KR100761869B1

KR100761869B1 - 트리아진 유도체 화합물 및 이를 포함하는 암 치료용조성물

Info

Publication number: KR100761869B1
Application number: KR1020060064059A
Authority: KR
Inventors: 김현기; 김진우
Original assignee: 김현기
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2007-10-04
Also published as: JP2009542635A; EP2051969A1; EP2051969A4; CN101511801A; US20090258878A1; WO2008004836A1; CA2656929A1

Abstract

본 발명은 특정 화학식을 가진 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염과 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물 또는 조성물은 암을 치료하는데 유용하며, 특히 유방암 치료에 탁월한 효능을 가진다.

트리아진 유도체 화합물, 암, 유방암

Description

트리아진 유도체 화합물 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물{Triazine derivative compound and composition for treating cancer containing them}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물들이 MCF-7 유방암세포의 성장을 억제하는 것을 보여주는 200배 확대 사진이다.

도 2는 MCF-7 유방암세포를 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 100 uM로 처리한 후 성장 억제 정도를 나타낸 그래프이다.

도 3은 음성 대조군의 실험결과로 누드마우스에 MCF-7 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴를 보여주는 사진이다.

도 4는 누드마우스에 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴에 본 발명에 따른 일 실시예인 화합물 Dan-BC1 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.

도 5는 누드마우스에 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴에 본 발명에 따른 일 실시예인 화합물 Dan-BC2 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.

도 6은 누드마우스에 유방암세포를 투여하여 발생시킨 유방암 종괴에 본 발명에 따른 일 실시예인 화합물 Dan-BC3 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.

도 7은 유방암이 유도된 누드마우스에서 본 발명의 일 실시예인 트리아진 유도체 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 종양억제 효과를 비교한 그래프이다.

도 8은 암형성 형질전환 동물 모델에서 자연 발생한 유방암 종괴에 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 Dan-BC1 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.

도 9는 암형성 형질전환 동물 모델에서 자연 발생한 유방암 종괴에 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 Dan-BC2 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.

도 10은 암형성 형질전환 동물 모델에서 자연 발생한 유방암 종괴에 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 Dan-BC3 투여 후 종괴크기의 변화를 관찰한 사진이다.

도 11은 암형성 형질전환 동물 모델에서 본 발명의 일 실시예인 트리아진 유도체 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 종양억제 효과를 비교한 그래프이다.

본 발명은 암, 특히 유방암을 치료하는데 유용한 신규 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 치료방법에 관한 것이다.

최근 국내 보도자료에 의하면, 암을 비롯하여 고혈압, 뇌혈관 질환, 당뇨병 등과 같은 만성질환의 발병률이 계속 증가하고 있으며, 이러한 질병으로 인한 경제적 손실은 약 37조 원에 이른다고 분석하고 있다. 특히, 우리나라에서 질병으로 인한 사망률 1위가 암이며, 암으로부터의 고통은 경제적 비용뿐만 아니라 정신적인 손실에도 막대한 영향을 끼친다. 그러나, 암 치료법의 진전으로 암으로 인한 사망 자 수는 꾸준히 감소하고 있으나 암 환자 수 자체의 지속적인 증가 및 치료 약물의 투여 기간이 장기화되고 있다.

한편 유방암은 유방에 생기는 암으로 유방에 있는 많은 종류의 세포 중 어느 것이라도 암이 될 수 있으므로 유방암의 종류는 매우 많다고 할 수 있지만, 대부분의 유방암이 유관과 유엽에 있는 세포 그 중에서도 유관세포에서 기원하므로 일반적으로 유방암이라 하면 유관과 유엽의 상피세포에서 기원한 암을 말한다. 유방암은 암 중에서 연구가 가장 많이 된 암종 중 하나인데도 아직 확실하게 유방암의 발생기전으로 밝혀진 것은 없다.

한국에서 유방암은 전체 암에서 위암, 폐암, 간암, 대장암에 이어서 다섯 번째로 2000년에는 전체 암 발생의　6.5%(5,444명)이고 여성의 악성 종양 중에서 위암에 이어 두 번째로 흔한 암이었으나, 2002년에는 전체 암 발생의　7.4%(7,359명)로 위암을 제치고 여성의 악성 종양 중 1위(16.8%)를 차지하였다(국립암센터 2005년 자료보고). 한편, 유방암은 여성에게서만 발생하는 것은 아니어서 남성도 유방암에 걸릴 수 있으나 발생 비율이 여성의 1/100 미만이다.

현재의 항암요법 중, 화학요법을 이용한 항암제가 전체에서 약 30% 정도를 차지하고 있으며, 그의 일례로서, 전립선암에 루프론, 난소암에 탁솔, 유방암에 졸라덱스 등을 비롯한 40-50 여종이 임상에서 사용되고 있으며, 이외의 여러 화학요법제가 개발 중에 있다. 항암제의 개발 목적은 보다 선택적이고 근원적으로 암을 정복하는 동시에 독성으로 인한 부작용, 내성의 유발 및 재발을 극복하는 것이다. 특히, 기존의 치료방법에도 유방암 환자의 사망률은 매우 높아 새로운 유방암치료 제의 모색이 절실히 필요하다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 암을 치료하는데 유용한 신규 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 암 치료방법을 제공하는 데 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 포함하는 암 치료용 조성물 및 이를 이용하는 암 치료방법을 제공한다.

상기 화학식 1에서, R₁은 탄소수 1 내지 8의 직쇄상(linear) 또는 분지상(branched) 알킬이며, R₂는 탄소수 1 내지 8의 직쇄상 또는 분지상 알킬, 알릴(allyl), 피리디닐메틸(pyridinylmethyl), 피리디닐에틸 및 피리디닐프로필로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, R₃는 치환되지 않은 벤조일(benzyol) 또 는 탄소수 1 내지 3의 알킬로 치환된 벤조일이고, n은 1 내지 3의 정수이다.

바람직하게, 상기 화학식 1에서 R₁은 부틸이며, R₂는 알릴, 1-에틸프로필 및 피리디닐메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, R₃는 치환되지 않은 벤조일(benzyol)이고, n은 2이며, 더욱 바람직하게, 상기 화학식 1에서 R₂는 알릴이다.

이하, 본 발명에 따른 새로운 암 치료제, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 암 치료방법에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 트리아진 유도체 화합물 라이브러리(library) 중 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물들이 암, 특히 유방암을 치료하는데 탁월한 효과를 보인다는 점에 기초한다. 트리아진 유도체 화합물 라이브러리는 본래 마이오서베린(myoseverin)-유사 항-튜불린 약물을 개발하고자 마이오서베린 유도체들로부터의 알려진 구조-활성 상관성(SAR) 데이터와 컴퓨터 이용 모델링(computer aided modeling)으로부터 고안되었으며(Moon, H-S., et al ., J Am Chem Soc., 124(39), 11608-11609 (2002) 참조). 이러한 트리아진 유도체 화합물 라이브러리를 이용하여 배양된 유방암세포를 포함한 일련의 암세포를 이용하여 발굴된 항암 화합물의 효능을 검증하여 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이 암, 특히 유방암에 탁월한 효과를 보인다는 사실을 확인하였다.

또한 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물들 중에 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 Dan-BC1(C₃₁H₄₂N₈O₄, 분자량: 590.724), 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 Dan-BC2(C₃₄H₄₃N₉O₄, 분자량: 641.772) 및 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 Dan-BC3(C₃₃H₄₈N₈O₄, 분자량: 620.793)가 종양 억제효율 등 여러 측면에서 암 치료에 더욱 효과적이다.

발굴된 트리아진 유도체 화합물들을 이용하여 항암 효능을 파악하고자 유방암세포, 대장암세포, 신장암세포, 뇌암세포 등에서 화학적 유전적 스크리닝을 실시하고, 전술한 트리아진 유도체 화합물 라이브러리에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물들, 보다 바람직하게는 상기 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 3가지 화합물들이 암세포 억제 활성에 있어 더욱 유용하다는 것을 밝혀내었다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 화합물들은 MCF-7 유방암 세포주(ATCC Number: HTB-22)에서 세포성장 억제효과가 가장 높았고, 다음은 MDA-MB-435(ATCC Number: HTB-129) 유방암 세포주, MDA-N 유방암 세포주(Wang, J.J., et al ., Anticancer Drugs, 15(3), 277-286 (2004)) 순으로 세포성장 억제효과가 높았으며, HCT15(ATCC Number: CCL-225) 대장암 세포주, NCI/ADR-RES 유방암 세포주(Ehrlichova, M., et al ., Anticancer Res., 25(6B), 4215-4224 (2005)), CAKI-1(ATCC Number: HTB-46) 신장암 세포주, ACHN (ATCC Number: CRL-1611) 신장암 세포주, SF295 뇌암 세포주(Rao, V.K., et al., Cancer Genet Cytogenet, 160(2), 126-133 (2005)) 및 UO-31 신장암 세포주 (Jansen, A.P., et al., Mol. Cancer Ther., 3(2), 103-110 (2004); Chen, Y-L., et al ., Eur J Med Chem., 40, 928-934 (2005))에서도 암세포 성장 억제효과를 나타내었다.

사용된 세포주 및 구체적 화합물의 종류에 따라 달라질 수는 있으나, 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물들의 IC₅₀ 값은 약 10　uM 정도이고, 이들의 활성농도는 약 1　내지 10　uM이며, 세포독성(Cytotoxicity)은 약 100　uM까지 관찰되지 않았다.

본 발명의 "약학적으로 허용가능한 염"은 독성이 없거나 적은 산 또는 염기로 제조된 염들을 말한다. 본 발명의 화합물들이 상대적으로 산성일 경우 염 기(base) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 염기와 적당한 비활성(inert) 용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 마그네슘 또는 유기 아미노로 이루어진 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물들이 상대적으로 염기성일 경우 산(acid) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 산과 적당한 비활성 용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 프로피온산, 이소부틸산, 옥살산, 사과산, 말론산, 안식향산, 호박산, 수버릭(suberic), 푸마르산, 만데릭산, 프탈릭산, 벤젠설폰산, p-토릴설폰산, 구연산, 주석산, 메탄설폰산, 염산, 브롬산, 질산, 탄산, 일수소탄산(monohydrogencarbonic), 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소, 아인산 등으로 형성된 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 알지네이트(arginate) 같은 아미노산의 염 및 글루쿠로닉(glucuronic) 또는 갈락투노릭(galactunoric) 산들과 같은 유기산의 유사체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 화합물들은 수화물 형태를 포함하여 용매화된 형태뿐만 아니라 비-용매화된(unsolvated) 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명의 일부 화합물들은 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다. 또한 본 발명의 일부 화합물들은 광학 중심인 비대칭 탄소원자들 또는 이중 결합들을 가질 수 있어 라세미체, 에난치오머, 디아스테레오머, 기하 이성질체 등이 존재할 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있으며, 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 매일 약 0.04 mg/kg 내지 약 20 mg/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.4 mg/kg 내지 약 2 mg/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성, 사용된 화합물 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 트리아진 유도체 화합물 라이브러리의 설계 및 합성

트리아진 구조에 기초한 트리아진 유도체 화합물 라이브러리의 설계 및 합성은 Khersonsky, S.M. 등이 개시한 방법(J Am Chem Soc., 125, 11804-11805 (2003))에 기초하여 수행하였다. 간단하게, 트리아진 유도체 화합물 라이브러리를 제조하기 위하여 고체-상 방법(solid-phase method)이 사용되었으며, 세 가지 빌딩 블럭(building block)들이 분리되어 제조되었고, 이들은 직교하여(orthogonally) 연결되어 1,536개의 순수한 트리아진 유도체 화합물들을 생성하였다.

보다 구체적으로, 하기 반응식 1에 나타나는 바와 같이, 세 가지 빌딩 블럭은 (Ⅰ) PAL-레진 결합 일차 아민, (Ⅱ) 2 위치에 아민, 알코올 또는 티올 부착된 4,6-디클로로-[1,3,5]트리아진, 및 (Ⅲ) 일련의 일차 또는 이차 아민이다. 다양한 벤질아민을 포함하는 일차 아민이 환원 아미노화(reductive amination) 반응을 사 용하여 PAL 알데히드 레진에 부착되어 빌딩 블럭 Ⅰ이 생성되었다. 또한 트리아진 트리클로라이드 상의 첫 번째 치환 반응의 고 반응성을 이용하여 저 친핵성(low nucleophilic) 반응성을 가진 알킬/아릴 알코올, 벌키한(bulky) 아민 또는 아닐린이 도입되어 빌딩 블럭 Ⅱ가 제조되었다. 다양한 일차 및 이차 아민이 빌딩 블럭 Ⅲ으로 미리 준비되었다.

미리 제조한 또는 상업적으로 이용가능한 상기 빌딩 블럭들을 이용한 이러한 간단한 합성 프로세스를 통하여, 본원발명의 트리아진 유도체 화합물을 제조하였으며, 모든 제조된 화합물은 LC-MS로 확인되었고, 그 순도는 모두 98% 이상이었다.

(a) R₁NH₂ (5 당량), 2% 아세트산의 THF, 실온, 1시간, 그 후, NaB(OAc)₃H (7 당량), 실온, 12시간.

(b) THF 내 R₂R₂'NH, R₂OH 또는 R₂SH (1 당량), 0℃, 1시간.

(c) THF 내 빌딩 블럭 Ⅱ (4 당량), DIEA (4 당량), 60℃, 3시간.

(c) NMP:n-BuOH의 1:1 혼합용매 내 R₃R₃'NH (4 당량), DIEA (4 당량), 120℃, 3시간.

(e) DCM 내 5% TFA, 10분.

< 실시예 2> 세포 배양

MCF-7 유방암 세포주(ATCC Number: HTB-22), MDA-MB-435(ATCC Number: HTB-129) 유방암 세포주, MDA-N 유방암 세포주(Wang, J.J., et al ., Anticancer Drugs, 15(3), 277-286 (2004), HCT15(ATCC Number: CCL-225) 대장암 세포주, NCI/ADR-RES 유방암 세포주(Ehrlichova, M., et al ., Anticancer Res., 25(6B), 4215-4224 (2005), CAKI-1(ATCC Number: HTB-46) 신장암 세포주, ACHN(ATCC Number: CRL-1611) 신장암 세포주, SF295 뇌암 세포주(Rao, V.K., et al., Cancer Genet Cytogenet, 160(2), 126-133 (2005)) 및 UO-31 신장암 세포주(Jansen, A.P., et al ., Mol. Cancer Ther., 3(2), 103-110 (2004); Chen, Y-L., et al., Eur J Med Chem., 40, 928-934 (2005))의 암세포들은 37℃, 5% CO₂가 포함된 세포 배양기에서 배양시켰다. 배양 및 계대 시에는 10% 우태아 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 성장시켰다.

< 실시예 3-1> 암 세포를 이용한 트리아진 유도체 화합물들의 스크리닝

동결건조된 라이브러리 화합물들을 디메틸셀폭사이드(DMSO)에 재현탁하여 최 종 농도를 10　mM가 되게 하였다. 라이브러리 화합물을 첨가하기 하루 전에 암 세포들을 24-웰 플레이트에 1 ml의 배양 매질로 웰 당 5×10⁴　세포가 되게 위치시켰다. 모든 화합물들을 표시된 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 모든 실험에 있어, DMSO를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포들은 다른 표시가 없는 한 72시간 동안 배양되었고, 세포 생존률은 CellTiter 96 수성 비-방사활성 세포 증식 분석(aqueous non-radioactive cell proliferation assay)(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정되었다..

CellTiter 96™ AQueous 비-방사활성 세포 증식 분석은 세포증식, 세포독성 또는 화학민감(chemosensitivity) 분석에 있어 생존 세포의 수를 측정하기 위한 균일하고, 비색계적(colorimetric) 방법이다. CellTiter 96 AQueous 분석은 새로운 테트라졸리움 화합물(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움, 내부 염(inner salt), MTS)과 전자 커플링 시약(phenazine methosulfate, PMS)로 이루어져 있다. MTS는 조직 배양 매질 내로 용해되는 포르마잔(formazan) 프로덕트로 세포에 의해 생환원(bio-reduce)된다. 이 포르마잔 프로덕트의 490 nm 흡광도가 96-웰 분석 플레이트로부터 추가적인 처리 없이 직접 측정될 수 있다. MTS의 수용성 포르마잔 프로덕트로의 전환은 대사적으로 활성인 세포에서 발견되는 디하이드로게나제 효소에 의해 수행된다. 490 nm 흡광도의 양으로 측정되는 포르마잔 프로덕트의 양은 배양액 중 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례한다.

< 실시예 3-2> 화합물 Dan - BC1 , Dan - BC2 또는 Dan - BC3 가 유방암 세포주 생존도(viability)에 미치는 영향평가

MCF-7 유방암 세포주에 각각의 화합물을 농도별로 투여 후 유방암세포의 활성을 관찰하였다. MCF-7 세포 2×10⁵ 개를 6웰 플레이트에 각각 분주하여 성장시켰다. 그 후 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3를 약제투여 농도인 10, 50 및 100 uM이 되도록 희석하여 암세포에 농도별로 2일간 처리한 후 세포 생존도를 약제를 처치하지 않은 군과 비교 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에 상기 3 가지 화합물들이 MCF-7 유방암세포의 성장을 억제하는 것을 보여주는 사진(200배 확대)을 나타내었다. 도 1에 나타나는 바와 같이, Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3 모두에서 10 uM 농도에서는 세포성장 억제효과가 미약했으며 50 uM 농도에서도 아주 뚜렷한 세포성장억제효과를 볼 수 없었으나, 100 uM 농도에서는 세포 사멸효과를 육안으로 쉽게 확인할 수 있었다. 따라서 각 트리아진 유도체 화합물의 투여농도를 100 uM로 정하여 후속 실험을 진행하였다.

도 2에 MCF-7 유방암세포를 상기 세 가지 화합물 100 uM로 처리한 후 성장 억제 정도를 나타내었다. 유방암세포에 대한 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 성장억제효과를 보면 Dan-BC3는 100 uM 투여 후 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 투여 후 12시간째에는 약 60%가 생존하였고, 24시간째에는 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 약 37%만이 생존하였고 36시간째에는 약 7% 및 48시간째에는 모든 세포가 사멸에 이르렀다. Dan-BC1은 100 uM 투여 후 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 투여 후 12시간째에는 약 68%가 생존하였고, 24시간째에는 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 약 37%만이 생존하였고 36시간째에는 약 27% 및 48시간째에는 모든 세포가 사멸에 이르렀다. Dan-BC2는 100 uM 투여 후 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 투여 후 12시간째에는 약 75%가 생존하였고, 24시간째에는 약제를 투여하지 않은 유방암세포주에 비하여 약 49%만이 생존하였고 36시간째에는 약 33% 및 48시간째에는 20%만이 생존하였다.

< 실시예 4-1> 누드마우스에 유방암 종괴의 형성 및 시험 화합물의 평가

누드마우스에서 MCF-7 종양세포의 종양형성 능력을 측정하기 위하여 생후 4-5주된 암컷 누드마우스(BALB/c계 athymic nu/nu)를 대상으로 트립판(trypan) 블루 염료 배제(dye exclusion) 검사상 생존도가 95% 이상인 5×10⁶개의 MCF-7 종양세포를 200 ㎕의 PBS에 섞어 30 마리에게 피하부위에 접종하였고 이후 2주에서 2개월까지 성장시킨 후 형성된 종양의 직경이 10-25mm 이상이 되는 경우 시험 화합물의 투여를 시작하였다. 시험 화합물은 종양크기 측정 2일 후 투여하기 시작하였으며 일주일 간격으로 투여하였고 최초 투여 농도는 각각 500 uM로 하였다. 시험 화합물이 투여되지 않은 종양이 형성된 누드마우스의 사진을 도 3에 나타내었으며, 종양의 크기는 장경 25 mm, 단경 20 mm, 높이 15 mm, 체중 27 g이었다.

< 실시예 4-2> 각 화합물들의 생체 내 유방암 억제효과 평가

실시예 4-1과 같이 누드마우스에 유방암을 형성시킨 후 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3를 투여하여 종괴크기의 변화를 관찰하였다. 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3를 500 uM씩 2회 투여 후 동일한 시간이 지난 상기 실시예 4-1의 음성 대조군의 유방암 종괴 크기(장경 25 mm, 단경 20 mm, 높이 15 mm)와 비교한 결과, 화합물 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3 투여 후 종괴크기는 크기가 각각 하기 표 1, 2 및 3에 기재한 정도로 감소하여 누드마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 대한 본 발명의 트리아진 유도체 화합물의 강력한 항암효과를 확인할 수 있었다. 각각의 사진을 도 4, 5 및 6에 나타내었다.

화합물 Dan-BC1	약물농도(uM)	장경(mm)	단경(mm)	높이(mm)	체중(g)
최초투여 1일 전	-	4	2	2	18.5
최초투여 당일	500	12	10	5	21.2
최초투여 1주일 후	500	10	8	2	19.5

화합물 Dan-BC2	약물농도(uM)	장경(mm)	단경(mm)	높이(mm)	체중(g)
최초투여 1일 전	-	4	2	2	19.5
최초투여 당일	500	12	10	5	21.2
최초투여 1주일 후	500	15	10	3	20.5

화합물 Dan-BC3	약물농도(uM)	장경(mm)	단경(mm)	높이(mm)	체중(g)
최초투여 1일 전	-	4	2	2	19.5
최초투여 당일	500	12	7	5	21.2
최초투여 1주일 후	500	15	10	2	20.5

상기 표 1, 2 및 3의 결과를 종합하여 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타나는 바와 같이 누드마우스에서 각 화합물들의 유방암세포 사멸효과는 화합물 Dan-BC1이 가장 높았고, 다음은 화합물 Dan-BC3, 그리고 화합물 Dan-BC2의 순서로 항암효과가 나타났다.

< 실시예 5-1> 암형성 형질전환 동물모델을 이용한 화합물 Dan - BC1 , Dan - BC2 및 Dan-BC3의 항암효과 평가

포유동물에서 과발현되어 암을 유발하는 인간 원암유전자로 형질전환된 마우스를 이용하여 본 발명에 따른 화합물인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3의 항암효과를 평가하였다.

마우스를 형질전환시키기 위해 사용된 세포주는 종양형성능을 가지고 있어, 포유동물에 이식될 경우 촉지성 종양(palpable tumor)과 같은 암종을 형성한다. 본 실험에 사용된 세포주는 인간 원암유전자(이하, HCCR-1)을 과발현하여 다량의 HCCR-1 단백질을 생성하며, 이 단백질이 암과 관련된 것으로 보고된 바 있는 D52 단백질(GenBank 등록번호 NM003288)(Byrne, J.A. et al ., Cancer Res., 55, 2896-2903 (1995); 및 Bryne, J.A. et al., Oncogene, 16, 873-881 (1998) 참조)과 상호작용하고, 단백질 키네이즈C 및 텔로머레이즈를 활성화시키며, 세포주기 체크포이트(Checkpoint) 조절 기능을 상실하게 하고, egr-1 유전자의 발현을 하향 조절하는 과정을 거쳐 악성 종양으로 전환한다. 특히 이 과정에서 세포주기 조절에 관련된 종양억제 유전자 p53의 발현이 증가되지만 생성된 p53 단백질의 대부분이 불활성화됨으로써 종양 억제 기능을 다하지 못해 악성 종양으로 전환되는 것으로 보인다. 즉, HCCR-1은 상위 단계(upstream level)에서 종양 억제 유전자 p53의 기능을 불활성화시키는 것으로 보인다(대한민국특허 등록번호 제426452호 "인간 원암 유전자로 형질전환된 포유동물 및 이 유전자를 이용한 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암 진단용 키트"; 및 대한민국특허 등록번호 제367978호 "인간 자궁경부암 1 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질" 참조).

따라서, 이러한 형질전환 포유동물은 인간 원암 유전자 HCCR-1을 과발현하여 암을 형성하므로 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있고, 특히 유방암, 신장암, 난소암 또는 위암에 효과적인 약물의 스크리닝에 유용하다.

암형성 형질전환 마우스 암컷에서 자연히 형성된 유방암들에 본 발명에 따른 화합물들인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3을 각각 100 uM씩 일주일 간격으로 투여한 후 종양억제효과를 관찰하였으며, 각각의 결과를 도 8, 9 및 10에 나타내었고, 각각의 결과를 종합하여 도 11에 그래프로 나타내었다.

도 8에 나타나는 바와 같이, 유방암이 자연발생한 형질전환 마우스에 화합물 Dan-BC1를 100 uM씩 2회 투여하였다. 화합물 Dan-BC1의 경우 1회 투여만으로도 유방암의 소실을 유도하였으며, 따라서 화합물 Dan-BC1은 유방암 형질전환 마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 대한 강력한 항암효과를 나타내었다.

도 9에 나타나는 바와 같이, 유방암이 자연발생한 형질전환 마우스에 화합물 Dan-BC2 100 uM을 1회 투여 후 유방암이 소실되었다. Dan-BC2의 경우 1회 투여만으로도 유방암의 소실을 유도하였으나 이차주사시에는 다시 종양의 형성이 유도되었다. 화합물 Dan-BC2은 유방암 형질전환 마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 항암효과를 나타내었다.

도 10에 나타나는 바와 같이, 유방암이 자연발생한 형질전환 마우스에 화합물 Dan-BC3 100 uM을 1회 투여 후 유방암이 소실되었다. Dan-BC3의 경우 1회 투여만으로도 유방암의 소실을 유도하였으나 이차주사시에는 다시 종양의 형성이 유도되었다. 화합물 Dan-BC3은 유방암 형질전환 마우스 생체 내에서 형성된 유방암에 대한 항암효과를 나타내었다.

이상의 결과를 종합하여 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타나는 바와 같이, 암발생 형질전환 동물모델에서 본 발명에 따른 트리아진 유도체 화합물인 Dan-BC1, Dan-BC2 및 Dan-BC3 중 Dan-BC1의 효과가 가장 탁월하였으며, 다음은 Dan-BC3 그리고 Dan-BC2의 순서로 효과에 차이가 있었다.

본 발명은 암을 치료하는데 유용한 상기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 치료방법을 제공한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, R₁은 탄소수 1 내지 8의 직쇄상(linear) 또는 분지상(branched) 알킬이며, R₂는 탄소수 1 내지 8의 직쇄상 또는 분지상 알킬, 알릴(allyl), 피리디닐메틸(pyridinylmethyl), 피리디닐에틸 및 피리디닐프로필로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, R₃는 치환되지 않은 벤조일(benzyol) 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬로 치환된 벤조일이고, n은 1 내지 3의 정수임.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 R₁은 부틸이며, R₂는 알릴, 1-에틸프로필 및 피리디닐메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이고, R₃는 치환되지 않은 벤조일(benzyol)이며, n은 2인 것을 특징으로 하는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 R₂는 알릴인 것을 특징으로 하는 트리아진 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 트리아진 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 신장암, 뇌암, 난소암, 위암, 자궁경부암, 폐암, 백혈병, 림프종, 간암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.