KR100784168B1

KR100784168B1 - New xylanase having increased thermostability

Info

Publication number: KR100784168B1
Application number: KR1020060072962A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 정미영
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-12-10

Abstract

A novel xylanase is provided to be successfully used for producing an enzymatic protein of other variant type with excellent thermostability by showing increased thermostability without changing any enzymatic property by introducing a disulfide bond into a xylanase(XynA) structure. A xylanase includes an amino acid sequence described as SEQ ID : NO. 2 and is characterized in that Cys 100 and Cys 150 have a disulfide bond. A xylanase gene includes a sequence of SEQ ID : NO. 3 encoding the amino acid sequence described as SEQ ID : NO. 2. A recombinant vector includes the xylanase gene. A host cell is transformed by the recombinant vector.

Description

열안정성이 증대된 신규 자일란 분해효소 {New xylanase having increased thermostability}New xylanase having increased thermostability}

도 1은　XynA내로의　이황화　결합　도입을　위한　아미노산　잔기　선별　방법의　제시　및　예상된　야생형과　변종형　XynA의　구조를 보여준다.Fig. 1 shows the structure of the amino acid and the expected wild type and the variant XynA, showing the selection of the amino acid residue residue for the introduction of disulfide bonds into XynA.

도 2는 변종형　XynA를 생산하기 위해 돌연변이된 xylanase 유전자를 가지는 플라스미드 pHINC5.5/SNC의 지도이다.Figure 2 is a map of plasmid pHINC5.5 / SNC with xylanase gene mutated to produce variant XynA.

도 3은 히스티딘을 결합시킨 변종형 XynA를 과발현시키기 위한 재조합 벡터 pET/XynA(SNC)의 지도이다.3 is a map of the recombinant vector pET / XynA (SNC) for overexpressing variant XynA with histidine bound.

도 4는 야생형과　변종형　XynA의 thermostability (A)와　thermophilicity (B)를 나타내는 그래프이다. ◇, XynA WT; ■, XynA SNC4 is a graph showing the thermostability (A) and thermophilicity (B) of wild type and mutant XynA. ◇, XynA WT; ■, XynA SNC

도 5는 고온 처리에 의한 야생형과 변종형 XynA의 온도에 따른 실활 그래프 (A) 및 열처리 비활성 에너지에 대한 Arrhenius 그래프 (B)이다. ◇, XynA WT; ■, XynA SNC5 is an inactivation graph (A) and Arrhenius graph (B) of heat treatment inert energy according to the temperature of wild type and mutant XynA by high temperature treatment. ◇, XynA WT; ■, XynA SNC

도 6은 야생형과 변종형 XynA의 온도에 따른 기질 가수 분해 양상을 나타내는 그래프이다. ◇, XynA WT; ■, XynA SNC6 is a graph showing the substrate hydrolysis of the wild type and mutant XynA with temperature. ◇, XynA WT; ■, XynA SNC

본 발명은 열안정성이 증대된 신규 자일란 분해효소 (xylanase)에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 토양으로부터 분리한　바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) No. 236 균 유래의　자일란 분해효소 분자 내에 새로운　이황화　결합을　도입함으로써 열안전성이 증대된 신규 자일란 분해효소에 관한 것이다.The present invention relates to a novel xylanase (xylanase) with increased thermal stability, more specifically Bacillus stearothermophilus No. The present invention relates to a novel xylan degrading enzyme whose thermal safety is enhanced by introducing a new disulfide bond into a xylan degrading enzyme derived from the bacteria.

Endo-β-1,4-xylanase (EC 3.2.1.8)는 xylan이라는 자연계에 널리 존재하는 이질 다당체의 β-1,4-결합된　xylopyranose를 가수분해하는 효소이다. Xylan을 분해하는 주된 효소들은 지난 세기 동안 식품, 음료, 사료 및　제지 공업 등의 다양한 산업에서 널리 사용되고 있다. 그러나 산업적 이용 과정에 있어서 높은 온도와 극한의 pH와 같은 공정 조건은 효소의 산업적 이용에 많은 제약이 되고 있다.Endo-β-1,4-xylanase (EC 3.2.1.8) is an enzyme that hydrolyzes the β-1,4-linked βxylopyranose of a heterologous polysaccharide widely found in nature called xylan. The main enzymes that break down Xylan have been widely used in various industries, such as the food, beverage, feed and paper industry for the last century. However, process conditions such as high temperature and extreme pH in the industrial use process are a lot of constraints on the industrial use of the enzyme.

이러한 산업적 이용에 있어서의 제약을 해결하기 위해 많은 연구자들은 다음의 두 가지 서로 다른 접근 방법을 통해 본래보다 높은 열안정성을 가지는 xylan 분해 효소를 개발하고자 하였다. 그 하나는 고온성의 미생물을 동정해 고온에 저항성을 가지는 xylanase를 새롭게 클로닝하는 것이고, 다른 하나는 중온성의 xylanase를 극한의 조건에 견딜 수 있도록 분자생물학적 기술을 이용해 변화시키는 것이었다 (Kulkarni et al, (1999) FEMS Microbiol. Rev. 23, 411-45).To address the limitations of this industrial use, many researchers have attempted to develop xylan degrading enzymes with higher thermal stability than inherent in two different approaches. One is to identify high-temperature microorganisms and to clone new xylanase that is resistant to high temperatures, and the other is to change mesophilic xylanase using molecular biological techniques to withstand extreme conditions (Kulkarni et al, (1999). FEMS Microbiol. Rev. 23, 411-45).

현재까지 연구되어진 고온성 xylanase의 구조적 정보는 중온성 패밀리 11 xylanase의 열안정성에 영향을 미치는 잠재적인 요소들을 제시해 주고 있다. 이러한 요소들은 원자의 빈도, 전하를 가지는 아미노산, 수소 결합과 이황화 결합들로 효소 단백질 분자 내에 이들 요소들의 증가가 분자 구조의 상호작용 네트워크를 증가시키는 것으로 보고되었다 (Hakulinen et al, (2003) Eur. J. Biochem. 270, 1399-1412). 그러나, 기하학적 측면만을 고려한 이황화 결합의 디자인은 많은 후보 아미노산 조합들로 인해 그 선택에 어려움을 가지고 있다.The structural information of the pyrogenic xylanase studied to date suggests potential factors affecting the thermal stability of the mesophilic family 11 xylanase. These factors include the frequency of atoms, amino acids with charge, hydrogen bonds and disulfide bonds, and it has been reported that the increase of these elements in the enzyme protein molecule increases the interaction network of the molecular structure (Hakulinen et al, (2003) Eur. J. Biochem. 270, 1399-1412). However, the design of disulfide bonds, considering only geometric aspects, has difficulty in selecting because of the many candidate amino acid combinations.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분자 내 이황화 결합 도입을 예측함에 있어서 종래의 기하학적 측면과 더불어 새롭게 이황화 결합에 관여하는 cystein 잔기 보존성을 분석하여 실제 이황화 결합 가능성을 높일 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have diligently researched to overcome the problems of the prior arts, and as a result, in the prediction of the introduction of intramolecular disulfide bonds, the possibility of actual disulfide bonds is analyzed by analyzing cystein residue retention that is newly involved in disulfide bonds. It was confirmed that it can increase, and the present invention was completed.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 새로운 이황화 결합의 도입을 통해 열안정성이 증대된 신규 자일란 분해효소 (xylanase)를 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention is to provide a novel xylanase (xylanase) with increased thermal stability through the introduction of a new disulfide bond.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 자일란 분해효소를 생산하기 위한 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector for producing the novel xylan degrading enzyme and a host cell transformed thereby.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 Cys 100과 Cys 150이 이황화결합을 갖는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소(xylanase)를 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a xylanase which has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and Cys 100 and Cys 150 have disulfide bonds.

본 발명에 있어서, 야생형 자일란 분해효소(XynA WT)의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시하였고, 변종형 자일란 분해효소(XynA SNC)의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시하였다.In the present invention, the amino acid sequence of wild-type xylan lyase (XynA WT) is represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the variant xylan lyase (XynA SNC) is represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소 유전자를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a xylan degrading enzyme gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명에 있어서, 상기 자일란 분해효소 유전자의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 어떤 염기서열도 될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the nucleotide sequence of the xylan degrading enzyme gene may be any nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, preferably characterized by having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 자일란 분해효소 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant vector comprising the xylan degrading enzyme gene according to the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 본 발명의 자일란 분해 효소 유전자를 포함하는 어떤 재조합 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 도 2의 개열지도를 갖는 pHINC5.5/SNC인 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 pET/XynA(SNC)인 것을 특징으로 한다. 상기 pET/XynA(SNC)는 히스티딘을 결합시킨 재조합 효소 단백질을 과발현시킬 수 있으며 정제가 용이하다.In the present invention, the recombinant vector may be any recombinant vector including the xylan degrading enzyme gene of the present invention, and preferably, pHINC5.5 / SNC having a cleavage map of FIG. 2. More preferably, it is characterized in that the pET / XynA (SNC). The pET / XynA (SNC) can overexpress the recombinant enzyme protein bound to histidine and is easy to purify.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a host cell, characterized in that transformed with the recombinant vector according to the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 재조합 벡터내 자일란 분해 효소 유전자를 발현시키는 프로모터의 종류에 따라 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으나, 바람직하게는 대장균(E.coli)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 일례로 E.coli BL21 (DE3)을 사용하였다.In the present invention, the host cell may be prokaryotic or eukaryotic, depending on the type of the promoter expressing the xylan degrading enzyme gene in the recombinant vector, but is preferably E. coli. In the embodiment of the present invention, E. coli BL21 (DE3) was used as an example.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 토양으로부터 분리한 B. stearothermophilus No.236이 생산하는 endo-β-1,4-xylanase (Cho and Choi, (1996) J. Microbiol. Biotechnol. 6, 79-8)에 새로운 이황화 결합을 도입하는 변이 (mutation)을 통해 열안정성을 증가시켜 산업적으로 유용한 효소 단백질 개발을 목적으로 하였다. 이 효소는 약 22,000 kDa의 분자량을 가지는 것으로 측정되었으며, 55℃와 pH 8.0에서 가장 높은 효소 활성을 가지며, 염기서열의 비교 분석 결과 중온성 xylanase family 11 로 분류되었다. 선행연구를 통한 xylanase 유전자의 클로닝, 분자적 수준에서의 특성분석은 본 실험에서의 이 효소의 유전자 조작을 더욱 용이하게 하였다.The present invention provides a new disulfide bond to endo-β-1,4-xylanase (Cho and Choi, (1996) J. Microbiol. Biotechnol. 6, 79-8) produced by B. stearothermophilus No. 236 isolated from soil. The purpose of the present invention is to develop enzyme proteins that are industrially useful by increasing thermal stability through mutations. The enzyme was measured to have a molecular weight of about 22,000 kDa, has the highest enzyme activity at 55 ℃ and pH 8.0, and was classified into mesophilic xylanase family 11 as a result of comparative analysis of the sequences. Cloning of the xylanase gene from previous studies and characterization at the molecular level further facilitated the genetic manipulation of this enzyme in this experiment.

새로운 이황화 결합의 도입에 있어서는 기존의 이황화 결합 가능성의 기하학적 분석과 더불어 같은 family에 속하는 효소 단백질들에 대한 아미노산 서열의 분석 및 구조의 비교 분석을 통해 이황화 결합을 디자인 하였다. 그 결과, 새로운 이황화 결합을 통해서 중온성의 xylanase의 열안정성이 실제로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.In the introduction of new disulfide bonds, disulfide bonds were designed through the geometric analysis of the possibility of disulfide bonds as well as the analysis of the amino acid sequence and the structure of enzyme proteins belonging to the same family. As a result, it was confirmed that the thermal stability of mesophilic xylanase actually increased through the new disulfide bond.

본 발명의 실험 결과들을 종합해 볼 때, XynA 구조 내로의 새로운 이황화 결합의 도입은 이 효소 단백질의 효소적 특성을 변화시키지 않으면서, 열역학적 안정성만을 증가시킨다고 결론을 내릴 수 있었다. 이 실험에서 우리는 아미노산 서열 비교를 통한 유전적 보전성 분석을 통해 효과적인 cysteine 잔기를 찾아 낼 수 있었지만, 이것은 유전적으로 보존된 cysteine 잔기를 가지지 않는 다른 효소 단백질에 적용할 수 없다는 한계를 가진다. 그러나 기하학적 측면만을 고려한 이황화 결합의 디자인의 어려움을 고려해 볼 때, 현재 본 발명이 제시한 방법은 고전적인 방법들에 비해 보다 효과적인 결과를 가져올 것으로 예상된다.Combining the experimental results of the present invention, it was concluded that the introduction of new disulfide bonds into the XynA structure only increased thermodynamic stability without changing the enzymatic properties of this enzyme protein. In this experiment, we were able to find effective cysteine residues through genetic integrity analysis through amino acid sequence comparisons, but this is not applicable to other enzyme proteins that do not have genetically conserved cysteine residues. However, given the difficulty of designing disulfide bonds considering only geometric aspects, the present method is expected to produce more effective results than the classical methods.

결론적으로, XynA 구조 내에 전략적으로 도입된 이황화 결합이 이 효소의 열처리에 의한 비활성에 대한 저항도를 효과적으로 증가시키는 것으로 나타났으며, 우리가 처음으로 제시한 이 방법이 열안정성이 뛰어난 변종형의 효소 단백질을 생산해 내는데 성공적으로 쓰일 수 있을 것이라고 생각되어 진다. In conclusion, the disulfide bonds strategically introduced into the XynA structure have been shown to effectively increase the resistance of the enzyme to inactivation due to heat treatment. It is thought that it can be used successfully to produce protein.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예1. 사용된 미생물의 계통, 플라스미드와 배양조건Example 1 Microorganism Lines Used, Plasmids and Culture Conditions

E. coli DH5는 xylanase 유전자를 가지는 재조합 플라스미드의 생산 및 세포의 조효소액 생산에 대한 숙주세포로 사용되었다. 크로모좀 내에 T7 RNA polymerase 유전자를 가지는 E. coli BL21 (DE3)는 xylanase 효소의 대량생산을 위한 숙주세포로 사용되었다. 재조합 플라스미드 pHINC5.5는 B．stearothermophilus No. 236 genomic DNA로부터 유래한 활성 xylanase 유전자를 포함하는 1.4 Kb DNA 단편을 가지며 (Ha et al., (2001) J. Microbiol. Biotechnol. 11, 131-137), 본 실험에서는 xylanase 유전자의 공급원으로 사용되었다. XynA 유전자 및 프로모터를 포함하는 5 kb의 DNA 단편을 B. stearothermophilus No. 236의 게놈 (genome)으로부터 shot-gun 방법을 통해 pUC19 벡터(ATCC 37254)의 SphI site에 클로닝하였다. 이 플라스미드를 제한효소인 HincII를 처리하여, 벡터 내의 MCS (multicloning site)에 존재하는 HincII와 xynA 유전자의 start site로부터 약 200 bp 위쪽에 존 재하는 HincII의 두 site를 잘라내어 벡터와 유전자를 포함하는 약 5.5 kb의 DNA 단편을 얻었으며, 이것을 self-ligation시킴으로써 얻은 플라스미드를 최종적으로 pHINC5.5로 명명하였다. 상기 설명된 E. coli 균주는 보통 Luria-Bertani (LB) 배지에서 적절한 항생제와 함께 37℃에서 배양하였으며, 필요한 경우, 단백질 발현 유도제로서 0.1 mM의 IPTG를　첨가하였다. E. coli DH5 was used as a host cell for the production of recombinant plasmids with xylanase gene and for the production of cell coenzyme solution. E. coli BL21 (DE3) with T7 RNA polymerase gene in chromosome was used as host cell for mass production of xylanase enzyme. Recombinant plasmid pHINC5.5 was determined by B. stotherothermophilus No. It had a 1.4 Kb DNA fragment containing an active xylanase gene derived from 236 genomic DNA (Ha et al., (2001) J. Microbiol. Biotechnol. 11, 131-137) and was used as a source of xylanase gene in this experiment. . A 5 kb DNA fragment containing the XynA gene and promoter was selected from B. stearothermophilus No. The genome of 236 was cloned into the SphI site of pUC19 vector (ATCC 37254) by shot-gun method. The plasmid was treated with the restriction enzyme HincII to cut two sites of HincII present at about 200 bp up from the start site of the HincII and xynA genes present at the MCS (multicloning site) in the vector, and the vector and gene containing the drug. A 5.5 kb DNA fragment was obtained and the plasmid obtained by self-ligation was finally named pHINC5.5. The E. coli strains described above were usually incubated at 37 ° C. with appropriate antibiotics in Luria-Bertani (LB) medium, and 0.1 mM IPTG was added as needed to induce protein expression.

실시예 2. 야생형과 변종형 XynA의 구조 예측Example 2. Structural Prediction of Wild and Variant XynA

B. stearothermophilus No. 236 XynA의 삼차구조의 예상은 B.　circulans xylanase (BCX)의 X-ray 구조　분석 결과 (Wakarchuk et al., (1994a) Protein Sci. 3, 467-47)에 이 두 단백질의 아미노산 서열을 InsightII Homology program (Accelrys, CA)을 이용하여 비교　분석하여 이루어졌다．야생형 XynA 및 변종형 XynA의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었다. BCX는 B. stearothermophilus No.236 xylanase와 83%의 상동성을 가지는 것으로　나타났다. 따라서, 본 실험에 사용된 프로그램은 자동적으로 B. stearothermophilus No.236의 아미노산 서열을　BCX와 비교하여 그 알려진 구조로부터 거리 제한 방법을 이용하여 전체적인 구조를 만들어 내었다. B. stearothermophilus No. 236 XynA's tertiary structure is predicted by analyzing the X-ray structure of B. circulans xylanase (BCX) (Wakarchuk et al., (1994a) Protein Sci. 3, 467-47). Comparative analysis was performed using the program (Accelrys, CA). The amino acid sequences of the wild type XynA and the variant XynA are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. BCX showed 83% homology with B. stearothermophilus No.236 xylanase. Thus, the program used in this experiment automatically compared the amino acid sequence of B. stearothermophilus No. 236 with BCX to produce the overall structure using distance limiting methods from its known structure.

실시예 3. Site-directed mutagenesisExample 3 Site-directed mutagenesis

이황화 결합 생성을 위한 아미노산 돌연변이(mutagenesis)는 플라스미드 pHINC5.5를 주형으로 Quick Change^TMsite-directed mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 이루어졌다. 돌연변이를 위한 프라이머 (primer)는 Genotech (Seoul, Korea)에서 합성되었으며, 그 서열은 다음과 같다. 주형과 결합되어지지 않는 부분은 밑줄을 쳐서 표시하였다; Ser100의 Cys로의 치환에는 sense primer (5’-GGGAACGGTGAACTGCGACGGAGG-3’) 그리고 anti-sense primer (5’-CCTCCGTCGCAGTTCACCGTTCCC-3’)가，Asn15０의 Cys로의 치환에는 sense primer (5’-CCATCACTTTCAGCTGTCACGTGAATGCC-3’) 그리고 anti-sense primer (5’-GGCATTCACGTGACAGCTGAAAGTGATGG-3’)가 사용되었다. 75 ng의 주형 DNA, 250 ng의 각 sense와 anti-sense 프라이머, 최종 농도 250 μM의 dNTP 혼합액, 버퍼와 Pfu polymerase를 포함하는 50 ㎕의 혼합액을 PCR 기계에 넣고, PCR 반응을 통하여 돌연변이를 일으켰다. 아미노산 서열의 돌연변이 확인은　DNA 염기서열 분석을 통해 이루어졌다. 돌연변이 xylanase 유전자의 염기서열은 서열번호 3으로 나타내었다. 돌연변이를 일으킨 xylanase 유전자를 가지는 플라스미드는　pHINC5.5/SNC라고 명명하였다 (도 2).Amino acid mutations for disulfide bond generation were made using the Quick Change ^™ site-directed mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, Calif.), With the plasmid pHINC5.5 as a template. Primers for mutations were synthesized at Genotech (Seoul, Korea) and the sequence is as follows. Parts not joined with the template are underlined; Substitution of Ser100 with Cys includes sense primer (5'-GGGAACGGTGAAC T GCGACGGAGG-3 ') and anti-sense primer (5'-CCTCCGTCGC A GTTCACCGTTCCC-3'). TG TCACGTGAATGCC-3 ') and anti-sense primer (5'-GGCATTCACGTGA CA GCTGAAAGTGATGG-3') were used. 75 ng of template DNA, 250 ng of each sense and anti-sense primer, a final concentration of 250 μM of dNTP mixture, 50 μl of mixture containing buffer and Pfu polymerase were placed in a PCR machine and mutated by PCR reaction. Mutation identification of the amino acid sequence was made through DNA sequencing. The base sequence of the mutant xylanase gene is shown in SEQ ID NO: 3. The plasmid with the mutated xylanase gene was named pHINC5.5 / SNC (FIG. 2).

실시예 4. Thiol기 적정Example 4. Thiol Group Titration

2 ㎎㎖^-1 농도의 야생형 XynA WT와　변종형　XynA SNC를 완충용액 (2% SDS, 80 mM sodium phosphate (pH 8.0)，2 mM EDTA)에 50 mM dithiothreitol (DTT)의 유무를 달리하여 섞어 10 분간 가열함으로써 단백질을 　변성시켰다. 변성된 효소 단 백질들 (환원형 또는 비환원형)은 Centricon 10 concentrator (Amicon, Beverly, USA)을 이용하여 농축시킨 후, DTT를 제거하기 위해 변성 완충용액에 담아 투석하였다. 최종적으로 얻어진 효소 단백질의 일부는 Bradford 방법을 이용하여 단백질 양을 측정하였다. 티올(thiol)기 환원은 30배의 단백질 효소를 환원 완충 용액에 녹인 １배의 4 ㎎㎖^-1dithionitrobenzoic acid (DTNB)과 혼합한 후, 15 분간 상온에서 반응시킨 뒤, 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 몰 흡광 계수는 13,600 M^-1 ㎝^-1으로 계산하였다.Wild type XynA WT and mutant XynA SNC at concentrations of 2 mg ml ^-1 were mixed in buffer (2% SDS, 80 mM sodium phosphate (pH 8.0), 2 mM EDTA) with or without 50 mM dithiothreitol (DTT). The protein was denatured by heating for a minute. Denatured enzyme proteins (reduced or non-reduced) were concentrated using Centricon 10 concentrator (Amicon, Beverly, USA) and then dialyzed in denaturing buffer to remove DTT. Some of the finally obtained enzyme proteins were measured for protein amount using the Bradford method. Thiol group reduction was performed by mixing 30-fold protein enzyme with 1-fold 4 mg ml ^-1 dithionitrobenzoic acid (DTNB) dissolved in a reducing buffer solution, reacting at room temperature for 15 minutes, and then measuring absorbance at 412 nm. It was. At this time, the molar extinction coefficient was calculated as 13,600 M ^-1 cm ^-1 .

실시예 5. 효소 활성 측정Example 5. Determination of Enzyme Activity

Xylanase 효소 활성은 0.5 ㎖의 birchwood xylan (0.5% in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0)과　 동량의 조효소액을 혼합한 뒤, 55℃에서 20 분 동안 반응시켰다. 효소반응으로 방출된 환원당의 농도는 DNS 방법 (Miller, (1959) Anal. Chem. 31, 426-42)을 통하여 구하였다．1 유닛 (unit)의 효소활성은 분당 1 μmol의 xylose를 방출시킬 수 있는 효소의 양을 나타낸다. Xylanase enzyme activity was mixed with 0.5 ml of birchwood xylan (0.5% in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0) and the same amount of crude enzyme solution and reacted at 55 ° C. for 20 minutes. The concentration of reducing sugars released by enzymatic reaction was determined by DNS method (Miller, (1959) Anal. Chem. 31, 426-42). Enzymatic activity of 1 unit can release 1 μmol of xylose per minute. The amount of enzyme present.

실시예 6. 히스티딘 (histidine)을 결합시킨 재조합 효소 단백질의 과발현 및 정제Example 6 Overexpression and Purification of Recombinant Enzyme Proteins Conjugated to Histidine

야생형 XynA와 변종형 XynA의 생산 및 정제를 위해서, 각 효소 단백질 생산 유전자를 프라이머 xynAF (5’-CCGCATATGAAGTTAAAGAAG-3’)와 xynAR (5’-GCTAAGCTTCCAAACCGTAAC-3’)를 이용하여 각 유전자를 가지는 플라스미드 pHINC5.5 와 pHINC5.5/SNC를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭하였다. 증폭된 DNA는 정제를 마친 후, 제한효소인 NdeI과 HindIII로 처리하여 동일하게 처리한 pET 23b 벡터 (Qiagen, USA)에 서브클로닝하였다. 이렇게 생산된 최종 산물을 각각 pET/XynA(WT)과 pET/XynA(SNC)로 명명하고 (도 3) 단백질 과발현을 위해 E. coli BL21 (DE3)에　trasformation하였다．형질전환된 세포의 성장이 증식기에 이르렀을 때, 0.1 mM IPTG을 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 ６ 시간 동안 20℃에서 배양하였다. 원심분리하여　얻은 세포들을 단백질 분해효소 저해제인 1 mM PMSF을 포함하는 세포용해 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)에 부유시킨 다음, 초음파 파쇄기 (SONOPLUS, BANDELIN, Germany)를 이용하여 세포벽을 파쇄하였다. 원심분리 후 얻어진 상층액을 1 ㎖의 Ni-NTA 현탁액과 섞어 4℃에서 １ 시간 동안 단백질과 결합하도록 반응시켰다. 결합 반응 후에 Ni-NTA agarose beads를 수세 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole)으로 ４차례 수세한 후, 용리 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole)으로 결합되어 있던 단백질을 분리해 내었다. 정제된 단백질들은 사용전까지 -20℃에서 보관하였다.For the production and purification of wild type XynA and mutant XynA, each enzyme protein producing gene was used as primers xynAF (5'-CCGCATATGAAGTTAAAGAAG-3 ') and xynAR (5'-GCTAAGCTTCCAAACCGTAAC-3'). .5 and pHINC5.5 / SNC were amplified by polymerase chain reaction (PCR) as a template. After purification, the amplified DNA was subcloned into pET 23b vector (Qiagen, USA), which was treated with Nde I and Hind III, restriction enzymes. The final product thus produced was named pET / XynA (WT) and pET / XynA (SNC), respectively (Figure 3) and trasformated to E. coli BL21 (DE3) for protein overexpression. When reached, 0.1 mM IPTG was added to induce protein expression and incubated at 20 ° C. for 6 hours. Cells obtained by centrifugation were suspended in cytolysis buffer (50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole) containing 1 mM PMSF, a protease inhibitor, followed by ultrasonic crusher (SONOPLUS, BANDELIN, Germany). The cell wall was disrupted using. The supernatant obtained after centrifugation was mixed with 1 ml of Ni-NTA suspension and reacted with the protein for 1 hour at 4 ° C. After binding reaction, Ni-NTA agarose beads were washed four times with washing buffer (50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 50 mM imidazole), followed by elution buffer (50 mM NaH ₂ PO ₄ , 300 mM NaCl, 200 mM). imidazole) was used to isolate the protein. Purified proteins were stored at -20 ° C until use.

실시예 7. 효소 단백질의 열안정성 측정Example 7 Measurement of Thermal Stability of Enzyme Proteins

효소 단백질들의 열안정성을 측정하기 위해서, 원심분리를 통해 얻은 세포들을 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) 완충액에 부유시키고 초음파 파쇄기로 파쇄한 후 원심분리하여 얻어진 상층액을 조효소액으로 사용하였다. 준비된 조효소 액은 기질의 존재 유무를 달리하여 각각 정해진 온도에서 20 분간 반응시킨 후, 동일 부피의 0.5% birchwood xylan 용액과 섞어 55℃에서 30 분간 반응시켰다. 고온 처리 후에 남아있는 효소 활성은 DNS 방법을 통해 측정하였다. 1 유닛 (unit)의 효소활성은 분당 1 μmol의 xylose를 방출시킬 수 있는 효소의 양을 나타낸다. In order to measure the thermal stability of the enzyme proteins, the cells obtained by centrifugation were suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) buffer, crushed by an ultrasonic crusher, and the supernatant obtained by centrifugation was used as a coenzyme solution. The prepared coenzyme solution was reacted for 20 minutes at different temperatures according to the presence or absence of a substrate, and then mixed with an equal volume of 0.5% birchwood xylan solution for 30 minutes at 55 ° C. Enzyme activity remaining after high temperature treatment was measured by DNS method. One unit of enzymatic activity represents the amount of enzyme capable of releasing 1 μmol of xylose per minute.

실시예 8. 열처리에 의한 효소 단백질의 비가역적 비활성화Example 8. Irreversible Inactivation of Enzyme Protein by Heat Treatment

비활성 속도 상수를 구하기 위해, 정제된 야생형과 변종형 XynA를 각각　60, 65, 70℃에서 반응시키면서, 정해진 시간 간격으로 시료를 채취한 뒤, 즉시 얼음물에서 열을 식힌 후 남아 있는 효소 활성을 측정하였다. 비활성 속도 상수 (k _ina)는 시간 대비 잔류 효소 활성의 반대수 그래프 (semi-logarithmic plot)로부터 얻었다. 측정된 속도 상수를 이용해 아래의 Arrhenius식에 따라 활성화 에너지를 구하였다.In order to obtain an inert rate constant, the purified wild-type and mutant XynA were reacted at 60, 65 and 70 ° C., respectively, and samples were taken at predetermined time intervals, and immediately after cooling in ice water, the remaining enzyme activity was measured. . Inactivation rate constant ( k _ina ) was obtained from a semi-logarithmic plot of residual enzyme activity over time. Using the measured rate constant, the activation energy was calculated according to the following Arrhenius equation.

k = Ae^- ^E ^{a/ RT} k = Ae ^- ^E ^{a / RT}

k는 각 온도에서의 속도 상수를, A는 공간 효과와 분자 충돌 횟수와 관련된 지수 앞자리 인자(pre-exponential factor)를, R은 기체상수 (8.314 J mol^-1 K^-1)를, E _a는 활성화 에너지를 나타낸다. 따라서, lnk _ina에 대한 1/T의 함수 그래프에서의 기울기 (-E _a R^-1)로부터 각 온도에서의 활성화 에너지 값을 계산할 수 있다. 고온 비활성에 대한 활성화 자유 에너지 (the activation free energies for thermo- inactivation)는 다음과 같이 구하였다.k is the rate constant at each temperature, A is the pre-exponential factor related to spatial effects and the number of molecular collisions, R is the gas constant (8.314 J mol ^-1 K ^-1 ), and E _a is Activation energy. Therefore, the activation energy value at each temperature can be calculated from the slope ( −E _a R ⁻¹ ) in the function graph of 1 / T for ln k _ina . The activation free energies for thermoinactivation were obtained as follows.

△G^‡ = RT (lnk _BT/h-lnk)ΔG ^‡ = RT (ln k _B T / h-ln k )

k _B는 Boltzman constant (1.3805 10^-23 JK^-1)를, h는 Planck’s constant (6.6256 10^-34 J s)를, 그리고, k는 각 온도에서의 속도 상수를 나타낸다. k _B is Boltzman constant (1.3805 10 ^-23 J K ^-1 ), h represents Planck's constant (6.6256 10 ^-34 J s), and k represents the rate constant at each temperature.

실시예 9. 효소 단백질의 동력학적 인자와 활성화 에너지의 측정Example 9 Determination of Kinetic Factors and Activation Energy of Enzyme Proteins

효소의 동력학적 인자(kinetics parameters) K _m와 V _max는 xylayase 효소 활성을 표준 조건에 따라 분석함으로써 결정하였다. 일정 반응 시간 후에 반응액의 일부 (300 ㎕)를 취해서 생성된 환원당을 DNS 방법에 따라서 측정하였다. 얻어진 결과들을 Lineweaver-Burk 방법에 따라서 그래프로 그리고 K _m와 V _max를 이론적으로 계산하였다. 이전의 실험에서 얻어진 효소 단백질의 분자량을 이용하여 k_cat을 계산하였다.Kinetics parameters K _m and V _max of the enzyme were determined by analyzing the xylayase enzyme activity according to standard conditions. After a certain reaction time, a portion (300 μl) of the reaction solution was taken and the resulting reducing sugar was measured according to the DNS method. The obtained results were graphed according to the Lineweaver-Burk method and theoretically calculated K _m and V _max . K _cat was calculated using the molecular weight of the enzyme protein obtained in the previous experiment.

활성화 에너지를 계산하기 위하여 40℃에서 55℃의 범위의 온도에서 온도에 따른 xylanase 효소 활성을 측정하였다. Arrhenius 식에 따라 lnk _cat에 대한 1/T의 함수 그래프를 그리고, 이 그래프의 기울기로부터 활성화 에너지 값을 구하였다.In order to calculate the activation energy, xylanase enzyme activity was measured with temperature at a temperature ranging from 40 ° C to 55 ° C. A function graph of 1 / T for ln k _cat was drawn according to the Arrhenius equation, and the activation energy value was obtained from the slope of the graph.

실시예 10. Western blot analysisExample 10 Western blot analysis

위에 언급한 바와 같이 준비한 조효소액을 동량을 취해 15% SDS-PAGE에 전기영동한 후, nitrocellulose membrane에 transfer시켰다. 이 membrane을 항-XynA-항체와 반응시킨 후, chemi-luminescence kit (Amersham, North Ryde, Australia)으로 효소 단백질을 확인하였다.The coenzyme solution prepared as mentioned above was taken in the same amount and electrophoresed on 15% SDS-PAGE, and then transferred to the nitrocellulose membrane. After reacting the membrane with anti-XynA-antibody, the chemi-luminescence kit (Amersham, North Ryde, Australia) confirmed the enzyme protein.

실험결과 1: 변종형 효소 단백질 설계에 대한 이론적 근거Experimental Result 1: Theoretical Basis for the Design of Variant Enzyme Protein

적절하게 설계된 새로운 이황화 결합의 단백질 내의 도입을 통해 효소의 열안정성을 증가시키고자 하였다. 본 발명자들은 B. stearothermophilus No. 236으로부터 클로닝한 중온성의 XynA의 열안정성을 증가시키기 위해 이황화 결합을 형성할 수 있는 잠재적인 아미노산 잔기들을 조사해 보았다. 우선 기하학적　측면을 바탕으로 하여 이황화 결합이 가능한 아미노산 잔기 조합을 예측하는 Design^TM 프로그램 (Dombkowski, (2003) Bioinformatics 19, 1852-1853)을 통해 XynA의 아미노산 잔기를 분석하였다. 그 결과, 기하학적인 제약 (geometric constraints)을 만족하는 25개의 결합 가능한　아미노산 잔기의 조합(Amino acid pair)을 얻을 수 있었다 (도 1a). 다음으로, 이들 25개의 결과물 중에서 가장 가능성있는 조합을 찾기 위해, 이 효소 단백질이 속하는 다른　중온성　family 11 xylanase들과 XynA의 아미노산 서열을 비교하여 이황화 결합 생성에 관련된 cysteine 잔기의 보존과 XynA 단백질 내의 위치를 비교 분석하였다. ClusterW 프로그램을 이용한 정렬 결과, 중온성　family 11 xylanase에 진화적으로 보존된 cysteine 잔기에 해당되는 XynA의 아미노 산 잔기는 V28, T33, V38, A55, T67, S100, Y108, N140, N150, L159 그리고 S179 등 모두 11 개로 조사되었다. 이 두 결과를 종합적으로 분석한 결과 다음의 세 개 아미노산 잔기(S100, Y108 그리고 N150)가 이 기하학적 제약과 치환하고자　하는 특정 아미노산(본 실험의 경우 cysteine)의 보존의 두가지 조건을 모두 만족하는 것으로 나타났으며,　이 중, S100과 N150의 경우 이황화 결합 가능 아미노산 잔기 조합에서 비교적 낮은 저항(tolerance) 수치를 보이며 쌍을 이루고 있는 것으로 나타났다 (도 1a와 1b). Fiamily 11에 속하는 다른 xylanase와 같이, B. stearothermophilus No. 236 유래 xylanase 역시 큰 두 개의 베타－시트 (β-sheet) 부분과 하나의 알파－헬릭스 (α-helix) 부분으로 이루어진 약간 오무린 오른손을 닮은 구조를 가지는 것으로 예상되었다 (Gruber et al., 1998) (도 1c 및 도 1d). 위에서 얻은 결과에 상응하는 아미노산 잔기는 family 11에　속하는 고온성의 xylanase들에서 모두 동일한 자리에 공통적으로 위치하는 것을 발견하였다. 또한 도 1d에서 보여지듯이, XynA의 예상된 구조 모델에서 이 두 아미노산 잔기를 cysteine으로 치환하였을 경우, 이황화 결합을 이룰 수 있을 정도로 구조적으로 가까운 거리에 위치하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 두 아미노산 잔기를 site-directed mutagenesis 방법으로 cysteine으로 치환시켰으며, 치환된 결과는 염기 서열 분석으로 확인하였다 (도 1b). 결과적으로 얻어진 변종형 XynA와 야생형 XynA은 XynA SNC와 XynA WT로 명명되었으며, 그들의 열안정성 등 효소의 기능적 성질에 대하여 구체적으로 조사하였다.The introduction of a properly designed new disulfide bond in the protein was intended to increase the thermal stability of the enzyme. The inventors have found that B. stearothermophilus No. Potential amino acid residues that could form disulfide bonds were investigated to increase the thermostability of mesophilic XynA cloned from 236. First, the amino acid residues of XynA were analyzed through the Design ^TM program (Dombkowski, (2003) Bioinformatics 19, 1852-1853), which predicts disulfide bond amino acid residue combinations based on geometric aspects. As a result, a combination of 25 bindable amino acid residues (Amino acid pair) satisfying geometric constraints was obtained (FIG. 1A). Next, to find the most likely combination of these 25 products, the amino acid sequence of XynA was compared with the other mesophilic family 11 xylanases to which this enzyme protein belongs, conserving cysteine residues involved in disulfide bond formation and positioning within the XynA protein. Was analyzed comparatively. As a result of the alignment using the ClusterW program, the amino acid residues of XynA corresponding to the cysteine residues evolutionarily conserved in mesophilic family 11 xylanase are V28, T33, V38, A55, T67, S100, Y108, N140, N150, L159 and S179. All 11 were investigated. Comprehensive analysis of these two results shows that the following three amino acid residues (S100, Y108 and N150) satisfy both these geometric constraints and the preservation of the specific amino acid to be substituted (cysteine in this experiment). Among them, in the case of S100 and N150, the disulfide-linkable amino acid residue combinations were shown to be paired with relatively low tolerance values (FIGS. 1A and 1B). Like other xylanases belonging to Fiamily 11, B. stearothermophilus No. 236-derived xylanase was also expected to have a slightly receding right handed structure consisting of two large beta-sheet and one alpha-helix moieties (Gruber et al., 1998). (FIGS. 1C and 1D). The amino acid residues corresponding to the results obtained above were found to be commonly located at the same site in all of the pyrogenic xylanases of family 11. In addition, as shown in FIG. 1D, in the expected structural model of XynA, when these two amino acid residues were substituted with cysteine, it was confirmed that they were located at a structurally close distance to form a disulfide bond. Therefore, these two amino acid residues were substituted with cysteine by the site-directed mutagenesis method, and the result was confirmed by sequencing (FIG. 1B). The resulting variant XynA and wild type XynA were named XynA SNC and XynA WT, and their functional properties such as their thermal stability were examined in detail.

실험결과 2: 새로운 이황화 결합의 형성Experimental Result 2: Formation of New Disulfide Bonds

야생형 XynA 내 새로운 이황화 결합의 도입은 정제 후 변성시킨 단백질의 thiol기 적정을 통해 실험적으로　확인할 수 있었다. 야생형과 변종형 XynA 내 DTT 처리 전 후의 자유 황화 수소기의 개수를 측정한 결과 야생형 XynA는 이황화 결합이 존재하지 않으며, 변종형 XynA에는 하나의 이황화 결합이 존재하는 것으로 나타났다 (표　1). 따라서, 구조적으로 알파－헬릭스 부분이 인접한 베타－시트 부분에 좀 더 단단히 결합할 수　있을 것으로 추정되었다. 치환시킨 각 아미노산 잔기와 그 결과 만들어진 이황화 결합은 도면에 표시하였다 (도 1c와　1d). 변종형 XynA의 전체적인 구조는 야생형과 완벽한 동형을 이루고 있는 것으로 나타났다. 야생형 효소 내에 이황화 결합의 부재는 이 효소의 유전자의 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열 결과와 일치하는 결과이다. The introduction of new disulfide bonds in wild-type XynA could be confirmed experimentally by thiol titration of purified and denatured proteins. As a result of measuring the number of free hydrogen sulfide groups before and after DTT treatment in wild type and mutant XynA, wild type XynA did not have disulfide bond, and there was one disulfide bond in mutant XynA (Table 1). Thus, it was assumed that the alpha-helix moiety could bind more tightly to the adjacent beta-sheet moiety. Each substituted amino acid residue and the resulting disulfide bond are shown in the figure (Fig. 1C and Fig. 1D). The overall structure of the variant XynA was found to be perfectly homologous to the wild type. The absence of disulfide bonds in the wild type enzyme is consistent with the amino acid sequence results deduced from the nucleotide sequence of the gene of this enzyme.

[표 1]　야생형과　변종형　XynA　내의　thiol기　적정　실험　결과[Table 1] Results of "thiol-based titration test" in "wild type and" variant "

실험결과 3. 야생형과 변종형 XynA의 열안정성Experimental Results 3. Thermal Stability of Wild and Variant XynA

새롭게 도입된 이황화 결합의 열안정성에 대한 기여 정도는 야생형과 변종형 XynA의 고열 처리에 의한 실활 정도를 측정함으로써 예측할 수 있었다. 야생형과 변종형 XynA를 생산하는 재조합 세포로부터 세포　추출액을 취해 기질의 존재 (thermophilicity) 및 부재 (thermostability)하에 온도를 점차 증가시켜 각 온도에서 20 분씩 반응시킨 후, 잔류　효소 활성을 방법에 기재한 대로 측정하였다. 도 4a에 제시된 바 대로, 효소 활성이 약 50％로 비활성화되는 온도는 변종형의 경우 70℃이었던 것에 반해, 야생형의 경우 65℃였다. 두 효소 단백질의 활성 온도는 서로 차이가 없는 것으로 측정되었으므로 (표 4), 변종형 XynA의 높은 온도에서 상대적으로 증가된 효소의 잔류 활성은 이 효소의 열저항성 증가에서 기인한 것으로 생각되어진다. 반면에, 기질 존재하에서의 열안정성은 야생형과 변종형　XynA에서 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다 (도 4b). The contribution of thermal dissociation to the newly introduced disulfide bonds could be predicted by measuring the degree of deactivation of the wild type and mutant XynA by the high heat treatment. Cell line extracts were obtained from recombinant cells producing wild-type and mutant XynA, reacted for 20 minutes at each temperature by gradually increasing the temperature in the presence and absence of the substrate (thermophilicity) and the residual enzyme activity as described in the method. Measured. As shown in FIG. 4A, the temperature at which enzyme activity was inactivated at about 50% was 65 ° C. for the wild type, whereas it was 70 ° C. for the variant. Since the activity temperatures of the two enzyme proteins were determined to be indifferent (Table 4), the relatively increased residual activity of the enzyme at high temperatures of variant XynA is believed to be due to the increased heat resistance of the enzyme. On the other hand, the thermal stability in the presence of the substrate did not show a significant difference between wild type and mutant XynA (FIG. 4B).

열역학적 특성의 구체적인 비교를 위해, 야생형과 변종형 XynA의 고온에 의한 실활에 있어서의 활성화 에너지를 측정하였다. 정제된 야생형과 변종형 효소를 각각 60℃ 부터 70℃ 까지의 온도 범위에서 5℃씩 온도 차이를 주어 열처리하고, 시간대 별로 시료를 채취하여 효소 활성을 측정하였다. 효소의 고온 처리에 의한 비활성 반감기는 변종형이 야생형에 비하여 65℃에서 7분에서 25분으로, 70℃에서는 4분에서 9분으로 증가한 것으로 측정되었다. 시간에 따른 효소의 잔류 활성을 반대수 그래프로 나타었을 때 직선을 이루는 것으로 나타나므로, 이 그래프의 기울기로부터 각 온도에서의 대략적인 비활성 속도 상수(k _in )를 구할 수 있었다 (도 5a). 각 실험 온도에서의 효소의 비활성 속도 상수는 온도가 증가함에 따라서 증가되는 경향을 나타내었지만, 변종형이 야생형에 비해 모든 측정 온도에서 상대적으 로 높은 값을 나타내었다 (표 2). 위와 같이 구한 비활성 속도 상수를 이용해 Arrhenius 그래프를 그리고 (도 5b), 각 온도에서의 비활성에 필요한 자유 에너지(△G^‡)를 계산하여 표시하였다 (표 2). 예상한 대로, 활성 자유 에너지는 변종형의 경우에 있어서 야생형보다 평균적으로 각　온도에서 약 3 kJ mol^-1정도 높은 값을 나타내었다. For specific comparison of thermodynamic properties, activation energies of wild type and mutant XynA at high temperature inactivation were measured. The purified wild-type and mutant enzymes were heat-treated at 5 ° C. in a temperature range of 60 ° C. to 70 ° C., respectively, and samples were sampled at different times to measure enzyme activity. The inactive half-life by the high temperature treatment of enzymes was determined to increase from 7 minutes to 25 minutes at 65 ° C. and from 4 minutes to 9 minutes at 70 ° C. compared to wild type. Since the residual activity of the enzyme with time is shown as a straight line graph, the approximate inert rate constant ( k _in ) at each temperature was obtained from the slope of the graph (FIG. 5A). The enzyme inert rate constants at each experimental temperature tended to increase with increasing temperature, but the variant showed a relatively high value at all measured temperatures compared to the wild type (Table 2). An Arrhenius graph was drawn using the inert rate constants obtained as described above (FIG. 5B), and the free energy (ΔG ^‡ ) required for inactivation at each temperature was calculated and displayed (Table 2). As expected, the active free energy was about 3 kJ mol ⁻¹ higher at each temperature on average than in the wild type for the variant.

[표　２]야생형과　변종형　XynA의　열역학적　변수.TABLE 2 Thermodynamic variables of wild type and mutant XynA.

^a T _1/2 및 k _ina 는 도 5a로부터 계산됨. ^a T _1/2 and k _ina are calculated from FIG. 5A.

^b △G^‡는 도 5b의 Arrhenius plot으로부터 계산됨. ^b ΔG ^‡ is calculated from the Arrhenius plot of FIG. 5B.

이러한 결과는 XynA에 도입된 이황화 결합이 단백질의 펼쳐진 상태 (unfolded state)에서의 구조적인 열역학 에너지를 감소시킴으로써 궁극적으로 고열 처리에 대해서 상대적으로 높은 안정성을 가져온 것이라고 생각되어진다. 단백질과 같은 중합체의 통계학상의 열역학에 따르면 공유결합은 공유결합을 포함하지 않는 중합체에 비해 상대적으로 분자의 배좌 자유도 (the conformational degrees of freedom)를 제약시킴으로써 공유결합을 포함하는 펼쳐진 상태의 폴리펩타이드 중합체의 엔트로피를 감소시킨다고 보고된 바 있다. 1988년 Pace 등은 두 개의 황화수소기가 이황화 결합을 이루는 경우에 초점을 맞추고, 이 두 황화수소기의 간격을 4.8 Å로 가정한 후 이황화 결합에 기인한 구조적 엔트로피의 소실을 계산해 낼 수 있는 다음과 같은 식을 유도하였다.These results suggest that disulfide bonds introduced into XynA reduce structural thermodynamic energy in the unfolded state of the protein, ultimately resulting in relatively high stability for high heat treatment. Statistical thermodynamics of polymers, such as proteins, indicate that covalent bonds are conjugated polypeptide polymers in an unfolded state by restricting the conformational degrees of freedom relative to polymers that do not contain covalent bonds. It has been reported to reduce entropy of. In 1988, Pace et al. Focused on the case where two hydrogen sulfide groups form disulfide bonds, and assuming that the spacing of these two hydrogen sulfide groups is 4.8 Å, the following equation can be used to calculate the loss of structural entropy due to disulfide bonds: Induced.

△S = -4.184(-2.1 + (3/2) R ln n) (1)Δ S = -4.184 (-2.1 + (3/2) R ln n) (1)

n은 이황화 결합으로 형성된 루프 (loop) 사이에 포함되는 아미노산 잔기의 개수를, R은 cal mol^-1 K^-1 를 단위로 하는 기체 상수를 나타낸다． n represents the number of amino acid residues contained between loops formed by disulfide bonds, and R represents a gas constant based on cal mol ⁻¹ K ⁻¹ .

도입된 이황화 결합에서 기인한 자유 에너지의 변화는 펼쳐진 상태에서의 구조적 엔트로피의 변화와 상관성을 가지며 다음의 식으로 표현될 수 있다. The change in free energy due to the disulfide bond introduced is correlated with the change in structural entropy in the unfolded state and can be expressed by the following equation.

△△G^‡ = -T△S (2) △△ G ^‡ = -T △ S (2)

T는 Kelvin 온도를 나타낸다.T stands for Kelvin temperature.

이 식들을 이용하여 우리는 XynA에 도입된 이황화 결합으로부터 유래한 분자적 안정성의 변화를 이론적으로 구할 수 있었으며, 그 값을 실험 수치와 비교하였 다. 이론적으로 얻어진 엔트로피의 변화 수치 (△S)를 수식 (2)에 대압하여 각 온도에서의 자유에너지 변화량을 얻었다. 각 온도에서 변종형 XynA는 야생형에 비해　높은 비활성 자유 에너지를 나타내었으나, 이론값의 약 16％정도에 미치는 것으로 나타났다. 이러한 이론치와 실험치의 차이는 XynA 내의 가교 형성 (cross-linking)이 알파-헬릭스와 베타-시트 부분을 연결시켜주는데서 기인하는 것으로 추정된다. 이론적으로, 움직임이 자유로운 구조에 가교 구조를 형성한 경우 단백질의 구조를 안정화시키지만, 시트와 헬릭스를 연결하는 가교 구조는 시트와 루프를 연결하는 가교 구조보다 안정도에 기여도가 낮은 것으로 보고되었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, 변종형 XynA 내의 이황화 결합은 열처리에 의해 펼쳐진 단백질 구조의 구조적 엔트로피를 감소시킴으로써 이 효소 단백질의 열안정화에 기여한 것임을 알 수 있었다.Using these equations, we were able to theoretically determine the change in molecular stability resulting from the disulfide bonds introduced in XynA, and compare the values with the experimental values. Daeap a theoretical change of the entropy value (△ S) obtained by the equation (2) to obtain the free energy change at each temperature. At each temperature, the variant XynA showed higher inactive free energy than the wild type, but reached approximately 16% of the theoretical value. This difference between the theoretical and experimental values is presumed to be due to the cross-linking in XynA linking the alpha-helix and beta-sheet portions. Theoretically, when the crosslinked structure is formed in the free-moving structure, the structure of the protein is stabilized, but the crosslinked structure connecting the sheet and the helix has been reported to contribute less to the stability than the crosslinked structure connecting the sheet and the loop. In summary, it can be seen that disulfide bonds in the variant XynA contributed to thermal stabilization of the enzyme protein by reducing the structural entropy of the protein structure unfolded by heat treatment.

[표 3] 이황화 결합의 구조적 안정성에 대한 기여도: 이론과 실제.TABLE 3 Contributions to the structural stability of disulfide bonds: theory and practice.

^a Empirical △△G^‡ 값은 △G^‡ (kJ mol^-1)_{XynA SNC}에서 △G^‡ (kJ mol^-1)_{XynA WT}를 빼서 계산함. ^a Empirical △△ G ^{‡ The} value is calculated by subtracting △ G ^‡ (kJ mol ^-1 ) _{XynA WT} from △ G ^‡ (kJ mol ^-1 ) _{XynA SNC} .

^bTheoretical △△G^‡ 값은 두개의 등식, △S = -4.184(2.1 + 3/2 R ln n) 및 △△G^‡ = -T△S으로 계산함. ^b Theoretical also △△ G ^‡ value of the two equations, △ S = -4.184 (2.1 + 3/2 R ln n) and △△ G ^‡ = calculated -T △ S.

실험결과4: 야생형과 변종형 XynA의 효소적 성질과 동력학적 요소의 비교Experimental Result 4: Comparison of Enzymatic Properties and Kinetics of Wild and Variant XynA

야생형과 변종형 XynA의 효소적 특성을 파악하기 전에, 도입된 이황화 결합이 이 효소의 발현과 안정성에 미치는 영향을 western bolt analysis를 통해 알아본 결과, 새롭게 단백질 내에 도입된 이황화 결합은 변종형 효소 단백질의 발현이나 안정성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 다음으로, 야생형과 변종형 XynA의 효소적 성질과 동력학적 변수 (kinetics parameters)들을 비교하기 위해, 6개의　histidine을 결합시킨 재조합 효소 단백질을 Ni-NTA agarose beads를 이용해 정제하였다. 표 4에 제시한 바와 같이 효소 활성의 적정 온도와 pH 등은 두 효소 모두에서 동일하게 각각 55℃와 pH 8.0로 측정되었다. 효소 특이적 활성도는 야생형과 변종형에서 각각 40.58과 35.33 U　㎎^-1로 측정된 바, 변종형이 야생형에 비해　큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다. 변종형의 동력학적 변수 또한 야생형의 그것과 크게 다르지 않는 것으로 측정되었다. 야생형과 변종형의 K _m수치는 각각 44.32와 44.46 ㎎㎖^-1로, 촉매활성 k _cat/K _m)의 경우 각각 0.19와 0.17이었다. 거기에 더해, 반응을 일으키기 위한 최소한의 에너지인 Ea의 경우도 마찬가지로 야생형과 변종형에서 각각 16.87과 18.82 kJ mol^-1이었다. 이러한 결과들은 새로 도입된 이황화 결합의 존재가 이 변종형 효소 단백질의 반응 속도와 기질에 대한 특이성에 큰 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다.Before understanding the enzymatic properties of wild-type and mutant XynA, western bolt analysis of the effects of the introduced disulfide bonds on the expression and stability of the enzymes revealed that the newly introduced disulfide bonds in the variant protein It did not appear to affect the expression or stability of. Next, to compare the enzymatic properties and kinetic parameters of wild type and mutant XynA, six histidine bound recombinant enzyme proteins were purified using Ni-NTA agarose beads. As shown in Table 4, the appropriate temperature and pH of the enzyme activity were measured at 55 ° C. and pH 8.0, respectively, for both enzymes. The enzyme specific activity was measured to be 40.58 and 35.33 U mg ⁻¹ in the wild type and the mutant, respectively. Kinetic variables of the variant were also determined not to differ significantly from those of the wild type. The wild type and mutant K _m values were 44.32 and 44.46 mg ㎖ ^-1 , respectively, and the catalytic activity k _cat / K _m ) was 0.19 and 0.17, respectively. In addition, E a, the minimum energy for the reaction, was likewise 16.87 and 18.82 kJ mol ⁻¹ in the wild and mutant forms, respectively. These results indicate that the presence of the newly introduced disulfide bonds did not significantly affect the reaction rate and substrate specificity of this variant enzyme protein.

[표　４] 야생형과　변종형　XynA의　효소적　특성　비교．[Table 4] Comparison of Enzymatic Characteristics of Wild and Variant XynA.

Ea는 Arrhenius plot의 기울기로부터 계산함. Ea is calculated from the slope of the Arrhenius plot.

다음으로, 효소 단백질의 정성적인 측면 (qualitative respective)에서의 효소 단백질의 열안정성을 측정하기 위하여, 야생형과 변종형 XynA의 온도 증가에 따른 기질 가수 분해 활성을 측정하였다. 야생형과 변종형 효소 모두 55℃와 60℃에서 60 분에 이르기 까지는 반응 시간에 대한 효소 활성이 일차적인 직선형을 나타내었다. 비록 온도가 증가함에 따라 두 효소 단백질 모두 기질 가수분해 능력이 감소되는 양상을 나타내었지만,　변종형의 경우 70℃의 고온에서 야생형보다 효과적으로 기질을 분해하는 것으로 나타났다 (도 6).Next, in order to measure the thermal stability of the enzyme protein in the qualitative respective (qualitative respective) of the enzyme protein, the substrate hydrolytic activity of the wild type and mutant XynA with increasing temperature was measured. Both wild-type and mutant enzymes showed linear linear enzyme activity over reaction time from 55 ° C and 60 ° C to 60 minutes. Although both enzyme proteins showed a decrease in substrate hydrolytic ability with increasing temperature, the mutant strain was found to degrade the substrate more effectively than the wild type at a high temperature of 70 ° C. (FIG. 6).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, XynA 구조 내로 새로운 이황화 결합의 도입함으로써 이 효소 단백질의 효소적 특성을 변화시키지 않으면서, 열역 학적 안정성만을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 처음으로 제시한 이 방법은 열안정성이 뛰어난 다른 변종형의 효소 단백질을 생산해 내는데도 성공적으로 사용될 수 있을 것이라고 생각된다.As described above, according to the present invention, by introducing a new disulfide bond into the XynA structure, only thermodynamic stability can be increased without changing the enzymatic properties of this enzyme protein. This method, which was first presented in the present invention, is thought to be successfully used to produce enzymes of different variants with excellent thermal stability.

서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 Cys 100과 Cys 150이 이황화결합을 갖는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소(xylanase).A xylanase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and characterized in that Cys 100 and Cys 150 have disulfide bonds.

서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소 유전자.A xylan degrading enzyme gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

제 2항에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 자일란 분해효소 유전자. According to claim 2, wherein the nucleotide sequence xylase gene, characterized in that having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

제 2항에 따른 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.Recombinant vector comprising a gene according to claim 2.

제 4항에 있어서, 도 2의 개열지도를 갖는 pHINC5.5/SNC인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.The recombinant vector according to claim 4, which is pHINC5.5 / SNC having a cleavage map of FIG.

제 4항에 있어서, 도 3의 개열지도를 갖는 pET/XynA(SNC)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.The recombinant vector according to claim 4, which is pET / XynA (SNC) having a cleavage map of FIG.

제 4항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주세포.A host cell transformed with the recombinant vector according to claim 4.

제 7항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(E.coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.8. The host cell of claim 7, wherein the host cell is E. coli.