KR100781070B1 - A chitin- and jasmonate-inducible arabidopsis lectin gene and a method for the generation of disease-resistant transgenic plants by transforming the gene - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 애기장대 잎에서 자스모네이트의 외부처리에 의해 AtMJI2 유전자의 발현이 유도되고 있음을 나타내는 노던 블럿 실험의 결과이다.1 is a result of a Northern blot experiment showing that the expression of AtMJI2 gene is induced by external treatment of jasmonate in Arabidopsis foliar leaves.
도 2는 애기장대 유묘(seedling)에서 여러 농도의 키틴 처리에 의해 AtMJI2 유전자의 발현이 유도되고 있음을 나타내는 노던 블럿 실험의 결과이다.2 is a result of a northern blot experiment showing that AtMJI2 gene expression is induced by chitin treatment at different concentrations in Arabidopsis seedlings.
도 3은 애기장대 AtMJI2 유전자 프로모터에 대장균에서 유래한 글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 유전자(GUS)를 결합하고 발현벡터에 삽입한 후 제작한 애기장대 잎에 물리적 상처를 주었을 때, 상처 주위세포에서 GUS 단백질이 발현되고 있음을 나타내는 GUS 염색 사진이다.Figure 3 is combined with the glucuronidase (β-glucuronidase) gene ( GUS ) derived from Escherichia coli to the Arabidopsis AtMJI2 gene promoter and inserted into the expression vector after the physical wounds on the produced Arabidopsis leaf, wound around GUS staining photograph showing that the GUS protein is expressed in the cell.
도 4는 애기장대 AtMJI2 유전자를 식물 형질전환용 발현벡터 pBl121에서 GUS를 제거한 pBI111L벡터에 재조합한 DNA construct인 pCaAtMJI2의 개열지도이다. 4 is a baby poleAtMJI2 A cleavage map of pCaAtMJI2, a DNA construct in which a gene was recombined into a pBI111L vector from which a GUS was removed from an expression vector pBl121 for plant transformation.
도 5의 위쪽 그림 A는 AtMJI2 유전자 전이 후 가나마이신 저항성을 보이는 5개 라인의 애기장대를 선발하여 노던 블럿 실험으로 AtMJI2의 과발현을 확인한 결과이다. 아래쪽 그림 B는 AtMJI2 유전자의 과발현이 확인된 26번 라인에 유전자가 올바르게 삽입되었는지 여부를 확인하기 위하여 게놈 서던 블럿을 실시한 결과이다.Top A of Figure 5 is AtMJI2 After the gene transfer, five lines of Arabidopsis resistant to kanamycin were selected and Northern blot experiments confirmed the overexpression of AtMJI2 . Figure B below shows the results of a genomic Southern blot to verify that the gene was correctly inserted into
도 6은 형질전환 및 비형질전환 애기장대에 검은무늬병(흑반병)을 일으키는 진균(곰팡이) 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)를 점적 접종하여 5일 후 발생한 병변 확장 면적을 측정함으로써 식물체의 진균병 저항성을 조사한 결과를 보여주는 도표이다.Figure 6 is a fungal (fungal) Alternaria brassicicola causing a black pattern disease (black spot disease) in the transgenic and non-transformed Arabidopsis inoculation drip inoculation of the plant by measuring the area of lesion expansion occurred after 5 days This chart shows the results of investigating fungal disease resistance.
도 7은 형질전환 및 비형질전환 애기장대에 검은무늬병(흑반병)을 일으키는 진균(곰팡이) 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)를 분무하여 감염시킨 후 5일 후의 식물 상태를 관찰함으로써 진균병 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진이다. 7 is a fungal (fungal) Alternaria brassica that causes black pattern disease (black spot disease) in transgenic and nontransgenic Arabidopsis (Alternaria brassicicola) Is a picture showing the results of fungal disease resistance by observing the plant state 5 days after infection by spraying).
본 발명은 키틴과 자스모네이트에 의해 발현이 유도되는 애기장대 렉틴 유전자와 이 유전자를 전이하여 병저항성이 강화된 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a Arabidopsis lectin gene induced expression by chitin and jasmonate and a method for producing a plant with enhanced disease resistance by transferring the gene.
렉틴 (lectin)은 동식물에 존재하는 탄수화물 결합 단백질들(carbohydrate-binding proteins)의 총칭으로 정의되며, 식물세포의 경우 액포(vacuole) 또는 세포벽(cell wall)에 존재한다(Rudiger and Gabius, Glycoconjugate J. 18: 589-613, 2001). 렉틴의 생물학적 역할은 명확히 결론지어 진 바 없다. 그러나 많은 연구결 과를 종합해 보면, 식물에 있어서 발아 및 생장 등 발달과정에서 렉틴의 역할이 일부 밝혀져 있으며, 특히 식물의 병충해 저항성에 기여하는 것으로 생각되어 지고 있다. Lectin is defined as a generic term for carbohydrate-binding proteins present in animals and plants, and in plant cells is present in vacuoles or cell walls (Rudiger and Gabius, Glycoconjugate J. 18: 589-613, 2001). The biological role of lectins is not clear. However, in the light of many research results, the role of lectins in the developmental process such as germination and growth in plants has been revealed, and it is thought to contribute to plant pest resistance.
식물 렉틴을 크게 두 부류로 나누어 보면, phytohemagglutinin (PHA) family와 wheat germ agglutinin (WGA) family로 구분할 수 있다. PHA는 동물 또는 해충(insects)의 내장 점질물질과 결합하여 소화흡수 되는 것을 저해함으로써 식물에 저항성을 부여한다(Murdock and Shade, J Agric . Food Chem . 50: 6605-6611, 2002). 이에 비하여, WGA 그룹은 구조상 키틴(chitin) 결합 부위(chitin-binding domain)을 가지고 있다. 키틴은 유충의 각질이나 곰팡이(fungi) 세포벽(cell wall)의 주요 구성성분이다. 그러므로 식물체가 유충이나 곰팡이의 침해를 입었을 때, 렉틴이 키틴과 결합함으로써 이들의 생장을 직접적으로 저해하는 것으로 보고 있다(Chrispeels and Raikhel, Plant Cell 3: 1-9, 1991).Dividing plant lectins into two broad classes can be divided into the phytohemagglutinin (PHA) family and the wheat germ agglutinin (WGA) family. PHA imparts resistance to plants by inhibiting the digestion and absorption which in combination with the internal viscous material of animal or pest (insects) (Murdock and Shade, J Agric. Food Chem . 50: 6605-6611, 2002). In contrast, the WGA group has a chitin-binding domain in its structure. Chitin is a major constituent of the larvae and fungi cell walls of larvae. Therefore, when plants are invaded by larvae or fungi, it is believed that lectins directly inhibit their growth by binding to chitin (Chrispeels and Raikhel, Plant). Cell 3: 1-9, 1991).
키틴은 N-아세틸글루코스아민(N-acetyl glucosamine, GlcNAc)이 β-1,4 결합으로 연결되어 있는 고분자 중합체(polymer)이다. 병원성 곰팡이가 식물조직에 침투하게 되면, 식물세포에 기존해 있던 키틴 분해효소 β-chitinase가 곰팡이 세포벽을 공격하여 크고 작은 길이의 키틴절편 (chitin fragment)들을 발생시키게 된다. 키틴절편들은 이들의 특이한 식물 수용체(receptor)에 결합되어 (Kaku et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103: 11086-11091, 2006) 식물세포의 다양한 저항성 반응을 유도하는 신호물질(elicitor)로 이용된다(Hahn, Annu. Rev . Phytopathol . 34: 387-412, 1996).Chitin is N - acetyl glucosamine (N-acetyl glucosamine, GlcNAc) is β-1,4 polymer (polymer) that is coupled to the connection. When pathogenic fungi penetrate into plant tissues, the chitinase β-chitinase, which is present in plant cells, attacks the fungal cell walls, producing chitin fragments of large and small lengths. Chitin fragments bind to their specific plant receptors (Kaku et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103: 11086-11091, 2006) . Elicitors that induce various resistance responses in plant cells. ) is used as (Hahn, Annu Rev Phytopathol 34: ... 387-412, 1996).
키틴, 글루칸 (β-glucan) 등 당류(carbohydrates)가 유도하는 식물 저항성 반응은 주로 자스모네이트(jasmonate)에 의해 저항성유전자(defense genes)의 발현으로 연결된다(Mueller et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90: 7490-7494, 1993). 자스몬산(jasmonic acid; JA)과 메틸자스모네이트(jasmonate methyl ester; MeJA)로 대표되는 자스모네이트는 다양한 식물에 널리 존재하는 성장조절물질일 뿐만 아니라, 물리적 또는 해충에 의한 식물의 상처 또는 병원균의 침입에 대항하는 저항성 반응을 매개하는 신호전달물질(signal transducer)로 잘 알려져 있다(Creelman and Mullet, Annu . Rev . Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 48; 355-381, 1992).Plant resistance responses induced by carbohydrates such as chitin and glucan are mainly linked to the expression of resistance genes by jasmonates (Mueller et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90: 7490-7494, 1993). Jasmonates, represented by jasmonic acid (JA) and jasmonate methyl ester (MeJA), are not only growth regulators widely present in various plants, but also wounds or pathogens of plants caused by physical or pests. It is of mediating the resistance response against the intrusion signaling molecules known as (signal transducer) (Creelman and Mullet , Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 48; 355-381, 1992).
자스모네이트는 해충 또는 물리적 요인으로 발생한 상처 부위의 신호를 전달하여 그 결과 식물체는 감염부위 뿐만 아니라 전신에 걸쳐 저항성을 나타내게 된다. 이때 유도되는 유전자들로서 담배, 토마토 등에서 발견된 Pin2 (proteinase inhibitor II) 등 단백질 분해효소 저해물질(protease inhibitor)을 대표적으로 꼽을 수 있다. 이 저해물질이 유충의 소화를 방해하여 해충의 번식을 막는다. 그리고 병원균 침투시 자스모네이트가 생합성 되어 PDF(plant defensin), thionin, PR 단백질(pathogenesis-related proteins) 등의 주요한 저항성 단백질들의 발현을 유도한다. 메틸자스모네이트 생성효소 JMT(jasmonate methyltransferase)의 유전자 AtJMT를 과발현 시켜 자스모네이트 대사를 활성화한 식물체에서 병저항성이 증진된 사례가 보고되었다(Seo et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98: 4788-4793, 2001).Jasmonate transmits signals from wounds caused by pests or physical factors, resulting in plants that are resistant to infection as well as the whole body. Protease inhibitors such as Pin2 (proteinase inhibitor II) found in tobacco, tomato, etc. may be representative. These inhibitors interfere with the digestion of the larvae, preventing the reproduction of pests. In the pathogen invasion, jasmonate is biosynthesized to induce the expression of major resistance proteins such as PDF (plant defensin), thionin, and PR (pathogenesis-related proteins). There has been reported an increase in pathogenic resistance in plants that overexpressed the methyljasmonate synthase JMT (jasmonate methyltransferase) gene AtJMT to activate jasmonate metabolism (Seo et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98: 4788-4793, 2001).
렉틴 유전자를 식물체에 전이(transformation)하여 해충저항성을 증진 시키고자 하는 연구가 오래 전부터 진행되어 왔다. 대표적인 예로서 아네모네(snowdrop)에서 클로닝한 렉틴 유전자 GNA를 감자(Gatehouse et al., Mol . Breeding 3: 49-63. 1997), 벼(Rao et al., Plant J. 15: 469-477, 1998; Tinjuangjun et al., Mol . Breeding 6: 391-399, 2000; Maqbool et al., Mol . Breeding 7: 85-93, 2001), 밀(Stoger et al., Mol . Breeding 5: 65-73, 1999) 등 다양한 작물에 전이하여 진딧물(aphids), 나방(moths), 메뚜기(hoppers) 등에 대하여 살충효과를 관찰한 예가 있다. Research has been underway for a long time to improve the resistance of insects by transforming lectin genes into plants. As a representative example, the lectin gene GNA cloned from anemone (snowdrop) can be obtained from potato (Gatehouse et al., Mol . Breeding 3: 49-63. 1997), rice (Rao et al., Plant J. 15: 469-477, 1998). Tinjuangjun et al., Mol . Breeding 6: 391-399, 2000; Maqbool et al., Mol . Breeding 7: 85-93, 2001), wheat (Stoger et al., Mol . Breeding 5: 65-73, 1999), insecticides were observed for aphids, moths, and hoppers by transferring to various crops.
그리고 키틴결합부위(chitin-binding domain)를 가지고 있는 렉틴을 정제하여 식물체에 직접 처리함으로써 진균류에 대한 병저항성(fungicidal action)을 높인 사례가 일부 있다(Rudiger and Gabius, Glycoconjugate J. 18: 589-613, 2001). 그러나 이 경우 렉틴 정제 과정 중 거치게 되는 친화크로마토그라피(affinity chromatography)에서 키틴에 렉틴과 유사한 친화력을 가지고 있는 키틴분해효소들(chitinases)의 오염에서 오는 항균효과인지 명확히 구별되지 않고 있다.In some cases, fungalidal action against fungi has been increased by purifying lectins with chitin-binding domains and directly processing them (Rudiger and Gabius, Glycoconjugate J. 18: 589-613). , 2001). However, in this case, it is not clearly distinguished whether it is an antimicrobial effect from the contamination of chitinses having affinity similar to lectin in chitin in affinity chromatography that is performed during the lectin purification process.
본 발명은 병충해 저항성유발 신호물질 키틴(chitin)과 이를 저항성 유전자 발현으로 연결하는 신호전달물질(signal transducer) 자스모네이트(jasmonate)에 의하여 활성화되는 신규의 애기장대(Arabidopsis thaliana) 렉틴 유전자를 탐색하기 위한 연구를 수행하였다. 이 연구를 통하여 발견한 렉틴 유전자를 식물체에 도입하여 과발현시킴으로써 병원성 진균류(곰팡이)에 대한 저항성을 나타내는 형질전 환 식물체를 제작하는 기술을 개발하였다.The present invention is to search for a novel Arabidopsis thaliana lectin gene activated by a pest resistance-inducing signal chitin and a signal transducer jasmonate that connects it to resistance gene expression. A study was conducted. This study developed a technique for producing transgenic plants that exhibit resistance to pathogenic fungi (fungus) by introducing and overexpressing lectin genes found in plants.
따라서, 본 발명의 목적은 애기장대 유래의 렉틴 유전자 AtMJI2를 제공한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a lectin gene AtMJI2 derived from Arabidopsis.
또한, 본 발명의 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.It is also an object of the present invention to provide a recombinant plant expression vector comprising the gene.
또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 이용한 형질전환식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 병저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.It is also an object of the present invention to provide a method for producing a transformed plant using the recombinant plant expression vector, and a transformed plant having increased disease resistance produced by the method.
또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공한다.It is also an object of the present invention to provide seeds of the transgenic plant.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 유전자 마이크로어레이(microarray) 분석을 통하여 애기장대 자스모네이트에 의해 발현이 유도되는 애기장대 렉틴 유전자 AtMJI2를 탐색하였다. 이 유전자가 키틴에 의해서도 그 발현이 유도됨을 확인하였고, 또한 균류 또는 해충 침투시 일반적으로 발생하는 상처 부위에 특이하게 발현되고 있음을 관찰하였다. 상기 유전자는 두과작물형 렉틴(legume lectin)을 암호화하는 유전자로서, 곰팡이 세포벽 및 유충 표피각질의 주성분인 키틴(chitin)과 병저항성 세포반응을 유도하는 식물호르몬 자스모네이트(jasmonate)에 의하여 발현되어 식물에 병저항성을 부여하는 기능을 갖는다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 애기장대 유래의 렉틴 유전자 AtMJI2 이다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 렉틴 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention was searched for Arabidopsis lectin gene AtMJI2 induced expression by Arabidopsis jasmonate through gene microarray analysis. It was confirmed that this gene was also induced by chitin, and it was also observed that the gene was specifically expressed at the wound site that commonly occurs when fungus or pest invasion. The gene is a gene encoding the legume lectin, which is expressed by chitin, which is a major component of fungal cell walls and larval epidermal keratin, and by the plant hormone jasmonate, which induces a pathogenic cell response. It has the function of imparting disease resistance to plants. Gene of the present invention is a lectin gene AtMJI2 derived from Arabidopsis having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to be. In addition, variants of such sequences are included within the scope of the present invention. A variant is a nucleotide sequence that changes in base sequence but has similar functional properties to that of SEQ ID NO: 1. Specifically, the lectin gene comprises a base sequence having at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology with the base sequence of SEQ ID NO: 1 can do.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.The "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to). The% identifies the number of positions where identical nucleic acid bases are present in both sequences, yielding the number of matching positions, dividing the number of matching positions by the total number of positions in the comparison region, and multiplying the result by 100 to display the sequence Calculated by calculating the percent of same sex. Optimal alignment of sequences for comparison is by computerized implementation of known algorithms (e.g. GAP, BESTFIT, FASTA and TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science). Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), or by examination.
저항성 유전자 발현으로 연결하는 신호전달물질 메틸자스모네이트(methyl jasmonate, MeJA)를 애기장대에 처리하고, 이때 발현이 유도되는 유전자들을 마이크로어레이(microarray)로 분석하였다. 그 중 기존의 렉틴 유전자들과 염기서열 및 아미노산 서열이 유사한 유전자를 발견하고 AtMJI2 (MeJA-inducible 2)로 명명하였다. 서열번호 1로 표시되는 AtMJI2가 100 μM의 MeJA를 외부에서 분무(spray) 처 리한 애기장대의 잎에서 mRNA로 발현이 유도되는 것을 노던 분석(Northern analysis)으로 확인하였다(도 1). 또한 AtMJI2는 μg 수준의 키틴을 처리해 준 경우에도 뚜렷한 발현을 보였다(도 2).Signaling substance methyl jasmonate (MeJA), which leads to resistance gene expression, was treated in Arabidopsis, and the genes from which expression was induced were analyzed by microarray. Among them, genes similar in nucleotide sequence and amino acid sequence to existing lectin genes were found and named as AtMJI2 (MeJA-inducible 2). AtMJI2 that shown in SEQ ID NO: 1, whose expression is induced with 100 μM of MeJA mRNA in a spray (spray) leaf of Arabidopsis Treated externally confirmed by Northern analysis (Northern analysis) (Figure 1). In addition, AtMJI2 showed distinct expression even when treated with μg of chitin (FIG. 2).
AtMJI2 유전자의 프로모터 부분을 GUS 유전자에 연결하고, 이를 발현 벡터 pCAMBIA 1391Z에 삽입하여 식물에 전이하였다. 이 식물체에 물리적인 상처를 가했을 때, 상처 부위에 GUS 단백질이 집적되는 것을 확인하였다(도 3).The promoter portion of the AtMJI2 gene was linked to the GUS gene and inserted into the expression vector pCAMBIA 1391Z to transfer to plants. When a physical wound was applied to this plant, it was confirmed that GUS protein was accumulated at the wound site (FIG. 3).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 렉틴 유전자 AtMJI2를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물 발현 벡터는 도 4에 기재된 pCaAtMJ12이다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention is a lectin gene according to the present inventionAtMJI2It provides a recombinant plant expression vector comprising a. Preferably, the plant expression vector is pCaAtMJ12 described in FIG. 4.
본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상류 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In a recombinant plant expression vector according to one embodiment of the present invention, the promoter may be, but is not limited to, CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter. The term "promoter" refers to a DNA upstream region from a structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of the transformants may be made by various tissues at various stages. Thus, the configuration promoter does not limit the selection possibilities.
본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 노팔린 신타아제(NOS) 또는 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.In the recombinant plant expression vector according to one embodiment of the present invention, the terminator may be nopalin synthase (NOS) or rice α-amylase RAmy1 A terminator, but is not limited thereto. With regard to the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of terminators is highly desirable in the context of the present invention.
오픈 리딩 프레임이 숙주 세포 내에 유지되도록 하기 위하여, 그것은 일반적으로 선택된 숙주 세포에 의해 인지되고 복제되는 DNA에 연결된 본 발명에 따른 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 레플리콘 형태로 제공될 것이다. 따라서, 레플리콘의 선택은 선택 숙주 세포에 의해 많이 좌우된다. 선택된 특별한 숙주에 적합한 레플리콘의 선택을 좌우하는 원리는 당업자의 범위 내에 포함된다.In order for the open reading frame to be maintained in the host cell, it will generally be provided in the form of a replicon comprising the open reading frame according to the invention linked to the DNA to be recognized and replicated by the selected host cell. Thus, the choice of replicon is highly dependent on the host cell of choice. Principles that govern the selection of suitable replicons for the particular host selected are within the scope of those skilled in the art.
레플리콘의 특별한 유형은 그 자체 또는 그의 일부를 식물 세포와 같은 다른 숙주 세포로 전이시킬 수 있는 것이며, 그에 의해서 본 발명에 따른 오픈 리딩 프레임을 상기 식물 세포로 동시 전이시킬 수 있다. 그러한 가능성을 가진 레플리콘은 본 명세서에서 벡터로서 칭해진다. 그러한 벡터의 예로는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A particular type of replicon is one that can transfer itself or part of it to another host cell, such as a plant cell, thereby allowing the simultaneous transmission of the open reading frame according to the invention to said plant cell. Replicons with such a possibility are referred to herein as vectors. An example of such a vector is a Ti-plasmid vector capable of transferring part of itself, the so-called T-region, to plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens. Another type of Ti-plasmid vector (see
본 발명에서는 AtMJI2 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 만들기 위하여, 유전자의 항시 발현을 유도하는 CaMV35S 프로모터에 AtMJI2 유전자를 융합하고 pBI111L벡터에 재조합하여 pCaAtMJI2 DNA construct를 제작하였다(도 4).According to the present invention to make a transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing AtMJI2 gene, fused to the gene AtMJI2 CaMV35S promoter to drive the expression of genes at all times and the recombinant vector was prepared in pBI111L pCaAtMJI2 DNA construct (FIG. 4).
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터를 식물에 전이하는 단계를 포함하는, AtMJI2를 과발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for producing a transgenic plant overexpressing AtMJI2 , comprising the step of transferring the recombinant plant expression vector according to the present invention to a plant.
항생제 저항성 식물체 선발 실험과 노던 블롯 (Northern blot) 분석 결과를 기준으로 AtMJI2 유전자를 항시 과발현하고 있는 것으로 확인된 형질전환 식물체를 확보하였다(도 5). 선발된 식물체에서 DNA를 추출하여 AtMJI2 유전자가 올바르게 삽입되어 있는지를 확인하고 삽입 개수(copy number)를 측정하였다(도 6).Based on antibiotic resistance plant selection experiments and Northern blot analysis, transgenic plants were found to be constantly overexpressing the AtMJI2 gene (FIG. 5). DNA was extracted from the selected plants to confirm whether the AtMJI2 gene was correctly inserted and the copy number was measured (FIG. 6).
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., Nature 296: 72-74, 1982; Negrutiu et al., Plant Mol . Biol . 8: 363-373, 1987), 원형질체의 전기천공 법(Shillito et al., Bio / Technol . 3: 1099-1102, 1985), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., Mol . Gen . Genet . 202, 179-185, 1986), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., Nature 327, 70-73, 1987), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. The method is based on the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens et al., Nature 296: 72-74, 1982; Negrutiu et al., Plant Mol . Biol . 8: 363-373, 1987), electroporation of protoplasts (Shillito et al, Bio / Technol 3:..... 1099-1102, 1985), microscopic scanning method to the plant element (Crossway et al, Mol Gen Genet 202, 179-185, 1986), the various plant components (DNA or RNA- coated) particle bombardment method (Klein et al., Nature 327 , 70-73, 1987), the infiltration of plants or mature pollen or sopoja Agrobacterium tumerfaciens mediated gene transfer by transformation can be appropriately selected from (incomplete) infection with virus (
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.The "plant cells" used for plant transformation may be any plant cells. The plant cells may be cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs and more preferably any form of cultured cells.
또한, 본 발명은 상기 형질전환식물체의 제조 방법에 의해 제조된 AtMJI2를 과발현하여 병저항성이 증가된 특징을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다. AtMJI2 과발현 Arabidopsis에 검은무늬병(흑반병, Black spot)을 일으키는 진균 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)를 처리하고 대조구인 비형질전환 식물체나 AtMJI2 유전자가 불활성화된 변이식물체(mutant)와 비교할 때, 저항성이 강화되었음을 확인하였다(도 7).In addition, the present invention provides a transgenic plant having an increased disease resistance by overexpressing AtMJI2 produced by the method for producing a transgenic plant. A black blotch on AtMJI2 overexpressing Arabidopsis (heukbanbyeong, Black spot) for causing fungal Alterna Ria beurasi when Coke (Alternaria brassicicola) when processed and compared with the control group of non-transgenic plants or AtMJI2 mutant plants (mutant) gene is inactivated , It was confirmed that the resistance was enhanced (Fig. 7).
본 발명의 형질전환 식물체는 하기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다:The transgenic plant of the present invention may be selected from the group consisting of:
벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류;Food crops selected from the group consisting of rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats, and sorghum;
애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류;Vegetable crops selected from the group consisting of Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot;
인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류;Special crops selected from the group consisting of ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut and rapeseed;
사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류;Fruit trees selected from the group consisting of apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, lambs, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots and bananas;
장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및Flowers selected from the group consisting of roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies and tulips; And
라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류.Forage crops selected from the group consisting of lygras, redclover, orchardgrass, alphaalpha, tolsfeque and perennial lygragrass.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체로부터 얻은 종자를 제공한다.The present invention also provides a seed obtained from the transgenic plant.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 자스모네이트 유도 발현 애기장대 유전자의 탐색Example 1 Screening of Jasmonate-Induced Expression Arabidopsis Gene
본 발명을 위한 연구는 자스모네이트가 발현을 유도하는 유전자를 탐색하는 실험으로 시작되었다. 발아 후 5주 간 생장한 애기장대에 100 μM의 메틸자스모네이트(MeJA)를 분무하고 24시간 후에 바닥잎(rosette lef)을 채취하였다. 이 시료에 서 mRNA를 추출하고 biotin으로 표지화 하였다. 마이크로어레이(microarray array) 실험에는 Affymetrix사에서 제조 공급하는 GeneChip®을 구입하여 사용하였다. 많은 유전자를 탐색하고 이들 중 그 기능을 모르는 신규 유전자들을 선발하여 일련번호와 함께 MJI (MeJA-inducible) 유전자들로 명명하였다.The study for the present invention began with an experiment to search for genes in which jasmonate induces expression. After germination, 100 μM of methyl jasmonate (MeJA) was sprayed on the Arabidopsis grown for 5 weeks, and the bottom leaf (rosette lef) was collected 24 hours later. MRNA was extracted from this sample and labeled with biotin. For microarray array experiments, GeneChip®, manufactured by Affymetrix, was purchased and used. To explore the many genes and starting a new gene does not know the capabilities of those with serial numbers MJI (MeJA-inducible) genes.
AtMJI2는 AGI (Arabidopsis Genome Initiative) number가 At3g15356인 유전자이다. Database search, blast, multiple amino acid alignment, phylogenetic tree 등의 분석을 수행한 컴퓨터 분석 결과, 이 유전자는 기존의 식물 렉틴을 암호화하는 유전자들과 상동성이 매우 높은 것으로 나타났다. 이 유전자가 암호화하는 단백질은 두과작물(legume)형 렉틴의 베타(β) 부위(domain)의 전형적인 구조를 가지고 있으며, 구조상 키틴결합 부위(chitin-binding domain)는 가지고 있지 않은 것으로 분석되었다. AtMJI2AGI (Arabidopsis Genome Initiative) is a gene with At3g15356. Computer analyzes of database searches, blasts, multiple amino acid alignments, and phylogenetic trees have shown that the genes are highly homologous to genes encoding plant lectins. The protein encoded by this gene has the typical structure of the beta (β) domain of legume-type lectins, and has been analyzed as having no chitin-binding domain.
이 유전자의 발현 양상을 확인할 목적으로 노던(Northern) 분석을 수행하였다. 애기장대(ecotype: columbia)를 1/2 강도로 희석된 고체 MS 배지에서 발아시키고 22-24°C에서 3주 생장시킨 후, 100 μM의 MeJA를 처리하였다. 처리한 애기장대의 바닥 잎에서 RNA를 추출하고 젤 상에서 크기 별로 분류하였다. 나일론막에 블롯을 만든 후, 다른 유사 유전자와 구별할 수 있도록 AtMJI2 유전자에 특이(specific)한 염기서열을 가진 방사성 DNA 조각을 탐침(probe)로 하여 혼합반응(hybridization)을 시행하였다.Northern analysis was performed to confirm the expression of this gene. Arabidopsis (ecotype: columbia) were germinated in half-strength diluted solid MS medium and grown for 3 weeks at 22-24 ° C., followed by 100 μM of MeJA. RNA was extracted from the bottom leaves of the treated Arabidopsis and sorted by size on gel. After making a blot on the nylon membrane, hybridization was performed using a probe of a radioactive DNA fragment having a nucleotide sequence specific to the AtMJI2 gene to distinguish it from other similar genes.
AtMJI2 유전자는 처리 6시간 후부터 발현이 감지되어 24시간 후에는 매우 뚜렷한 mRNA의 집적을 보였다(도 1). 도 1에서 JR2와 PDF1 .2 유전자들은 MeJA가 발현 을 유도하는 것으로 기존에 잘 알려진 표지유전자(marker gene) 들이다. 이 실험에서 처리 후 각 시간 별로 채취한 시료에서 동량의 RNA를 전기영동 젤(gel)에 취하였음을 증명하기 위하여 젤을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 결과를 함께 제시하였다. AtMJI2 The gene was detected at 6 hours after treatment, showing a very pronounced mRNA accumulation after 24 hours (FIG. 1). In Figure 1JR2WowPDF1 .2 Genes are well known marker genes that MeJA induces expression. In order to prove that the same amount of RNA was taken on the electrophoretic gel (gel) from the sample taken for each hour after treatment in this experiment, the results were shown with the result of staining the gel with ethidium bromide (EtBr).
<실시예 2> 키틴 처리에 의한 AtMJI2 유전자의 발현 유도Example 2 Induction of AtMJI2 Gene Expression by Chitin Treatment
AtMJI2 유전자가 키틴처리에 의하여 발현이 유도되는지 실험하였다. 키틴은 상품화된 (Sigma Chem. Inc.) crab-shell chitin을 구입하여 1 mg을 10 mL의 증류수에 넣고 실온을 유지하면서 180 rpm으로 진동을 주어 용해하였다. 이 용액을 원액으로 하여 적당한 농도로 희석한 후, 고체 MS(1/2 강도) 배지에서 발아하고 22-24°C에서 3주 생장한 애기장대에 처리하였다. AtMJI2 Whether the gene is induced by chitin treatment was tested. Chitin was purchased by commercializing (Sigma Chem. Inc.) crab-shell chitin and dissolved in 1 mg in 10 mL of distilled water by shaking at 180 rpm while maintaining room temperature. This solution was diluted to an appropriate concentration as a stock solution, then germinated in solid MS (1/2 strength) medium and treated to Arabidopsis grown for 3 weeks at 22-24 ° C.
도 2에 나타낸 바와 같이, AtMJI2 유전자는 1 μg/mL 또는 0.1 μg/mL의 낮은 농도의 키틴에 의해서도 발현이 유도되었다. 이 실험에서도 실시예 1에서와 마찬가지로, 블롯을 만든 후 다른 유사 유전자와 구별할 수 있도록 AtMJI2 유전자에 특이(specific)한 염기서열을 가진 방사성 DNA 조각을 탐침(probe)로 하여 혼합반응(hybridization)을 시행하였다. 각 처리 농도 별로 채취한 시료에서 동량의 RNA를 전기영동 젤(gel)에 취하였음을 증명하기 위하여 젤을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 결과를 함께 제시하였다.As shown in FIG. 2, the AtMJI2 gene was also induced by chitin at low concentrations of 1 μg / mL or 0.1 μg / mL. In this experiment, as in Example 1, hybridization was performed using a probe made of a radioactive DNA fragment having a nucleotide sequence specific to the AtMJI2 gene so as to be distinguished from other similar genes. Was implemented. The results of staining the gel with ethidium bromide (EtBr) were presented to demonstrate that the same amount of RNA was taken on the electrophoretic gel (gel) from the samples collected at each treatment concentration.
<실시예 3> 상처(wound)에 의한 AtMJI2의 발현 관찰을 위한 GUS 염색 실험Example 3 GUS Staining Experiment for Observation of AtMJI2 Expression by Wounds
AtMJI2 유전자 프로모터(3.0 kb)에 대장균에서 유래한 글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 유전자(GUS)를 결합하고 pCAMBIA 1391Z 벡터에 삽입하여 식물형질전환 실험용 DNA construct를 제작하였다(도 생략). 이 벡터에는 항생제 가나마이신에 대한 저항성 유전자 NPTII가 포함되어 있어 성공적으로 유전자가 전이된 미생물을 선별하는데 이용할 수 있도록 되어 있다. GUS 단백질은 무색의 글루쿠로닌산/염색물질(dye)복합체(X-Glu)를 분해하여 파란 색을 내는 유리 염색물질(X)을 내게 하므로, 식물체 조직을 이 복합체 용액에 침지하면 이 단백질이 생산되는 조직만을 특이하게 염색하게 된다. A glucuronidase gene ( GUS ) derived from Escherichia coli was combined with an AtMJI2 gene promoter (3.0 kb) and inserted into a pCAMBIA 1391Z vector to construct a plant transformation experiment DNA construct (not shown). The vector contains the gene NPTII , which is resistant to the antibiotic kanamycin, so that it can be used to screen for microbes that have successfully transferred. The GUS protein breaks down the colorless glucuronic acid / dye complex (X-Glu) to give a blue staining free dye (X), so when plant tissues are immersed in this complex solution, Only the tissue produced is specifically dyed.
DNA construct를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 전이하고, 전이 DNA를 집적(integration)하고 있는 것으로 선별된 아그로박테리움을 꽃대침지법(floral dip transformation)에 따라(Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998) 애기장대에 전이(transformation)하였다. 발아 후 4주 생장한 형질전환 애기장대의 잎을 핀셋으로 강하게 압착하여 0.5 x 0.5 cm2 정도의 상처를 여러 곳에 주었다.DNA construct in Agrobacterium tumefaciens C58C1), and Agrobacterium selected for integrating the transition DNA was subjected to floral dip transformation (Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998). Transformed to pole. Four weeks after germination, the leaves of the transgenic Arabidopsis squeezed strongly with tweezers, giving a wound about 0.5 x 0.5 cm 2 in several places.
GUS 염색실험 결과, 상처를 받은 부분의 경계면에 GUS 단백질이 발현되어 무색의 기질 X-Glu를 분해하여 청색의 염색물질(X)을 생산하고 있음을 확인하였다(도 3, 그림 A). 상처 받은 잎(local)과 이웃한 다른 가지의 건강한 잎(systemic)을 채취 하여 노던 실험(Nothern blot)을 시행하였다. 상처 받은 잎에서 AtMJI2 유전자의 발현이 강하게 유도되는 것을 확인하였으며, 건강한 잎에 상처로 인하여 발생한 신호(signal)가 전달되어 상처 받지 않은 잎에도 그 발현이 관찰되었다(도3, 그림 B). 식물이 병원균이나 해충의 침투에 의하여 상처를 받게 되면, 식물체는 자스모네이트를 생합성하여 상처가 발생한 부위뿐만 아니라 식물체 전신에 저항성 반응을 나타내게 된다. 그러므로 이 실험에서 관찰한 AtMJI2유전자의 발현도 자스모네트의 작용에 따른 전신성 저항성 반응(systemic defense response)의 일부분일 것으로 추론하였다.As a result of the GUS staining experiment, it was confirmed that the GUS protein was expressed on the interface of the wounded portion to decompose the colorless substrate X-Glu to produce a blue dye (X) (FIG. 3, FIG. A). A healthy blot of the wounded (local) and other neighboring branches was taken and a Northern blot was performed. It was confirmed that the expression of AtMJI2 gene was strongly induced in the wounded leaves, and the signal generated by the wound was transmitted to the healthy leaves, and the expression was observed in the undamaged leaves (Fig. 3 and Fig. B). When a plant is wounded by the invasion of pathogens or pests, the plant biosynthesizes jasmonate, which causes resistance to the whole body of the plant as well as to the site of the wound. Therefore, it was inferred that the expression of AtMJI2 gene observed in this experiment may be part of the systemic defense response following the action of Jasmonnet .
<실시예 4> AtMJI2 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 식물의 제작Example 4 Fabrication of Arabidopsis Transgenic Plant Overexpressing AtMJI2 Gene
AtMJI2 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 만들기 위하여, 유전자의 항시발현을 유도하는 CaMV35S 프로모터에 AtMJI2 cDNA를 융합하고 식물 발현벡터 pBI111L의 제한효소 인지서열인 XbaI 및 BamHI 사이에 삽입하였다(도 4). 이 벡터에는 식물 유전체에 삽입되는 T-DNA 부분의 경계를 나타내는 유전자 염기서열인 LB와 RB 사이에 항생제 가나마이신에 대한 저항성을 부여할 수 있는 NPTII 유전자가 함께 삽입되어 있다. 이 DNA 구조물의 이름을 pCaAtMJI2로 명명하였다. AtMJI2 To create a transgenic Arabidopsis that overexpresses a gene, a CaMV35S promoter that induces constant expression of the geneAtMJI2 cDNA fusion and restriction enzyme recognition sequence of the plant expression vector pBI111LXbaI andBamInserted between HIs (FIG. 4). This vector is able to confer resistance to the antibiotic kanamycin between LB and RB, the gene sequences that represent the boundaries of the T-DNA moiety inserted into the plant genome.NPTII The genes are inserted together. This DNA construct was named pCaAtMJI2.
이 DNA 구조물을 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 전이하고, 꽃대침지법(floral dip transformation)에 따라 애기장대에 전이하였다(Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998). 간단히 설명하면, 아그로박테 리움 균주 배양액에 애기장대의 꽃대를 3분간 담근 후, 거의 100% 상대습도 상태의 밀폐된 용기에 비스듬하게 뉘여서 24시간 정치하였다가 이후 개봉하여 식물을 세워서 22-24°C로 유지되고 있는 생장상(growth chamber)에서 키웠다. 이들 식물체에서 얻은 종자를 가나마이신이 함유된 배지에서 발아시켜, 가나마이신 저항성 식물체를 선발하였으며, 이로부터 새로운 종자를 받아 가나마이신 배지에서 다시 발아 선별한 후, 항생제에 저항성을 보이는 형질전환체를 토양에 이식하여 제 2 세대 종자를 얻었다. 이를 다시 선별하여 카나마이신 감수성 개체가 나오지 않는 식물체를 대상으로 실험을 하였다.This DNA construct is called Agrobacterium tumefaciens C58C1) and to the Arabidopsis by floral dip transformation (Clough and Bent, Plant J. 16: 735-743, 1998). In brief, submerse the Arabidopsis stalk in Agrobacterium strain culture for 3 minutes, then lie at an angle in an airtight container at nearly 100% relative humidity for 24 hours, then open and plant up to 22-24 °. It was grown in a growth chamber maintained at C. Seeds obtained from these plants were germinated in a medium containing kanamycin to select kanamycin resistant plants, and after receiving new seeds from the kanamycin medium, the seeds were germinated and selected, and the transformants showing resistance to antibiotics were soiled. Transplanted to obtain second generation seeds. This was again screened and tested on plants without kanamycin susceptible individuals.
<실시예 5> 형질전환 애기장대의 전이 유전자 분석Example 5 Transfer Gene Analysis of Transgenic Arabidopsis
AtMJI2 유전자를 전이한 애기장대에서 RNA를 추출하고, AtMJI2 유전자 특이(specific) DNA를 탐침(probe)으로 하여 노던블롯(Northern blot) 분석을 시행하였다. 그 결과 이 유전자를 항시 과발현하고 있는 것으로 확인된 5 line의 개체를 확보하였다 (도 5, 그림 A).RNA was extracted from Arabidopsis transcripts transferred from AtMJI2 gene, and Northern blot analysis was performed using AtMJI2 gene specific DNA as a probe. As a result, 5 lines of individuals identified as overexpressing the gene at all times were obtained (Fig. 5, Fig. A).
이들 형질전환 애기장대에 삽입된 목적유전자의 개수와 위치다양성을 확인하기 위해, 26번 line의 애기장대에서 DNA를 추출하고 제한효소 XbaI으로 절단한 후, AtMJI2 유전자 특이 DNA를 탐침으로 하여 서던블롯(Southern blot)분석을 시행하였다. 결과, 비형질전환체에서는 약 4.5 kb 길이 정도의 원래 애기장대에 존재하던 1 개의 유전자가 확인되었으며, 형질전환체 26번의 게놈(genome)에는 전이된 3.7 kb 의 외래의 전이된 유전자의 존재가 추가로 확인되었다. 이로써 26번 line의 형질전환 애기장대 유전체에는 1 개의 전이 유전자가 삽입(integration)되어 있으며, AtMJI2 유전자를 항시 발현하고 있는 것으로 확인되었다.In order to confirm the number and positional diversity of the target genes inserted into these transgenic pole poles, DNA was extracted from the Arabidopsis pole of
한편으로, AtMJI2 유전자에 대한 발현 불활성화(knockout) 변이 애기장대(SALK_030762)를 미국 SALK 연구소(미국 San Diego)가 제작하여 보유하고 있음을 확인하고 이의 종자를 동 연구소로부터 획득하였다. 이 불활성화 변이체는 외관 및 성장에 있어 야생형과 크게 다른 성질을 보이지 않았다.On the other hand, it was confirmed that the expression knockdown mutation Arabidopsis (SALK_030762) for the AtMJI2 gene was produced and possessed by the SALK Institute (San Diego, USA), and its seed was obtained from the Institute. This inactivated variant did not show significantly different properties than the wild type in appearance and growth.
<실시예 6> AtMJI2 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대의 병저항성 조사Example 6 Investigation of Disease Resistance of Transgenic Arabidopsis Overexpressing AtMJI2 Gene
AtMJI2 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대의 병저항성이 증가하였는지 여부를 조사하였다. 식물에 감염시, 자스모네이트가 저항성 반응을 유도하는 균종으로 알려진 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)에 대한 저항성을 측정하였다. 이 진균(곰팡이)은 애기장대 뿐만 아니라 배추, 양배추, 무 등의 채소류에 검은무늬병(흑반병, black spot)을 일으키게 된다. AtMJI2 We investigated whether the pathogenic resistance of transgenic Arabidopsis overexpressing the gene was increased. When infected with plants, Alternaria brassica, known as a species in which jasmonate induces a resistance reaction (Alternaria brassicicolaResistance to) was measured. This fungus (black mold) causes black spots (black spots, black spots) on vegetables such as cabbage, cabbage, and radish as well as baby poles.
알터나리아 브라시시콜라(A. brassicicola)를 PDA 배지에 접종하고 3주 간 배양한 후 50 mL의 PDB 용액을 배지에 부어 균사를 수집한 후 여과(filtration)하였다. 생장 6주일 된 애기장대로부터 한 식물 당 3장씩 잎을 채취하고, 한 장의 잎 위 두 군데에 3.3 × 105 spores/mL의 곰팡이 현탁액을 각각 5 μL씩 점 적(spotting)하였다(도6, 그림 A). 이를 5일간 방치하고 발생한 병변부위의 지름을 측정하였다. 같은 실험을 3 반복하고 평균값과 표준편차(SD) 값을 계산하였다(도 6, 그림 B). 그 결과 비형질전환체의 애기장대(WT)나 AtMJI2가 불활성화(knockout)된 애기장대(KO) 보다 AtMJI2 유전자 과발현체(AtMJI2-ox)에서 병변부위의 크기가 더 작은 것으로 나타나 저항성이 강화되었음을 확인하였다.Alternaria brassicola ( A. brassicicola ) was inoculated in PDA medium and incubated for 3 weeks, 50 mL of PDB solution was poured into the medium to collect the mycelia, and then filtered (filtration). Three leaves per plant were harvested from the 6-week-old Arabidopsis edodes, and 5 μL of 3.3 × 10 5 spores / mL fungal suspension was spotted on each of the two leaves (Figure 6, Figure 6). A). This was left for 5 days and the diameter of the lesion was measured. The same experiment was repeated 3 times and the mean and standard deviation (SD) values were calculated (FIG. 6, Figure B). As a result, the lesion size was smaller in the AtMJI2 gene overexpression ( AtMJI2 -ox) than the Arabidopsis (WT) or AtMJI2 knockout (KO) of the non-transformant, indicating that resistance was enhanced. Confirmed.
도 7은 같은 농도의 곰팡이 현탁액을 6주 생장한 애기장대에 분무(spray)하고 5일 후 병변의 정도를 관찰한 결과이다. 도 6에서와 마찬가지로 비형질전환체의 애기장대(WT)나 AtMJI2가 불활성화(knockout)된 애기장대(KO) 보다 AtMJI2 유전자 과발현체(AtMJI2-ox)에서 병증이 훨씬 약한 것으로 관찰되었다. 그러므로 AtMJI2 렉틴 유전자를 과발현하는 애기장대에 알터나리아 브라시시콜라(A. brassicicola)에 대한 병저항성이 강화되었음을 확인하였다.7 is a result of spraying the same suspension of fungi suspension on the Arabidopsis grown 6 weeks and observed the degree of lesion after 5 days. As in FIG. 6, it was observed that the disease was much weaker in the AtMJI2 gene overexpression ( AtMJI2 -ox) than the Arabidopsis (WT) or AtMJI2 knockout of the non-transformant. Therefore, the Arabidopsis overexpressing the AtMJI2 lectin gene was confirmed to have enhanced disease resistance against A. brassicicola .
본 발명에 따르면, 본 발명의 애기장대 AtMJI2는 진균류(곰팡이) 세포벽 성분인 키틴과 병저항성 유도 신호물질 자스모네이트에 의해 발현이 유도되는 렉틴 유전자이다. 이 유전자를 식물형질전환용 발현벡터에 조합하여 전이함으로써 병저항성이 강화된 식물체를 얻을 수 있다. 키틴은 유충의 각질 및 진균류의 세포벽에 일반적으로 분포하고 있으며 자스모네이트는 모든 종(species)의 식물에 존재하는 일반적인 신호물질이므로, 이 유전자가 전이된 형질전환 식물체는 광범위한 병원성 진균류에 대하여 높은 저항성을 보이는 효과를 제공하게 된다. 따라서 유전자가 전이된 형질전환 경제작물을 개발할 경우, 병해충의 감염으로부터 야기되는 손실을 크게 감소시켜 수확량 증대에 기여할 것으로 기대된다.According to the present invention, the Arabidopsis AtMJI2 of the present invention is a lectin gene whose expression is induced by chitin, which is a fungal (fungal) cell wall component, and a pathogen-inducing signaling substance, jasmonate . This gene is transferred to a plant vector for expression for plant transformation and transferred to obtain a plant with enhanced disease resistance. Chitin is commonly distributed in the stratum corneum and fungal cell walls and jasmonate is a common signal present in plants of all species, so transgenic plants transfected with this gene have high resistance to a wide range of pathogenic fungi. Will provide a visible effect. Therefore, the development of transgenic economically-transformed crops is expected to greatly reduce the loss caused by the infection of pests, which will contribute to the increase in yield.
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