현 형질전환체의 뿌리 신장 및 뿌리털 특성 확인 Identification of Root Elongation and Root Hair Characteristics of Overexpressing Transformants
형질전환하여 얻은 OsCSLD1 과발현 식물체의 뿌리 및 뿌리털 길이를 비교한 결과 정상적인 식물체에 비해 뿌리 및 뿌리털이 월등히 길었다.The root and root hair lengths of the transgenic OsCSLD1 overexpressed plants were significantly longer than those of normal plants.
실시예 5 및 6은 OsCSLD1 과발현 형질전환 식물체의 뿌리 및 뿌리털 길이 신장에 대한 실험결과이다.Examples 5 and 6 are experimental results of root and root hair length extension of OsCSLD1 overexpressing transgenic plants.
(6) (6) OsCSLD1OsCSLD1 과발현 형질전환체에서의 양분 흡수 능력 향상 확인 Enhancement of Nutrient Uptake in Overexpressing Transformants
과발현 식물체를 양액을 통한 수경재배에서 미량원소의 양분 흡수를 실험해 본 결과 과발현 식물체가 정상적인 식물체와 변이체 보다 훨씬 많은 양분을 흡수할 수 있었다.In the hydroponic cultivation of overexpressing plants through nutrient solution, the nutrient uptake of trace elements was found to be able to absorb much more nutrients than normal plants and mutants.
실시예 7은 양분흡수에 대한 실험 결과이다.Example 7 is an experimental result for nutrient absorption.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 열거한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위나 내용이 변경되거나 축소되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. The embodiments are only listed by way of example to illustrate the present invention, thereby not changing or reducing the scope or content of the technical spirit of the present invention.
실시예 1 : Example 1: OsCSLD1OsCSLD1 유전자의 발견과 염기서열 분석 자료 Gene discovery and sequencing data
본 발명자들이 사전에 구축하여 둔 Ac/Ds Tagging system에 의해 창출된 돌연변이 집단에서 OsCSLD1 변이체를 선발하고, 변이체 분석을 통하여 OsCSLD1의 기능을 밝혔다.The present inventors selected OsCSLD1 variants from the mutant population generated by the Ac / Ds Tagging system, which was previously constructed, and revealed the function of OsCSLD1 through variant analysis.
변이 식물체의 DNA를 추출하고 PCR를 통하여 크로닝된 Ds flanking DNA의 염기서열을 분석함으로써 OsCSLD1 변이 유전자를 선별하였다. PCR를 통한 OsCSLD1의 유전자 동정 방법을 개략적으로 기술한다. OsCSLD1 mutant genes were selected by extracting the DNA of mutant plants and analyzing the sequencing of the cloned Ds flanking DNA by PCR . The method for gene identification of OsCSLD1 by PCR is outlined.
뿌리털의 발달이 미숙한 변이 (Ds tagging 식물체) 식물체의 종자를 소독 발아시켜 포트에서 키운 후 3엽기에 잎을 채취하여 DNA 추출용액을 사용하여 통상의 방법으로 DNA를 얻었다. 추출된 DNA (50 ng/㎕)를 순차적으로 TAIL3-1 (서열번호 4), TAIL3-2 (서열번호 5), TAIL3-3 (서열번호 6)과 W4 (서열번호 7) 프라이머를 이용하여 TAIL-PCR을 수행하였다. 2차와 3차 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후 Ethidium Bromide로 염색하여 3차에서 산물이 2차 산물보다 50base pair 짧아진 band를 elution 하였다. elution 된 DNA를 Ds3-4(서열번호 8)를 이용하여 직접 염기서열 분석을 하여 돌연변이체의 flanking sequence(서열번호 3)를 얻었다. 각 프라이머의 염기서열을 표 1에 나타내었다.Seeds of immature mutant ( Ds tagging plants) plants with immature development of root hairs were sterilized and grown in pots, and then leaves were harvested in three leaves and DNA was obtained by using a DNA extraction solution in a conventional manner. Extracted DNA (50 ng / μl) was sequentially TAIL3-1 (SEQ ID NO: 4), TAIL3-2 (SEQ ID NO: 5), TAIL3-3 (SEQ ID NO: 6) and W4 (SEQ ID NO: 7) primers. -PCR was performed. Secondary and tertiary PCR products were electrophoresed on 2% agarose gel and stained with Ethidium Bromide to elution the bands with 50base pairs shorter than the secondary products in the third. Elution DNA was directly sequenced using Ds3-4 (SEQ ID NO: 8) to obtain a flanking sequence (SEQ ID NO: 3) of the mutant. The base sequence of each primer is shown in Table 1.
이미 밝혀진 벼의 전체 염기서열(science, vol 296, 79-92, http://btn.genomics.org.cn/rice) 중에서 위에서 분석된 Ds flanking DNA 서열을 포함하고 있는 약 10kb의 DNA sequence를 찾아 SoftBerry(http://www.softberry.com/berry.phtml)와 NCBI을 통하여 Ds가 삽입되어 있는 유전자의 coding region을 예측하고 Ds가 삽입된 곳이 OsCSLD1 유전자라는 정보를 얻었다(도 1). 전체 DNA중에서 염기서열의 비교를 통하여 Ds의 삽입위치와 방향을 확인하였다. Find a DNA sequence of about 10 kb that contains the Ds flanking DNA sequence analyzed above from all the known nucleotide sequences of rice (science, vol 296, 79-92, http://btn.genomics.org.cn/rice). SoftBerry (http://www.softberry.com/berry.phtml) and through the NCBI Ds predict the coding region of the inserted gene and obtain the information where the insertion of the Ds OsCSLD1 gene (Fig. 1). The insertion position and orientation of Ds were confirmed by comparing the nucleotide sequences in the whole DNA.
염기서열 분석을 통하여 OsCSLD1 유전자는 3471bp의 염기서열(서열번호 2)로 이루어져 있고 2개의 exon(총 3384 bp)과 1개의 intron(87 bp)을 가지고 있으며, 발현 단백질은 1127개의 아미노산서열(서열번호 1)로 되어 있음을 알 수 있었다. Through sequencing analysis, the OsCSLD1 gene consists of 3471bp of nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2), two exons (3384 bp in total) and one intron (87 bp), and the expressed protein has 1127 amino acid sequences (SEQ ID NO: It was found that 1).
flanking sequence 분석과 GUS의 발현을 통하여 확인한 바, 본 발명에 의한 OsCSLD1 돌연변이체는 OsCSLD1 유전자의 첫 번째 exon의 말단에 reporter 유전자가 발현하는 방향으로 위치하고 있었다(도 2). 도 2에서 두 개의 사각형은 각각 엑손을, 사각형 사이의 빈 공간은 인트론을, 역삼각형은 삽입된 Ds를 의미한다.As confirmed by flanking sequence analysis and expression of GUS, OsCSLD1 mutant according to the present invention was located in the direction of the reporter gene expression at the end of the first exon of the OsCSLD1 gene (Fig. 2). In FIG. 2, two squares denote exons, an empty space between squares denotes an intron, and an inverted triangle denotes inserted Ds .
실시예 2 : Example 2: OsCLSD1OsCLSD1 의 발현 양상 분석Expression Analysis of
벼에서 OsCSLD1 유전자가 발현되는 양상을 조사하였다. OsCSLD1 gene expression was examined in rice.
OsCSLD1 유전자는 뿌리 조직에서만 특이적으로 발현되는 것이 관찰되었다. OsCSLD1 gene was observed to be specifically expressed only in the root tissue.
벼의 각 조직별로 OsCSLD1 mRNA가 발현되는 정도를 Northern hybridization을 통하여 관찰한 것과, 삽입된 Ds 안의 reporter 유전자로 붙여놓은 GUS를 X-Gluc을 통하여 발현시켜 관찰해 본 결과 Northern 분석과 동일한 결과를 얻었다. 아래는 본 연구에 사용한 Northern hybridization과 GUS stain 방법에 대한 기술이다.The expression of OsCSLD1 mRNA in each tissue of rice was observed through Northern hybridization, and the GUS attached to the inserted reporter gene in Ds was expressed through X-Gluc. Below is a description of the Northern hybridization and GUS staining methods used in this study.
(1) Northern hybridization을 통한 조직별 발현 양상 분석(도 3) (1) Analysis of expression patterns of tissues through Northern hybridization (FIG. 3)
Easy-BLUE(intron cat. No.17061)를 이용하여 벼의 조직별 [Seedling(발아직후 식물체), Root(뿌리), Leaf(잎), Booting(수분전 화기), Heading(수분후의 화기)] RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 1.3% formaldehyde gel 상에서 전기영동 한 후 Ethidium Bromide로 염색하여 같은 양의 RNA를 확인한 다음, 10×SSC에서 Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech) membrane에 RNA를 옮기고 65℃에서 Church buffer (1% BSA, 200 μM EDTA, 0.5 M sodium phosphate, 7% SDS)와 함께 32P로 표지된 OsCSLD1 (forward 5'-TGG AGT CTT CTT CAG CTT CTG-3'와 reverse 5'-CAG GTT CCA AGT TCC GAG C-3'를 프라이머로 이용하여 PCR을 통해 클로닝된 DNA) probe을 이용하여 Northern blot을 수행하였다(도 3). 실험 결과, 도에서도 볼 수 있듯이, 오로지 뿌리에서만 OsCSLD1 유전자가 특이적으로 발현됨을 확인하였다. 도에서 아래 사진 (EtBr)은 sample간에 상대적으로 같은 양의 RNA을 loading 했는지 확인하기 위한 대조구이다. By tissue of rice using Easy-BLUE (intron cat.No.17061) [Seedling (plants after germination), Root (root), Leaf (leaf), Booting (Heading after fire), Heading (fire after fire)] RNA was extracted. The extracted RNA was electrophoresed on 1.3% formaldehyde gel, and then stained with Ethidium Bromide to confirm the same amount of RNA. The RNA was transferred to a Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech) membrane at 10 × SSC, followed by Church buffer (1% OsCSLD1 (forward 5'-TGG AGT CTT CTT CAG CTT CTG-3 'and reverse 5'-CAG GTT CCA AGT TCC GAG C labeled with 32 P with BSA, 200 μM EDTA, 0.5 M sodium phosphate, 7% SDS) Northern blot was performed using DNA probes cloned through PCR using -3 'as a primer (FIG. 3). As a result of the experiment, it was confirmed that the OsCSLD1 gene was specifically expressed only in the roots. In the figure below (EtBr) is a control for checking whether the same amount of RNA loaded between the samples.
(2) GUS 염색을 통한 뿌리털 발현 분석(도 4) (2) Root hair expression analysis through GUS staining (FIG. 4)
변이체에 대하여서 Ac/Ds system에 reporter 유전자로 붙여놓은 GUS의 발현을 관찰하였다.For the variants, the expression of GUS attached to the reporter gene in the Ac / Ds system was observed.
변이체의 뿌리조직을 X-Gluc 용액[50mM NaH2PO4, 10mM EDTA, 0.1% Triton, 2mM Potassium ferrocyanide, 2mM Potassium ferricyanide, 0.204mg/ml Chlorampenicol, 10% X-Gluc]에 담근 후 37℃ 암 조건에서 48시간을 보관한 후 푸른색의 GUS 발현이 관찰되면 30%, 50%, 70% 에탄올을 단계적으로 처리한 후 70% 에탄올에 보관하면서 40배율의 현미경(Leica L2)에서 관찰하였다(도 4). 그 결과, 뿌리 중에 뿌리털이 발생하는 곳에서 GUS가 강하게 발현됨을 확인하였다.The root tissue of the variant was soaked in X-Gluc solution [50mM NaH 2 PO 4 , 10mM EDTA, 0.1% Triton, 2mM Potassium ferrocyanide, 2mM Potassium ferricyanide, 0.204mg / ml Chlorampenicol, 10% X-Gluc] After 48 hours of storage in blue GUS expression was observed 30%, 50%, 70% ethanol was observed in a microscope of 40 times magnification (Leica L2) while storing in 70% ethanol step by step (Fig. 4 ). As a result, it was confirmed that GUS is strongly expressed in the place where root hair occurs in the root.
(3) GUS를 이용한 세포 수준에서의 유전자 발현 관찰(도 5에서 A) (3) Gene expression observation at the cellular level using GUS (A in FIG. 5)
GUS가 발현되는 세포를 해부학적으로 관찰하기 위하여 변이체의 뿌리조직을 50%, 70%, 85%, 95%, 100%의 에탄올에서 각각 90분씩 처리하여 수분을 제거하였다. 이어서 검체를 Eosin에 2시간 동안 염색하고 에탄올과 tert-buthanol의 비율 7:3, 5:5, 3:7인 용매에 각각 30분씩 처리하였다. 이어서 검체를 100% Tert-buthanol에서 1시간 처리한 후, 용해된 파라핀과 tert-buthanol의 혼합물에 12시간씩 4회 처리하고 boats에 용해된 파라핀과 처리된 조직을 넣고 실온에서 굳혔다. 이렇게 마련된 paraffin sample을 microtome으로 자른 후 microscope slide에 올린 후 xylene을 처리하여 파라핀을 제거하고 현미경으로 관찰하였다(도 5 A). 관찰 결과, GUS는 뿌리털이 생성되는 뿌리의 표피세포에서만 발현하는 것을 확인하였다.In order to anatomically observe the cells expressing GUS, the root tissues of the variants were treated with 90% of 50%, 70%, 85%, 95%, and 100% ethanol, respectively, to remove water. Subsequently, the samples were stained with Eosin for 2 hours and treated with ethanol and tert-buthanol at a ratio of 7: 3, 5: 5, and 3: 7 for 30 minutes each. Subsequently, the sample was treated for 1 hour in 100% Tert-buthanol, and then treated 4 times for 12 hours in a mixture of dissolved paraffin and tert-buthanol, and the paraffin dissolved in the boats and the treated tissue was hardened at room temperature. The prepared paraffin sample was cut with a microtome, placed on a microscope slide, and then treated with xylene to remove paraffin and observed under a microscope (FIG. 5A). As a result, it was confirmed that GUS is expressed only in the epidermal cells of the roots from which the root hairs are generated.
(4) in situ mRNA hybridization을 통한 세포 수준에서의 유전자 발현 관찰(도 5에서 B) (4) Gene expression observation at the cellular level through in situ mRNA hybridization (B in FIG. 5)
GUS는 Ds가 삽입되어 있는 OsCSLD1::Ds 변이체에서 가능하고, in situ mRNA hybridization은 정상적인 식물체에서 발현되는 OsCSLD1 mRNA를 직접 관찰할 수 있게 한다. 따라서 전술한 GUS 염색을 통해 얻은 결과를 보완하기 위하여 아래와 같이 in situ mRNA hybridization 방법으로 정상적인 식물체에서 OsCSLD1 mRNA 발현을 직접 관찰하였다. GUS is possible in OsCSLD1 :: Ds variants with Ds inserted, and in situ mRNA hybridization allows direct observation of OsCSLD1 mRNA expressed in normal plants. Therefore, in order to supplement the results obtained by the above-described GUS staining, OsCSLD1 mRNA expression was directly observed in normal plants by the in situ mRNA hybridization method as follows.
식물체 뿌리 조직을 Kouchi and Hata (Mol Gen Genet. 1993 238:106-119)가 보고한 fixing 용액(0.25% Glutaldehyde, 4% paraformaldehyde, 100mM Na-Phosphate pH7.5)에서 12시간 처리한 후 위 (3)과 같은 방법으로 현미경 관찰용 조직검체를 준비하였다. 이와는 별도로 제작된 OsCSLD1 antisense RNA를 상기 조직에 hybridization시키고 anti-DIG-AP와 BCIP/NBT를 이용하여 mRNA가 발현되는 세포를 관찰하였다(도 5에서 B). 그 결과, GUS의 발현과 같은 양상으로 뿌리털이 생성되는 뿌리의 표피세포에서만 OsCSLD1 mRNA가 나타남을 확인 할 수 있었다. Plant root tissues were treated for 12 hours in a fixing solution (0.25% Glutaldehyde, 4% paraformaldehyde, 100 mM Na-Phosphate pH7.5) reported by Kouchi and Hata (Mol Gen Genet. 1993 238: 106-119). Tissue specimens for microscopic observation were prepared by the same method. Separately, OsCSLD1 antisense RNA prepared separately was hybridized to the tissue and mRNA-expressing cells were observed using anti-DIG-AP and BCIP / NBT (B in FIG. 5). As a result, it was confirmed that OsCSLD1 mRNA appeared only in the epidermal cells of the roots in which the root hairs were produced in the same manner as the expression of GUS.
실시예 3 : 본 발명에 의한 OsCLSD1 유전자의 기능 분석 Example 3 Analysis of Function of OsCLSD1 Gene according to the Present Invention
(1) 뿌리의 형태학적 특성 (1) Morphological characteristics of root
돌연변이 식물체 (OsCSLD1::Ds)의 뿌리를 형태학적으로 관찰하여 OsCSLD1 유전자가 뿌리에서 발휘하는 기능을 확인하였다.Morphological observation of the roots of mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) confirmed the function of the OsCSLD1 gene in the roots.
정상적인 식물체(wild-type)와 돌연변이 식물체 (OsCSLD1::Ds) 종자를 프로라즈유제를 이용하여 소독한 후 화분 토양에서 10일 동안 키운 다음 식물체의 표현형을 관찰하였다. 그 결과 돌연변이 식물체의 뿌리생장이 정상 식물체에 비해 20% 이상 저해되는 것을 확인하였다. 따라서 뿌리털에서 발현되는 OsCSLD1이 뿌리 신장에도 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다(도 6, 표 2). Normal wild-type and mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) were disinfected with prorazem, grown in pollen soil for 10 days and observed for phenotypes of plants. As a result, it was confirmed that root growth of mutant plants was inhibited by more than 20% compared to normal plants. Therefore, it was confirmed that OsCSLD1 expressed in the root hairs also affected the root elongation (FIG. 6, Table 2).
(2) 뿌리털의 형태학적 특성 (2) Morphological Characteristics of Root Hair
OsCSLD1 유전자가 뿌리의 세포에 미치는 영향을 세포학적 측면에서 분석하였다. The effect of OsCSLD1 gene on the cells of root was analyzed in terms of cytology.
정상적인 식물체와 돌연변이 식물체 (OsCSLD1::Ds)를 MS용액에 2.5% phytagel을 넣은 배지에서 1주일 키운 후 0.05% Toluidine Blue 시약으로 염색하여 현미경 상에서 관찰하였다(도 7에서 A 및 B). 그 결과 정상적인 식물체에서는 뿌리털의 발달이 정상적임에 비해 돌연변이체에서는 뿌리털의 발달이 저해되는 것을 확인하였다. 도 7에서 A는 정상 식물체의 뿌리조직이고, B는 돌연변이 식물체 (OsCSLD1::Ds)의 뿌리조직이다.Normal plants and mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) were grown for one week in a medium containing 2.5% phytagel in MS solution and stained with 0.05% Toluidine Blue reagent and observed under a microscope (A and B in FIG. 7). As a result, it was confirmed that the development of root hair is inhibited in the mutant compared to the normal development of root hair in normal plants. In FIG. 7, A is the root tissue of a normal plant, and B is the root tissue of a mutant plant ( OsCSLD1 :: Ds ).
뿌리털의 미세형태를 전자현미경으로 관찰하였다. Micromorphism of root hair was observed by electron microscopy.
상기 실시예 2에서 얻어진 식물체의 뿌리 조직을 2.5% glutaraldehyde, 0.1% Na-cacodylate pH7.5 용액을 이용하여 12 시간 동안 fixation 하고 1% OsO4시약에 4℃에서 2시간 동안 놓아둔 후 20%, 50%, 70%, 90% 에탄올에서 각각 15분씩 처리하고 100% 에탄올에 30분씩 3회 처리하였다. 이어서 Critical Point Dryer (Tosimis SAMDRI-795)를 시행하여 조직을 경화시키고 Sputter Coater (JFC-1100E)를 이용하여 100mM에서 200초 동안 조직의 표면을 Ion spotting 시켰다. 준비된 시료를 SEM를 통하여 관찰해 본 결과(도 8) 정상적인 식물체에 비해 변이체에서 뿌리털의 발달이 저해되는 것을 볼 수 있었다. 도 8에서 A는 정상적인 식물체의 뿌리털이고, B는 돌연변이 식물체 (OsCSLD1 :: Ds)의 뿌리털이다.The root tissue of the plant obtained in Example 2 was fixed for 12 hours using 2.5% glutaraldehyde, 0.1% Na-cacodylate pH7.5 solution, and placed in 1% OsO 4 reagent for 2 hours at 4 ° C for 20%. 15 minutes each in 50%, 70%, 90% ethanol and 30 minutes in 100% ethanol three times. Subsequently, a critical point dryer (Tosimis SAMDRI-795) was used to harden the tissues and ion spotting the tissue surface for 200 seconds at 100 mM using a Sputter Coater (JFC-1100E). As a result of observing the prepared sample through SEM (FIG. 8), the development of root hairs was inhibited in the mutant compared to the normal plant. In FIG. 8, A is the root hair of a normal plant, and B is the root hair of a mutant plant ( OsCSLD1 :: Ds ).
실시예 4: OsCSLD1 과발현 형질전환 식물체 제작Example 4 Preparation of Transgenic Plants Overexpressing OsCSLD1
OsCSLD1 유전자를 과발현 시킬 경우 나타나는 표현형을 확인하기 위하여 강력한 promoter인 35S promoter를 이용하여 과발현 vector를 제작하고 이를 이용하여 벼를 형질전환하였다.To confirm the phenotype of overexpression of OsCSLD1 gene, an overexpression vector was constructed using the 35S promoter, a strong promoter, and rice was transformed using the expression.
(1) 형질전환용 벡터의 제작 (1) Preparation of transformation vector
35S promoter와 GFP를 가지고 있는 벡터 pCAMBIA1302 (CAMBIA사 제품, 호주)에 OsCSLD1 cDNA를 삽입하여 과발현 벡터인 pCAMBIA-CSLD1을 제작하였다. 상기 벡터 pCAMBIA1302는 식물체 형질전환 전용으로 만들어진 벡터로써 총 10,549bp의 염기로 이루어져 있고, 식물체의 selection marker로 Hygromycin, kanamycin 저항성 유전자를 가지고 있으며, GFP와 fusion 단백질로 발현 시킬 수 있게 제작된 벡터이다. An overexpression vector pCAMBIA-CSLD1 was constructed by inserting OsCSLD1 cDNA into a vector pCAMBIA1302 (CAMBIA, Australia) containing a 35S promoter and GFP. The vector pCAMBIA1302 is a vector made exclusively for plant transformation and consists of a total of 10,549 bp, has a hygromycin and kanamycin resistance gene as a selection marker of the plant, and is a vector produced to express GFP and fusion proteins.
본 발명에 의한 과발현 벡터 pCAMBIA-CSLD1의 자세한 제작 과정을 설명한다. ① PCR을 통하여 OsCSLD1 cDNA에서 양쪽 말단에 SpeI 제한효소 절단 서열을 갖는 OsCSLD1을 증폭하여 pBSK plasmid vector(STRATAGENE사. 미국)에서 크로닝한다. ② T-DNA vector pCAMBIA1302와, CaMV35S promotor와 CSLD1 cDNA가 들어있는 plasmid vector를 각각 SpeI 효소로 digestion한다. ③ 35S promoter와 CSLD1의 DNA를 gel에서 elution 한 후 pCAMBIA1302에 16℃에서 O/N 동안 ligation시킨다. ④ Ligation된 DNA를 E.coli competent cell 에 transformation 시켜 얻은 clone으로부터 DNA를 뽑아 SpeI 효소로 잘라 ligation 여부를 확인하여 형질전환용 벡터로 사용하였다. The detailed manufacturing process of the overexpression vector pCAMBIA-CSLD1 by this invention is demonstrated. ① Amplify OsCSLD1 having SpeI restriction enzyme cleavage sequence at both ends of OsCSLD1 cDNA by PCR and then clone it in pBSK plasmid vector (STRATAGENE, USA). ② T-DNA vector pCAMBIA1302, plasmid vector containing CaMV35S promotor and CSLD1 cDNA are digested with SpeI enzyme, respectively. ③ After elution of DNA of 35S promoter and CSLD1 from gel, ligation is performed for p / camera1302 at 16 ℃ for O / N. ④ DNA was extracted from the clone obtained by transforming the ligated DNA into E. coli competent cell and cut with Spe I enzyme to confirm ligation and used as a transformation vector.
완성된 본 발명에 의한 과발현 벡터 pCAMBIA-CSLD1의 주요부를 도 9에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 본 발명에 의한 OsCSLD1 cDNA가 35S promoter와 GFP 유전자 사이에 삽입되어 있다. The main part of the overexpression vector pCAMBIA-CSLD1 according to the present invention is shown in FIG. 9. As shown, OsCSLD1 cDNA according to the present invention is inserted between the 35S promoter and the GFP gene.
(2) 과발현 식물체의 제작 (2) Production of overexpressed plants
식물체의 형질전환은 통상 사용하는 아그로박테리움법을 적용하였다.Plant transformation was applied to the conventional Agrobacterium method.
먼저, OsCSLD1 cDNA를 내재하고 있는 pCAMBIA-CSLD1을 Agrobacterium LBA4404 균주에 형질전환(transformation)하였다. 이를 AB plate에서 30℃에서 3일 동안 배양한 뒤 DNA를 추출하여 co-integration을 확인하여 확인된 균주를 다시 3일 동안 키워 infection에 사용하였다. 형질전환된 아그로박테리움 세포를 벼의 calli를 통해 infection하여 3일간 암실배양(AAM, 2N6-AS 배지), 3~4주간 암실에서 선택배양(N6-CH-Hyg50mg), 10일간 암실에서 전-계대배양(Pre-regeneration) (N6-7-CH), 3주 이상 명실에서 1차 계대배양(Regeneration I)(N6S3-CH-I), shooting 때 까지 명실에서 2차 계대배양(Regeneration II )(N6S3-CH-II)한 후 병 배지(MS)에 옮겨 명실에서 배양하여 형질전환 식물체를 획득하였다. 식물체가 형질전환되었는지 여부는 식물체의 genomic DNA를 추출하여 PCR 및 Hygromycin probe을 이용한 Southern blot으로 확인하였다.First, pCAMBIA -CSLD1 incorporating OsCSLD1 cDNA was transformed into Agrobacterium LBA4404 strain. This was incubated in the AB plate for 30 days at 30 ℃ after extracting the DNA to confirm the co-integration and confirmed strain was grown again for 3 days and used for infection. Transformed Agrobacterium cells were infected by rice calli and then cultured in the dark for 3 days (AAM, 2N6-AS medium), selective culture in the dark for 3 to 4 weeks (N6-CH-Hyg50mg), and in the dark for 10 days. Pre-regeneration (N6-7-CH), Regeneration I (N6S3-CH-I) in bright room for more than 3 weeks, Regeneration II in bright room until shooting ( N6S3-CH-II), and then transferred to a bottle medium (MS) to culture in a clear room to obtain a transgenic plant. Whether the plant was transformed was confirmed by Southern blot using the PCR and Hygromycin probe by extracting the genomic DNA of the plant.
실시예 5: 과발현 식물체 뿌리의 신장 촉진 특성 확인Example 5 Confirmation of Renal Promoting Properties of Overexpressed Plant Roots
정상 식물체(wild-type), 돌연변이 식물체(OsCSLD1::Ds) 및 과발현 식물체(35S::OsCSLD1)의 종자를 프로라즈유제를 이용하여 소독한 후 화분토양에 10일 동안 키운 다음 식물체의 표현형을 관찰하였다. 돌연변이 식물체의 뿌리 생장은 정상 식물체에 비해 20% 이상 저해되며, 과발현 식물체의 뿌리 생장은 정상 식물체보다 20% 이상 촉진되는 것을 확인하였다(도 6 및 표 4 참조). 과발현 식물체 뿌리의 신장이 촉진되는 이유는 아래 실시예 6 및 7에서 확인된 바와 같이 뿌리털이 길게 자라면서 영양흡수가 상대적으로 좋아지기 때문으로 판단된다. 도에서 A, B, C는 각각 정상 식물체, 돌연변이 식물체, 과발현 식물체를 의미한다. Seeds of wild-type, mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) and overexpressing plants (35S :: OsCSLD1) were sterilized with Proraz emulsion and grown in pollen soil for 10 days before observing the phenotype of the plants. It was. Root growth of mutant plants was inhibited by more than 20% compared to normal plants, root growth of overexpressed plants was confirmed to be promoted by more than 20% than normal plants (see Fig. 6 and Table 4). The reason why the elongation of the overexpressed plant roots is promoted is that the absorption of the root is longer and the nutrition absorption is relatively improved, as confirmed in Examples 6 and 7 below. In the drawings, A, B, and C refer to normal plants, mutant plants, and overexpressed plants, respectively.
실시예 6: 과발현 식물체 뿌리털의 형태학적 특성 확인Example 6: Confirmation of Morphological Characteristics of Overexpressed Plant Root Hair
정상 식물체(wild-type), 돌연변이 식물체(OsCSLD1 :: Ds) 및 과발현 식물체 (35S::OsCSLD1)의 종자를 소독 후 MS 배지에서 3일 동안 기른 다음 식물체의 뿌리 조직을 전술한 실시예 3(2)에서의 SEM 관찰용 처리방법으로 처리하여 전자현미경으로 관찰하였다(도 10). 사진에서 볼 수 있듯이, 정상적인 식물체(도 10에서 A)보다 변이체(도 10에서 B)에서 뿌리털의 생장이 저조하며, 본 발명에 의한 과발현 식물체(도 10에서 C)의 뿌리털은 정상적인 식물체보다 현저하게 길게 생장함을 확인하였다(표 3). Seeds of normal plants (wild-type), mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) and overexpressing plants (35S :: OsCSLD1) were sterilized and grown in MS medium for 3 days, and then the root tissues of the plants were prepared in Example 3 (2). ) And observed with an electron microscope in the treatment method for SEM observation (Fig. 10). As can be seen in the photo, root hair growth is lower in the mutant (B in Fig. 10) than in the normal plant (A in Fig. 10), the root hair of the overexpressing plant (C in Fig. 10) according to the present invention is significantly more than the normal plant Long growth was confirmed (Table 3).
그러나 정상 식물체(wild-type), 돌연변이 식물체(OsCSLD1::Ds)와 과발현 식물체 (35S::OsCSLD1)의 뿌리털 밀생정도(뿌리털의 개수)에는 유의미한 차이가 없었다(표 4).However, there was no significant difference in root hair density (number of root hairs) of wild-type, mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) and overexpressed plants (35S :: OsCSLD1) (Table 4).
실시예 7: 과발현 식물체의 양분 흡수능 분석Example 7: Analysis of Nutrient Absorption Capacity of Overexpressing Plants
뿌리 및 뿌리털의 신장이 촉진된 본 발명에 의한 OsCSLD1 과발현 식물체가 양분 흡수 능력상에 어떤 차이가 있는지 확인하였다. OsCSLD1 overexpressed plants according to the present invention, which promoted elongation of roots and root hairs, were identified for differences in nutrient absorption capacity.
정상 식물체(wild-type), 돌연변이 식물체(OsCSLD1::Ds) 및 과발현 식물체 (35S::OsCSLD1)의 종자를 24시간 동안 0.05% prochloraz에서 소독하여 증류수로 세척한 후 9-cm-diam Petri dishes 위에 Whatmman No. 2 filter paper를 깔고 종자를 치상한 다음 30℃의 암조건에서 5일 동안 발아시켰다. 발아 식물체를 양액 [Carmak and Marschner(1992) 0.88mM K2SO4, 1mM Ca(NO3)2, 1mM (NH4)2SO4, 1mM MgSO4, 0.25mM KH2PO4, 0.1mM KCl, 40uM FeEDTA, 10μM H3BO4, 1μM MnSO4, 1μM ZnSO4, 0.1μM CuSO4 and 0.01μM (NH4)6MoO24]이 담긴 상자로 옮겨 growth camber [16h photoperiod at 30/22℃ day/night and 70% RH, 250mE m-2 s-1 ] 안에서 15일 동안 매 2일마다 양액을 교환하며 길렀다. 15일 후 뿌리를 잘라 70℃에서 3일간 건조시킨 후 분말화하였다. 각각의 뿌리 분말을 1N HCl에 넣고 24 시간 교반한 후 Whatmman No. 2 paper로 filter하여 추출액을 얻었다. Seeds of wild-type, mutant plants ( OsCSLD1 :: Ds ) and overexpressing plants (35S :: OsCSLD1) were sterilized in 0.05% prochloraz for 24 hours in distilled water and then washed on 9-cm-diam Petri dishes. Whatmman No. 2 filter papers were put on the seeds and germinated for 5 days at 30 ° C dark conditions. Germinated plants were nutrient solution [Carmak and Marschner (1992) 0.88 mM K 2 SO 4 , 1 mM Ca (NO 3 ) 2 , 1 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 mM MgSO 4 , 0.25 mM KH 2 PO 4 , 0.1 mM KCl, Transfer to a box containing 40 uM FeEDTA, 10 μM H 3 BO 4 , 1 μM MnSO 4 , 1 μM ZnSO 4 , 0.1 μM CuSO 4 and 0.01 μM (NH 4 ) 6 MoO 24 ] growth camber [16h photoperiod at 30/22 ° C day / night and 70% RH, 250mE m −2 s −1 ] in nutrient solution every 2 days for 15 days. After 15 days, the roots were cut, dried at 70 ° C. for 3 days, and then powdered. Each root powder was added to 1N HCl and stirred for 24 hours, followed by Whatmman No. Filter with 2 paper to obtain an extract.
plasma spectrophotometry로 상기추출액 중의 양분의 미량원소 함량을 측정하였다(도 11). 도에서 볼 수 있듯이 본 발명에 의한 과발현 식물체가 정상적인 식물체 보다 Mg, Zn, Fe, Mn, Cu 등 전체 미량원소 흡수 능력이 현저하게 우수함을 확인하였다.The trace element content of the nutrients in the extract was measured by plasma spectrophotometry (FIG. 11). As can be seen in the overexpressing plants according to the present invention it was confirmed that the total trace element absorption capacity, such as Mg, Zn, Fe, Mn, Cu significantly superior to the normal plants.
본 실시예는 실험의 오차를 줄이기 위하여 3회 반복하였다. This example was repeated three times to reduce the error of the experiment.
본 발명에 의하여 실험적, 농업적으로 중요한 뿌리와 뿌리털의 발생과 발달을 조절할 수 있는 OsCSLD1 유전자의 기능이 구명되었으며 이를 통하여 양분과 수분의 흡수 능력을 향상 시킬 수 있는 식물체를 창출하였다. According to the present invention, the function of the OsCSLD1 gene, which can control the development and development of experimental and agriculturally important roots and root hairs, has been investigated , thereby creating a plant that can improve the ability to absorb nutrients and moisture.
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