KR100787830B1 - 돈단독균 불활화항원에 돈단독균 특이정제단백 항원을 첨가한 돈단독균 불활화백신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명자는 돈단독불활화백신의 면역효능을 향상시키기 위하여 불활화한 돈단독균체에 돈단독균 특이방어항원인 분비단백질을 정제, 농축하여 첨가한 돈단독불활화백신의 면역능에 미치는 효과를 시험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

돈단독균 배양상층액중의 정제단백항원의 항체형성능이 균체항원보다 월등하였으며 마우스 방어효과도 보다 우수하였다. 또한 돈단독불활화 항원에 정제단백항원을 첨가하므로서 항체가 및 방어가 모두가 향상되었다.

상기의 불활화항원과 정제단백 혼합항원에 돈단독 특이항체 또는 glucan 등 면역증강물질을 첨가하므로서 항체가 및 방어효과의 현저한 상승효과를 나타내었다.

마우스에서 면역원성 향상효과가 확인된 항원으로 제조한 돈단독불활화백신을 목적동물인 이유자돈에 접종하고 항체형성능 및 안전성을 시험한 바 불활화항원만으로 만든 백신보다 균질화항원에 항체를 첨가하거나 불활화 항원에 정제단백 및 항체를 첨가한 군의 항체가가 월등히 높았으며 시험기간 동안 발열 등 이상반응이 관찰되지 않아 안전성이 확인되었다.

돈단독 불활화백신, 정제단백항원, 돈단독 특이항체, 면역증강물질

Description

돈단독균 불활화항원에 돈단독균 특이정제단백 항원을 첨가한 돈단독균 불활화백신의 제조방법{The preparing method of inactivated vaccine of Swine Erysipelas prepared with inactivated antigen and specific purified protein antigen of Swine Erysipelas}

도1은 돈단독균의 세포외막단백(OMP) 및 배양액상층액중의 단백의 SDS-PAGE 양상을 나타낸 것이다.

도2는 돈단독균을 균질화(Sonication)한 전자현미경 사진으로 도2a는 초음파파쇄기로 10분간 처리하여 파괴되지 않은 균체와 파괴된 균물질이 혼재되어있음을 나타내며 도2b는 초음파파쇄기로 40분간 처리하여 완전 파괴된 균체성분을 나타낸 것이다.

본 발명은 돈단독균 불활화백신의 면역원성 향상을 위해 불활화시킨 배양 돈단백항원에 돈단독균 배양물로부터 추출한 정제단백항원(43, 63-33kDa)을 첨가하거나 불활화 돈단독균항원 및 정제단백항원 혼합물에 돈단독균 특이항체, 돼지보체, 면역증강물질을 첨가하여 만든 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다.

지금까지 생산되고 있는 돈단독균 불활화백신은 액체배지에서 배양한 균을 적정농도의 포르말린으로 불활화하고 보좌제로서 겔을 첨가하여 제조하고 있으나, 이렇게 생산된 불활화백신항원은 약독화 생균백신항원에 비해 안전성은 높으나 면역원성이 낮아 큰 문제가 되고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 돈단독균 불활화항원에 돈단독균 배양상층액으로부터 정제, 농축한 특이방어항원인 단백질을 정제 및 농축하여 첨가하여 돈단독균항원을 생산함으로써 면역효능을 획기적으로 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고 그 면역효과를 시험하여 개발백신의 면역효과가 크게 증진되었음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

첫째, 본 발명은 돈단독균 생산용배지에 돈단독 종균을 배지량의 0.1부피%되게 접종하고 37℃, 18-20시간 배양한 것을 0.2부피% 포르말린을 첨가하여 불활화하고 5000 × g, 30분간 원심분리하여 가라앉은 균을 제거한 상층액을 수집하고 여기에 황산암모늄(ammonium sulfate)을 포화용액이 되도록 서서히 첨가하여 단백질을 분리하고 단백질정제용 투석막에 넣어 단백질 이외의 불순물들을 제거한 후 수집한 정제단백질(43, 63-66kDa)을 부피비로 배양상층액의 1/10양이 되도록 PBS(PH 7.21)에 부유시켜 돈단독균 특이방어항원(이하 "정제단백"이라 함)으로 제조하고, 상기 정제단백을 돈단독균 불활화항원에 30-50부피% 되도록 첨가하고 혼합하여 제조되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다. 도1의 SDS-PAGE 양상에서 상기 돈단독균 특이방어항원인 정제단백인 43 및 64-66kDa의 밴드가 모든 배양물에서 관찰됨을 확인할 수 있다.

둘째, 본 발명은 상기 정제단백이 첨가되어 제조된 돈단독균 불활화항원에 돈단독균 특이항체를 부피비로 항원양의 1/10이 되도록 첨가하고 37℃, 1시간 반응시켜 제조되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다.

셋째, 본 발명은 상기 정제단백이 첨가되어 제조된 돈단독균 불활화항원에 돼지보체를 부피비로 항원양의 1/10이 되도록 첨가하고 37℃ 1시간 반응시켜 제조되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다. 상기 돼지보체는 자이모산(Zymosan)처리 활성화 돼지보체임이 바람직하다.

넷째, 본 발명은 상기 정제단백이 첨가되어 제조된 돈단독균 불활화항원에 면역증강물질를 부피비로 항원양의 1/10이 되도록 첨가하여 제조되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다. 상기 면역증강물질은 베타글루칸(Sigma G-5011), 본 발명자가 개발하여 산업화한 제제(특허 10-179338, 1998.11.26)인 이뮤노스티(대성미생물연구소, 제조번호 2501)임이 바람직하다.

다섯째, 본 발명은 돈단독균 생산용배지에서 배양한 돈단독균 배양물을 초음파파쇄기로 40분간 균질화하여 만든 돈단독균 균질화항원에 항체역가 20배인 돈단독균 특이항체를 부피비로 항원양의 1/10이 되도록 첨가하고 37℃ 1시간 반응시켜 제조되는 돈단독균 불활화백신에 관한 것이다. 도2의 돈단독균을 균질화한 전자현미경 사진에서 초음파파쇄기로 10분간 처리한 경우는 파괴되지 않은 균체와 파괴된 균물질이 혼재하나(도2a) 초음파파쇄기로 40분간 처리한 경우 완전 파괴된 균체성분을 볼 수 있다(도2b).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예1 . 돈단독균 배양 및 불활화

공시균주 : 돈단독불활화백신 생산에 사용한 균주는 강독주인 T2주를 사용하였다.

생산용 배지

Proteose peptone N0.3 5g

Yeast extract 5g

Na2HPO4 12g

KH2PO4 2.1g

Tween 80 1ml

Arginine solution 5ml

Glucose solution 2ml

Gelatin solution 2ml

D.W 1,000ml

pH 7.4 - 7.5

균배양 및 불활화 : 생산용배지에 종균을 배지량의 0.1부피%되게 접종하고 37℃에서 18-20시간 배양하였다. 배양물은 0.2부피%되도록 formalin을 첨가하여 실온에서 2-3일 정치하며 불활화하였다.

실시예2 . 돈단독균 균질화항원 제조

실시예1의 배지에서 배양한 돈단독균 배양물을 초음파파쇄기로 40분간 균질화하여 균체를 완전히 파괴하였다. 여기에 보좌제로 알루미늄겔을 항원양의 15부피%가 되도록 첨가하여 냉장실에 보관하였다.

실시예3 . 돈단독균 배양상층액 중의 정제단백항원 제조

실시예1의 배지에서 37℃, 18-20시간 배양한 것을 배양물의 0.2부피%가 되도록 formalin을 첨가하여 불활화하고 5000 × g, 30분간 원심분리하여 가라앉은 균을 제거한 상층액을 수집하고 여기에 황산암모늄을 포화용액이 되도록 서서히 첨가하여 단백질을 분리, 정제하였다. 분리한 정제단백을 단백질정제용 투석막에 넣어 충분한 양의 증류수가 있는 비커에서 교반하면서 3일간 냉장실에서 단백질이외의 불순물들을 제거한 후 수집한 순수단백질을 부피비로 배양상층액의 1/10양이 되도록 PBS(pH 7.2)에 부유시켜 사용할 때까지 냉장보관하였다.

실시예4 . 정제단백을 이용한 돈단독균 불활화백신 제조

실시예1의 불활화 돈단독균 배양물에 실시예3의 정제단백을 10, 30, 50부피%되도록 첨가하여 혼합하고 보좌제로 알루미늄 겔을 항원량의 15부피%가 되도록 첨가하여 냉장실에서 보관하였다.

실시예5 . 정제단백을 이용한 돈단독균 불활화항원에 면역증강물질을 첨가한 돈단독균 불활화백신 제조

정제단백첨가 불활화백신의 면역원성을 향상시키기 위하여 조제한 실시예4의 겔흡착 불활화백신에 돈단독균 특이항체, 개발 면역증강제 등을 백신양의 10부피%가 되도록 첨가하였다. 첨가한 특이항체 및 면역증강물질은 다음과 같다.

- 고도면역 토끼혈청; 돈단독(항체가; 1:80, 1:20)

- 보체; Zymosan활성화 돼지보체

- Glucan(Sigma G-5011); 1mg/ml 농도로 조제하여 사용

- 개발 면역증강제; 국내 제품 (이뮤노스티: 대성미생물연구소, 제조번호 2501) * 개발 면역증강제는 본 연구자가 개발하여 산업화한 제제(특허 10-179338, 1998.11.26)임.

실험예1 . 항원제조 방법별 돈단독균 불활화항원의 면역원성

돈단독 T2주 배양균을 0.2부피% formalin을 첨가하여 불활화한 항원, 배양균을 초음파파쇄기로 균질화한 항원 및 돈단독균 배양 상층액에서 정제한 단백항원 각각에 알루미늄 겔을 15부피% 첨가하고 백신을 제조하여 체중 20-25g의 ICR 마우스에 항체조사용은 백신 원액을, 방어효과 조사용 백신은 10-30배 희석하여 한 희석배수당 3-4수의 마우스를 공시하여 피하로 0.2ml 접종하고 2주후의 혈중항체가와 병원성돈단독균(T2주)으로 공격접종(100LD₅₀/0.2ml) 후의 방어효과를 조사한 결과는 표 1과 같다. 배양균 불활화항원 또는 균질화항원 접종마우스의 항체가는 동일하게 16배로 나타났으나 정제단백 항원으로 제조한 백신의 혈중항체가는 현저히 높았고 제조한 단백질 농도에 비례하여 항체가가 증가하여 단백농도 30부피%, 50부피%, 100부피%의 항원접종 마우스의항체가가 각 32배, 64배 및 128배였다.

백신을 희석접종한 마우스의 공격접종에 대한 방어효과는 대조군인 배양균 불활화항원의 방어가 25%보다 균질화항원 접종 마우스의 방어가가 33.3%로 다소 높았고 가장 높은 방어효과를 보인 것은 100% 정제단백항원을 접종한 마우스로 방어가가 36.4%였으며 50부피% 및 30부피% 정제단백 항원을 접종한 마우스의 방어가도 33.3%로 배양균 불활화항원 접종군보다 높았다.

실험예2 . 돈단독 불활화 항원에 정제단백첨가 돈단독균 백신의 면역원성

불활화 항원에 정제단백을 10, 30, 50부피% 첨가하고 백신을 제조하여 마우스에 1회 접종한 후 2주후의 혈중항체가와 공격접종에 대한 방어효과를 조사한 결과는 표 2와 같다. 항체가는 배양균 불활화항원 접종 마우스는 8배였으나 정제단백항원군은 매우 높은 항체형성능을 보였으며 첨가한 단백항원의 농도에 따라 상승하여 10부피%, 30부피%, 50부피% 및 정제단백 100부피% 접종군의 항체가가 각 16, 32, 64, 128배였다. 공격접종에 대한 방어효과는 불활화항원군 30.0%에 비하여 정제단백항원 첨가군의 방어가는 전반적으로 상승하여 10부피%, 30부피%, 50부피% 첨가군의 방어가가 각 33.3%, 36.4%, 50.0%였다.

실험예3 . 돈단독균 특이항체처리 균질화항원의 면역원성

균질화항원에 돈단독 면역혈청(항체가; 20배)을 첨가하고 37℃, 1시간 처리하여 만든 항원과 균질화항원과의 면역능을 비교하기 위하여 마우스에 항원을 접종한 2주후의 혈중항체가와 공격접종에 대한 방어효과를 조사한 결과는 표 3과 같다. 마우스 항체가는 항체로 처리하지 않은 균질화항원을 접종한 균의 4배보다 항체로 처리한 군의 항체가가 4배이하로 낮았으나 방어가는 항체처리하지 않은 군의 50%보다 현저히 높은 75.0%를 나타냈다.

실험예4 . 정제단백첨가 돈단독균 항원에 면역증강물질 첨가에 따른 면역원성

돈단독균 불활화항원에 정제단백항원을 10부피%첨가하여 복합항원을 만들고 여기에 특이항체 등 면역증강물질을 첨가하여 마우스에서의 면역원성을 시험한 결과는 표4와 같다. 항체가는 항원에 항체(항체가 20배), beta-glucan을 첨가한 군이 각 32배와 16배로 대조군인 불활화항원 접종군의 항체가 8배 보다 다소 높았으나 그이외의 면역증강물질 첨가군의 항체가는 대조군과 같거나 약간 낮았다. 그러나 공격접종에 대한 마우스방어가는 대조군의 25.0%에 비해 면역증강물질 첨가한 군의 방어가가 모두 높아 항체 (20배, 80배)처리군, 개발 면역증강제, beta-glucan 및 돼지보체 첨가군의 방어가가 각 66.7, 50.0, 50.0, 50.0, 33.3%였다.

실험예5 . 항원별 이유자돈에 대한 항체형성능 및 안정성

각종 시험백신의 목적동물인 돼지에서의 면역원성을 조사하기 위하여 백신별로 50일령의 이유자돈 각 2두씩에 근육으로 2ml씩 접종하고 2주후의 항체형성능과 안전성을 조사한 결과는 표 5와 같다. 기존의 불활화균체항원으로 만든 백신의 평균항체가 10배보다 균질화항원에 항체(20배)를 첨가한 백신과 불활화항원에 정제단백 50부피% 및 항체(20배)를 첨가한 백신의 항체가가 각 36배 및 24배로 월등히 높았다. 이외에도 100부피% 상층액 항원, 불활화항원에 정제단백(20부피%) 첨가한 항원 및 불활화항원에 정제단백(50부피%) 및 개발 면역증강제(20부피%)를 첨가한 백신을 접종한 군의 항체가가 모두 16배로 불활화항원만 접종한 군보다 다소 높았다. 백신접종 후 2주간 임상관찰 결과 발열 등 이상반응이 나타나지 않아 안전성이 확인되었다.

표1. 항원제조 방법별 돈단독균 불활화항원의 면역원성

항 원 별	항체가(GAT)**	마우스 방어효과(%) (10-30배 백신희석 접종)
균질화 항원	16	4/12*(33.3)
정제단백항원(100%) 정제단백항원(50%) 정제단백항원(30%)	128 64 32	4/11(36.4) 4/12(33.3) 4/12(33.3)
배양균 불활화항원	16	3/12(25.0)

* 생존 마우스 수/공격접종한 마우스 수

** GAT : Growth agglutination test

표2. 배양균 불활화항원에 정제단백 첨가 돈단독백신의 면역원성

항 원 조 성	항 체 가 (GAT)	마우스 방어효과(%) (10-30배 백신희석 접종)
불활화항원+정제단백(10%) 불활화항원+정제단백(30%) 불활화항원+정제단백(50%)	16 32 64	4/12(33.3) 4/11(36.4) 6/12(50.0)
정제단백(100%)	128	5/12(41.7)
불활화항원	8	3/10(30)

표3. 돈단독 특이항체처리 균질화항원의 면역원성

항 원 별	항체가(GAT)	마우스 방어효과%) (5-30배 백신희석 접종)
균질화항원+항체(20배)	<4	9/12(75.0)
균질화항원	4	6/12(50.0)

표4. 돈단독 복합항원에 면역증강물질 첨가에 따른 면역원성

항 원 별	항 체 가 (GAT)	마우스 방어효과(%) (10-30배 백신희석접종)
불활화항원+정제단백(10%)+항체(80배) 불활화항원+정제단백(10%)+항체(20배) 불활화항원+정제단백(10%)+면역증강제 불활화항원+정제단백(10%)+Glucan 불활화항원+정제단백(10%)+돼지보체	8 32 4 16 8	6/12(50.0) 8/12(66.7) 6/12(50.0) 6/12(50.0) 4/12(33.3)
불활화항원	8	3/12(25.0)

표5. 항원별 이유자돈에 대한 항체형성능 및 안전성

항 원 별	자돈번호	항체가(GAT)		안정성 (발열 등 임상증상)
		개체별	평 균
100% 상층액	9	16	16	이상없음
	10	16		"
균질화항원+항체(20배)	26	64	36	"
	27	8		"
균질화항원	28	8	6	"
	29	4		"
불활화항원+ 정제단백(20%)	30	16	16	"
	31	16		"
불활화항원+ 정제단백(10%) +항체(80배)	32	8	8	"
	33	8		"
불활화항원+ 정제단백(50%) +항체(20배)	36	16	24	"
	37	32		"
불활화항원+ 정제단백(50%) +면역증강제(20%)	38	16	16	"
	39	16		"
불활화항원	7	16	10	"
	8	4		"

이상에서 설명한 바와 같이 정제단백을 첨가하거나 균질화한 독단독균 불활화항원은 대조군에 비해 유의하게 면역원성이 증가됨을 알 수 있으며, 이는 배양상측액으로 분비된 균단백이 독단독균 특이항원(43, 63-66kDa)으로 작용함으로써 들어가게 되는 돈단독균 특이항원양이 대조군보다 더 많아지기 때문이다.

또한, 본 발명에서 개발한 기술은 기존의 돈단독 불활화백신 생산공정에 쉽게 적용이 가능하므로 활용성 및 산업화가능성이 매우 높다. 또한 본 발명이 돈단독 불활화백신 생산에 적용되면 백신의 효능이 크게 향상되어 양돈농가의 돼지 급, 만성 전염병인 돈단독으로 인한 경제적 피해를 감소시킬 수 있을 뿐아니라 급격히 수입물량이 증가하고 있는 외국백신과의 경쟁력도 강화될 것으로 기대된다.

Claims (8)

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2. 돈단독균 생산용배지에 돈단독 종균을 배지량의 0.1부피%되게 접종하고 37℃, 18-20시간 배양한 것을 배양액 양의 0.2부피%가 되도록 포르말린을 첨가하여 불활화하고 5000 × g, 30분간 원심분리하여 가라앉은 균을 제거한 상층액을 수집하고 여기에 황산암모늄(ammonium sulfate)을 포화용액이 되도록 서서히 첨가하여 단백질을 분리하고 단백질정제용 투석막에 넣어 단백질 이외의 불순물들을 제거한 후 수집한 정제단백질을 부피비로 배양상측액의 1/10양이 되도록 PBS(PH 7.2)에 부유시켜 돈단독균 특이방어항원으로 제조된 정제단백을 돈단독균 불활화항원에 10-50부피% 되도록 첨가하고 혼합한 혼합물에 돈단독균 특이항체를 부피비로 혼합물양의 1/10이 되도록 첨가하고 37℃, 1시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 돈단독균 불활화백신의 제조방법.
3. 청구항 2의 정제단백과 돈단독균 불활화항원의 혼합물에 돼지보체를 부피비로 혼합물양의 1/10이 되도록 첨가하고 37℃ 1시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 돈단독균 불활화백신의 제조방법.
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