KR100760328B1

KR100760328B1 - Production of Attenuated Negative Stranded RNA Virus Vaccines from Cloned Nucleotide Sequences

Info

Publication number: KR100760328B1
Application number: KR1020017013102A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 알. 머피; 피터 엘. 콜린스; 아나 피. 더빈; 마리오 에이치. 스키아도포울로스
Original assignee: 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2007-10-04
Also published as: BR0011159A; CN1347458A; WO2000061737A2; AU2005203596B8; AU2005203596B2; AU781238B2; WO2000061737A3; MXPA01010392A; JP4646410B2; CA2369817A1; KR20020008831A; AU2005203596C1; AU4231500A; JP2002541798A; IL145797A0; AU2005203596A1; EP1171623A2

Abstract

백신으로 사용하기에 적합한 어테뉴에이티드 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스가 상기 바이러스를 코딩하는 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드로부터 제조된다. 재조합 게놈 또는 안티게놈은 이형의 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인된 어테뉴에이팅 돌연변이의 아미노산 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 상기 재조합 바이러스의 재조합 단백질 내에서 돌연변이를 코딩하도록 변형된다.
Attenuated recombinant negative strand virus suitable for use as a vaccine is prepared from one or more isolated polynucleotides encoding the virus. The recombinant genome or antigenome is modified to encode a mutation in the recombinant protein of the recombinant virus at an amino acid position corresponding to the amino acid position of the attenuating mutation identified in the heterologous recombinant negative strand RNA virus.

어테뉴에이션, RNA, 바이러스, 백신, 뉴클레오타이드, 홍역, 게놈Attenuation, RNA, Virus, Vaccine, Nucleotide, Measles, Genome

Description

클론된 뉴클레오타이드 서열로부터 어테뉴에이티드된 네가티브 스트랜드 ＲＮＡ 바이러스 백신을 제조하는 방법{Production of Attenuated Negative Stranded RNA Virus Vaccines from Cloned Nucleotide Sequences}Production of Attenuated Negative Stranded RNA Virus Vaccines from Cloned Nucleotide Sequences

네가티브 스트랜드 RNA 바이러스군은 매우 파괴성이 큰 주요 병원균의 다양한 모노네가바이랄(Mononegavirales) 목을 포함한다. 이 군에 속하는 인간 병원균들에는 광견병 바이러스(RaV), 홍역 바이러스(MeV), 볼거리 바이러스(MuV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 여러 유전인자형을 갖는 파라인플루엔자 바이러스(PIV)가 포함된다. RSV의 경우, 1세 미만의 영아에게 폐렴 및 세기관지염을 일으키는 모든 다른 미생물성 병원균들보다 우위에 있다. RSV가 발병 원인으로 되는 것은 호흡계 질환 때문에 병원을 찾는 환자 5명 중 1명 이상의 비율이고, RSV로 인하여 미국 내에서만 1년에 91,000명이 입원하고 4,500명이 사망한다. 인간 PIV 바이러스들(예: HPIV1, HPIV2 및 HPIV3)도 주로 영아나 아동에게 세기관지염, 위막성 후두염 및 폐렴을 일으키는 등 인간에게 막대한 희생을 치르게 한다. 이에 대해서는 다음의 문헌들을 참조하라: Karron et al., J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins et al. "Parainfluenza Viruses", p. 1205-1243. In B. N. Fields et al., eds., Fields Virology, 3rd ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia (1996); Murphy et al., Virus Res. 11: 1-15 (1988). 호흡계 감염 때문에 입원하 는 어린 영아나 아동들의 20% 정도는 그 원인이 인간 PIV 바이러스류의 감염이다.The negative strand RNA virus family includes a variety of Mononegavirales from major pathogens that are highly disruptive. Human pathogens belonging to this group include rabies virus (RaV), measles virus (MeV), mumps virus (MuV), respiratory syncytial virus (RSV) and parainfluenza virus (PIV) with several genotypes. RSV is superior to all other microbial pathogens that cause pneumonia and bronchiolitis in infants under 1 year of age. The cause of RSV is the rate of more than one in five patients who come to the hospital because of respiratory illness, and RSV causes 91,000 hospitalizations and 4,500 deaths per year in the United States alone. Human PIV viruses (such as HPIV1, HPIV2, and HPIV3) also make significant sacrifices to humans, mainly causing bronchiolitis, laryngopharyngitis and pneumonia in infants and children. See, for example, Karron et al., J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins et al. "Parainfluenza Viruses", p. 1205-1243. In B. N. Fields et al., Eds., Fields Virology, 3rd ed, vol. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia (1996); Murphy et al., Virus Res. 11: 1-15 (1988). About 20% of young infants and children admitted for respiratory infections are caused by human PIV viruses.

RSV 및 PIV에 대하여 효과적인 백신을 개발하기 위하여 수십년간 연구가 진행되었음에도 불구하고, 이들 바이러스에 의한 심각한 병상 및 상당한 사망률을 감소시킬 수 있는 안전하고 효과적인 백신은 아직까지 개발되지 않고 있다. 모노네가바이랄의 다른 멤버들도 마찬가지로 효과적인 백신이 개발되기를 기대하거나 개선된 백신으로부터 혜택을 받고자 한다. 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스류에 대한 생(生) 백신을 개발함에 있어서 한 가지 장애물은 어테뉴에이션(attenuation)과 면역원성간의 적절한 균형을 이루기가 어렵다는 점이다. 어테뉴에이티드된바이러스의 유전적 안정성도 문제된다. 또한 RSV에 대한 백신 개발에서 세포 배양시의 RSV의 비교적 더딘 성장 및 바이러스 입자의 불안정성도 장애 요인이 된다. RSV 감염의 또다른 특징은 유도된 면역성이 2차 감염에 대하여 완전히 방어 역할을 하지 못한다는 점이다. 이러한 현상의 원인에는 호흡관의 관강내 표면 상에 바이러스 감염을 막는 면역 시스템이 비교적 효율적이지 못하거나, 국소 점막 면역성이 오래 유지되지 못하거나, 바이러스 복제가 매우 빠르고 강력하게 일어난다거나, 면역학적 미성숙으로 인하여 어린 아이들의 면역 반응이 감소되거나, 태반으로부터 유래된 모체 혈청 항체에 의해 면역억제가 일어난다거나 바이러스의 특정 성질, 예를 들면 단백질의 글리코실화가 고도로 일어나는 등 여러 가지가 있다. 또한, 후술하는 바와 같이, RSV는 2가지의 안티게놈 서브그룹 A와 B로 존재하고 한 서브그룹에 대한 면역성은 다른 서브그룹에 대한 것보다 효율성이 떨어진다.Although decades of research have been conducted to develop effective vaccines against RSV and PIV, no safe and effective vaccines have yet been developed that can reduce the serious condition and significant mortality caused by these viruses. Other members of Mononegaviral likewise expect to develop effective vaccines or benefit from improved vaccines. One obstacle in developing live vaccines against negative strand RNA viruses is the difficulty in achieving a proper balance between attenuation and immunogenicity. The genetic stability of the attenuated virus is also a problem. In addition, relatively slow growth of RSV in cell culture and instability of viral particles in the development of vaccines against RSV are also obstacles. Another feature of RSV infection is that induced immunity does not fully defend against secondary infection. This can be due to the relatively inefficient immune system that prevents viral infections on the lumenal surface of the respiratory tract, the lack of local mucosal immunity for a long time, the rapid or strong viral replication, or the immunological immaturity. This can lead to reduced immune responses in young children, immunosuppression by maternal serum antibodies derived from the placenta, or certain properties of the virus, such as high glycosylation of proteins. In addition, as described below, RSV exists in two antigenomic subgroups A and B, and the immunity to one subgroup is less efficient than that for the other subgroup.

1960년대 중반 포르말린으로 불활성화시킨 RSV를 RSV에 대한 백신으로서 테 스트를 한 적이 있었으나, RSV 감염 또는 질병에 대하여 방어 역할을 하지 못했고 바이러스의 2차 감염시 증상이 더 악화되었다[Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89: 422-434 (1969), Chin et al., Am. J. Epidemiol., 89: 449-463 (1969) ; Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89: 405-421 (1969)]. 보다 최근에는, RSV에 대한 백신 개발을 위해 어테뉴에이티드된 RSV 변이체에 초점을 맞추었다. 프리에데발드 등은 냉실에 통과시킨 RSV (cpRSV) 변이체가 백신 후보가 될 수 있을 정도로 어테뉴에이션이 충분히 되는 것으로 보인다고 보고하였[J. Amer. Med. Assoc.204: 690-694 (1968)]. 이 변이체는 그 모체인 야생형 바이러스에 비하여 26℃에서의 성장 효율이 약간 높았으나, 그 복제가 온도 민감성도 아니고 유효할 정도로 냉온에 적응하는 것도 아니었다. 그러나, 냉온에 통과시킨 변이체는 성인에 대해서는 어테뉴에이션되었다. RSV에 감염된 적이 있는 영아나 아동(즉, 혈청 양성 반응을 보이는 사람들)에 대해서는 만족할 정도로 어테뉴에이션되고 면역원성도 갖기는 하나, cpRSV 변이체는 혈청 음성 반응을 보이는 영야의 상부 호흡계에 대해서는 낮은 발병률을 유지하였다.In the mid-1960s, formalin-inactivated RSV was tested as a vaccine against RSV, but it did not play a protective role against RSV infection or disease, and symptoms worsened during the second infection of the virus [Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89: 422-434 (1969), Chin et al., Am. J. Epidemiol., 89: 449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89: 405-421 (1969)]. More recently, the focus has been on the augmented RSV variants for vaccine development against RSV. Priewald et al. Reported that the attenuation of RSV (cpRSV) variants passed through the cold compartment appeared to be sufficient to be candidates for vaccines [J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968). This variant had slightly higher growth efficiency at 26 ° C than its parental wild type virus, but its replication was neither temperature sensitive nor adaptable to cold. However, variants that passed through cold and warm were attenuated for adults. Although satisfactorily attenuated and immunogenic for infants and children who have been infected with RSV (ie, those who have seropositive), the cpRSV variant maintained a low incidence for the upper respiratory system of the seronegative .

이와 유사하게, 가르퓨어 등은 온도 민감성 RSV (tsRSV) 변이체를 분리하였고, 이것 또한 백신 후보로 유망한 것으로 보고하였다[J. Virol. 3: 414-421 (1969)]. 실험실에서 지원자들에 대하여 한 변이체(ts-1)를 면밀히 평가하였다. 이 변이체는 성인 지원자들에 있어서 무증상 감염을 나타냈고 면역화시킨 후 45일간 야생형 바이러스에 저항하는 내성을 나타냈다. 또한, 혈청 양성 반응을 보이는 영아와 아동은 무증상 감염을 나타냄에 반해, 음성 반응을 보이는 영야는 비염의 징후와 기타 경증상을 나타냈다. 더구나, 비록 온도 민감성이 부분적으로 또는 완전히 소실된 바이러스는 백신으로부터 회수가능한 바이러스의 일부였지만, 온도 민감성 표현형의 불안정성이 감지되었고, 이는 가벼운 비염 이외의 질병 징후와 무관하였다. Similarly, Garpure et al. Isolated temperature sensitive RSV (tsRSV) variants, which also reported to be promising vaccine candidates [J. Virol. 3: 414-421 (1969). One variant (ts-1) was carefully evaluated for volunteers in the laboratory. This variant showed asymptomatic infection in adult volunteers and was resistant to wild-type virus for 45 days after immunization. In addition, seropositive infants and children showed asymptomatic infections, whereas negative infants showed signs of rhinitis and other mild symptoms. Moreover, although the virus that partially or completely lost temperature sensitivity was part of the virus recoverable from the vaccine, instability of the temperature sensitive phenotype was detected, which was independent of disease signs other than mild rhinitis.

상기의 연구 및 기타 다른 연구 결과, 냉온에 통과시킨 온도 민감성 RSV 균주는 어테뉴에이션이 덜 되어 특히 혈청 음성 반응을 보이는 영아에 있어서는 일부 백신의 경우 경증상을 일으켰음에 반해 다른 것들은 어테뉴에이션이 과도하게 되어 방어성 면역 반응을 일으킬 정도로 충분하게 복제되지는 못하였음이 밝혀졌다[Wright et al., Infect. Immun., 37: 397-400 (1982))]. 더구나, 후보 백신 변이체들의 유전적 불안정성 때문에 온도 민감성 표현형이 소실되었고, 나아가 효과적인 RSV 백신의 개발이 어려웠다[Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145: 1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8: 689696 (1974), Belshe et al., J. Med. Virol., 3: 101-110 (1978)].The above and other studies have shown that temperature-sensitive RSV strains that pass through cold and cold are less attenuated and cause mild symptoms in some vaccines, especially in infants with seronegative reactions, while others are excessively attenuated. It has been found that it has not been replicated enough to cause a protective immune response. [Wright et al., Infect. Immun., 37: 397-400 (1982)). Moreover, the genetic instability of candidate vaccine variants resulted in the loss of temperature sensitive phenotypes and further development of effective RSV vaccines [Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145: 1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8: 689696 (1974), Belshe et al., J. Med. Virol., 3: 101-110 (1978).

냉온 통과와 같은 조절이 정교하지 못한 생물학적 방법을 사용하여 어테뉴에이티드된적절한 RSV 균주를 만들어내는 접근 방법을 포기하고, 연구자들은 정제된 RSV 외피 당단백질을 사용하여 서브유닛 백신 후보들을 테스트하였다. 당단백질은 코튼 랫(cotton rat)의 폐의 RSV 감염에 대한 내성을 유도하였으나[Walsh et al., J. Infect. Dis. 155: 1198--1204 (1987)], 그 항체들은 항원 중화력이 약하여 정제된 서브유닛 백신으로 설치류를 면역화시킨 경우 이전에 처리된 RSV 백신에 의해 질병이 악화될 가능성이 커졌다[Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990)]. Abandoning the approach of producing appropriate RSV strains that were attenuated using biological methods with poor control such as cold and cold passage, the researchers tested candidate subunit vaccines using purified RSV envelope glycoproteins. Glycoprotein induced resistance to RSV infection in the lungs of cotton rats [Walsh et al., J. Infect. Dis. 155: 1198--1204 (1987)], the antibodies have low antigenic neutralizing ability, which increases the likelihood of disease exacerbation by previously treated RSV vaccines when immunized rodents with purified subunit vaccines [Murphy et al. , Vaccine 8: 497-502 (1990).

F 또는 G 외피 당단백질을 발현하는 우두 바이러스 재조합체를 사용한 백신도 연구되었다. 이들 제조합체는 진정 바이러스성 대응체로부터 구별될 수 없는 RSV 당단백질을 발현하고, 우도-RSV F 및 G 제조합체를 피내 감염시킨 설치류는 바이러스 감염도를 낮추는 특정 항체를 다량 생성하였다. 실제로, 코튼 랫을 우두-F 재조합체로 감염시킨 경우 하부 호흡계에서는 RSV 복제에 대하여 거의 완벽한 내성을 보였고 상부 호흡계에서도 상당한 내성을 보였다[Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7462-7466 (1986))]. 그러나, 침팬지를 우두-F 및 -G 재조합체로 면역화시킨 경우에는 상부 호흡계에서는 거의 방어 기능이 일어나지 못했고[Collins et al., Vaccine 8: 164-168 (1990))] 하부 호흡계에서는 방어 기능이 일관되게 일어나지 않았다[Crowe et al., Vaccine 11: 1395 1404 (1993))].Vaccines using vaccinia virus recombinants expressing F or G envelope glycoproteins have also been studied. These preparations expressed RSV glycoproteins indistinguishable from truly viral counterparts, and rodents infected with the likelihood-RSV F and G conjugates produced large quantities of specific antibodies that lowered viral infectivity. Indeed, when cotton rats were infected with vaccinia-F recombinants, they showed almost complete resistance to RSV replication in the lower respiratory system and significant resistance in the upper respiratory system [Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7462-7466 (1986)). However, immunization of chimpanzees with vaccinia-F and -G recombinants resulted in almost no defensive function in the upper respiratory system (Collins et al., Vaccine 8: 164-168 (1990)) and consistently in the lower respiratory system. Did not occur (Crowe et al., Vaccine 11: 1395 1404 (1993)).

이와 같이, 생물학적으로 어테뉴에이티드된바이러스 균주, 서브 유닛 백신, 그밖의 RSV 및 기타 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 처리하기 위한 백신 개발 전략들이 만족스럽지 못한 바, 새로운 백신을 개발하기 위한 신규의 방법, 특히 생육 가능하고 어테뉴에이티드된재조합체에 신규의 표현형질이 생길 수 있는 유전적 변화가 일어나도록 재조합 백신 후보들을 인위적으로 조작하는 방법이 요구되고 있다.As such, vaccine development strategies for treating biologically attenuated virus strains, subunit vaccines, other RSV and other negative strand RNA viruses are not satisfactory, and thus new methods for developing new vaccines, especially growth. There is a need for a method of artificially manipulating recombinant vaccine candidates so that genetic changes that can result in new phenotypes in possible and attenuated recombinants occur.

그러나, RSV 및 기타 네가티브 센스 RSV 바이러스들의 게놈의 RNA를 조작하는 것은 지금까지 어려운 것으로 믿어져왔다. RNA 조작을 어렵게 하는 주요 요인에는 이들 바이러스의 게놈의 RNA 그 자체가 비감염성을 나타낸다는 점, 조직 배양시바이러스 성장률이 낮다는 점, 복제 사이클이 길다는 점, 비리온(virion)이 불안정 하다는 점, 게놈이 복잡하다는 점 및 유전자 산물이 다루기 힘들게 구성되어 있다는 점 등이 포함된다.However, engineering the RNA of the genome of RSV and other negative sense RSV viruses has been believed to be difficult until now. The main factors that make RNA manipulation difficult are that the RNAs of these viruses' genomes themselves are non-infectious, low virus growth rate in tissue culture, long replication cycles, and unstable virions. This includes the complexity of the genome and the unwieldy composition of gene products.

PIV3의 경우, 어테뉴에이티드된생 백신 2개가 특히 주목을 받아왔다. 이들 중 하나는 소 PIV3 (BPIV3) 균주인데, 이는 항원적으로 HPIV3와 관련이 있고, HPIV3로부터 동물들을 보호하는 것으로 알려져 있다. BPIV3는 어테뉴에이션되고, 유전적으로 안정하며 영아 및 아동에게 면역원성을 갖는다[Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron et al., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b))]. 또다른 PIV3 백신 후보는 JS cp45인데, 이는 HPIV3의 JS 야생형의 냉온에 적응된 변이체이다[Karron et al., (1995b), supra; Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-42 (1982))]. 상기 어테뉴에이션되고, 냉온에 통과시킨(cp) PIV3 생 백신 후보는 온도에 민감하고(ts), 냉온에 적응성이 있으며(ca), 생체 내에서 바이러스가 복제된 후에는 안정성을 갖는 어테뉴에이션(att) 표현 형질을 갖는다. cp45 바이러스는 실험 동물의 경우 인간 PIV3에 대한 방어 기능을 나타내고 어테뉴에이션되고, 유전적으로 안정적이며 혈청 음성 반응을 보이는 영아 및 아동에게 면역원성을 갖는다[Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992); Karron et al., J. Infect. Dis. 172 (6): 1445-1450 (1995b), supra)]. For PIV3, two attenuated live vaccines have received particular attention. One of these is the bovine PIV3 (BPIV3) strain, which is antigenically associated with HPIV3 and is known to protect animals from HPIV3. BPIV3 is attenuated, genetically stable and immunogenic to infants and children [Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron et al., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)). Another PIV3 vaccine candidate is JS cp45, which is a cold-adapted variant of the JS wild type of HPIV3 [Karron et al., (1995b), supra; Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-42 (1982)). The attenuated, cold-passed (cp) PIV3 live vaccine candidates are temperature sensitive (ts), adaptive to cold and cold (ca), and stable after virus replication in vivo (att) ) Has an expressing trait. The cp45 virus is immunogenic in infants and children who exhibit protective function against human PIV3 in experimental animals and are attenuated, genetically stable and sero negative [Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992); Karron et al., J. Infect. Dis. 172 (6): 1445-1450 (1995b), supra).

재조합 DNA 기술에 의해 cDNA로부터 감염성 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스들을 회수하여 바이러스 클론을 유전적으로 조작하여 신규 백신 후보들을 제조하고, 그들의 어테뉴에이션 정도 및 표현 형질의 안정성을 신속히 평가할 수 있게 되었다[Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996))]. 본문에서는, 감염성 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3), 광견병 바이러스 (RaV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스(MeV), 센다이(Sendai) 바이러스(SeV) 우역 바이러스, 원숭이 바이러스 제S형, 및 필수 바이러스 단백질들 존재하에 cDNA-코딩된 안티게놈 RNA로부터 유래된 소 RSV 에 대한 재조합 구조체들이 보고되었다[Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 92: 8388-92 (1995); Hoffman et al., J Virol. 71: 4272-4277 (1997); Kato et al., Genes to Cells 1: 569-579 (1996), Roberts et al., Virology 247 (1), 1-6 (1998); Baron et al., J Virol. 71: 1265-1271 (1997); WO 97/06270; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); U.S.P No. 08/892,403 (출원일: 1997. 7. 15) ; Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); He et al. Virologv 237: 249-260 (1997); Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); Jin et al. Virolosv 251: 206-214 (1998); Bucholz et al. J. Virol. 73: 251-259 (1999); Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442 (1999); 이들은 본 명세서에 참고로 인용됨)].Infectious negative strand RNA viruses can be recovered from cDNA by recombinant DNA technology to genetically engineer virus clones to prepare new vaccine candidates, and to rapidly assess their attenuation and stability of expression traits [Conzelmann, J. Gen. . Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996)). Infectious respiratory syncytial virus (RSV), human parainfluenza virus 3 (HPIV3), rabies virus (RaV), bullous stomatitis virus (VSV), measles virus (MeV), Sendai virus (SeV) virus Recombinant constructs for bovine RSV derived from cDNA-coded antigenomic RNA in the presence of virus, monkey virus type S, and essential viral proteins have been reported [Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995). ); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 92: 8388-92 (1995); Hoffman et al., J Virol. 71: 4272-4277 (1997); Kato et al., Genes to Cells 1: 569-579 (1996), Roberts et al., Virology 247 (1), 1-6 (1998); Baron et al., J Virol. 71: 1265-1271 (1997); WO 97/06270; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); U.S.P No. 08 / 892,403 (filed July 15, 1997); Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); He et al. Virologv 237: 249-260 (1997); Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); Jin et al. Virolosv 251: 206-214 (1998); Bucholz et al. J. Virol. 73: 251-259 (1999); Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442 (1999); These are incorporated herein by reference).

재조합된 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 회수하여 변형시키는 역 유전적 방법을 사용할 수 있음에도 불구하고, RSV, PIV 및 기타 모노네가바이랄에 속하는 병원균들에 의해 발생될 수 있는 질병을 경감시키는 안전하고 효과적인 백신을 개발하는 추가적인 방법들이 여전히 요구되고 있다. 이러한 방법을 개발함에 있어서 남은 장애물들 중에는 적절하게 어테뉴에이션되고 면역원성이 있고 유전적으로 안정적인 백신 후보를 얻는 것이 어렵다는 점이 포함된다.Although reverse genetic methods can be used to recover and modify recombinant negative strand RNA viruses, safe and effective vaccines can be used to alleviate diseases that can be caused by pathogens belonging to RSV, PIV, and other mononegavirals. Additional methods of development are still required. Remaining obstacles in developing such methods include the difficulty in obtaining appropriately attenuated, immunogenic and genetically stable vaccine candidates.

이러한 목적으로 달성하기 위해서는, 재조합 바이러스 균주에 어테뉴에이션 돌연변이를 확인하고 도입하는 기존의 방법들을 응용하여야 한다. 놀랍게도, 본 발명은 이러한 목적을 달성하고 하기하는 바와 같은 부가적인 잇점을 제공한다.To achieve this purpose, existing methods of identifying and introducing attenuation mutations into recombinant viral strains must be applied. Surprisingly, the present invention achieves this object and provides additional advantages as follows.

<발명의 요약>Summary of the Invention

본 발명은 백신으로 사용하기에 적합한 어테뉴에이티드된재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 설계하고 제조하는 신규한 방법 및 그 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는 1 이상의 단리된, 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 제조된다. 즉, 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 감염성 바이러스 또는 바이러스 입자를 제조하는 데에 필수적인 바이러스 단백질과 함께 세포 또는 무세포 시스템으로 공발현함에 의해 제조된다.The present invention provides novel methods and compositions thereof for designing and preparing attenuated recombinant strand strand RNA viruses suitable for use as vaccines. According to the method of the present invention, the recombinant negative strand RNA virus is prepared from one or more isolated, virus-encoding polynucleotide molecules. That is, one or more polynucleotide molecules encoding a recombinant genome or antigenome of a virus are prepared by co-expressing a cellular or cell-free system with viral proteins essential for producing an infectious virus or viral particle.

대상 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 이형의 변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 의 어테뉴에이션 돌연변이 부위에 대응하는 1 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이가 일어나도록 변형한다. 이 돌연변이는 채택 또는 되풀이되는 방식으로 전달된 것으로서 이는 놀랍게도 재조합 바이러스에게 어테뉴에이션 표현형 질을 부여한다. 이러한 방식으로, 후보 백신 바이러스를 재조합 가공하여 대상 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 숙주 내에서 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하도록 한다.The recombinant genome or antigenome of the subject virus is modified such that the mutation occurs at one or more amino acid positions corresponding to the attenuation mutation site of the heterologous variant strand strand RNA virus. This mutation was delivered in an adoptive or repetitive manner, which surprisingly gives the recombinant virus an attenuation phenotype. In this way, candidate vaccine viruses are recombinantly processed to induce an immune response against negative stranded RNA viruses in a host susceptible to infection by the subject virus.

본 발명의 일면에서, 어테뉴에이티드된재조합 네가티브 스트랜드 바이러스 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된, 폴리뉴클레오타이드 분자 및 벡터가 제공된다. 이와 관련하여, 상기 게놈 또는 안티게놈은 이형의, 변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 어테뉴에이션시키는 돌연변이 부위에 상응하는 아미노산 위치에서 바이러스의 선택된 재조합 단백질 내에 돌연변이를 코딩한다.In one aspect of the invention, isolated, polynucleotide molecules and vectors encoding the synthesized recombination negative strand virus genome or antigenome are provided. In this regard, the genome or antigenome encodes a mutation in a selected recombinant protein of the virus at an amino acid position corresponding to a mutation site that is attenuated within a heterologous, variant negative strand RNA virus.

또한 본 발명은 상기와 같이 돌연변이된 어테뉴에이티드된재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 함유하는 조성물 및 이를 이용하여 대상 바이러스의 감염을 예방 및 치료하기 위한 방법도 제공한다.The present invention also provides a composition containing the mutated attenuated recombinant negative strand RNA virus as described above and a method for preventing and treating infection of the virus of interest using the same.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는 RSV, PIV 또는 MeV이다. 이들 실시태양들과 관련하여, 이형의, 변이된 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는 이형의 RSV, HPIV(HPIV1, HPIV2, HPIV3), BPIV, SeV, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), SV5, MuV, MeV, 강아지 디스템퍼(distemper) 바이러스(CDV), RaV 또는 VSV이다.In a preferred embodiment of the invention, the recombinant negative strand RNA virus is RSV, PIV or MeV. In connection with these embodiments, heterologous, mutated, negative strand RNA viruses are heterologous RSV, HPIV (HPIV1, HPIV2, HPIV3), BPIV, SeV, Newcastle Disease Virus (NDV), SV5, MuV, MeV, Puppy Distemper ( distemper) virus (CDV), RaV or VSV.

본 발명의 방법에 따라, 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스로부터 여러 가지 표적 단백질들에 대하여 이형의 단백질 내의 대응 부위에 어테뉴에이션 돌연변이를 도입하게 된다. 모노네가바이랄 목 전체 중에서, 5개의 표적 단백질들이 보존성을 강하게 나타내고 특정 영역 또는 도메인에 대하여 서열 일치도도 높다. 특히, 모 노네가바이랄의 공지된 구성원들 모두는 하기 5 단백질의 상동 정렬을 공유하고 있다: 뉴클레오캡시드 단백질(N), 뉴클레오 인단백질(P), 비글리코실화 매트릭스 단백질(M), 1 이상의 표면 당단백질(HN, H, or G) 및 대형 폴리머라제 단백질(L). 이들 단백질은 모두 이형의 돌연변이 바이러스 내에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이 부위에 상응하는 부위에서 재조합 바이러스의 한 단백질 내의 1 이상의 보존된 잔기를 변경시킴으로써 어테뉴에이션 돌연변이를 도입하는 데에 유용한 표적들이다.According to the method of the present invention, attenuation mutations are introduced at the corresponding sites in the heterologous protein for various target proteins from the negative strand RNA virus. Of the mononegaviraral necks, five target proteins are strongly conservative and show high sequence agreement for a particular region or domain. In particular, all known members of the mononegaribal share a homologous arrangement of the following five proteins: nucleocapsid protein (N), nucleophosphoprotein (P), aglycosylated matrix protein (M), 1 Surface glycoproteins (HN, H, or G) and large polymerase proteins (L). All of these proteins are useful targets for introducing attenuation mutations by altering one or more conserved residues in a protein of a recombinant virus at a site corresponding to an attenuation mutation site identified in a heterologous mutant virus.

보다 상세하게는, 모노네가바이랄 목 중 특정의 과, 아과, 속 또는 종들과만 공유될 수 있는 추가의 단백질들이 표적화된다. 예를 들면, 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 과의 모든 구성원들은 2 이상의 표면 당단백질 HN (or H or G) 및 F을 갖는다. 레스피로 바이러스(Respirovirus), 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 모르빌리바이러스(Morbillivirus) 과의 거의 모든 구성원들은 시스테인이 풍부한 단백질 V를 갖는다. 또한 레스피로바이러스와 모르빌리바이러스는 동형 C 단백질을 코딩한다. 뉴모바이러스(Pneumoviruses)와 루불라바이러스의 서브세트(SV5 및 MuV)는 동형의 표면 당단백질 SH를 공유한다. 뉴모바이러스 과[소, 양, 염소 RSV 및 쥐의 폐렴 바이러스{별칭: 쥐(murine) RSV} 등이 포함됨]내에서는, 몇몇 단백질 NS1, NS2, M2(ORF1) 및 M2(ORF2)이 추가적으로 보전적이다. 조류 뉴모바이러스들은 NS1 및 NS2은 없으나 M2(ORF1), M2(ORF2) 및 SH 단백질은 있다. 상기한 단백질들은 모두 관심의 대상이 되는 표적 단백질을 공유하는 계통간에 어테뉴에이션 돌연변이의 이형 전달을 위한 유용한 표적들이 된다. More specifically, additional proteins are targeted that can only be shared with a particular family, subfamily, genus or species of the mononegaviral tree. For example, all members of the Paramyxovirus family have two or more surface glycoproteins HN (or H or G) and F. Almost all members of the Respirovirus, Rubulavirus, and Morbillivirus families have cysteine rich protein V. In addition, respiroviruses and morbiliviruses encode isoform C proteins. Pneumoviruses and subsets of rubulaviruses (SV5 and MuV) share homozygous surface glycoprotein SH. Within the pneumovirus family [including cattle, sheep, goat RSV and murine pneumonia viruses (also called murine RSV)], several proteins NS1, NS2, M2 (ORF1) and M2 (ORF2) are additionally conserved. to be. Avian pneumoviruses lack NS1 and NS2 but have M2 (ORF1), M2 (ORF2) and SH proteins. These proteins are all useful targets for heterologous transfer of attenuation mutations between lines that share the target protein of interest.

본 명세서에서, 본 발명의 방법은 첫번째 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 어테뉴에이션 돌연변이를 확인하는 것에 기초한다. 돌연변이(이는 돌연변이 부위를 표지하는 아미노산 위치에서 야생형과 변이체 간의 서열 차이로 확인됨)는 재조합 어테뉴에이션을 위한 표적 바이러스인 다른 바이러스 내에 동형 단백질에과 서열 비교를 위한 인덱스를 제공한다. 어테뉴에이션 돌연변이는 이미 알려진 것일 수도 있고 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스를 발생시키고 특성화하는 데에 사용되는 돌연변이유발 기법 및 역 유전 기법에 의해 확인될 수 있다. 또는, 드 노보(de novo)로 발생시키고 특성화할 수도 있다(예: 부위 특이적 돌연변이유발 및 통상의 선별 방법).Herein, the methods of the present invention are based on identifying attenuation mutations in the first negative strand RNA virus. Mutations, which are identified by sequence differences between wild type and variant at the amino acid positions that label the mutation sites, provide an index for sequence comparison to homologous proteins in other viruses that are target viruses for recombinant attenuation. Attenuation mutations may already be known and may be identified by mutagenesis and reverse genetic techniques used to generate and characterize biologically induced mutant viruses. Alternatively, it may be generated and characterized by de novo (eg, site specific mutagenesis and conventional screening methods).

네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인된 각 어테뉴에이션 돌연변이는 1 이상의 이형 네가티브 스트랜드 바이러스 내의 동형 단백질과의 서열 비교를 위한 인덱스를 제공한다. 본 명세서에서, 어테뉴에이션 돌연변이를 포함하는 단백질과 어테뉴에이션을 위한 표적 재조합 바이러스인 다른 바이러스의 동형 단백질 사이의 대응 단백질 부위 및 아미노산 위치를 확인하기 위하여, 기존의 서열 정렬 방법 또는 통상의 서열 정렬 방법을 사용하여 서열 비교를 할 수 있다. 야생형(표적 바이러스 단백질의 대응 아미노산 위치가 보존되어 있음)에 대하여 어테뉴에이션 돌연변이를 표지하는 1 이상의 잔기를 변형시키는 경우, 표적 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 아미노산 결실, 치환 또는 삽입을 코딩하도록 재조합 변형시켜 표적 바이러스 단백질 내의 보존 잔기(들)이 변형되게 하여 재조합 바이러스 상에 유사, 어테뉴에이티드된 표현형질을 부여한다. Each attenuation mutation identified in a negative strand RNA virus provides an index for sequence comparison with homologous proteins in one or more heterologous negative strand viruses. In the present specification, in order to identify the corresponding protein site and amino acid position between a protein comprising an attenuation mutation and a homologous protein of another virus that is a target recombinant virus for attenuation, an existing sequence alignment method or a conventional sequence alignment method is used. Can be used to compare sequences. When modifying one or more residues that label an attenuation mutation for a wild type (where the corresponding amino acid position of the target viral protein is preserved), the genome or antigenome of the target virus is recombinantly modified to encode an amino acid deletion, substitution or insertion. The conserved residue (s) in the target viral protein are modified to confer a similar, attenuated phenotype on the recombinant virus.

어테뉴에이티드된 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스를 제작하기 위한 이러한 합리적인 방법에서는, 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 표지하는 아미노산 위치에서의 잔기들의 야생형은 매우 보존성이 높거나, 표적 바이러스 단백질 내에서의 대응 아미노산 위치에서 치환이 보존적으로 일어날 수 있다. 따라서, 표적 바이러스 단백질의 대응 잔기(들)은 동일할 수도 있고 아미노산 측쇄 기 구조 및 기능에 있어서 wild-type residue (s) found to be altered by the 이형의 돌연변이 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이에 의해 변형된 것으로 확인된 야생형 잔기와 보존적으로 관련되어 있을 수도 있다. 어떤한 경우이든, 본 발명의 방법에서는 표적 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 아미노산 결실, 치환 또는 삽입이 일어나도록 코딩하게 변형시켜 보존된 잔기가 변형되도록 함으로써 재조합 바이러스 내에서 유사 어테뉴에이션이 일어나도록 할 수 있다. 본 명세서에서, 이형의 돌연변이 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 표지하는 변형에 보존적으로 대응하는 보존된 잔기의 변형을 코딩하도록 게놈 또는 안티게놈을 변형시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산 치환이 야생형 서열과 비교할 때 돌연변이 바이러스의 한 부위에서 일어난다면 치환은 재조합 바이러스 내의 해당 잔기에 일어나도록 조작하여야 한다. 바람직하게는 돌연변이 바이러스 단백질 내에 존재하는 치환 잔기와 동일하거나 보존적인 것으로 치환하는 것이다. 그러나, 돌연변이 단백질 내의 치환 잔기에 대하여 비보존적인 돌연변이 부위에 본래 존재하는 아미노산 잔기를 변형시킬 수도 있다(예를 들어, 야생형 잔기 또는 그 기능을 파괴하거나 손상시킬 수 있는 어떤 다른 아미노산을 사용함으로써). 결실이나 삽입에 의한 돌연변이의 경우, 재조합 바이러스 내로 해당 결실 또는 삽입 돌연변이를 전달시킬 수 있으나, 결실 또는 삽입되는 단백질 단편의 아미노산 서열의 크기는 차이가 있을 수 있다.In this rational method for constructing recombinant recombinant stranded viruses, the wild type of residues at amino acid positions that label the attenuation mutations in the negative strand RNA virus are either highly conserved or correspond to the corresponding amino acid in the target viral protein. Substitution at the position may occur conservatively. Thus, the corresponding residue (s) of the target viral protein may be identical and modified by an attenuation mutation in a heterologous mutant virus in amino acid side chain structure and function. It may also be conservatively related to the identified wild type residue. In either case, the methods of the present invention modify the recombinant genome or antigenome of the target virus to encode amino acid deletions, substitutions or insertions such that conserved residues are modified so that similar attenuation occurs in the recombinant virus. Can be. Herein, it is desirable to modify the genome or antigenome to encode a modification of a conserved residue that conservatively corresponds to a modification that labels an attenuation mutation in a heterologous mutant virus. For example, if an amino acid substitution occurs at one site of the mutant virus as compared to the wild type sequence, the substitution should be manipulated to occur at that residue in the recombinant virus. Preferably, the substitution is carried out with the same or conservative substitution residues present in the mutant viral protein. However, it is also possible to modify amino acid residues originally present at non-conserved mutation sites for substitution residues in a mutant protein (eg, by using wild type residues or any other amino acid that can destroy or impair its function). In the case of mutation by deletion or insertion, the deletion or insertion mutation can be transferred into the recombinant virus, but the size of the amino acid sequence of the protein fragment to be deleted or inserted can be different.

본 발명의 일면에서, 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스 내로 도입된 돌연변이는 목적으로 하는 어테튜에이션 표현형질 또는 이와 함께 그와 관련된 여러 표형형질들을 부여할 수 있다. 즉, 예를 들면 바이러스의 재조합 단백질 내에, 어테뉴에이션 표현형질은 물론 이들과 함께, 온도 민감성(ts), 냉온 적응성(ca), 소형 플라크성(sp), 또는 숙주 범위 제한성(hr) 표현형질들들 도입할 수도 있고, 성장이나 면역원성을 변화시킬 수도 있다.In one aspect of the invention, the mutations introduced into the recombinant negative strand virus can confer the desired attention phenotype or several phenotypes associated therewith. That is, for example, in a recombinant protein of a virus, together with the attenuation phenotype, temperature sensitivity (ts), cold adaptability (ca), small plaque (sp), or host range restriction (hr) phenotypes They can also be introduced, or they can change growth or immunogenicity.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 예를 들면 HPIV3와 같은 네가티브 스트랜드 바이러스의 대형 폴리머라제 L 단백질 내에 온도감수성 또는 비온도감수성 돌연변이를 도입시킨다. 어테뉴에이션 돌연변이는 이형의 돌연변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스(예: RSV) 내에서 확인되고, 이는 관심의 대상이 되는 돌연변이를 갖는PIV3와 구조적으로 관련성이 있는 보존적인 단백질을 공유하는 바이러스라면 어떠한 것이어도 좋다. 보다 구체적으로는, 이형의 돌연변이 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이는 인간 RSV cpts530 (ATCC VR 2452)의 521번 위체에 있는 페닐알라닌의 치환을 포함한다.In a preferred embodiment of the invention, a temperature sensitive or non-temperature sensitive mutation is introduced into the large polymerase L protein of a negative strand virus, such as, for example, HPIV3. Attenuation mutations are identified in heterologous mutant negative strand RNA viruses (eg RSV), which may be any virus that shares a conservative protein that is structurally related to PIV3 having the mutation of interest. More specifically, attenuation mutations in heterologous mutant viruses include substitution of phenylalanine at position 521 of human RSV cpts530 (ATCC VR 2452).

본 발명의 다른 실시태양에서, 온도감수성 또는 비온도감수성 어테뉴에이션 돌연변이는 PIV(예: HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV, MPIV(murine PIV) 또는 SeV)의 재조합 단백질 내에 도입된다. 재조합 게놈 또는 안티게놈은 재조합 바이러스의 N, P, C, D, V, M, F, HN 또는 L 단백질 내에 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 코딩하도록 변형된다. 이러한 변형으로 인해 재조합 바이러스에 온도감수성 또는 비온도감수성 어테뉴에이션 표현형질이 부여된다. 바람직한 면에서는, 이형의 돌연변이 네가티스 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이는 생물학적으로 유도된 돌연변이 균주 HPIV3 JS cp45의 돌연변이에 대응되고, 바람직하게는 HPIV3 JS cp45 L 단백질 내의 아미노산 치환이다. 본 발명의 돌연변이의 예에는 HPIV3 JS cp45 L 단백질의 942번 위치의 타이로신의 치환, 992번 위치의 류신의 치환, 및/또는 1558번 위치의 쓰레오닌의 치환이 포함된다.In another embodiment of the invention, a temperature sensitive or non-temperature sensitive attenuation mutation is introduced into a recombinant protein of PIV (eg HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV, murine PIV or SeV). The recombinant genome or antigenome is modified to encode amino acid substitutions, deletions or insertions within the N, P, C, D, V, M, F, HN or L proteins of the recombinant virus. These modifications give recombinant viruses a thermosensitive or non-temperature sensitive attenuation phenotype. In a preferred aspect, the attenuation mutation in the heterologous mutant negativeis strand RNA virus corresponds to a mutation of the biologically induced mutant strain HPIV3 JS cp45, preferably an amino acid substitution in the HPIV3 JS cp45 L protein. Examples of mutations of the invention include substitution of tyrosine at position 942, substitution of leucine at position 992, and / or substitution of threonine at position 1558 of the HPIV3 JS cp45 L protein.

그러나, 본 발명의 재조합 PIV를 제조하는 데에 사용하기 위한 이형의 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인된 돌연변이에는 추가적으로 HPIV3 JS cp45 F 단백질 내의 아미노산 치환도 포함된다. 즉, HPIV3 JS cp45 F 단백질의 420번 위치의 이소류신의 치환을 그 예로 들 수 있다. 또는, HPIV3 JS cp45 F 단백질의 450번 위치의 알라닌의 치환을 그 예로 들 수도 있다. 마찬가지로, RSV 내에서 확인되는 어테뉴에이션 돌연변이에 유사한 돌연변이를 코딩하도록 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변형시킴으로써 재조합 PIV의 어테뉴에이션을 달성할 수도 있다. 하기의 한 실시예에서는, RSV 내에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이는 RSV L 단백질의 521번 위치의 페닐알라닌의 치환을 포함한다. PIV 게놈 또는 안티게놈은 이형 RSV 돌연변이체 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 표지하는 변형에 보존적으로 대응하는 보존된 잔기의 변형을 코딩하도록 변형된다. 한 실시태양에서, 돌연변이는 재조합 HPIV3 단백질 내에 도입되고 HPIV3 L 단백질의 456번 위치에 있 는 페닐알라닌의 치환을 포함한다.However, mutations identified in heterologous recombinant negative strand RNA viruses for use in preparing the recombinant PIV of the present invention additionally include amino acid substitutions within the HPIV3 JS cp45 F protein. For example, the substitution of isoleucine at position 420 of the HPIV3 JS cp45 F protein may be mentioned. Alternatively, a substitution of alanine at position 450 of the HPIV3 JS cp45 F protein may be mentioned. Similarly, attenuation of recombinant PIV can also be accomplished by modifying the recombinant PIV genome or antigenome to encode a mutation similar to the attenuation mutation found in RSV. In one example below, the attenuation mutations identified in RSV include a substitution of phenylalanine at position 521 of the RSV L protein. The PIV genome or antigenome is modified to encode a modification of a conserved residue that conservatively corresponds to a modification that labels an attenuation mutation in the heterologous RSV mutant. In one embodiment, the mutation comprises a substitution of phenylalanine introduced into the recombinant HPIV3 protein and located at position 456 of the HPIV3 L protein.

또한, 본 발명에서는 제조합 PIV 게놈 또는 안티게놈을 SeV 내에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이에 유사한 돌연변이를 코딩하도록 변형시킴으로써 PIV 백신 후보를 추가적으로 제공할 수 있다. 하기 한 실시예에서는, 어테뉴에이션 돌연변이는 SeV C 단백질의 170번 위치에 있는 페닐알라닌의 치환을 포함한다. PIV 게놈 또는 안티게놈은 이형의 SeV 돌연변이체 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 표지하는 변형에 보존적으로 대응하는 보존된 잔기의 변형을 코딩하도록 변형된다. 한 실시태양에서, 돌연변이는 재조합 HPIV3 단백질 내에 도입되고 HPIV3 C 단백질의 164번 위치에 있는 페닐알라닌의 치환을 포함한다. In addition, in the present invention, PIV vaccine candidates can be further provided by modifying the pre-assembled PIV genome or antigenome to encode a mutation similar to the attenuation mutation identified in SeV. In one example below, the attenuation mutation comprises a substitution of phenylalanine at position 170 of the SeV C protein. The PIV genome or antigenome is modified to encode a modification of a conserved residue that conservatively corresponds to a modification that labels an attenuation mutation in a heterologous SeV mutant. In one embodiment, the mutation comprises a substitution of phenylalanine at position 164 of the HPIV3 C protein and introduced into the recombinant HPIV3 protein.

또다른 실시태양에서는, 온도감수성 또는 비온도감수성 어테뉴에이션 돌연변이가 MeV의 재조합 단백질 내에 도입된다. 어테뉴에이션 돌연변이가 확인된 이형의 돌연변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는 RSV, HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV, SeV, NDV, SV5, MuV, MeV, CDV, RaV, 또는 VSV일 수 있다.ㅇIn another embodiment, either temperature sensitive or non-temperature sensitive attenuation mutations are introduced into the recombinant protein of MeV. Heterologous mutant negative strand RNA viruses in which an attenuation mutation has been identified may be RSV, HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV, SeV, NDV, SV5, MuV, MeV, CDV, RaV, or VSV.

이형의 돌연변이 바이러스로서 바람직한 것은 HPIV3 JS cp45이다. 한 실시태양에서, HPIV3 JS cp45 내에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이는 L 단백질의 942번 위치에 있는 타이로신의 치환을 포함한다.Preferred as heterologous mutant viruses are HPIV3 JS cp45. In one embodiment, the attenuation mutation identified in HPIV3 JS cp45 comprises a substitution of tyrosine at position 942 of the L protein.

재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 키메릭(chimeric) 바이러스인 것도 본 발명의 또다른 실시태양이다. 특히, 상기 바이러스는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 한 종, 하부 그룹 또는 균주의 전체 또는 일부 게놈 또는 안티게놈과 함께 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 또다른 종, 하부 그룹, 균주의 이형 유 전자 또는 그 단편을 포함하는 재조합 게놈 또는 안티게놈을 갖는다. 어테뉴에이션 돌연변이는 이형 유전자 또는 그 단편에 의해 코딩되는 단백질 내에 도입될 수도 있고 그러하지 않을 수도 있다. 상기 키메릭 바이러스로서 바람직한 예로는 PIV 종, 하부그룹 또는 균주의 전체 게놈 또는 안티게놈과 함께 이형의 PIV 종, 하부그룹 또는 균주의 HN 및 F 당단백질 유전자 1 이상 또는 그 단편을 갖는 PIV를 들 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 키메릭 바이러스로 RSV가 사용되는데, 그 재조합 게놈 또는 안티게놈은 이형의 RSV 종, 하부그룹 또는 균주의 F, G 또는 SH 당단백질 유전자 또는 그 단편을 포함한다. 바람직하게는, 인간 RSV 하부그룹 A의 F 및 G 당단백질 유전자들은 RSV A의 배경(background)에 있는 인간 RSV 하부그룹 B의 F 및 G 당단백질 유전자들로 치환된다.It is another embodiment of the invention that the recombinant negative strand RNA virus is a chimeric virus. In particular, the virus comprises a heterologous gene of another species, subgroup, strain, or fragment thereof of the negative strand RNA virus together with all or part of the genome or antigenome of one species, subgroup or strain of the negative strand RNA virus. Have a recombinant genome or antigenome. Attenuation mutations may or may not be introduced into a protein encoded by a heterologous gene or fragment thereof. Preferred examples of the chimeric virus include PIV having one or more fragments of HN and F glycoprotein genes of heterologous PIV species, subgroups or strains together with the entire genome or antigenome of the PIV species, subgroups or strains. have. In one embodiment, RSV is used as the chimeric virus, wherein the recombinant genome or antigenome comprises the F, G or SH glycoprotein gene or fragment thereof of a heterologous RSV species, subgroup or strain. Preferably, the F and G glycoprotein genes of human RSV subgroup A are substituted with the F and G glycoprotein genes of human RSV subgroup B in the background of RSV A.

본 발명의 다른 일면에 의하면, 재조합 게놈 또는 안티게놈을 추가적으로 변화시켜 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 추가적으로 변형 또는 어테뉴에이션시킨다. 한 실시태양에 의하면, 생물학적으로 유도된 돌연변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스로부터 채택된 1 이상의 추가적인 어테뉴에이션 돌연변이를 코딩하도록 더 변형시킨다. 예를 들어, 재조합 RSV에 있어서, 게놈 또는 안티게놈은 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV 균주 내에 존재하는 어테뉴에이션 돌연변이 1 이상 및 그 완전 상보체를 코딩할 수 있도록 변형된다. 그 대상에는 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)가 포함된다. 또한, 재조합 PIV의 경우, 재조합 게놈 또는 안티게놈은 HPIV3 JS cp45 내에 존재하는 어테뉴에이션 돌연변이 1 이상 및 그 완전 상보체를 코딩한다. 어뉴에이션 돌연변이 1 이상을 돌연변이를 특정하는 코돈 내에 다중으로 뉴클레오타이드를 변화시킴으로써 안정화시키는 것이 바람직하다.According to another aspect of the invention, the recombinant genome or antigenome is further modified to further modify or attenuate the recombinant negative strand RNA virus. In one embodiment, further modifications are made to encode one or more additional attenuation mutations adopted from a biologically derived mutant negative strand RNA virus. For example, for recombinant RSV, the genome or antigenome is modified to encode at least one of the attenuation mutations and their complete complement present in a biologically derived mutant RSV strain. Its targets include (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451) cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52 / 2B5 (ATCC VR 2542), and RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579). In addition, for recombinant PIV, the recombinant genome or antigenome encodes at least one of the mutation mutations present in HPIV3 JS cp45 and its full complement. It is preferable to stabilize at least one of the mutation mutations by varying the nucleotides multiplely in the codon specifying the mutation.

본 발명의 다른 일면에 의하면, 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는 성장 특성, 어테뉴에이션, 온도 민감성, 냉온 적응성, 소형 플라크, 숙주 범위 제한성 또는 면역원성의 변화등과 같은 표현형질 변화들 중 하나를 특정하는 뉴클레오타이드를 변형시킴으로써 더 변형시키거나 어테뉴에이션시킨다. 예를 들어, RSV의 경우 재조합 게놈 또는 안티게놈은 유전자 발현이 일어나지 않거나 유전자를 결실시키는 등 SH, NS1, NS2, 또는 G 유전자의 변형을 포함할 수 있다. RS 및 기타 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 존재하는 다른 뉴클레오타이드의 변형에는 결실, 삽입, 추가 또는 시스형으로 작용하는 조절 서열 또는 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서의 재정렬이 포함된다.According to another aspect of the present invention, a recombinant negative strand RNA virus is a nucleotide that specifies one of the phenotypic changes such as growth characteristics, attenuation, temperature sensitivity, cold adaptability, small plaques, host range restriction or immunogenicity change, etc. By further modifying or attenuating. For example, in the case of RSV, the recombinant genome or antigenome may include modification of the SH, NS1, NS2, or G gene, such as no gene expression or deletion of the gene. Modifications of other nucleotides present in RS and other negative strand RNA viruses include regulatory sequences or rearrangements within recombinant genomes or antigenomes that act as deletions, insertions, additions or cis-types.

본 발명은 또한 대상 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 숙주 내에서 면역 반응을 유도하고, 어테뉴에이티드된, 단리된 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 제공한다. 이 바이러스는 게놈 또는 안티게놈과 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 제조하는 데에 필요한 바이러스 단백질을 포함한다. 재조합 게놈 또는 안티게놈은 바이러스의 재조합 단백질 내의, 이형의 돌연변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인되는 어테뉴에이션 돌연변이의 아미노산 위치에 대응하는 아미노산 위치에서 변형을 코딩하도록 변형된다. 이 돌연변이는 재조합 단백질 내로 의 도입을 통해 재조합 바이러스에게 어테뉴에이티드된 표현형질을 부여한다.The present invention also provides an isolated, isolated, recombinant stranded RNA virus that induces an immune response in a host susceptible to infection by a subject virus. This virus contains the viral proteins necessary to make infectious viral particles of the genome or antigenome and RNA virus. The recombinant genome or antigenome is modified to encode a modification at an amino acid position that corresponds to the amino acid position of an attenuation mutation found within a heterologous mutant negative strand RNA virus within the recombinant protein of the virus. This mutation gives the recombinant virus an attenuated phenotype through its introduction into the recombinant protein.

본 발명은 또한 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 상기 재조합 게놈 또는 안티게놈도, 이형의 돌연변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인되는 어테뉴에이션 돌연변이의 아미노산 위치에 대응하는 아미노산 위치에서,바이러스 재조합 단백질 내에 변형을 코딩하도록 변형된다. 이 돌연변이는 재조합 단백질 내로의 도입을 통해 재조합 바이러스에게 어테뉴에이티드된 표현형질을 부여한다. 이와 관련하여, 본 발명은 기능적으로 상호 연결된 전사 프로모터, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타디으 분자 및 전사 터미네이터를 포함하는 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides an isolated polynucleotide molecule encoding a recombinant genome or antigenome of a recombinant negative strand RNA virus. The recombinant genome or antigenome is also modified to encode a modification in the viral recombinant protein at an amino acid position corresponding to the amino acid position of an attenuation mutation identified within a heterologous mutant negative strand RNA virus. This mutation confers the synthesized phenotype to the recombinant virus through introduction into the recombinant protein. In this regard, the present invention provides an expression vector comprising a functionally interconnected transcriptional promoter, a polynucleotide molecule encoding a recombinant genome or antigenome of the recombinant negative strand RNA virus, and a transcription terminator.

또한 본 발명은 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대한 방어 작용을 유도하는 면역 시스템을 촉진하는 방법도 제공한다. 이 방법은 면역학적으로 충분한 양의 상기 어테뉴에이티드된 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스를 생리학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명은 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 면역성 조성물도 제공한다. 이 조성물은 면역학적으로 충분한 양의 상기 어테뉴에이티드된 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스를 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 상기 어테뉴에이티드된 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스로서 바람직한 것은 RSV, PIV 또는 MeV이다.The present invention also provides a method for promoting an immune system that induces a protective action against negative strand RNA viruses. The method comprises administering an immunologically sufficient amount of said attenuated recombinant negative strand virus with a physiologically acceptable carrier. In this regard, the present invention also provides an immunogenic composition that induces an immune response against negative strand RNA virus. The composition comprises an immunologically sufficient amount of said attenuated recombinant negative strand virus physiologically acceptable carrier. Preferred as said attenuated recombinant negative strand virus is RSV, PIV or MeV.

도 1의 A는 RSV Phe-521(화살표로 표시됨)을 갖는 RSV(서열 번호 44), PIV3(서열 번호 45), MeV(서열 번호 46) 및 SeV(서열 번호 47)의 L 폴리머라제의 아미노산 서열이다. 각 위치의 3 이상의 잔기에서 정확히 일치하는 콘센서스 서열(서열 번호 48)이 생겼다. 표시된 숫자는 서열들의 제1 아미노산의 위치를 나타낸다. 굵은 글씨로 표현된 것은 4 바이러스 모두에서 보존된 잔기들을 나타낸다. 밑줄로 표현된 잔기들은 PIV2, CDV, SPIV 41(원숭이 파라인플루엔자 바이러스 41), SPIV 5, 조류 뉴모바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 헨드라 바이러스 및 우역 바이러스 L 폴리머라제(각각 P26676, P24658, P35341, Q88434, Y09630, U65312, X05399, AF017149, P41357). RSV cpts530 내에서 류신 돌연변이에 대한 페닐알라닌의 위치는 PIV3 L 폴리머라제의 456번째 아미노산에 대응된다.1A shows the amino acid sequence of L polymerase of RSV (SEQ ID NO: 44), PIV3 (SEQ ID NO: 45), MeV (SEQ ID NO: 46), and SeV (SEQ ID NO: 47) with RSV Phe-521 (indicated by arrow) to be. At 3 or more residues at each position resulted in a consensus sequence (SEQ ID NO: 48) that exactly matches. The numbers shown indicate the position of the first amino acid of the sequences. Expressed in bold type indicates residues conserved in all 4 viruses. Representative underlined residues are PIV2, CDV, SPIV 41 (monkey parainfluenza virus 41), SPIV 5, avian pneumovirus, Newcastle disease virus, hendra virus and virus virus L polymerase (P26676, P24658, P35341, Q88434, Y09630, respectively). U65312, X05399, AF017149, P41357). The position of phenylalanine for the leucine mutation in RSV cpts530 corresponds to the 456th amino acid of PIV3 L polymerase.

도 1의 B는 PIV3 rwt에 도입된 F456L 돌연변이와 cp45 돌연변이를 도식화하여 나타낸 것이다. ★와 ◆ 표시는 각각 도입된 cp45 돌연변이와 F456L의 상대적 위치를 나타낸다.FIG. 1B schematically shows the F456L mutation and the cp45 mutation introduced into PIV3 rwt. The ★ and ◆ marks indicate the relative positions of the introduced cp45 mutation and F456L, respectively.

도 1의 C는 F456L 돌연변이(서열 번호 50)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(포지티브 센스)을 wt 서열(서열 번호 49)과 비교하여 나타내고 있다. 완전 rwt 안티게놈에 따라 넘버링된 PIV3 뉴클레오타이드 서열은 wt 바이러스에 대하여 나타내고 돌연변이 서열은 아래에 나타낸 것이다. 밑줄 부분은 뉴클레오타이드가 변화된 부분을 나타내고 굵은 글씨체로 표현된 부분은 F456L 돌연변이를 갖는 코돈을 나타낸다. 이탤릭체로 표현된 부분은 돌연변이 서열 중 도입된 Xmnl의 제한 효소 인식 부위를 나타낸다. 1C shows the nucleotide sequence encoding the F456L mutation (SEQ ID NO: 50) (positive sense) compared to the wt sequence (SEQ ID NO: 49). The PIV3 nucleotide sequence numbered according to the complete rwt antigenome is shown for wt virus and the mutant sequence is shown below. The underlined portion represents the nucleotide altered portion and the bolded portion represents the codon with the F456L mutation. The part expressed in italics indicates the restriction enzyme recognition site of Xmnl introduced in the mutant sequence.

도 2는 침팬지의 상부 소화관의 rcp45 및 rcp45-456의 복제를 나타낸다. 감염후 경과일수 상에 표시한 것은 비강인두 스웝 시료 내의 평균 바이러스 역가이다(?, rcp45-456 n=6; ■, rcp45 n=4). 표시된 수치간의 통계적 유의차: (a) p < 0.005; (b) p < 0.05; (c) p < 0.025; 스튜던트 t-검정. (d) 검출한계 < 0.5 log₁₀ TCID₅₀/ml. 2 shows the replication of rcp45 and rcp45-456 in the upper digestive tract of chimpanzees. Shown on days post-infection are mean viral titers in nasal pharyngeal swabs (?, Rcp45-456 n = 6; ■, rcp45 n = 4). Statistically significant differences between the indicated values: (a) p <0.005; (b) p <0.05; (c) p <0.025;Student's t-test. (d) Detection limit <0.5 log ₁₀ TCID ₅₀ / ml.

도 3은 HPIV3 P/C/D/V ORFs의 조직도이다(스케일링하지 않았음). P mRNA의 리딩 프레임 3개(+1, +2 and +3)을 사각형 P, C, D 및 V ORFs와 함께 나타내었다. 아미노산 길이도 표시하였다. 수직선은 RNA 에디팅 부위를 나타낸다. 그 서열 모티프(motif)는 완전 HPIV3 안티게놈 서열의 뉴클레오타이드 위치에 따라 넘버링하여 나타내었다.3 is an organization chart of HPIV3 P / C / D / V ORFs (not scaled). Three leading frames of P mRNA (+1, +2 and +3) are shown with squares P, C, D and V ORFs. Amino acid length is also indicated. Vertical lines represent RNA editing sites. The sequence motif is numbered according to the nucleotide position of the complete HPIV3 antigenomic sequence.

도 3의 A는 에디팅되지 않은 P mRNA의 조직도이다. P 및 C ORFs의 번역 개시 부위를 포함하는 서열(서열 번호 52)를 나타내고, 완전 안티게놈 서열에 따라 넘버링하였다. 안티게놈 서열 내의 P, C, D, 및 V ORFs의 뉴클레오타이드 위치: P, 1784-3595; C, 1794-2393; D, 2442-2903; V, 2792-3066. P mRNA를 기준으로, P ORF를 개시하는 AUG 는 80-82 위치에 있다.3A is a histogram of unedited P mRNA. Sequences comprising the translation initiation sites of P and C ORFs (SEQ ID NO: 52) are shown and numbered according to the complete antigenome sequence. Nucleotide positions of P, C, D, and V ORFs in an antigenome sequence: P, 1784-3595; C, 1794-2393; D, 2442-2903; V, 2792-3066. Based on P mRNA, the AUG initiating P ORFs are at positions 80-82.

도 3의 B는 에디팅 부위 내에 템플레이팅되지 않은 2개의 G 잔기(GG)의 삽입이 있는, 에디팅된 P mRNA의 조직도이다(서열 번호 51). 삽입으로 인해 +2 프레임에 있는 P ORF의 상류 말단은 +3 프레임에 있는 D ORF에 융합된다. 이렇게 하여 생성된 키메릭 단백질은 D ORF에 의해 코딩되는 C-말단 아미노산 131개에 융합된 P ORF에 의해 코딩되는 N-말단 아미노산 241개를 포함한다.3B is a histogram of the edited P mRNA with the insertion of two non-templated G residues (GG) within the editing site (SEQ ID NO: 51). The insertion causes the upstream end of P ORF in the +2 frame to fuse to the D ORF in the +3 frame. The chimeric protein thus generated comprises 241 N-terminal amino acids encoded by P ORF fused to 131 C-terminal amino acids encoded by D ORF.

도 4는 rF164S의 C 단백질의 발현을 설명하는 방사성면역침전시험의 결과를 나타낸다. 레인 (a) ³⁵S-표지된 세포 용출물은 폴리클로날 c-특이적 래빗 항혈청으로 침전되었다. C 단백질에 대응되는 22kD 밴드는 rJS 및 rF164S에서는 분명하게 존재한다. 레인 (b) 세포 용출물은 HPIV3 HN 단백질에 특이적인 모노클로날 항체 2개의 혼합물에 의해 침전되었다. HN 단백질(폐 화살표로 표현됨)에 대응되는 64kD 밴드는 모든 바이러스 용출물에서 존재하는데, 이에 의해 그들이 진실로 HPIV3이고 단백질들과 동등량으로 발현됨이 확인된다. 대조 레인은 감염되지 않은 세포로부터 수득된 조직 배양 용출액을 의미한다.Figure 4 shows the results of the radioimmunoprecipitation test explaining the expression of the C protein of rF164S. Lane (a) ³⁵ S-labeled cell eluate was precipitated with polyclonal c-specific rabbit antiserum. The 22 kD band corresponding to C protein is clearly present in rJS and rF164S. Lane (b) cell eluate was precipitated by a mixture of two monoclonal antibodies specific for HPIV3 HN protein. 64 kD bands corresponding to HN proteins (expressed as lung arrows) are present in all viral eluates, which confirm that they are truly HPIV3 and are expressed in equivalent amounts to proteins. Control lanes refer to tissue culture eluates obtained from uninfected cells.

도 5는 재조합 돌연변이 바이러스 rF 164S와 그의 모 바이러스인 rJS간에 복수 사이클 복제 결과를 나타낸다. 바이러스 역가는 TCID₅₀/ml로 나타내었으며, 이는 카피 샘플의 평균치이다.Figure 5 shows the results of multiple cycle replication between recombinant mutant virus rF 164S and its parent virus rJS. Virus titers are expressed as TCID ₅₀ / ml, which is the mean of the copy samples.

본 발명의 방법은 백신으로 사용하기에 적합한 어테뉴에이티드된 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 제공한다. 이 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는 바이러스를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자 1 이상으로부터 제조된다. 즉, (i) 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 (ii) 감염성 바이러스 또는 서브 바이러스 입자를 제조하는 데에 필수적인 바이러스 단백질과 함께 세포 또는 무세포 시스템으로 공발현함 에 의해 제조된다.The method of the present invention provides the synthesized recombinant negative strand RNA virus suitable for use as a vaccine. This recombinant negative strand RNA virus is prepared from at least one isolated polynucleotide molecule encoding a virus. I. Is manufactured by.

재조합 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈은 이형의 돌연변이 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이 부위에 해당하는 아미노산 위치 1 이상에서 바이러스의 재조합 단백질 내의 변형을 코딩하도록 변형한다. 즉 이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이를 재조합 바이러스 내의 해당 부위에 "전달"함으로써 재조합 바이러스에게 어테뉴에이션 표현형질을 부여한다. 전달된 돌연변이는 전형적으로 이형의 돌연변이 바이러스 내에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이와 동일하거나 이에 대해 보존적이다(물론 비보존적인 치환을 일으키지 못하는 것은 아님). 이러한 방식으로 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에게 전달성 돌연변이를 도입함으로써, 바이러스에 감염되기 쉬운 숙주로 하여금 그 바이러스에 대한 바람직한 면역 반응을 유도할 수 있도록 후보 백신에 조작을 가할 수 있다.The recombinant genome or antigenome of the recombinant virus modifies to encode a modification in the recombinant protein of the virus at amino acid position 1 or more corresponding to an attenuation mutation site in a heterologous mutant negative strand RNA virus. That is, the attenuation phenotype is conferred to the recombinant virus by "delivering" the attenuation mutation identified in the heterologous negative strand RNA virus to the site in the recombinant virus. The mutations transferred are typically the same as or conservative for the attenuation mutations identified in heterologous mutant viruses (though not without causing non-conservative substitutions). By introducing a transmissive mutation into the recombinant negative strand RNA virus in this manner, the candidate vaccine can be engineered to allow a host susceptible to the virus to elicit a desired immune response against that virus.

본 발명은 이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 확인함에 기초하여 어테뉴에이티드된 백신 바이러스를 합리적으로 설계하기 위한 신규한 패러다임을 구현한다. 예를 들면, 돌연변이 바이러스와 어테뉴에이션되지 않은 그의 모 바이러스 간에 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 비교법에 의해, 이형 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 이형의 돌연변이 바이러스 내에 있는 대상 단백질 중 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입으로 맵핑한다. 본 명세서에서는, 모 바이러스는 최소한 어테뉴에이션 표현형질에 관해서는 생물학적으로 유도된 야생형 균주이다. 그러나, 부분적으로 어테뉴에이션된 균주가 사용 될 수도 있고, 이 경우 인위적인 돌연변이 유발 또는 천연적인 다형현상 등에 의해 추가적인 어테뉴에이션 돌연변이가 일어날 수도 있다. 또한, 어테뉴에이션 돌연변이가 유도되고 이어서 맵핑되는 모 바이러스에는 공지의 역 유전 방법에 따라 cDNA 바이러스 클론을 통해 제조되는 것과 같이 인위적으로 제조되는 것도 포함된다.The present invention embodies a novel paradigm for the rational design of attenuated vaccine viruses based on the identification of attainment mutations in heterologous negative strand RNA viruses. For example, by nucleotide or amino acid sequence comparison method between a mutant virus and its parent, which is not attenuated, mapping an mutation of mutation in a heterologous virus to deletion, substitution or insertion of one or more amino acids in a protein of interest in a heterologous mutant virus do. In this specification, a parental virus is at least a biologically induced wild type strain with respect to the attenuation phenotype. However, partially attenuated strains may be used, in which case additional attenuation mutations may occur due to artificial mutagenesis or natural polymorphisms. In addition, parent viruses to which attenuation mutations are induced and subsequently mapped include those that are artificially produced, such as those produced through cDNA virus clones according to known reverse genetic methods.

따라서, 이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 확인되는 어테뉴에이션 돌연변이는 기지의 것일 수도 있고 통상의 돌연변이 유발법 및/또는 역 유전자 기법에 의해 만들어지고/지거나 확인되는 것일 수도 있다. 이들 기법은 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스를 만들거나 그의 특성 파악을 하는 데에 응용될 수도 있고, 관심의 대상이 되는 어테뉴에이션 돌연변이를 드 노보 방법으로 유발하거나 특성 파악하는 데에 응용할 수도 있다(예를 들어, 어테뉴에이티드된 유도체를 확인하기 위하여 야생형 또는 어테뉴에이션되지 않은 돌연변이 바이러스 cDNA 클론에 대하여 부위 특이적 돌연변이 유발법을 통상의 스크리닝 방법과 함께 사용하는 방법에 의해 할 수 있음). 감염성 바이러스 클론을 회수하고 유전적으로 조작하기 위한 역 유전자 기법이 모노네가바이랄 목 전체를 대표하는 바이러스 그룹에 대하여 알려져 있다[Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996))]. Thus, the attenuation mutations identified in heterologous negative strand RNA viruses may be known and may be made and / or identified by conventional mutagenesis and / or reverse genetic techniques. These techniques may be applied to create or characterize biologically induced mutant viruses, or may be used to induce or characterize attenuation mutations of interest by de novo methods (e.g., For example, site specific mutagenesis can be performed in combination with conventional screening methods for wild type or untained mutant virus cDNA clones to identify attenuated derivatives). Reverse genetic techniques for the recovery and genetic manipulation of infectious viral clones are known for a group of viruses representing the entire mononegavirale throat [Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996)).

예를 들어, 감염성 바이러스 클론의 회수는 감염을 위해 필수적인 바이러스 단백질(즉, 뉴클레오캡시드 N, 인단백질 P 및 대형 폴리머라제 서브유닛 L)과 공발현된 cDNA-코딩 안티게놈 RNA로부터 유래하는 RaV, VSV, MeV, 및 SeV, 우역[Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271 (1997)] 및 SV S[He et al., Virology 237: 249- 260 (1997), p.5]에 대하여 보고된 바 있다[Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8388-92 (1995); WO 97/06270; 이상 본 명세서에 참고로 인용되었음].For example, recovery of infectious viral clones may include RaV derived from cDNA-encoding antigenomic RNA coexpressed with viral proteins (ie, nucleocapsid N, phosphoprotein P and large polymerase subunit L) essential for infection, VSV, MeV, and SeV, basin [Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271 (1997)] and SV S [He et al., Virology 237: 249-260 (1997), p. 5] [Garcin et al., EMBO J. 14: 6087 -6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8388-92 (1995); WO 97/06270; Which is hereby incorporated by reference].

감염성 RSV의 회수도 뉴클레오캡시드 N, 인단백질 P 및 대형 폴리머라제 서브유닛 L 및 특성화 되지 않은 M2 ORF1 유전자 산물과 공발현된 cDNA-코딩 안티게놈 RNA를 사용한 신규 시스템의 개발을 통해 달성하였다[미국특허출원 08/720,132(출원일: 1996. 9. 27); 미국특허출원 60/007,083(출원일: 1995. 5. 27), 미국특허출원 08/892,403(출원일: 1997. 7. 15), 미국특허출원 60/021,773(출원일: 1996. 7. 15)]. 이들 문헌에는 감염성 재조합 RSV(생물학적으로 유래된 RSV 돌연변이체로부터 채택된 어테뉴에이션 돌연변이를 포함하는 재조합 RSV 클론 포함)을 제조하는 데에 사용하기 위한 대표적인 구조체들이 기술되어 있다. D 53-530 부위로 표시된 RSV 변이체 cpts530의 어테뉴에이션 돌연변이를 포함하는 재조합 바이러스 클론은 그러한 구조체의 하나이다. 하기의 문헌들은 RSV 클론의 회수 및 재조합 조작을 위한 방법 및 그 조성물에 대하여 기술하고 있다: [Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-7 (1995); Juhasz et al., Vaccine 17: 1416-1424 (1999); Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); Whitehead et al., VirolozY 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); Whitehead et al., J. Virol. 73: (4) 3438-3442 (1999); 이상 본 명세서에 참고로 인용되어 있음].Recovery of infectious RSV was also achieved through the development of a novel system using nucleocapsid N, phosphoprotein P and large polymerase subunit L and cDNA-encoding antigenomic RNA coexpressed with uncharacterized M2 ORF1 gene product. Patent Application 08 / 720,132 filed September 27, 1996; U.S. Patent Application 60 / 007,083 (filed May 27, 1995), U.S. Patent Application 08 / 892,403 (filed July 15, 1997), U.S. Patent Application 60 / 021,773 (filed July 15, 1996). These documents describe representative constructs for use in preparing infectious recombinant RSVs (including recombinant RSV clones containing attenuation mutations adopted from biologically derived RSV mutants). Recombinant viral clones comprising an attenuation mutation of the RSV variant cpts530, denoted D 53-530 site, are one such construct. The following documents describe methods and compositions for recovery and recombinant manipulation of RSV clones: Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-7 (1995); Juhasz et al., Vaccine 17: 1416-1424 (1999); Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); Whitehead et al., Viroloz Y 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); Whitehead et al., J. Virol. 73: (4) 3438-3442 (1999); Which is hereby incorporated by reference].

또 감염성 PIV의 회수도 N, P 및 L 단백질들과 공발현한 c-DNA 코딩 안티게놈 RNA를 사용함으로써 달성한 예도 있다[미국특허출원 09/083,793 등]. 이들 문헌에는 감염성 PIV 클론을 제조하는 데에 사용하기 위한 하기의 플라스미드들이 개시되어 있다: p3/7 (131) (ATCC 97990); p3/7 (131) 2G (ATCC 97989); p218 (131) (ATCC 97991). There is also an example where the recovery of infectious PIV was achieved by using c-DNA encoding antigenomic RNA co-expressed with N, P and L proteins (US Patent Application 09 / 083,793, etc.). These documents disclose the following plasmids for use in preparing infectious PIV clones: p3 / 7 (131) (ATCC 97990); p3 / 7 (131) 2G (ATCC 97989); p218 (131) (ATCC 97991).

네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 회수 및 조작을 위한 역 유전자 기법은 어테뉴에이션 돌연변이의 상세한 분석과 맵핑을 가능하게 하여 특정 바이러스 종에 특이적인 유용한 재조합 백신 후보를 개발할 수 있게 된다. 지금까지, 모노네가바이랄 목 내에서의 재조합 방법에 의한 어테뉴에이션 돌연변이의 전달을 테스트하거나 성공한 바 없다. 그럼에도 불구하고, 역 유전자 기법과 같은 강력한 도구와 함께, RSV, PIV, MeV, 그밖의 모노네가바이러스들에서 확인되는 어테뉴에이티드된 돌연변이체가 다양하다는 사실은 본 발명의 방법에서 이형 전달을 위한 유용한 돌연변이를 결정하기 위한 풍부한 제공원으로 작용한다.Inverse genetic techniques for the recovery and manipulation of negative strand RNA viruses enable detailed analysis and mapping of attenuation mutations, allowing the development of useful recombinant vaccine candidates specific for specific viral species. To date, there has been no test or successful delivery of attenuation mutations by recombination methods within the mononegaribal throat. Nevertheless, the fact that there are a variety of attenuated mutants identified in RSV, PIV, MeV, and other mononegaviruses, along with powerful tools such as reverse genetic techniques, are useful mutations for heterologous delivery in the methods of the invention. It serves as a rich source for determining

이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이는 본 발명의 이형의 재조합 바이러스 내로 도입하기 위한 생물학적으로 유도된 돌연변이주 내에서 확인될 수 있다. 이러한 돌연변이는 천연적으로 일어날 수도 있지만 당업계에 공지된 돌연변이 유발 방법으로 야생형 또는 부분적으로 어테뉴에이션된 모 균주에 도입시킬 수도 있다. 예를 들면, 어테뉴에이티드된 덜연변이 바이러스는 세포 배양액 중에 화학적 돌연변이원을 첨가함으로써 화학 돌연변이시켜 얻을 수 있는데, 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위해서는 최적 온도 바로 아래의 온도에 바이러스를 통과시켜 선별하거나, 작은 플레이크(sp)를 형성하거나 세포 배양액 내에서 온도 감수성(ts)를 나타내는 돌연변이 바이러스를 선별할 수 있다[미국특허출원 08/327,263].Attenuation mutations in heterologous negative strand RNA viruses can be identified in biologically induced mutants for introduction into heterologous recombinant viruses of the invention. Such mutations may occur naturally but may also be introduced into wild-type or partially attenuated parental strains by mutagenesis methods known in the art. For example, attenuated less mutant viruses can be obtained by chemical mutations by adding chemical mutagens in the cell culture. In order to introduce growth restriction mutations, the virus is screened by passing the virus just below the optimal temperature, Mutant viruses that form small flakes (sp) or exhibit temperature sensitivity (ts) in cell culture can be selected (US Patent Application 08 / 327,263).

"생물학적으로 유도된" 돌연변이란 재조합 방법에 의해 만들어지지 않은 돌연변이 바이러스를 말하고 그 종류는 불문한다. 즉, 생물학적으로 유도된 돌연변이체에는 기준이 되는 야생형 서열의 게놈이 변화된 천연적으로 발생한 돌연변이가 포함된다(예를 들어, 부분적으로 어테뉴에이티드된 PIV 돌연변이주 등). 마찬가지로, 생물학적으로 유도된 돌연변이체에는 재조합법(특히, 돌연변이 유발 및 선별법)의 사용없이 모 바이러스 균주로부터 유래된 돌연변이체가 포함된다."Biologically induced" mutations refer to mutant viruses that are not produced by recombinant methods and of any kind. That is, biologically derived mutants include naturally occurring mutations in which the genome of the wild type sequence on which it is based changes (eg, partially attenuated PIV mutants, etc.). Likewise, biologically derived mutants include mutants derived from the parental virus strain without the use of recombinant methods (particularly mutagenesis and screening methods).

생물학적으로 유도된 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 만드는 방법으로서 공지된 방법들 중의 하나는 야생형 또는 부분적으로 어테뉴에이티드된 바이러스의 배양시 어테뉴에이팅 온도를 점차 낮추는 것이다. RSV의 경우, 야생형 바이러스는 통상적으로 약 34-37℃에서 배양된다. 부분적으로 어테뉴에이티드된 돌연변이체는 최적 온도 아래의 온도, 예를 들어 20-26℃의 세포 배양액(예: 제1 소 콩팥 세포)에 통과시켜 제조한다. 즉, cp 변이체 또는 그밖의 부분적으로 어테뉴에이티드된 균주(예: ts-1 또는r spRSV)는 MRC-5 또는 베로(Vero) 세포에 통과시킴으로써 저온(약 20-24℃, 바람직하게는 20-22℃)에서 잘 생육될 수 있도록 적응된다. 이와 같이 냉온 통과에 의한 RSV 돌연변이 선별을 함에 따라 변이주 중 부분적으로 어테뉴에이티드된 모 균주에 비해 기타 잔류 바이러스들이 대부분 제거된다. One of the known methods for making biologically induced negative strand RNA viruses is to gradually lower the attenuating temperature in culture of wild-type or partially attenuated virus. For RSV, wild type viruses are typically incubated at about 34-37 ° C. Partially attenuated mutants are prepared by passing cell cultures (eg, first bovine kidney cells) at a temperature below optimal temperature, for example 20-26 ° C. That is, cp variants or other partially attenuated strains (e.g., ts-1 or r spRSV) are passed through MRC-5 or Vero cells at low temperature (about 20-24 ° C., preferably 20- 22 ° C.), so as to grow well. As a result of RSV mutation screening by cold passage, most of the other residual viruses are removed as compared to the parent strains partially attenuated.

생물학적으로 유도된 바이러스에 특정 돌연변이를 도입할 수도 있다. 즉, 야생형 또는 부분적으로 어테뉴에이티드된 모 바이러스에게 화학적 돌연변이제를 가하여, 예를 들면 온도 감수성 돌연변이를 도입시키거나, 이미 온도 감수성이 있는 바이러스의 경우에는 어테뉴이이션 및/또는 온도 감수성 표현형질의 안정성을 부여하기에 충분한 추가의 온도 감수성 돌연변이를 도입시킬 수도 있다. Means for the introduction of mutations into 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에 돌연변이를 도입시키기 위한 수단에는 바이러스를 약 10^-3 내지 10^-5M, 바람직하게는 약 10^-4M 농도의 5-플루오로우리딘 또는 5- 플루오로우라실과 같은 돌연변이원의 존재하에 증식시키거나 약 100pg/ml 농도의 니트로소구아니딘에 노출시키는 방법이 포함된다[Gharpure et al., J.Virol. 3: 414-421 (1969) and Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978)]. 그밖의 화학적 돌연변이제를 사용할 수도 있다. 비록 보존성이 높은 폴리머라제(L) 유전자가 이러한 목적에 특히 적절한 표적으로 알려져 오고 있으나, 거의 모든 바이러스 유전자 내의 온도 감수성 돌연변이로부터 어테뉴에이션이 가능하다.Certain mutations may also be introduced in biologically induced viruses. That is, chemical mutagens are added to wild-type or partially attenuated parent viruses, for example, to introduce temperature sensitive mutations, or to the stability of the attenuation and / or temperature sensitive phenotypes for viruses that are already temperature sensitive. It is also possible to introduce additional temperature sensitive mutations sufficient to confer. Means for the introduction of mutations into negative strand RNA viruses include means for introducing mutations into a virus of 5-fluorouridine or 5- at a concentration of about 10 ^-3 to 10 ^-5 M, preferably about 10 ^-4 M. Proliferation in the presence of a mutagen such as fluorouracil or exposure to nitrosoguanidine at a concentration of about 100 pg / ml is included [Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969) and Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978). Other chemical mutants can also be used. Although the highly conserved polymerase (L) gene has been known as a particularly suitable target for this purpose, it is possible to attenuate it from temperature sensitive mutations in almost all viral genes.

본 발명에 사용할 수 있는 어테뉴에이티드된 바이러스의 복제시 온도 감수성의 정도는 허용 가능한 온도에서의 복제와 몇몇 제한된 온도들에서의 복제를 비교함으로써 결정한다. 허용 가능한 온도에서의 복제와 비교하여 복제가 100배 낮아지는 온도를 셧오프 온도라고 한다. 실험 동물 및 인간의 경우, RSV 돌연변이체의 복제능과 병독성은 돌연변이의 셧오프 온도와 상관성이 있다. 셧오프 온도가 38℃ 인 돌연변이는 복제가 덜 되고 질병 증상도 주로 상부 호흡관에 국한되나, 셧오프 온도가 39℃인 돌연변이의 복제는 적절하게 제한된다. 셧오프 온도가 35 내지 37℃인 바이러스는 인간의 경우 통상적으로 완전히 어테뉴에이션된다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 어테뉴에이트된 생물학적으로 유도된 온도 감수성 돌연변이 RSV는 셧오프 온도가 35 내지 39℃, 바람직하게는 35 내지 38℃이다. 부분적으로 어테뉴에이티드된 균주 내에 온도 감수성 돌연변이를 도입하면 본 발명의 백신 조성물에 유용한 다중으로 어테뉴에이티드된 바이러스가 제조된다.The degree of temperature sensitivity in replication of the attenuated virus that can be used in the present invention is determined by comparing replication at acceptable temperatures with replication at some limited temperatures. The temperature at which replication is 100 times lower compared to replication at an acceptable temperature is called the shutoff temperature. For experimental animals and humans, the replication capacity and virulence of the RSV mutant correlated with the shutoff temperature of the mutation. Mutations with a shutoff temperature of 38 ° C. have less replication and disease symptoms are mainly confined to the upper respiratory tract, but replication of mutations with a shutoff temperature of 39 ° C. is appropriately limited. Viruses with a shutoff temperature of 35 to 37 ° C. are typically fully attenuated in humans. Thus, the attenuated biologically induced temperature sensitive mutant RSVs for use in the present invention have a shutoff temperature of 35 to 39 ° C, preferably 35 to 38 ° C. Incorporation of temperature sensitive mutations into partially attenuated strains produces multiplely attenuated viruses useful in the vaccine compositions of the invention.

냉온에 통과시켜 이미 어테뉴에이티드된 바이러스 내에 다중 돌연변이를 도입하는 화학적 돌연변이를 수차례 반복 사용하여 여러 가지 어테뉴에이티드된 RSV 후보들을 개발하였다[Connors et al., Virology 208: 478-484 (1995); Crowe et al., Vaccine 12: 691-699 (1994a); Crowe et al., Vaccine 12: 783-790 (1994b)]. 성인 및 유아는 물론 설치류 및 침팬지 모델로 이들 생물학적으로 유도된 돌연변이체를 평가한 결과, 이들 후보 백신들 중 일부는 유전적으로 안정하고, 면역원성이 높으며, 어테뉴에이티드된 것임이 확인되었다. 하기 문헌에는 본 발명의 PIV 및 기타 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대한 어테뉴에이티드된 돌연변이 바이러스에 대하여 기술하고 있다[WO 98/02530; WO 98/53078 등].Several attenuated RSV candidates were developed using repeated repeated chemical mutations that introduced multiple mutations into already attenuated viruses by passing through cold and cold [Connors et al., Virology 208: 478-484 (1995). ; Crowe et al., Vaccine 12: 691-699 (1994a); Crowe et al., Vaccine 12: 783-790 (1994b). Evaluation of these biologically induced mutants with rodent and chimpanzee models, as well as adults and infants, has shown that some of these candidate vaccines are genetically stable, immunogenic and attenuated. The following documents describe attenuated mutant viruses for the PIV and other negative strand RNA viruses of the invention [WO 98/02530; WO 98/53078 and the like.

본 발명의 방법에 의하면, 돌연변이체와 모 균주(예: 야생형 또는 부분적으로 어테뉴에이팅된 DNA 또는 아미노산 서열 비교를 수반한 뉴클레오타이드 서열 분석법을 사용하여 특정 뉴클레오타이드 및 아미노산 변화에 대하여 어테뉴에이팅 돌연변이를 맵핑할 수 있다. 간혹 이들 변화에는 아미노산 치환이 수반되지만, 본 발명의 방법에 따라 보존적 전달을 받은 돌연변이는 표적 단백질 내의 보존 영역 또는 도메인을 크게 변화시키는 것은 물론이고 다중의 아미노산 치환, 삽입, 결실이 일어난다.According to the method of the present invention, attenuating mutations are mapped to specific nucleotide and amino acid changes using nucleotide sequence analysis involving mutant and parent strains (e.g., wild type or partially attenuated DNA or amino acid sequence comparisons). Occasionally, these changes involve amino acid substitutions, but mutations that undergo conservative delivery according to the methods of the present invention not only significantly change the conserved region or domain in the target protein, but also result in multiple amino acid substitutions, insertions, and deletions. Happens.

상기 역 유전자 기법을 사용하는 경우, 어테뉴에이티드된 돌연변이 바이러스 내에서 확인된 뉴클레오타이드 및 아미노산 변화는 이미 특성화되고 cDNA 코딩 바이러스 내로 도입시킬 수 있고, 그에 따라 당업자는 부수적인 사일런트 돌연변이와 표현형질 변화를 일으키는 돌연변이를 구분할 수 있다. 이와 관련하여 목표로 하는 돌연변이들을 각가 또는 조합하여 감염성 RSV 클론의 게놈 또는 안티게놈 내로 도입할 수 있다. 이 방법은, 모 바이러스 및 유도체 바이러스의 표현형질의 평가와 함께 하여, 어테뉴에이션, 온도 감수성, 냉온 적응성, 소형 플레이크성, 숙주 범위 제한성 등과 같은 목적으로 하는 특성을 일으키는 돌연변이를 더 확인하게 한다.Using this reverse genetic technique, nucleotide and amino acid changes identified in the mutated viruses that have already been characterized and can be introduced into cDNA coding viruses, thereby allowing those skilled in the art to cause incidental silent mutations and phenotypic changes. Mutations can be distinguished. In this regard, the mutations of interest can be introduced into the genome or antigenome of an infectious RSV clone, either individually or in combination. This method, together with the evaluation of the phenotypes of the parental and derivative viruses, allows further identification of mutations that cause the desired properties such as attenuation, temperature sensitivity, cold and hot adaptability, small flakeability, host range restriction, and the like.

이렇게 확인되고 맵핑된 돌연변이는 본 발명에 따른 이형 전달을 사용하여 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 설계하기 위한 후보 돌연변이의 풍부한 공급원이 된다. 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 확인하고 특성화하는 것에 관하여는 하기 문헌에 기술되어 있다: WO 98/02530; WO 98/53078. 이들 문헌과 기타 다른 문헌에는 본 발명에 따라 이형의 바이러스 클론 내에 돌연변이를 전달시칼 후보들을 어테뉴에이션 돌연변이들의 '메뉴'로 기재하고 있다.This identified and mapped mutation is a rich source of candidate mutations for designing recombinant negative strand RNA viruses using heterologous delivery according to the present invention. The identification and characterization of attenuation mutations in negative strand RNA viruses is described in the literature: WO 98/02530; WO 98/53078. These and other documents describe candidates for the delivery of mutations in heterologous viral clones according to the present invention as a 'menu' of attenuation mutations.

예를 들어, WO 98/02530에는 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)를 포함하여 냉온에 통과시킨(cp) 온도 감수성 RSV 돌연변이체들이 기재되어 있다. 이들 생물학적으로 유도된 돌연변이체로부터 어테뉴에이션 돌연변이를 맵핑하고 특성화하였는데, 이에는 대형 폴리머라제 유전자 L 내의 특정 뉴클레오타이드를 변화시켜 모 균주의 서열 위치 Phe 521(예: Phe521 대신 Leu), Gln 831(예: Gln831 대신 Leu), Met 69(예: Met69 대신 Val), Tyr 831(예: Tyr 831 대신 Asn)에 아미노산 변화를 일으키는 것이 포함된다. 이들 돌연변이는 보존성이 높은 L 단백질 내에서 일어나 돌연변이 바이러스에 온도 감수성 표현형질을 부여한다. 그러나, 추가의 돌연변이가 다른 보존된 단백질 내에서 뿐만 아니라 RSV 및 기타 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에서 확인되고, 이는 온도 감수성 어테뉴에이팅 표현형질 및 비 온도 감수성 어테뉴에이팅 표현형질을 포함한 광범위한 어테뉴에이팅 표현형질(예를 들면, cp, sp, ca, hr 돌연변이 균주에 존재하는 것과 같은 형질)을 부여한다.For example, WO 98/02530 includes cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts Hot and cold including RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52 / 2B5 (ATCC VR 2542), RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579) Temperature sensitive RSV mutants that have been passed through (cp) are described. Attenuation mutations were mapped and characterized from these biologically induced mutants, which included altering specific nucleotides in the large polymerase gene L, such as the sequence positions Phe 521 of the parent strain (eg Leu instead of Phe521), Gln 831 (eg Leu instead of Gln831, Met 69 (e.g. Val instead of Met69), and Tyr 831 (e.g. Asn instead of Tyr 831). These mutations occur within the highly conserved L protein and confer the temperature sensitive phenotype to the mutant virus. However, additional mutations have been identified in RSV and other negative strand RNA viruses as well as in other conserved proteins, which are extensive attenuating phenotypes including temperature sensitive attenuating phenotypes and non-temperature sensitive attenuating phenotypes. (For example, traits such as those present in cp, sp, ca, hr mutant strains).

따라서, 본 발명의 방법에 따라 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스 내에 도입시킬 추가 메뉴의 돌연변이는 관련이 먼 파라믹소바이러스, 인간 PIV3(파라믹소비리네과의 레스피로바리어스속)에 대한 것으로 확인되었다. 그러한 돌연변이들은 생물학적으로 유도된(냉온 통과된) HPIV3 돌연변이 바이러스 균주 JS cp45 내에서 확인되었다[WO 98/53078]. 이 균주 내에서 맵핑되고 특성화된 돌연변이들 중에는 모 균주의 폴리머라제 L 유전자 내의 Tyr942, Leu992, 및/또는 Thr1558 위치에서 온도 감수성 어테뉴에이팅 아미노산 치환을 코딩하는 뉴클레오타이드 변화가 있다. 예를 들면, JS cp45 돌연변이 L 단백질 내에서, Tyr942은 His으로, Leu992은 Phe으로, Thrl558은 Ile으로 치환된다. 이들 돌연변이는 여러 PIV 재조합체(r942, r992, rl558, r942/992, r992/1558, r942/1558, r942/992/1558이 포함되고, 치환은 병기된 숫자의 위치에서 일어나며 이는 각가 일어나거나 조합해서 일어남) 내에 성공적으로 도입된다.Thus, mutations of additional menus to be introduced into recombinant negative strand virus according to the method of the present invention have been identified for the related paramyxovirus, human PIV3 (Respirobaricaceae of Paramyxovirinaceae). Such mutations were identified in biologically induced (cold passed) HPIV3 mutant virus strain JS cp45 [WO 98/53078]. Among the mutations mapped and characterized within this strain is a nucleotide change encoding a temperature sensitive attenuating amino acid substitution at the Tyr942, Leu992, and / or Thr1558 positions in the polymerase L gene of the parent strain. For example, within the JS cp45 mutant L protein, Tyr942 is replaced by His, Leu992 by Phe, and Thrl558 by Ile. These mutations include several PIV recombinants (r942, r992, rl558, r942 / 992, r992 / 1558, r942 / 1558, r942 / 992/1558), with substitutions occurring at the positions of the numbered stages, which are angled or combined Is successfully introduced).

HPIV3 JS cp45 내에서 확인된 다른 돌연변이도 맵핑되고 HPIV3의 F 및 C 단백질 내에서 어테뉴에이팅 아미노산 치환을 코딩하는 특성이 있는 것으로 파악되었다. 이들 돌연변이에는 모 균주 JS HPIV3의 C 단백질의 Ile96(예: Ile96 대신 Thr) 위치에서 비 온도 감수성 어테뉴에이팅 아미노산 치환이 포함된다. HPIV3의 F 단백질에서 확인되는 또 다른 돌연변이는 모 균주의 Ile420 및 Ala450(예: Ile420 대신 Val 및 Ala450 대신 Thr) 위치에서의 아미노산 치환을 코딩한다.Other mutations identified within HPIV3 JS cp45 were also mapped and found to have properties that encode attenuating amino acid substitutions in the F and C proteins of HPIV3. These mutations include non-temperature sensitive attenuating amino acid substitutions at the Ile96 (eg Thr) position of the C protein of the parent strain JS HPIV3. Another mutation identified in the F protein of HPIV3 encodes an amino acid substitution at the Ile420 and Ala450 positions of the parent strain (eg, Thr instead of Ile420 and Thr instead of Ala450).

이러한 방식으로 확인될 수 있는 또다른 돌연변이에는 네가티브 스트랜드 바이러스 유전자의 비코딩 영역에 있는 어테뉴에이션 돌연변이이다. 예를 들어, 어테뉴에이션 돌연변이는 유전자 개시 서열 내에 단일 또는 다중 염기 변화가 포함될 수 있다(예: RSV M2 유전자 개시 서열의 뉴클레오타이드 7605 위치에서의 어테뉴에이팅 염기 치환). 이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에 보존된 뉴클레오타이드 위치들에 대하여 맵핑하는 경우, 본 발명의 방법에 따라 전달될 수도 있다.Another mutation that can be identified in this way is an attenuation mutation in the noncoding region of a negative strand virus gene. For example, the attenuation mutations may include single or multiple base changes within the gene initiation sequence (eg, attaining base substitution at nucleotide 7605 of the RSV M2 gene initiation sequence). When mapping for nucleotide positions conserved in heterologous negative strand RNA virus, they may be delivered according to the methods of the present invention.

이렇게 확인된 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 각 어테뉴에이션 돌연변이는 1 이상의 이형의 네가티브 스트랜드 바이러스 내의 이형의 단백질과의 서열 비 교를 위한 인덱스를 제공한다. 본 발명의 실시예에 의하면, 기존의 서열 정렬을 분석하거나, 통상의 서열 정렬 방법을 사용하여 서열 비교를 행하여 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이션 돌연변이를 갖는 단백질과 재조합 어테뉴에이션을 위한 표적 바이러스인 이형의 단백질 사이의 단백질 영역과 이에 상응하는 단백질 영역 및 아미노산 위치를 확인할 수 있다. 이러한 작업의 목표는 제1 (이형의) 바이러스(즉, 돌연변이 형질이 없는 모균주를 변화시킨 균주) 내의 어테뉴에이션 돌연변이와 관련된 1 이상의 잔기를 확인하기 위한 것이다. 서열 정렬에 의해, 돌연변이체의 모 서열이 보존되었는가 여부를 표적 (재조합) 바이러스 단백질 내의 해당 아미노산 위치에 동일 또는 보존적인 아미노산 잔기가 존재하는지에 따라 결정한다. 통상적으로, 이렇게 보존된 "야생형" 서열 요소는 단백질의 보존 여영역 또는 도메인 내에 나타날 것이나, 아미노산 잔지의 단리된 잔기 및 블록은 모노네가바이랄 목 내의 다른 계통에서도 매우 보존적이고, 이형의 RNA 바이러스간에 어테뉴에이션 돌연변이를 이형 전달하기 위한 유용한 표적을 제공한다(여기서, 돌연변이 변화를 포함하는 보존 서열 요소의 전부 또는 일부는 카피되거나 재조합 바이러스 내로 도입되어 신규의 어테뉴에이티드된 유도체를 만들게 됨).Each attenuation mutation of the negative strand RNA virus thus identified provides an index for sequence comparison with the heterologous protein in one or more heterologous negative strand viruses. According to an embodiment of the present invention, a protein having an attenuation mutation in a negative strand RNA virus and a target virus for recombinant attenuation may be analyzed by analyzing an existing sequence alignment or performing a sequence comparison using a conventional sequence alignment method. Protein regions between proteins and corresponding protein regions and amino acid positions can be identified. The goal of this work is to identify one or more residues associated with the attenuation mutation in the first (heterogeneous) virus (ie, the strain that changed the parent strain without the mutant trait). By sequence alignment, whether the parental sequence of a mutant has been conserved is determined by whether there is an identical or conserved amino acid residue at that amino acid position in the target (recombinant) viral protein. Typically, such conserved "wild-type" sequence elements will appear within the conserved region or domain of the protein, but the isolated residues and blocks of the amino acid residues are also highly conserved in other strains in the mononegaviral neck and between heterologous RNA viruses. Provides a useful target for heterologous delivery of attenuation mutations, where all or some of the conserved sequence elements, including mutation changes, are copied or introduced into a recombinant virus to create new attenuated derivatives.

모노네가바이랄 목 중 여러 보존성 단백질들은 하나의 이형 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내에서 발견되거나 발생시킨 어테뉴에이션 돌연변이를 다른 재조합 바이러스 내에 도입시키기 위한 본 발명의 유용한 표적이 된다. 이는 모노네가바이랄 목 내에서의 여러 계통 사이에 구조적 기능적 보존성이 상당히 높은 것에 기인한다. 이 목 전체에서, 일반적으로 5개의 단백질이 보존적이라 이들은 표적 단백질들이 되고, 이들은 계통적으로는 멀지만 조상이 공통된 바이러스로부터 유래된 이형의 단백질로 받아들여진다. 이들 단백질은 통상적으로 서열의 동일성이 높은데, 이는 공통 기능을 담당하고 있는 특정 영역 또는 도메인 내에서 특히 높다. 구체적으로, 모든 공지된 네가티스 스트랜드 RNA 바이러스들은 뉴클레오캡시드 단백질(N), 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 비글리코실화 매트릭스 단백질(M), 1 이상의 표면 당단백질(HN, H, or G) 및 대형 폴리머라제 단백질(L)을 포함하는 단백질들을 공유한다. 이들 단백질은 각각 보존적 서열 요소를 갖는데, 이들은 표적 바이러스와 이형의 모 바이러스가 공유하는 1 이상의 보존 잔기를 변화시켜 어테뉴에이팅 돌연변이를 전달하기 위한 유용한 표적으로 작용한다. 모 균주에 대한 돌연변이 유도체 또는 구조체들은 어테뉴테이션 표현형질을 특정하는 아미노산 변화를 나타내는 것으로 확인되었다.Several conservative proteins in the mononegavirale neck are useful targets of the present invention for the introduction of attenuation mutations found or generated in one heterologous stranded RNA virus into another recombinant virus. This is due to the extremely high structural and functional preservation among the various strains within the mononegaribal throat. Throughout this neck, five proteins are generally conservative, making them target proteins, which are accepted as heterologous proteins derived from viruses that are systematically distant but whose ancestors are common. These proteins typically have high sequence identity, which is particularly high within certain regions or domains that are responsible for common functions. Specifically, all known Negatis strand RNA viruses are nucleocapsid protein (N), nucleocapsid phosphoprotein (P), aglycosylated matrix protein (M), one or more surface glycoproteins (HN, H, or G). ) And large polymerase proteins (L). Each of these proteins has conservative sequence elements, which serve as useful targets for delivering attenuating mutations by altering one or more conserved residues shared by the target virus and the heterologous parental virus. Mutant derivatives or constructs for the parent strain have been shown to exhibit amino acid changes that specify the attenuation phenotype.

모노네가바이랄 목에는 필로비리데, 파라믹소비리데, 보르나비리데, 라브도비리데 과가 포함되고, 이들은 단일입자 네가티브 스트랜드 RNA 게놈을 갖는 바이러스들로 모두 구성된다[Pringle, Arch Virol. 117: 137-140(1991)]. 하기 문헌은 이 군 내의 계통에 대하여 잘 정리하여 기술하고 있다[Pringle, Arch Virol. 142(11): 2321-2326(1997)]. 모노네가바이랄의 개략적인 분류, 파라믹소비리데에 대한 상세한 분류는 하기 표 1을 참조하라. 선형 네가티스 스트랜드 RNA 게놈을 갖는 이들 3개 과의 바이러스는 유전적 구조상 공통적 특징을 갖는 바(특히, 유전적 재조합이 거의 잘 일어나지 않고 표현형질 관계는 유전적 연속성을 반영하는 것으로 보임), 이로 인해 이들은 함께 목으로 분류된다. Mononegaviral throats include the Phyloviride, Paramyxoviride, Bornaviride, and Lavdoviride families, all composed of viruses with a single particle negative strand RNA genome [Pringle, Arch Virol. 117: 137-140 (1991). The following documents summarize the lines within this group well [Pringle, Arch Virol. 142 (11): 2321-2326 (1997). Schematic classification of mononegaviral, detailed classification of paramyxoviride, see Table 1 below. Viruses of these three families with a linear negative strand RNA genome have common characteristics in genetic structure (particularly, genetic recombination rarely occurs and phenotypic relationships appear to reflect genetic continuity). These are classified together by the neck.

모노네가바이랄 목 Mononegaviral neck - 라브도비리데 과 베시쿨로바이러스 속(베시쿨라 STV) 리싸바이러스 속 (RaV) 엠페머로바이러스 속 (소 엠페랄 피버 바이러스) 기타 속 - 필보비리데 과 (에볼라 바이러스, 말버그 바이러스) - 보르냐비리데 과 (보르나병 바이러스) - 파라믹소비리데 과-Lavdoviride and Besiculovirus genus (Besicula STV) Lyssavirus genus (RaV) Emperovirus genus (Bovine Emperal Fever virus) Nyaviride (Bornna Virus)-Paramyxoviride 파라믹소비리데 아과 (파라믹소피비데 과 및 표시된 계통의 구성원 내에서의 RSV의 분류) Paramyxoviride subfamily (classification of RSV within paramyxovidide family and members of the indicated lineage) 파라믹소비리데 아과 레스피로바리어스 속 - 센다이 바이러스 (쥐 PIV 제1형) - HPIV 1 - HPIV 3 - BPIV 3 모르빌리바이러스 속 - MeV - 강아지 디스템퍼 바이러스 - 린더페스트 바이러스 - 고래(돌고래) 모르빌리바이러스 - 돼지(물개) 디스템퍼 바이러스 - 페스트-데스-페티티스-루미난츠 바이러스 - 헨드라 바이러스(호주 병원균에서 새로 확인된 것임) 루불라바이러스 - MuV - SV5 (강아지 PIV 2) - HPIV 2 - HPIV 4 - 조류 PIV(뉴캐슬병 바이러스 포함) - 돼지 루불라바이러스 - SV 41 - 마푸에라 바이러스 뉴모비리네 아과 뉴모바이러스 속 - HRSV (서브그룹 A, B) - BRSV - 양 및 염소 RSV - 쥐 폐렴 바이러스 조류 뉴모바이러스 속 - 조류 뉴모바이러스(터키 비기관지염 바이러스라고 불렸음)Paramyxoviride Agua Respirovarius genus-Sendai virus (rat PIV type 1)-HPIV 1-HPIV 3-BPIV 3 Morbilivirus Genus-MeV-Puppy Distemper Virus-Linderfest Virus-Whale (Dolphin) Morbilivirus-Pig (Seal) Distemper Virus-Pest-Des-Pettitis-Luminants Virus-Hendra Virus (Newly identified from Australian pathogens) Will be Rubula Virus-MuV-SV5 (Dog PIV 2)-HPIV 2-HPIV 4-Avian PIV (including Newcastle Disease Virus)-Swine Rubula Virus-SV 41-Mapuera Virus Pneumovirine subfamily Pneumovirus genus-HRSV (subgroups A, B)-BRSV-Sheep and goat RSV-Rat pneumonia virus Genus Avian Pneumovirus-Avian Pneumovirus (called Turkey Non-Bronchitis Virus)

보르나비리데 및 필로비리데 과는 단일 속으로 대표된다. 보르나바이러스 속은 단일 종(보르나병 바이러스)을 포함한다. 필로바이러스 속(말버그 바이러스 종) 내에는 뉴클레오타이드 서열 및 항원 다양성 및 부착(G) 단백질의 차등 발현에 따라 4 종이 존재한다. 라브도비리데는 5개의 속, 베시큘로바이러스, 리싸바이러스, 엠페머로바이러스, 시토라브도바이러스 및 뉴클레오라브도바이러스를 포함하고, 서열 및 항원성 차이는 숙주 범위, 보조 유전자 존재 유무, 세포 내 복제 부위에 의해 구별된다. 파라믹소비리데 과는 2개의 아과가 있다. 3개 속 즉, 레스피로바이러스(HPIV 1), 모르빌리바이러스(MeV), 루불라바이러스(MuV)로 된 파라믹소비리네와 뉴모비리네(HRSV) 및 조류 뉴모바이러스를 포함하는 추가의 속이 있다.The Bornaviridede and Piloviridae families are represented by a single genus. The Bornavirus genus includes a single species (Borna disease virus). Within the phyllovirus genus (Malberg virus species) there are four species depending on the nucleotide sequence and the differential expression of antigenic diversity and adhesion (G) proteins. Rabdoviride comprises five genera, Becculovirus, Lyssavirus, Emperovirus, Cytorabdovirus and Nucleolabdovirus, with sequence and antigenic differences in host range, presence of accessory genes, intracellular Distinct by replication site. Paramyxoviride family has two subfamily. There are additional genera, including three genera, paramyxovirines and pneumovirines (HRSV) and avian pneumoviruses of respirovirus (HPIV 1), mobilivivirus (MeV), rubula virus (MuV). .

상기 목에 속하는 모든 구성원들의 경우, 5-10개 유전자가 잇고 전사는 단일 3'-말단 프로모터로부터 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 일어난다. 일부 뉴모바이러스에서는 유전자 순서가 매우 보존적이라는 예외가 있다. 문헌[Pringle, Arch Virol. 142(11): 2321-2326(1997)]의 도 1에는, 다른 과, 아과 및 속을 대표하는 16개 바이러스들의 유전자들이 비교되어 있다. 즉, VSV는 5개 유전자(N, P, M, G, L)의 최소 상보체를 나타낸다. 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스 및 라브도비리데의 구성원 8개는 기본적인 5개 유전자 형태(N-P-M-G-L)을 나타내고, 에볼라 바이러스와 라브도바이러스 8개 중 4개는 G와 L 사이에 1 이상의 유전자가 삽입되어 있고, 라브도바이러스의 나머지 4개 중 3개는 P와 M 사이에 1 이상의 유전자가 삽입되어 있다. 파라믹소바이러스는 복잡성이 크다. 기본 5 유전자 형태가 P 유전자의 유전 정보가 다중으로 코딩되어 있고 M과 부착 단백질(H 또는 HN) 사이 에 외피 단백질 유전자(F)가 추가로 삽입되어 있으며, 루불라바이러스의 일부에는 SH가 추가 삽입되어 있다. 파라믹소바이러스 모두는 최소한 2개의 표면 당단백질, HN(H 또는 G) 및 F를 가진다. 레스피로바이러스, 루불라바이러스 및 모르빌리바이러스 속의 거의 모든 구성원은 시스테인 풍부 단백질 V를 갖는다. 레스피로바이러스 및 모르빌리바이러스는 동형 C 단백질도 코딩한다. 뉴모바이러스와 루불라바이러스의 서브세트(SV5, MuV)는 동형 표면 당단백질 SH를 공유한다. 뉴모바이러스 속 내에서, 일부 추가 단백질 NS1, NS2, M2(ORF1) 및 M2(ORF2)는 보존적이다. 파라믹소바이러스는 기본 패턴과 독특하게 차이가 나고, 가장 중요한 것은 추가의 유전자를 가진다는 점이다. 조류, 사람, 쥐 뉴모바이러스에서는, M2 유전자는 다른 리딩 프레임에서 2개의 단백질을 코딩하고, 이들 24ㅐ 모두 시험관내에서의 RNA 합성시 중요한 영향을 미친다. 사람과 쥐 뉴모바이러스는 기능이 알려져 있지 않은 비구조 단백질 NS1, NS2를 코딩하는 2 유전자가 3' 리더 영역과 N 사이에 존재한다. 조류 뉴모바이러스는 기본 패턴에 가장 가깝고, 2개의 독특한 3' 말단 NS 유전자가 없으며, M2 유전자가 삽입되어 있는 것을 제외하고는 파라믹소바이러스 유전자의 표준 순서를 보유하고 있다. 이러한 게놈 구조의 보존적 패턴은 외부로부터의 유전정보 도입에 의한 것보다 유전자 복제 및 유전자간 영역의 확장에 의한 진화를 제안한다[Pringle, Semin. Virol. 8: 49-57,1997]. For all members of the neck, there are 5-10 genes and transcription occurs by RNA dependent RNA polymerase from a single 3'-terminal promoter. In some pneumoviruses, there is an exception that the gene sequence is very conservative. Pringle, Arch Virol. 142 (11): 2321-2326 (1997), the genes of 16 viruses representing different families, subfamily and genus are compared. That is, VSV represents the minimum complement of five genes (N, P, M, G, L). Eight members of Borna's disease virus, Ebola virus, and Rabdoviride show five basic gene forms (NPMGL), and four of eight Ebola virus and Rabdoviruses have one or more genes inserted between G and L. And three of the remaining four of the rhabdoviruses have at least one gene inserted between P and M. Paramyxoviruses are complex. The basic 5 gene morphology is multiply encoded with genetic information of the P gene, with an additional coat protein gene (F) inserted between M and the attachment protein (H or HN), and additional insertion of SH in some of the bululaviruses. It is. Both paramyxoviruses have at least two surface glycoproteins, HN (H or G) and F. Nearly all members of the genus Respirovirus, Rubulavirus, and Morbiglivirus have cysteine rich protein V. Respiroviruses and morbiliviruses also encode isoform C proteins. A subset of pneumovirus and rubulaviruses (SV5, MuV) share the homozygous surface glycoprotein SH. Within the pneumovirus genus, some additional proteins NS1, NS2, M2 (ORF1) and M2 (ORF2) are conserved. Paramyxoviruses are uniquely different from the basic pattern and, most importantly, have additional genes. In avian, human and murine pneumoviruses, the M2 gene encodes two proteins in different reading frames, all of which have a significant impact on RNA synthesis in vitro. Human and murine pneumoviruses have two genes encoding nonstructural proteins NS1 and NS2 whose function is unknown, between the 3 'leader region and N. Avian pneumoviruses are closest to the baseline pattern, lacking two unique 3 'terminal NS genes, and carry the standard sequence of paramyxovirus genes except that the M2 gene is inserted. This conservative pattern of genomic structure suggests evolution by gene replication and expansion of intergenic regions rather than by introduction of genetic information from the outside [Pringle, Semin. Virol. 8: 49-57, 1997.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 제1 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 내의 어테뉴에이팅 돌연변이의 확인에 기초하고, 이 돌연변이는 야생형과 돌연변이의 서열을 비교하여 돌연변이 부위에 해당하는 아미노산 위치를 확인할 수 있도록 맵핑된다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 어테뉴에이션되지 않거나 부분적으로 어테뉴에이션된 재조합 바이러스 클론 내에 도입되어 어테뉴에이티드된 표현형질을 만들어낸다. 본 발명에서는 어테뉴에이팅 돌연변이의 숙주가 제공되고 기타 다른 것들은 하기 설명되어진 바와 같은 공지된 돌연변이 유발법 및 역 유전자 기법에 따라 용이하게 확인가능한 것들이다. 네가티스 스트랜드 RNA에서 확인된 각 어테뉴에이팅 돌연변이는 1 이상의 이형의 네가티브 스트랜드 바이러스 동형 단백질과 서열 비교를 위한 인덱스가 된다.As mentioned above, the method of the present invention is based on the identification of an attenuating mutation in the first negative strand RNA virus, which mutation maps the amino acid position corresponding to the mutation site by comparing the sequence of the wild type with the mutation. do. Preferably, these mutations are introduced into an unassembled or partially attenuated recombinant viral clone to produce an associated phenotype. In the present invention, a host of attenuating mutations is provided and others are readily identifiable according to known mutagenesis and reverse genetic techniques as described below. Each attenuating mutation identified in the negatives strand RNA is an index for sequence comparison with one or more heterologous negative strand virus isoform proteins.

본 발명의 실시를 함에 있어서, 기존의 서열 정렬 방법 또는 통상의 서열 정렬 방법을 사용하여 서열 비교를 하여, 어테뉴에이션을 위한 표적 재조합 바이러스인 다른 바이러스의 동형 단백질과 어테뉴에이션 돌연변이를 갖는 단백질 간에 해당 단백질 영역과 아미노산 부위를 확인할 수 있다. 모 균주, 예를 들어 야생형(표적 바이러스 단백질의 대응 아미노산 위치가 보존되어 있음)에 대하여 어테뉴에이션 돌연변이를 표지하는 1 이상의 잔기를 변형시키는 경우, 표적 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 아미노산 결실, 치환 또는 삽입을 코딩하도록 재조합 변형시켜 표적 바이러스 단백질 내의 보존 잔기(들)이 변형되게 하여 재조합 바이러스 상에 유사, 어테뉴에이티드된 표현형질을 부여한다. In the practice of the present invention, sequence comparison is carried out using conventional sequence alignment methods or conventional sequence alignment methods, so that the protein between the homologous protein of another virus, which is the target recombinant virus for attenuation, and the protein having an attenuation mutation. Regions and amino acid sites can be identified. When modifying one or more residues that label the attenuation mutations against the parent strain, eg, wild type (where the corresponding amino acid position of the target viral protein is preserved), the genome or antigenome of the target virus is deleted, substituted or inserted. Recombination modifications to encode the conserved residue (s) in the target viral protein result in modification to confer a similar, attenuated phenotype on the recombinant virus.

서열 정렬과 분석은 통계적인 서열 비교를 위한 기초를 제공하기 위해 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 기준 서열로 사용된 동형 "대응체" 유전자, 유전자 단편, 단백질 및/또는 단백질 영역에 초점을 맞추고 있다. 예를 들어, 기준 서열은 cDNA 또는 유전자 단편, 완전 cDNA 또는 유전자 서열 또는 단백질 또는 그 일부 의 서열일 수 있다.Sequence alignment and analysis focuses on homozygous "correspondence" genes, gene fragments, proteins and / or protein regions used as polynucleotide or amino acid reference sequences to provide a basis for statistical sequence comparison. For example, the reference sequence may be a cDNA or gene fragment, a complete cDNA or gene sequence or a protein or a portion thereof.

일반적으로, 대응체 유전자 또는 그 단편을 정의하기 위해 사용되는 기준 서열은 길이가 20 뉴클레오타이드 이상, 때로는 25 뉴클레오타이드 이상, 종종 50 뉴클레오타이드 이상이고, 단백질 및 단백질 단편의 경우 길이가 20 아미노산 이상이다. 2 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 각각 (1) 2 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 간에 유사한 서열(즉, 완전 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열의 일부)을 포함하고, (2) 2 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 사이에 차이가 있는 서열을 더 포함하기 때문에, 서열 동일성 또는 유사성의 국부 영역을 확인 비교하기 위하여 "비교 창"을 통해 대상 서열 2개의 서열을 통상 비교한다. "비교 창"이란 적어도 20개의연속하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치의 추상적 단편을 말하고, 여기서 서열은 적어도 연속하는 20개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 기준 서열과 비교될 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 일부는 2 서열의 최적 정렬을 위해 비교 창 내에서 기준 서열에 비하여 20% 이하의 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다.Generally, the reference sequence used to define the counterpart gene or fragment thereof is at least 20 nucleotides in length, sometimes at least 25 nucleotides, often at least 50 nucleotides in length, and for proteins and protein fragments, at least 20 amino acids in length. 2 polynucleotide or amino acid sequences each comprise (1) similar sequences between two polynucleotides or proteins (i.e. part of a complete polynucleotide or protein sequence), and (2) sequences with differences between the two polynucleotides or proteins As further included, sequences of two subject sequences are usually compared through a "comparison window" to identify and compare local regions of sequence identity or similarity. A “comparative window” refers to an abstract fragment of at least 20 contiguous nucleotide or amino acid positions, wherein the sequence can be compared to a reference sequence of at least 20 contiguous nucleotides or amino acids, wherein a portion of the polynucleotide or amino acid sequence is 2 It can include up to 20% additions or deletions relative to the reference sequence within the comparison window for optimal alignment of the sequences.

비교 창 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 스미쓰/워터만[Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘, 니들만/분쉬[J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]의 국부 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨/립만[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 상동성 방법을 위한 써어치법, 이들 알고리듬들을 컴퓨터화한 도구[위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA] 등에 의해 가능하고, 이들 여러 방법으로 만들어진 정렬 중 가장 적합한(즉, 비교 창 내에서 상동성이 가장 높은 것) 정렬을 선택한다. The optimal alignment of sequences for the comparison window alignment is Smith / Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], the local homology algorithm, Needleman / Bunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], local homology alignment algorithm, Pearson / Ripman [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)], a search method for homology methods, a computerized tool of these algorithms [Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, GAP of Genetics Computer Group, BESTFIT, FASTA, TFASTA], etc. Choose the alignment that is most suitable (ie, the one with the highest homology within the comparison window) among the alignments made by these different methods.

"서열 동일성"이란 2 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열이 비교 창 전체에서 (뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 또는 잔기-잔기 기준으로) 동일한 것을 의미한다. "서열 동일성 백분율"이란 비교 창에 최적으로 정렬된 2 서열을 비교함에 의해 계산되는 것으로서, 2 서열에서 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 동일하여 생생기는 위치의 숫자(매치된 위치의 수)를 결정하고, 이 매치된 위치의 수를 비교 창 내의 위치 전체 수로 나눈 후, 100으로 곱한 값을 말한다."Sequence identity" means that the two polynucleotide or protein sequences are identical (based on nucleotide-nucleotide or residue-residue) throughout the comparison window. “Sequence percent identity” is calculated by comparing two sequences optimally aligned in a comparison window, wherein the nucleic acid base or amino acid residues in the two sequences are identical to determine the number of positions (number of matched positions), The number of matched positions is divided by the total number of positions in the comparison window and multiplied by 100.

"실질적 동일"이란 2 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 적어도 20 뉴클레오타이드 20 또는 아미노산 20개, 경우에 따라서는 적어도 25-50 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로 된 비교 창 전체에 걸쳐 서열 동일성이 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90-95%, 경우에 따라서는 99% 이상인 경우를 말한다. 여기서, 서열 동일성의 백분율은 기준 서열과 비교 서열을 비교하여 계산된 값이고, 비교 서열은 비교 창 전체에 걸쳐 기준 서열의 20% 이하 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 기준 서열은 더 큰 서열의 서브세트일 수 있다."Substantially identical" means that the sequence identity is at least 85%, preferably at least throughout the comparison window of 2 polynucleotides or amino acid sequences of at least 20 nucleotides 20 or 20 amino acids, in some cases at least 25-50 nucleotides or amino acids 90-95%, and sometimes 99% or more. Here, the percentage of sequence identity is a value calculated by comparing a reference sequence with a comparative sequence, and the comparison sequence may comprise deletion or addition of up to 20% of the reference sequence throughout the comparison window. The reference sequence may be a subset of the larger sequence.

"서열" 동일성이란 용어가 단백질 및 단백질 내의 구성 성분에 적용되는 경우에는 대응 위치에서 1 이상의 동일한 아미노산을 공유하는 것을 의미한다. "서열 유사성(상동성)"이란 보존적 치환의 원인이 되는 대응 위치에서 보존적으로 관련된 1 이상의 아미노산을 공유하는 것을 의미한다. "실질적 서열 동일"이란 2 펩타이드 서열이 디폴트 갭 중량치를 사용하는 GAP나 BESTFIT과 같은 프로그램에 의 해 최적으로 정렬되었을 때에 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 95% 이상(예: 99%)의 서열 동일성을 가지는 것을 의미한다. "실질적 유사"란 2 펩타이드 서열이 해당 %의 서열 유사성을 갖는 것을 말한다.The term “sequence” identity, when applied to a protein and a component within the protein, means sharing one or more identical amino acids at the corresponding position. "Sequence similarity (homologousity)" means sharing one or more amino acids conservatively related at the corresponding position causing the conservative substitution. "Substantially identical" means at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% when the two peptide sequences are optimally aligned by a program such as GAP or BESTFIT using the default gap weights. : 99%). "Substantially similar" refers to two peptide sequences having the corresponding sequence similarity.

2 서열 사이의 대응 위치에 있는 아미노산 잔기가 동일하지는 않지만 보존성 아미노산 구조 관계에 의해 다를 경우에도 보존성 서열 관계는 존재한다. 본 발명에서, 보존성 아미노산 치환이란 유사한 측소ㅑ를 가지는 아미노산 잔기를 일반적으로 상호 교환할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산기군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고, 지방족 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산군은 세린 및 쓰레오닌이고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산군은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이고, 염기 측쇄를 갖는 아미노산 군은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인과 메티오닌이다. 바람직한 보존성 아미노산 치환군은 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 아스파라긴-글루타민. 통상적인 20개 아미노산, α-α-이치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 기타 비통상적인 아미노산의 스테레오 이성질체(예: D-아미노산)는 본 발명의 폴리펩타이드를 위한 적합한 구성 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예에는 4-하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N, N, N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, ω-N-메틸아르기닌 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(예: 4-하이드록시프롤린)이 있다. 또한, 아미노산은 글리코실화, 포스포릴화 등으로 변형될 수도 있다.Conservative sequence relationships exist even when the amino acid residues at the corresponding positions between the two sequences are not identical but differ by conservative amino acid structural relationships. In the present invention, conservative amino acid substitutions mean that amino acid residues having similar side chains can generally be interchanged. For example, the amino acid group having an aliphatic side chain is glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine, the amino acid group having an aliphatic hydroxyl side chain is serine and threonine, and the amino acid group having an aromatic side chain is phenylalanine, tyrosine and tryptophan. The group of amino acids having base side chains are lysine, arginine, histidine; A group of amino acids with sulfur containing side chains is cysteine and methionine. Preferred conservative amino acid substitution groups are: valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, asparagine-glutamine. Conventional 20 amino acids, stereoisomers of non-natural amino acids such as α-α-disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, other unusual amino acids (eg, D-amino acids) are suitable for the polypeptides of the present invention. It may be a component. Examples of unusual amino acids include 4-hydroxyproline, γ-carboxyglutamate, ε-N, N, N-trimethyllysine, ε-N-acetyllysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine , 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, ω-N-methylarginine and other similar amino acids and imino acids such as 4-hydroxyproline. In addition, amino acids may be modified by glycosylation, phosphorylation, and the like.

본 발명을 실시함에 있어서, 모노네가바이랄 목 내의 보존된 바이러스 단백질의 공지된 분자 계통 발생학을 참조한다. 이와 관련하여, 단백질의 연관성에 대해 분자 수준까지 연구한 사례가 많다. 이들 연구에는 모노네가바이랄 사이의 보존된 단백질들의 자세한 서열 비교가 포함되고, 이에 의해 보존된 구조 영역, 서열 요소 및 이들 단백질 내의 제한된, 단리된 잔기들에 대해 맵핑하게 하였다. 이들보존된 단백질 영역, 서열 요소 및 제한된 잔기 각각은 본 발명의 방법에 따라 이형의 어테뉴에이티드된 돌연변이 바이러스로부터 어테뉴에이션 돌연변이를 다른 재조합 바이러스에게 보존적 전달을 하기 위한 융용한 표적을 제공한다.In practicing the present invention, reference is made to known molecular phylogenetics of conserved viral proteins in mononegavirals. In this regard, there have been many studies at the molecular level of protein associations. These studies included detailed sequence comparisons of conserved proteins between mononegavirals, thereby allowing mapping of conserved structural regions, sequence elements, and restricted, isolated residues within these proteins. Each of these conserved protein regions, sequence elements, and restricted residues provides a compatible target for conservative delivery of attenuation mutations from heterologous attenuated mutant viruses to other recombinant viruses according to the methods of the present invention.

예를 들어, 포크 등의 문헌[J. Gen. Virol. 5: 1153-62, (1990)]는 라브도바이러스와 파라믹소바이러스의 L 단백질을 포함하여, 모노네가바이랄 내의 5 L 단백질에 대한 유추된 아미노산 서열의 상세한 비교를 하고 있다. 통상적인 정렬 방법에 의하면, 여러 바이러스 군으로부터 유래된 L 단백질들은 길이에서 상동성이 높았고 특히 상대적으로 잘 보존되어 있는 영역에 의해 분리된 보존 된 블록 내에 있는 아미노산은 불변성이 높았다. 따라서, 이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스로부터 유래된 이들 다른 L 단백질들은 연쇄된 기능 영역의 보존 구조를 갖는다. 예를 들어, L 단백질들은 고 보존된 중앙 영역을 가지는데, 이 부분은 RNA 합성을 위한 활성 부위를 포함하고 있는 것으로 여겨진다. 다른 보존된 구조 영역, 모티프 및 서열 요소들(고보존된, 단리된 잔기 포함)도 확인되고, 이들 중 일부는 보존 중앙 부를 중심으로 분포되고 중합효소 활성에 중요한 것으로 여겨진다. 이들 보 존된 서열 요소들은 어테뉴에이션 돌연변이가 생기로 맵핑된 이형의 모 균주의 L 단백질 서열과 비교하기 위한 상세한 정보를 제공한다[Poch et al., J. Gen. Virol. 5: 1153-62, (1990) Poch et al. EMBO J. 8 (12) 3867-3874, (1989), 특히 도 1]. 즉, 본 명세서에 참고로 인용된 문헌에 기재된 서열 결정 방법과 데이터와 함께 상기 서열 결정 방법 및 데이터를 사용하여 어테뉴에이팅 돌연변이를 가리키는 잔기가 표적 바이러스 L 단백질 내의 대응 아미노산 위치에서 보존된(즉, 동일하거나 보존적으로 연관된 아미노산 잔기) 모, 야생형 균주로부터 변경된 것인지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 즉, 이러한 결정은 재조합 표적 바이러스의 안티게놈 또는 게놈 내로 이형의 바이러스에서 확인된 어테뉴에이팅 돌연변이를 성공적으로 도입할 확률이 크다는 것을 지시한다.For example, Fork et al., J. Gen. Virol. 5: 1153-62, (1990), provides a detailed comparison of the inferred amino acid sequences for 5 L proteins in mononegavirals, including the L proteins of lavodovirus and paramyxoviruses. According to the conventional alignment method, L proteins from various virus groups were highly homologous in length, especially amino acids in conserved blocks separated by relatively well conserved regions. Thus, these other L proteins derived from heterologous negative strand RNA viruses have a conserved structure of linked functional regions. For example, L proteins have a highly conserved central region, which is believed to contain an active site for RNA synthesis. Other conserved structural regions, motifs and sequence elements (including highly conserved, isolated residues) are also identified, some of which are distributed around the central conserved region and are believed to be important for polymerase activity. These preserved sequence elements provide detailed information for comparison with L protein sequences of heterologous parental strains where the attenuation mutations are mapped to lively [Poch et al., J. Gen. Virol. 5: 1153-62, (1990) Poch et al. EMBO J. 8 (12) 3867-3874, (1989), in particular FIG. 1]. That is, using the sequencing methods and data described in the references cited herein, residues pointing to an attenuating mutation are conserved at the corresponding amino acid position in the target viral L protein (ie, Identical or conservatively related amino acid residues) can be readily determined whether or not altered from the parental, wild-type strain. That is, this determination indicates that there is a high probability of successfully introducing the attenuating mutations identified in the heterologous virus into the antigenome or genome of the recombinant target virus.

모노네가바이랄 전체에 걸쳐 다른 L 단백질의 상동체 사이의 구조적 보존성에 대해서는 하기 문헌에 자세히 기술되어 있다: Stec et al., Virology 183: 273287 (1991). 이 서열 결정은 파라믹소바이러스 3개, 레스피로바이러스 속(PIV3, SeV) 2개, 루불라바이러스 속(NDV) 1개, 모르빌리바이러스 속으로부터 파라빅소바이러스 1개, 라브도비리데 과로부터 2개의 반포된 L 유전자 및 단백질의 서열을 기초로 한다[Schubert et al., 1985; Shioda et al., 1986; Yusoff et al., 1987; Blumberg et al., 1988; Galinski et al., 1988; Teart et al., 1988], RSV에 대한 추가의 서열 정보 및 정렬 결과를 제공한다. 이들 결과는 파라믹소바이러스와 라브도바이러스 과 내의 서열 보존성이 높다는 것에 관한 포크 등의 교시를 확인하고, 또한 보존된 구조 영역, 모티브 및 서열 요소들을 추가로 확인하다. Structural preservation between homologs of other L proteins throughout mononegaviral is described in detail in Stec et al., Virology 183: 273287 (1991). This sequencing consists of 3 paramyxoviruses, 2 respirovirus genera (PIV3, SeV), 1 rubulavirus genus (NDV), 1 parabixovirus from Morbilivirus genus, and 2 from the Lavdoviride family. Based on the sequence of dog distributed L genes and proteins [Schubert et al., 1985; Shioda et al., 1986; Yusoff et al., 1987; Blumberg et al., 1988; Galinski et al., 1988; Teart et al., 1988], provide additional sequence information and alignment results for RSV. These results confirm the teachings of Fork et al. Concerning the high sequence retention in the paramyxovirus and labidovirus family, and further confirm conserved structural regions, motifs and sequence elements.

요약하면, 스텍 등의 개시 내용은 통상적인 정렬 방법에 의하고, 다른 비슷한 방법 중에서 이 방법은 본 발명에서는 유용하다. 특히, 스텍 등은 윌버/립만[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730 (1983)]의 방법, 결실(12) 및 갭 페널티(6), 스코링 매트릭스[Dayhoff et al., "Atlas of Protein Sequence and Structure" (M. O. Dayhoff, Ed.), Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-352 Natl. Biomed. Res. Found., Silver Spring, MD (1978)]를 사용하여 이형의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 서열을 정렬하였다. 상동성 스코링 시스템운 RSV와 다른 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 L 단백질(표 1 참조) 사이의 평행 글로벌 돗트 매트릭스 정렬을 구축하는 데에 사용하였다. 이 방법에 의해, 거리가 먼 파라믹소바이러스와 라브도바이러스의 L 단백질과 RSV L 단백질간의 명백한 서열 관계가 검출되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, RSV L 단백질과 다른 단백질들간의 서열 관계 영역은 공선형이고 아미노 근접 영역에 집중되어 있는데, 이는 각 분자의 5분의 1에 가깝다. 서열 상동성의 동일한 패턴은 다른 파라믹소바이러스와 라브도바이러스 L 단백질들의 공지된 정렬(포크 등이 수행한 SeV, MeV, NDV, RaV 및 VSV L 단백질에 대한 5원 정렬 포함)에 나타나 있다[Blumberg et al., 1988, Galinski et al., 1988; Teart et al., 1988].In summary, the disclosure of Stack et al. Is by conventional alignment methods, among other similar methods, which is useful in the present invention. In particular, Stack et al., Wilbur / Ripman [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730 (1983), deletion (12) and gap penalty (6), scoring matrix [Dayhoff et al., "Atlas of Protein Sequence and Structure" (MO Dayhoff, Ed.), Vol. . 5, Suppl. 3, pp. 345-352 Natl. Biomed. Res. Found., Silver Spring, MD (1978)] was used to align heterologous negative strand RNA virus sequences. A homologous scoring system was used to establish a parallel global dot matrix alignment between RSV and other negative strand RNA virus L proteins (see Table 1). By this method, a clear sequence relationship between the L protein and RSV L protein of distant paramyxovirus and rabdovirus was detected. As shown in FIG. 3, the sequence relationship region between the RSV L protein and other proteins is collinear and concentrated in the amino proximal region, which is close to one fifth of each molecule. The same pattern of sequence homology is shown in known alignments of other paramyxovirus and rabdovirus L proteins (including five-way alignments for SeV, MeV, NDV, RaV, and VSV L proteins performed by Fork et al.) [Blumberg et al. al., 1988, Galinski et al., 1988; Teart et al., 1988.

스텍 등의 7원 정렬의 경우, RSV L 단백질은 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 비하여 아미노 말단에는 약 70개의 아미노산이 연장되고, 카르복시 말단에는 약 100개의 아미노산이 잘려 있다. 그러나, 이러한 변화는 보존적 구조 요소를 확인하기 위한 정렬 방법의 신뢰성에 영향을 미치지 않고 따라서 RSV L 단백질이 상 류의 주변 유전자(M2; 예전에는 22K라고 하였음)와 오버랩됨에 의해 부분적으로 코딩되는 사실의 원인으로 여겨진다Collins et al., 1987].In the seven-membered alignment of Stack et al., The RSV L protein has about 70 amino acids extended at the amino terminus and about 100 amino acids are truncated at the carboxy terminus compared to the negative strand RNA virus. However, this change does not affect the reliability of the alignment method for identifying conservative structural elements and therefore the fact that RSV L protein is partially encoded by overlapping with upstream peripheral genes (M2, formerly known as 22K). It is believed to be the cause of Collins et al., 1987].

스텍 등의 문헌은 다른 계통 내에서도 거의 정확하게 보존되고 있는 이형의 네가티스 스트랜드 RNA 바이러스의 L 단백질 내에 짧은 단편이 다수 존재한다는 것을 확인한다. 이들 거의 동일한 단편들은 RSV L 내에서 보존되는 것으로 보이고 도 4에 나타낸 고보존된 영역 내의 잔기이다(박스로 표현된 서열 참조). 6 단편 내의 아미노산 동일성은 30 내지 80%로 변화한다. 확인된 단편 내의 수많은 잔기들은 7개의 다른 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 사이에서는 불변이다. 더구나, 이들 보존된 단편들 내에서 치환이 일어나는 경우 많은 경우는 보존적 치환임을 주목할 만하다. 전술한 바와 같이, 2 바이러스 과 내의 각 멤버들 사이에 이들 서열의 공통성이 높다는 것은 그들이 L 단백질의 기능에 있어서 중요하다는 것을 시사한다.Stack et al. Confirm that there are a large number of short fragments in the L protein of heterologous negativeis strand RNA virus that are almost exactly conserved within other strains. These nearly identical fragments appear to be conserved in RSV L and are residues in the highly conserved region shown in FIG. 4 (see sequence represented by box). Amino acid identity in the 6 fragments varies from 30 to 80%. Numerous residues in the identified fragments are constant between seven different negative strand RNA viruses. Moreover, it is noteworthy that when substitutions occur within these conserved fragments, in many cases they are conservative substitutions. As mentioned above, the high degree of commonality of these sequences between each member of the two virus families suggests that they are important in the function of the L protein.

보다 상세히 설명하면, 스텍 등의 문헌 도 4에 도시된 바와 같이 모노네가바이랄 내의 여러 다양한 계통 사이에 정렬된 L 단백질의 고도로 보존된 영역 대부분은 4개의 분명히 구별되는 폴리머라제 모티브를 가지고, 이 모티브들은 포크 등이 확인한 것과 일치한다. 상기 4개의 폴리머라제 모티브에 동형인 이들 영역은 아미노산 696 내지 887 사이의 RSV L 단백질 내에서 확인되었다. 이들 4 요소들 중 3(A-3)은 상기한 바와 같은 파라믹소바이러스와 라브도바이러스 L 단백질의 고도로 보존된 단편과 일치한다. 단편 D는 이들 바이러스들 사이에서 덜 보존되나, 불변 라이신과 보존 글리신을 포함하지 않는다(RSV의 경우, 각각 K-886, G-877). In more detail, most of the highly conserved regions of L protein aligned between the various diverse lines in mononegavirals, as shown in Stack et al., FIG. 4, have four distinctly distinct polymerase motifs, They match what the fork and others have confirmed. These regions homologous to the four polymerase motifs have been identified in RSV L proteins between amino acids 696-887. Three of these four elements (A-3) are consistent with highly conserved fragments of paramyxovirus and lavodovirus L proteins as described above. Fragment D is less conserved among these viruses but does not include constant lysine and conserved glycine (K-886, G-877, respectively, for RSV).

네가티스 스트랜드 RNA 바이러스들이 공유하고 있는 다른 단백질에 대한 상세한 서열 정렬과 분석이 개시되었고 본 발명의 표적으로서 유용하다. 이와 관련하여, 바 등[Barr et al., J. Gen. Virol. 72: 677-685 (1991)]은 모노네가바이랄의 이형 구성원들 간의 N 단백질의 서열 보존성을 분석하였다. 구체적으로, 이 연구는 RSV 및 PVM N 단백질의 예상 아미노산 서열들 사이의 아미노산 동일성(60%)이 높다는 것은 보여주었다(본 발명에 참고로 인용한 도 7 참조). 아미노산 잔기 1 내지 150, 150 내지 393은 각각 38%, 74%의 동일성을 보인 반면, 아미노산 잔기 245 내지 315는 71개 아미노산 중 68개가 동일(96% 동일성)한 것으로 나타났다. 이렇게 보존성이 높은 것은 RSV와 PVM의 N 단백질들이 혈청학적으로 관련이 있다는 조사와 일치한다[Gimenez et al., 1984; Ling & Pringle, 1989].Detailed sequence alignments and analyzes for other proteins shared by Negatis strand RNA viruses have been disclosed and are useful as targets of the invention. In this regard, Barr et al., J. Gen. Virol. 72: 677-685 (1991) analyzed the sequence conservation of N proteins between heterologous members of mononegavirale. Specifically, this study showed that the amino acid identity (60%) between the predicted amino acid sequences of RSV and PVM N proteins is high (see FIG. 7, which is incorporated herein by reference). Amino acid residues 1 to 150, 150 to 393 showed 38% and 74% identity, respectively, while amino acid residues 245 to 315 were found to be 68 identical (96% identity) of 71 amino acids. This high conservatism is consistent with the investigation of serologically related N proteins of RSV and PVM [Gimenez et al., 1984; Ling & Pringle, 1989].

PVM과 모노네가바이랄 멤버들의 N 단백질의 아미노산 서열에 대한 컴퓨터 매트릭스 비교 결과 보존 영역이 밝혀진다[Barr et al., supra, Fig. 5]. 본 명세서에서의 서열 보존은 PVM과 에볼라 바이러스의 N 단백질 사이의 것이다. 또한, 단편화되지 않은 네가티스 스트랜드 RNA 바이러스의 매우 다양한 그룹의 멤버들로부터 유래된 N 단백질들의 하이드로퍼씨 프로파일은 파라믹소바이러스와 모르빌리바이러스 사이의 가장 큰 서열 유사도를 나타내는 영역에서 서로 비슷하다[Galinski et al., 1985]. 각 단백질의 약 180개의 아미노산(아미노 말단으로부터 130 내지 170개 잔기로 시작)은 소수 영역과 친수 영역이 교대를 이룬다. 아미노산 서열 분석기에 의한 2차 구조 추정은 이 보존된 하이드로퍼씨 영역은 많은 알파-나선으로 시작할 수 있으나, 많은 베타-시트로 끝나고 다시 역으로 교대하는 것을 시사한다. 이들 데이타는 이들 보존 단백질들이 유사 하이드로퍼씨 영역 전체에 걸쳐 유사한 접힌 구조를 가질 수 있음을 시사한다.Computational matrix comparisons of the amino acid sequences of the N protein of PVM and mononegaviral members reveal conserved regions [Barr et al., Supra, Fig. 5]. Sequence conservation herein is between the PVM and the N protein of Ebola virus. In addition, the hydroperciation profiles of N proteins derived from members of a wide variety of unfragmented netistis strand RNA viruses are similar to each other in the region showing the greatest sequence similarity between paramyxoviruses and morbiliviruses [Galinski et al., 1985. About 180 amino acids of each protein (starting with 130-170 residues from the amino terminus) alternate between the hydrophobic and hydrophilic regions. Secondary structure estimation by amino acid sequence analyzer suggests that this conserved hydropercid region can begin with many alpha-helices, but ends up with many beta-sheets and reverses back. These data suggest that these conserved proteins may have a similar folded structure throughout the pseudo hydropersia region.

추가의 보존 단백질 영역, 구조 모티브 및 단리된 보존 아미노산 잔기를 포인트로 하여 잘 알려져 있는 프로그램인 CLUSTAL[Higging & Sharp, Gene 33: 237-244 (1988)]를 사용하여 보존된 하이드로퍼씨 영역에 초점을 맞춘 N 단백질에 대한 또다른 정렬 연구가 된 바 있다[Barr et al., Fig. 7, A, B, C 박스]. 이 연구 결과, SeV, VSV, PVM N 단백질 간의 보존성은 PVM 서열의 카르복시 말단 절반 내의 영역에서 특히 높은 것으로 나타났다(도 7, 박스 C). 이 영역은 에볼라 바이러스와 PVM 간을 DIAGON 비교하여 확인될 수도 있다. 2개의 짧은 상동성 영역은 서열들 내에서도 검출되었고, 이들 각각은 단일, 보존 염기 아미노산에 의해 중단된 소수성 영역으로 구성된다(K 또는 R: A 및 B 박스, 도 7). 대응 영역들은 다른 파라믹소바이러스와 라브도바이러스 N 단백질 내에서 비슷하게 간격되어져 있다. 이들 영역의 동일성 정도는 Barr 등의 표 1에 기재되어 있다. 비록 한 바이러스 과 내에서 동일성이 가장 높은 부분이 보이기는 하지만, 상동성의 정도는 바이러스 과 사이의 이들 영역 내에 나타날 수 있다(특히, 보존 치환이 고려되는 경우).Focus on conserved hydropercid regions using the well-known program CLUSTAL [Higging & Sharp, Gene 33: 237-244 (1988)], with additional conserved protein regions, structural motifs and isolated conserved amino acid residues as points. There has been another alignment study on N proteins that have been adapted [Barr et al., Fig. 7, A, B, C boxes]. The study showed that the conservation between SeV, VSV, and PVM N proteins was particularly high in regions within the carboxy terminal half of the PVM sequence (FIG. 7, Box C). This region may be identified by DIAGON comparison between Ebola virus and PVM. Two short homology regions were also detected within the sequences, each consisting of a hydrophobic region interrupted by a single, conserved base amino acid (K or R: A and B boxes, FIG. 7). Corresponding regions are similarly spaced in other paramyxoviruses and Rhabdovirus N proteins. The degree of identity of these regions is listed in Table 1 of Barr et al. Although the highest identity within a virus family is seen, the degree of homology can appear within these regions between virus families (especially where conservative substitutions are considered).

또한 모노네가바이랄의 이형 멤버들간의 N 단백질들의 분자 보존도가 높다는 점을 확인하는 또다른 반포된 정렬 연구가 있다. 예를 들면, 문헌[Parks et al., Virus Res. 22: 259-279, (1992)]은 10개의 다른 파라믹소바이러스로부터 얻은 N 단백질의 아미노산 서열을 컴퓨터로 분석한 결과를 기재하고 있다. 이 문헌의 도 3에 도시된 바와 같이, N 단백질의 가운데 부분 가까이에 있는 영역(SV5 잔기 323- 340)은 불변 모티브 F-X4-Y-X4-S-Y-A-M-G(X는 어떠한 잔기도 될 수 있다는 의미)를 포함하여 다른 계통의 N 단백질들 간의 큰 서열 보존성을 포함한다. 두번째로 보존성이 높은 영역(음성 전하를 띠는 아미노산 글루타메이트와 아스파테이트)는 N 단백질의 C-말단 영역 내에서 확인되었다(SV5 잔기 455-469).There is also another published alignment study confirming the high molecular preservation of the N proteins between heterologous members of mononegaviral. See, eg, Parks et al., Virus Res. 22: 259-279, (1992) describe the results of a computer analysis of the amino acid sequences of N proteins from ten different paramyxoviruses. As shown in FIG. 3 of this document, the region near the center of the N protein (SV5 residues 323-340) shows the constant motif F-X4-Y-X4-SYAMG (where X can be any residue). Including large sequence retention between N proteins of different lines, including. A second highly conserved region (negatively charged amino acid glutamate and aspartate) was identified within the C-terminal region of the N protein (SV5 residues 455-469).

N 단백질의 분자 보존성에 관한 또다른 연구[Miyahara et al., Arch. Virol. 124: 255-268 (1992)]는 HPIV-1 N 단백질의 아미노산 서열을 12개의 다른 파라믹소바이러스 HPIV-2[Yuasa et al., Virologv 179: 777-784 (1990)], HPIV3[Galinski et al., Virolosv 149: 139-151 (1986)], HPIV-4A 및 -4B[Kondo et al., Virologv 174: 1-8 (1990)], SV5 및 SV41[Tsurudome et al., J. Gen. Virol. 72: 2289-2292 (1991)], MuV[Elango, Virus Res. 12: 77-86 (1989)], SeV[Morgan et al., Virolosv 135: 279-287 (1984)], PIV-3[Sakai et al., Nucleic Acids Res. & : 2927-2944 (1987)], NDV[Ishida et al., Nucleic Acids Res. 14: 6551-6564 (1986)], MeV 및 (CDV)[Rozenblatt et al., J. Virol. 53: 684-690 (1985)]과 비교하였다.Another study on the molecular preservation of N proteins [Miyahara et al., Arch. Virol. 124: 255-268 (1992) described the amino acid sequence of HPIV-1 N protein in 12 different paramyxovirus HPIV-2 [Yuasa et al., Virologv 179: 777-784 (1990)], HPIV3 [Galinski et al. Virolosv 149: 139-151 (1986), HPIV-4A and -4B [Kondo et al., Virologv 174: 1-8 (1990)], SV5 and SV41 [Tsurudome et al., J. Gen. Virol. 72: 2289-2292 (1991)], MuV [Elango, Virus Res. 12: 77-86 (1989)], SeV [Morgan et al., Virolosv 135: 279-287 (1984)], PIV-3 [Sakai et al., Nucleic Acids Res. &Lt; RTI ID = 0.0 > < / RTI > 2927-2944 (1987)], NDV [Ishida et al., Nucleic Acids Res. 14: 6551-6564 (1986)], MeV and (CDV) [Rozenblatt et al., J. Virol. 53: 684-690 (1985).

미야하라 등의 문헌 도 3에 도시된 바와 같이 HPIV1의 N 유전자는 SeV와 상동성이 매우 높다; 뉴클레오타이드 동일성과 아미노산 동일성이 각각 70.8%, 87.8%였다. HPIV-1의 N 단백질은 HPIV-3(63.1%), BPIV-3(63.3%), NDV(20.9%), MeV(20.5%), CDV(19.6%), SV41(18.6%), SV5(17.9%), HPIV-4A(17.9%), HPIV-4B(17.5%), HPIV-2(17.5%) 및 MuV(17.1%)과 서열 동일성을 보였다. 프로테아제 민감성 "힌지(hinge)"는 SeV K 단백질의 2 영역의 접점에서 발견되었다; (1) RNA와 직접 상호결합하는 아미노 말단 영역, (2) 어셈블된 뉴클레오캡시드의 표면에 있는 카르복시 말단 영역[Heggeness et al., Virology 114: 555-562 (1981)].Miyahara et al., As shown in Fig. 3, the N gene of HPIV1 is highly homologous to SeV; Nucleotide identity and amino acid identity were 70.8% and 87.8%, respectively. The N protein of HPIV-1 is HPIV-3 (63.1%), BPIV-3 (63.3%), NDV (20.9%), MeV (20.5%), CDV (19.6%), SV41 (18.6%), SV5 (17.9 %), HPIV-4A (17.9%), HPIV-4B (17.5%), HPIV-2 (17.5%) and MuV (17.1%). Protease sensitive "hinge" was found at the junction of two regions of SeV K protein; (1) an amino terminal region that directly interacts with RNA, and (2) a carboxy terminal region on the surface of the assembled nucleocapsid (Heggeness et al., Virology 114: 555-562 (1981)).

미야하라 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 26개의 아미노산은 파라믹소바이러스 N 단백질 모두에서 보존적이었고, 보존된 N 도메인은 아미노산 260-360 사이의 N 단백질 내에서 확인되었다. 또한 40 글리신 중 37개와 13 프롤린 중 13개는 HPIV-1와 SV 내에서 보존적이었다. 이는 이들 단백질 SeV가 공통적인 3차 구조를 갖는다는 것을 시사한다.As described in Miyahara et al., 26 amino acids were conserved in all paramyxovirus N proteins, and conserved N domains were identified in N proteins between amino acids 260-360. 37 of 40 glycine and 13 of 13 proline were conserved in HPIV-1 and SV. This suggests that these proteins SeV have a common tertiary structure.

미야하라 등은 또한 M 단백질 서열을 HPIV-1 M 단백질과 13개의 다른 파라믹소바이러스와 비교하였다[미야하라 문헌의 도 4 참조].Miyahara et al also compared the M protein sequence with HPIV-1 M protein and 13 other paramyxoviruses (see FIG. 4 of the Miyahara literature).

were conserved in the N proteins of HPIV-이들 이형 바이러스들은 M 단백질 서열의 요소들과는 구조적으로 보존성이 높았다. 예를 들어, HPIV-1과 SeV는 뉴클레오타이드 동일성과 아미노산 동일성이 각각 72.6%, 88.4%였다. HPIV-1은 또한 HPIV-3(65.7%), BPIV-3(65.4%), MeV(36.4%), CDV(34.6%), RPV(36.7%)과 서열 보존성을 보였다. HPIV-1의 시스테인 5개 모두, 프롤린 22개 중 20게, 글리신 25개 중 24개가 SeV에 보존되었다. 거의 이들 모두는 PIV-3 내에서도 보존적이었다. 이러한 발견은 M 단백질의 3차 구조가 HPIV-1, SeV, HPIV-3, BPIV-3 내에서 보존적일 수 있음을 의미한다. 또한, 14개의 아미노산이 모든 파라믹소바이러스 M 단백질 내에서 보존적이었다.were conserved in the N proteins of HPIV-heterologous viruses were structurally conserved from the elements of the M protein sequence. For example, HPIV-1 and SeV had 72.6% and 88.4% nucleotide identity and amino acid identity, respectively. HPIV-1 also showed sequence conservation with HPIV-3 (65.7%), BPIV-3 (65.4%), MeV (36.4%), CDV (34.6%), RPV (36.7%). All five cysteines of HPIV-1, 20 of 22 prolines and 24 of 25 glycine were conserved in SeV. Almost all of them were conservative even within PIV-3. This finding means that the tertiary structure of the M protein can be conserved in HPIV-1, SeV, HPIV-3, BPIV-3. In addition, 14 amino acids were conserved in all paramyxovirus M proteins.

모노네가바이랄 내에서 공통적으로 보존적이고 따라서 본 발명의 돌연변이 이형 전달의 표적으로 특히 유용한 P 단백질에 대한 서열 정렬 및 분석도 개시된 바 있다[Kondo et al., Virolog 178: 321-326 (1990)]. 이 문헌에서는 SeV의 P 단백질[Giorgi et al., Cell 35: 82-836 (1983); Neubert, Nucleic Acids Res. 17: 10-101 (1989)]과 PIV3[Luk et al., Virology 153: 318-325 (1986)]이 서로 크기가 비슷하고, 아미노산은 각각 568개, 603개로 이루어진 것임을 밝히고 있다. 다른 계통, 예를 들어 MuV, SV5, PIV-2, NDV의 경우, P 유전자는 각각 391,392,395, 395개 아미노산을 함유하는 단백질을 코딩한다[Takeuchi et al., J. Gen. Virol. 69: 20432049 (1988); Thomas et al., Cell 54: 891-902 (1988); Sato et al., Virus Res. 7: 241-255 (1987)]. MeV와 CDV의 P 단백질은 중간 크기이다[Barret et al., Virus Res. 3: 367-372 (1985); Bellini et al., J. Virol. 53: 908-919 (1985)].Sequence alignment and analysis has also been disclosed for P proteins that are commonly conserved in mononegaviral and are therefore particularly useful as targets for mutant heterologous delivery of the invention (Kondo et al., Virolog 178: 321-326 (1990)). . In this document P protein of SeV [Giorgi et al., Cell 35: 82-836 (1983); Neubert, Nucleic Acids Res. 17: 10-101 (1989)] and PIV3 [Luk et al., Virology 153: 318-325 (1986)] are similar in size to each other and have 568 and 603 amino acids, respectively. For other strains, for example MuV, SV5, PIV-2, NDV, the P gene encodes a protein containing 391,392,395, 395 amino acids, respectively [Takeuchi et al., J. Gen. Virol. 69: 20432049 (1988); Thomas et al., Cell 54: 891-902 (1988); Sato et al., Virus Res. 7: 241-255 (1987). The P proteins of MeV and CDV are medium in size [Barret et al., Virus Res. 3: 367-372 (1985); Bellini et al., J. Virol. 53: 908-919 (1985).

콘도 등[Virology 178: 321-326 (1990)]이 비교한 모든 이형 바이러스의 P 특이 영역은 통상적인 방법에 따라 정렬 가능하였다. 보존적인 구조 요소들은 PIV-4A, PIV-4B, SV5, PIV-2, MuV, NDV, MeV, CDV, PIV-3, SeV 사이에서 확인되었다[도 2, Kondo 문헌]. 따라서, 상기 연구와 P 단백질 분자 계통 발생학에 관한 다른 문헌들은 또한 이형의 돌연변이 바이러스로부터 재조합 백신 균주에 어테뉴에이팅 돌연변이를 도입시키기 위한 표적을 평가하기 위하여 돌연변이 부위와의 정렬을 위한 추가의 보존적 단백질 도메인, 구조 모티브, 아미노산 단편 및 단리된 잔기를 확인한다.The P specific regions of all heterologous viruses compared by Condo et al. (Virology 178: 321-326 (1990)) were alignable according to conventional methods. Conservative structural elements were identified between PIV-4A, PIV-4B, SV5, PIV-2, MuV, NDV, MeV, CDV, PIV-3, SeV (FIG. 2, Kondo literature). Thus, the above studies and other literature on P protein molecular phylogeny also provide additional conservative proteins for alignment with mutation sites to assess targets for introducing attenuating mutations into recombinant vaccine strains from heterologous mutant viruses. Domains, structural motifs, amino acid fragments and isolated residues are identified.

본 발명의 실시를 가능하게 하는 또다른 서열 정렬 및 분석이 있다. 이는 모노네가바이랄 내의 모든 단백질에 대하여 응용한 것이다. 간략히 말하면, 유아사 등은 문헌[Yuasa et al., Virologv 179: 777-784, (1990)]에서 3' 유전자 말단 과 인간 및 인간 이외의 파라인플루엔자 바이러스 PIV-4A, PIV-4B, MuV, NDV, MeV, PIV-3, BPIV-3, SeV, RSV 내의 N 유전자의 보존된 구조 요소를 확인한다[도 2 및 4 참조]. 카와노 등은 문헌[Virology 174: 308-313 (1990)]에서 이형의 파라믹소바이러스 8개에 대한 HN 단백질의 정렬 및 분자 분석을 제공한다[도 2 참조]. 츠루돔 등은 문헌[J. Gen. Virol. 72: 2289-2292 (1991)]에서 HPIV-2, SV5, SV41의 N 단백질 정렬 및 분석을 제공한다[도 3 참조]. 스프릭스 등은 문헌[Virology 152: 241-251 (1986)]에서 RSV를 포함하여 이형 파라믹소바이러스 사이의 F 단백질 내의 구조적 보존 요소들을 확인하였다. 모노네가바이랄 내의 계통 사이의 L 단백질과 3' 및 5' 비코딩 게놈 말단에 대해서는 하기의 문헌을 참조하라: Higuchi et al., J. Gen. Virol. 73: 10051010 (1992), 도 4;, Kawano et al., Nuc. Acids. Res. 19 (10): 2739-2746 (1991), 도 2 및 6;, Muhlberger et al, Virologv 187: 534-547 (1992), 도 4 및 6; Ogawa et al., J. Gen. Virol. 73: 2743-2750 (1992), 도 3. N, P, C, L, M, HN, F, SH, V, D 및 추가의 ORFs, 모노네가바이랄 내의 유전자 산물들에 대하여 상세히 설명하는 문헌들은 다음과 같다: Collins et al., Fields Virology, Fields et al. eds., 3rd edition, Chapter 41: 1205-1241, Lippincott-Raven, Philadelphia (1996). There is another sequence alignment and analysis that enables the practice of the present invention. This applies to all proteins in mononegaviral. In short, Yuasa et al. Described in Yuasa et al., Virologv 179: 777-784, (1990) the 3 'gene terminus and human and non-human parainfluenza viruses PIV-4A, PIV-4B, MuV, NDV, The conserved structural elements of the N gene in MeV, PIV-3, BPIV-3, SeV, RSV are identified (see FIGS. 2 and 4). Kawano et al. Provide the alignment and molecular analysis of HN proteins for 8 heterologous paramyxoviruses in Virology 174: 308-313 (1990). Tsurudo et al. Gen. Virol. 72: 2289-2292 (1991) provides N protein alignment and analysis of HPIV-2, SV5, SV41 (see FIG. 3). Scrix et al. Identified structural preservation elements in the F protein between heterologous paramyxoviruses, including RSV, in Virology 152: 241-251 (1986). For L protein and 3 'and 5' non-coding genomic ends between lines in mononegaviral, see Higuchi et al., J. Gen. Virol. 73: 10051010 (1992), FIG. 4; Kawano et al., Nuc. Acids. Res. 19 (10): 2739-2746 (1991), FIGS. 2 and 6; Muhlberger et al, Virologv 187: 534-547 (1992), FIGS. 4 and 6; Ogawa et al., J. Gen. Virol. 73: 2743-2750 (1992), Figure 3. N, P, C, L, M, HN, F, SH, V, D and further ORFs, the literature detailing the gene products in mononegaviral Are as follows: Collins et al., Fields Virology, Fields et al. eds., 3rd edition, Chapter 41: 1205-1241, Lippincott-Raven, Philadelphia (1996).

본 발명의 실시태양에 의하면, 이형 바이러스 내에서 확인된 돌연변이의 전달에 의하여 어테뉴에이트된 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 키메릭 바이러스(예: 키메릭 RSV, PIV)로 가공한다. 본 발명의 키메릭 네가티브 스트랜드 바이러스는 1 이상의 바이러스 균주 또는 그 서브 그룹으로부터 뉴클레오타이드 서 열을 함유하여 감염성, 키메릭 바이러스 또는 서브 바이러스 입자를 제조하도록 재조합 가공된다. 이러한 방식으로, 후보 백신 바이러스들은 재조합 가공되어 포유류 숙주 세포 내의 면역 반응을 유발한다. 본 발명에 따른 키메릭 바이러스는 특정 바이러스 서브 그룹 또는 균주에 대한 면역 반응을 유발하거나, 다중 바이러스 서브 그룹 또는 균주들에 대한 다중 특이적 반응을 유발할 수 있다.In accordance with embodiments of the present invention, attenuated recombinant negative strand RNA viruses are processed into chimeric viruses (eg, chimeric RSV, PIV) by delivery of mutations identified in heterologous viruses. Chimeric negative strand viruses of the present invention are recombinantly processed to produce infectious, chimeric virus or subviral particles containing nucleotide sequences from one or more virus strains or subgroups thereof. In this way, candidate vaccine viruses are recombinantly processed to elicit an immune response in mammalian host cells. Chimeric viruses according to the present invention may elicit an immune response against a particular viral subgroup or strain, or may elicit a multispecific response against multiple viral subgroups or strains.

전형적인 실시예에 따르면, 상기한 어테뉴에이팅 돌연변이를 함유한 키메릭 바이러스는, 예를 들면 이형 RSV 로부터의 대응체 서열을 치환하여 키메릭 RSV 게놈이나 안티게놈을 제조하는 것과 같은 방식에 의하여 대상 바이러스의 재조합 게놈이나 안티게놈 내에 첨가 또는 도입된 이형 바이러스의 이형 유전자 또는 그 단편을 가질 수 있다. 본 발명의 키메릭 바이러스에는 다른 바이러스 균주 또는 서브그룹의 추가의 또는 대체 "공급자" 유전자 또는 그 단편과 결합한 한 바이러스 균주 또는 서브 그룹 바이러스로부터 유래된 부분 또는 완전 "수용체" 바이러스 게놈 또는 안티게놈이 포함된다.According to a typical embodiment, the chimeric virus containing the attenuating mutation described above is a subject virus, for example, by substituting a counterpart sequence from a heterologous RSV to produce a chimeric RSV genome or an antigenome. It may have a heterologous gene or fragment thereof of a heterologous virus added or introduced into the recombinant genome or antigenome of. Chimeric viruses of the invention include partial or complete “receptor” viral genomes or antigenomes derived from one viral strain or subgroup virus in combination with additional or replacement “supplier” genes or fragments of other viral strains or subgroups. do.

바람직한 실시태양에 의하면, 키메릭 어테뉴에이티드된 바이러스는 다른 인간 RSV A 또는 B 서브그룹 바이러스로부터 유래된 이형 유전자 또는 그 단편과 결합된 부분 또는 완전 인간 RSV A 또는 B 서브그룹 게놈 또는 안티게놈으로 이루어진 바이러스이다. 이러한 재조합 바이러스를 만들기 위해, RSV 또는 그 서브그룹으로부터 유래된 이형의 공급자 유전자 또는 그 단편(들)을 공급자 유전자 또는 그 단편의 삽입이나 첨가에 지지대 역할을 하는 수용체 게놈 또는 안티게놈과 결합시키거나 치환시킨다. 따라서, 수용체 게놈 또는 안티게놈은 벡터로서 역할하여 이 형 유전자 또는 그 단편을 도입, 발현하여 키메릭 RSV를 생산하는데, 이 RSV는 신규의 구조적 및/또는 표현형질 특성을 나타낸다. 바람직하게는, 선택된 수용체 RSV 균주 내의 이형 유전자 또는 그 단편의 첨가 또는 치환에 의해 신규의 표현형질, 예를 들면 어테뉴에이션, 성장 변화, 면역원성 변화, 또는 기타 표현형질의 바람직한 변화특성 변화가 일어난다.According to a preferred embodiment, the chimeric attenuated virus consists of a partial or fully human RSV A or B subgroup genome or antigenome combined with a heterologous gene or fragment thereof derived from another human RSV A or B subgroup virus. It is a virus. To make such a recombinant virus, a heterologous supplier gene or fragment (s) derived from RSV or a subgroup thereof is combined or substituted with a receptor genome or antigenome that serves as a support for insertion or addition of the supplier gene or fragment thereof. Let's do it. Thus, the receptor genome or antigenome acts as a vector to introduce and express this type gene or fragment thereof to produce chimeric RSV, which exhibits novel structural and / or phenotypic properties. Preferably, addition or substitution of heterologous genes or fragments thereof in a selected receptor RSV strain results in the desired alteration of a novel phenotype, such as attenuation, growth change, immunogenicity change, or other phenotypic change.

대응 F 및 G 당단백질들로 치환된 인간 RSV B 서브그룹 당단백질의 유전자 F 및 G 모두를 RSV A 게놈 내에 함유하고 있는 어테뉴에이티드된 키메릭 RSV를 개발하고 특성 파악하였다. 이 키메릭 바이러스는 (i) 온도 감수성 아미노산 치환(Gln831을 Leu로 치환, Tyr1321을 Asn으로 치환), (ii) 유전자 M2의 개시 서열 내의 온도 감수성 뉴클레오타이드 치환; (iii) 아미노산 치환(RSV의 N 유전자의 Val267을 Ile으로 치환, RSV의 폴리머라제 L 유전자의 Cys319를 Tyr으로 치환, His1690을 Tyr으로 치환)으로 정의되는 냉온 통과 RSV로부터 만들어진 어테뉴에이팅 돌연변이; (iv) SH 유전자의 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 어테뉴에이팅 포인트 돌연변이를 포함하도록 더 변형되었다[미국특허출원 09/291,894]. 바람직하게는, 이들 및 그밖의 키메릭 바이러스들은 동일하거나 다른 돌연변이 바이러스로부터 유래될 수 있는 2 이상의 어테뉴에이팅 돌연변이를 함유한다.Attenuated chimeric RSVs containing both the genes F and G of the human RSV B subgroup glycoproteins substituted with the corresponding F and G glycoproteins in the RSV A genome were developed and characterized. This chimeric virus includes (i) temperature sensitive amino acid substitutions (Gln831 replaced with Leu, Tyr1321 replaced with Asn), (ii) temperature sensitive nucleotide substitutions within the initiating sequence of gene M2; (iii) an attenuating mutation made from cold pass RSV defined by amino acid substitution (substitution of Val267 of N gene of RSV with Ile, Cys319 of Cyser319 of L gene of RSV with Tyr, substitution of His1690 with Tyr); (iv) further modified to include attenuating point mutations selected from the group consisting of deletions of the SH gene (US Patent Application 09 / 291,894). Preferably, these and other chimeric viruses contain two or more attenuating mutations that can be derived from the same or different mutant viruses.

어테뉴에이티드된 키메릭 PIV도 개발되어 특성이 파악되었다. 즉, PIV3 돌연변이체, cp45로부터 얻어진 어테뉴에이팅 돌연변이 뿐만 아니라 HPIV-1 및 -3로부터 얻어진 이형 서열을 포함하는 키메릭 PIV도 개발되어 그 특성이 파악되었[WO 98/53078]. 더 최근에는, cp45에서 확인된 어테뉴에이팅 돌연변이 모두(단, F 단 백질의 것은 예외)가 성공적으로 어테뉴에이티드된, 재조합 HPIV3-1 키메라 내에 도입되었다.The attenuated chimeric PIV was also developed and characterized. In other words, chimeric PIVs containing heterologous sequences obtained from HPIV-1 and -3 as well as attenuating mutations obtained from the PIV3 mutant, cp45, were developed and characterized [WO 98/53078]. More recently, all of the attenuating mutations identified in cp45 (except for the F protein) have been introduced into a recombinant, recombinant HPIV3-1 chimera.

이형의 면역원성 단백질, 도멘인, 에피토프를 도입하여 키메릭 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 제조하는 것은 면역화된 숙주가 신규의 면역 반응을 일으키는 데에 특히 유용하다. 공급자 바이러스 서브그룹 또는 균주로부터 얻은 면역원성 유전자 또는 그 단편을 다른 바이러스 서브그룹 또는 균주의 수용체 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가 또는 치환하면 공급자에 대한 면역 반응, 수용체에 대한 면역 반응 또는 양자 모두에 대한 면역 반응이 발생될 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 예를 들어 다른 바이러스의 엑토도메인 내에 융합된 한 바이러스 균주 또는 그 서브그룹에 특이적인 막간 영역 및/또는 세포질 꼬리를 갖는 면역원성 단백질과 같은 키메릭 단백질을 발현하는 키메릭 바이러스를 제조할 수도 있다. 이러한 형태의 재조합체의 다른 예는 한쌍의 단백질 영역(예: 한쌍의 면역원성 영역)을 반혈할 수 있다.The production of chimeric negative strand RNA viruses by introducing heterologous immunogenic proteins, domains, epitopes, is particularly useful for immunized hosts to elicit novel immune responses. The addition or substitution of an immunogenic gene or fragment thereof from a supplier virus subgroup or strain into the receptor genome or antigenome of another virus subgroup or strain results in an immune response to the supplier, an immune response to the receptor, or both. This may occur. To achieve this goal, for example, a chimeric protein expressing a chimeric protein, such as an immunogenic protein having an intermembrane region and / or a cytoplasmic tail specific for one virus strain or subgroup thereof fused into an ectodomain of another virus. Viruses can also be produced. Another example of this type of recombinant can bleed a pair of protein regions (eg, a pair of immunogenic regions).

종종 키메릭 게놈 또는 안티게놈에 있는 전체 유전자(cis로 역할하는 요소 및 코딩 영역 포함)를 첨가 또는 치환하는 것이 유용할 때도 있지만, 관심의 대상이 되는 공급자 부분만 전달하는 것도 유용하다. 일반적으로, 비코딩 뉴클레오타이드(예: cis로 역할하는 조절 요소)와 유전자간 서열은 공급자 유전자 코딩 영역과 함께 전달할 필요가 없다. 또한, 여러 유전자 단편들은 신규하고 유용한 성질을 지닌 키메릭 바이러스를 발현하는 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입하기에 유용한 공급자 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서, 이형 유전자는 이롭게도 바이러스로부터 얻어진 선택된 단백질의 세포질 꼬리, 막간 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 부착 부위 또는 영역, 활성 부위 또는 영역 등을 코딩할 수 있다. 이들 및 기타 다른 유전자 단편들이 첨가되거나 다른 바이러스의 대응 유전자 단편과 치환되어 신규의 키메릭 재조합체, 예를 들면, 다른 바이러스의 당단백질의 엑토도메인에 융합된 한 바이러스의 당단백질의 막간 도메인 및/또는 세포질 꼬리를 갖는 키메릭 단백질을 발현하는 재조합체를 만들어낼 수 있다. 이와 관련한 유용한 게놈 단편은 약 15-35 뉴클레오타이드(단백질의 작은 기능성 영역, 예를 들어 에피토프 부위를 코딩하는 유전자 단편의 경우)부터 약 50, 75, 100, 200-500, 500-1500 또는 그 이상의 뉴클레오타이드(단백질 영역의 대형 도메인을 코딩하는 유전자 단편인 경우)일 수 있다. Sometimes it is useful to add or substitute whole genes in the chimeric genome or antigenome, including elements that act as cis and coding regions, but it is also useful to deliver only the supplier portion of interest. In general, non-coding nucleotides (e.g., regulatory elements that act as cis) and intergenic sequences do not need to be delivered with the supplier gene coding region. In addition, several gene fragments provide supplier polynucleotides that are useful for insertion into chimeric genomes or antigenomes that express chimeric viruses with novel and useful properties. Thus, heterologous genes can advantageously encode the cytoplasmic tail, intermembrane domain or ectodomain, epitope region or region, attachment site or region, active site or region, etc. of a selected protein obtained from a virus. The transmembrane domain of one virus and / or other gene fragments added or substituted with the corresponding gene fragment of another virus, fused to a novel chimeric recombinant, eg, the ectodomain of the glycoprotein of another virus, and / or Alternatively, recombinants expressing chimeric proteins with cytoplasmic tails can be made. Useful genomic fragments in this regard range from about 15-35 nucleotides (for gene fragments encoding small functional regions, such as epitope regions), to about 50, 75, 100, 200-500, 500-1500 or more nucleotides. (If it is a gene fragment encoding a large domain of a protein region).

전달된 어테뉴이이팅 돌연변이를 갖는 키메릭 바이러스를 제작하기 위하여, 이형의 유전자를 바탕 게놈 또는 안티게놈에 전체적으로 또는 부분적으로 첨가 또는 치환하여 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 제조할 수 있다. 이형의 유전자(즉, 공급자 유전자) 또는 그 단편 내에는 돌연변이가 1이상의 추가적인 돌연변이와 함게 존재하거나 부분 또는 완전 수용체 안티게놈 또는 게놈 "바탕" 내에 도입될 수 있다. 치환에 의해 만들어진 키메라의 경우, 한 바이러스로부터 유래된 단백질 또는 단백질 영역(예: 세포질 꼬리, 막간 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부윈 또는 영역, 결합 부위 또는 영역, 활성 부위 또는 활성 부위 포함 영역 등)은 다른 바이러스 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 유전자 단편을 치환하여 야생형 또는 모균주에서는 나타나지 않는 목적하는 표현형질 변화를 갖는 신규의 재조합체 를 형성한다. 본 명세서에서 사용되는 "대응체(counterpart)" 유전자, 유전자 단편, 단백질, 단백질 영역은 단일 종 또는 균주 내의 다른 유전자들 또는 동일 유전자의 다른 변이체, 다른 바이러스 서브그룹 또는 균주들 내의 종 및 대립 변이체 등과 같이, 이형의 공급원으로부터 유래된 2개의 대응되는 폴리뉴클레오타이드를 말한다.In order to construct chimeric viruses with delivered attenuating mutations, the chimeric genome or antigenome can be prepared by adding or substituting a heterologous gene in whole or in part to the base genome or antigenome. Within heterologous genes (ie, supplier genes) or fragments thereof, mutations may be present with one or more additional mutations or introduced into a partial or complete receptor antigenome or genomic “bottom”. For chimeras produced by substitution, a protein or protein region derived from one virus (e.g., cytoplasmic tail, intermembrane domain or ectodomain, epitope boost or region, binding site or region, active site or region containing active site, etc.) Corresponding genes or gene fragments within the viral genome or antigenome are replaced to form new recombinants with the desired phenotypic changes not seen in wild-type or parent strains. As used herein, a “counterpart” gene, gene fragment, protein, protein region may be a single species or strain, other genes or other variants of the same gene, species and allelic variants in other viral subgroups or strains, and the like. Likewise, it refers to two corresponding polynucleotides derived from a heterogeneous source.

대응체 유전자 및 유전자 단편은 통상 구조적 유사성을 지닌다. 예를 들어, 대응체 유전자 단편은 관심 대상 단백질의 공통적 구조 도메인(예: 세포질 도메인, 막간 도메인, 엑토도메인, 결합 부위 또는 영역, 에피토프 부위 또는 영역 등)을 코딩할 수 있다. 통상적으로, 그들은 생물학적 기능에서도 공통성을 가진다. 예를 들어, 대응체 유전자 단편에 의해 코딩되는 단백질 도메인들은 공통의 막 스패닝 기능, 특이적 부착능, 면역 인식 부위 등을 갖는다. 본 발명의 어테뉴에이티드된 키메릭 바이러스를 제작하는 데에 사용되는 대응체 유전자 및 그 단편은 광범위한 크기 및 서열 편차를 갖는 종을 포함한다. 그러나, 대응체 유전자 및 그 단편의 선택은 상기에 정의한 바와 같이 대상 대응체들 사이의 실질적 서열 동일성에 의존된다. 여기서는, 선택된 폴리뉴클레오타이드 기준 서열은 공급자 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 중 어느 하나 안에 존재하는 서열 또는 그 서열의 일부이다. 이 기준 서열은 서열 비교를 위한 기초가 되는 서열이다. 예를 들어, 기준 서열은 cDNA 또는 유전자의 단편, 또는 완전 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다. Counterpart genes and gene fragments usually have structural similarities. For example, counterpart gene fragments may encode common structural domains of a protein of interest (eg, cytoplasmic domains, transmembrane domains, ectodomains, binding sites or regions, epitope sites or regions, etc.). Typically, they also have commonalities in biological function. For example, protein domains encoded by counterpart gene fragments have a common membrane spanning function, specific adhesion ability, immune recognition site, and the like. Corresponding genes and fragments thereof used to produce the attenuated chimeric virus of the present invention include species having a wide range of sizes and sequence variations. However, the selection of counterpart genes and fragments thereof depends on substantial sequence identity between the counterparts of interest as defined above. Here, the selected polynucleotide reference sequence is a sequence or part of a sequence present in either the supplier or receptor genome or antigenome. This reference sequence is the basis for sequence comparison. For example, the reference sequence can be a cDNA or fragment of a gene, or a complete cDNA or gene sequence.

당업계에 잘 알려진 cDNA를 사용한 방법은 이형의 바이러스 내에서 확인된 어테뉴에이팅 돌연변이를 포함한 재조합 키메릭 바이러스 또는 서브 바이러스 입자 의 대형 패널(panel)을 제작하는 데에 유용하다. 이들 재조합체는 백신으로서 사용하기 위한 어테뉴에이션 및 면역원성이 개선된 특성을 가진다. 본 발명에서 달성하고자 하는 표현형질 변화들 중에는 어테뉴에이티드된 표현형질의 복귀에 대한 내성, 배양액 또는 선택된 숙주 환경 내에서의 어테뉴에이션 향상, 면역원성 향상(증강 또는 감소에 의해 결정되는 것으로서 면역 반응 유발과 관련됨), 선택된 바이러스 산물의 전사/번역의 (+), (-) 조절 등이 있다.Methods using cDNA, which are well known in the art, are useful for making large panels of recombinant chimeric virus or subviral particles, including attenuating mutations identified in heterologous viruses. These recombinants have properties that have improved attenuation and immunogenicity for use as vaccines. Among the phenotypic changes to be achieved in the present invention are resistance to the recovery of the attenuated phenotype, enhanced attenuation in culture or selected host environment, enhanced immunogenicity (induced immune response as determined by augmentation or reduction). (+), (-) Regulation of transcription / translation of the selected viral product.

본 발명의 다른 일면에 의하면, 이형의 바이러스 내에서 확인된 어테뉴에이팅 돌연변이를 포함한 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스는 어테뉴에이팅 표현형질 변화를 일으키는 1 이상의 추가의 어테뉴에이팅 돌연변이를 도입함에 의해 더 변이될 수 있다. 이들 돌연변이는 드 노보로 일어날 수 있고 합리적인 돌연변이유발 전략에 따라 어테뉴에이팅 효과를 시험할 수 있다. 또는, 어테뉴에이팅 포인트 돌연변이는 생물학적으로 유도된 돌연변이체들(RSV, PIV ts 또는 cp 돌연변이체 등) 내에서 확인되고, 그런 후에 본 발명의 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스 내에 도입된다. 이렇게 더 어테뉴에이티드된 재조합체는 키메릭 바이러스일 수 있다.According to another aspect of the invention, an attenuated recombinant virus, including an attenuating mutation identified in a heterologous virus, is further mutated by introducing one or more additional attenuating mutations that cause an attenuating phenotypic change. Can be. These mutations can occur de novo and test the attenuating effect according to reasonable mutagenesis strategies. Alternatively, attenuating point mutations are identified in biologically induced mutants (RSV, PIV ts or cp mutants, etc.) and then introduced into the attenuated recombinant virus of the present invention. This more attenuated recombinant may be a chimeric virus.

백신 균주 내의 도입을 위한 생물학적으로 유도된 RSV 내의 어테뉴에이팅 돌연변이는 자연적으로 발생되거나 공지의 돌연변이 유발법으로 야생형에 도입시킬 수 있다USSN 08/327,263].Attenuating mutations in biologically induced RSV for introduction into vaccine strains can be naturally occurring or introduced into the wild type by known mutagenesis. USSN 08 / 327,263].

"생물학적으로 유도된" 돌연변이 바이러스란 재조합 방법에 의해 만들어지지 않은 돌연변이 바이러스를 말하고 그 종류는 불문한다. 즉, 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 종, 서브그룹 또는 균주가 포함된다. 그 예를 들면, 돌연변이 게놈 서열을 갖는 자연 발생적 PIV 또는 RSV, 또는 기준 야생형 서열의 게놈상 변이를 포함한 PIV 또는 RSV이다. 마찬가지로, 생물학적으로 유도된 바이러스에는 재조합법(특히, 인위적인 돌연변이 유발 및 선별법)에 의해 모균주로부터 유래된 돌연변이가 포함된다.A "biologically induced" mutant virus refers to a mutant virus that has not been produced by recombinant methods and of any kind. That is, biologically induced mutant viruses include negative strand RNA virus species, subgroups or strains. For example, naturally occurring PIV or RSV having a mutant genomic sequence, or PIV or RSV including genomic variation of a reference wild type sequence. Similarly, biologically induced viruses include mutations derived from the parent strain by recombinant methods (especially artificial mutagenesis and screening).

상기에서 확인된 어테뉴이이팅 돌연변이는 "메뉴"라고 하고, 이들은 단독 또는 조합으로 도입되어 후보 백신 바이러스가 적절한 수준의 어테뉴에이션, 면역원성, 어테뉴에이티드된 표현형질의 복귀에 대한 내성을 갖도록 한다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 돌연변이 바이러스는 상기 메뉴에서 확인된 점 돌연변이 1 이상, 더 바람직하게는 2 이상을 가진다. 예를 들면, RSV 돌연변이 패널은 다음과 같다: cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579.The attenuating mutations identified above are referred to as “menus” and they are introduced alone or in combination so that the candidate vaccine virus is resistant to the appropriate level of attenuation, immunogenicity, and the recovery of the attenuated phenotype. Preferably, the recombinant mutant virus of the present invention has one or more, more preferably two or more point mutations identified in the menu. For example, the RSV mutation panel is as follows: cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452 ), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52 / 2B5 (ATCC VR 2542), RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579.

공특이적 또는 이형 바이러스(예: ts, cp, 비ts, 비cp 어테뉴에이팅 돌연변이)로부터 추가의 돌연변이를 도입할 수 있다. 어테뉴에이팅 돌연변이는 유저자의 코딩 부 또는 cis 조절 서열과 같은 비코딩 영역 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 어테뉴에이팅 돌연변이에는 유전자 개시 서열 내에 단일 또는 다중의 염기 변화를 포함할 수 있다. 예를 들면, RSV M2 유전자 개시 서열의 뉴클레오타이드 7605에서 단일 염기 치환이 있을 수 있다. 이러한 방식으로, 재조합 백신 후보의 어테뉴에이션은 혈청 음성 반응을 보이는 유아를 포함한 환자 군 1 이상에 사용하 기 위하여 정교하게 보정될 수 있다. cDNA로부터 바이러스를 제조할 수 있으면 이들 돌연변이를 개별적으로 또는 여러가지 선택된 조합으로 전장 cDNA 클론 내에 쉽게 도입한 후, 도입된 돌연변이를 가지는 재조합 바이러스의 표현형질을 쉽게 결정할 수 있다.Additional mutations can be introduced from cospecific or heterologous viruses (eg, ts, cp, nonts, noncp attenuating mutations). The attenuating mutation can be selected within a noncoding region, such as the coding portion or cis regulatory sequence of the user. For example, attenuating mutations may include single or multiple base changes within the gene initiation sequence. For example, there may be a single base substitution at nucleotide 7605 of the RSV M2 gene initiation sequence. In this way, the attenuation of recombinant vaccine candidates can be precisely calibrated for use in at least one patient group, including infants with seronegative responses. If the virus can be produced from cDNA, these mutations can be easily introduced into the full-length cDNA clone individually or in various selected combinations, and then the phenotype of the recombinant virus with the introduced mutations can be readily determined.

예를 들어 cp, ts 표현형질과 같은 바람직한 표현형질과 관련있는 특정 어테뉴에이팅 돌연변이를 확인하고 감염성 재조합 바이러스 클론에 도입함에 의해, 본 발명은 확인된 돌연변이에서, 또는 그 내부 가까이에 다른 부위 특이적 돌연변이를 일으킨다. 생물학적으로 유도된 바이러스 내에서 만들어진 어테뉴에이팅 돌연변이 대부분이 단일 아미노산 치환임에 반해, 다른 "부위 특이적" 돌연변이들이 재조합 기술에 의해 본 발명의 재조합 바이러스 내로 도입될 수 있다. 여기서 사용되는 부위 특이적 돌연변이란 적게는 1 내지 3부터 많게는 5 내지 15개 이상의 변형된 뉴클레오타이드가 삽입, 치환, 결실, 재정렬되는 것을 포함한다(예: 야생형 서열, 선택된 돌연변이 균주의 서열 또는 돌연변이유발시킨 재조합 모균주로부터 변형된 것). 상기 부위 특이적 돌연변이는 선택된 어테뉴에이팅 돌연변이에 또는 그 영역의 내부에 도입될 수 있다. 또한, 상기 돌연변이는 바이러스 클론, 예를 들어 단백질 활성 부위, 결합 부위, 면역 에피토프 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 cis 역할을 하는 조절 서열에서 또는 그 근처에 도입될 수 있다. 부위 특이적 바이러스 돌연변이체는 통상적으로 바람직한 어테뉴에이팅 표현형질을 보유하나, 대부분 어테뉴에이션과 무관한 변형된 표현형질(예: 면역원성이 강화 또는 대역화되거나 성장이 개선되는 등)을 나타낼 수 있다. 바람직한 부위 특이적 돌연변이체 의 예에는 어테뉴에이팅 돌연변이를 지정하는 코돈 내에 추가의 안정화 뉴클레오타이드 돌연변이를 포함하는 재조합 바이러스들이 포함된다. 가능하다면, 이 경우 2 이상의 뉴클레오타이드 치환을 모균주 또는 재조합 클론 내에서 어테뉴에이팅 아미노산 변화를 정의하는 코돈에 도입하여테뉴에이티드된 표현형질로부터의 복귀에 대한 유전적 내성을 갖는 재조합체를 만들어낼 수 있다. 다른 실시태양에 의하면, 부위 특이적 뉴클레오타이드 치환, 첨가, 결실 또는 재정렬을 표적 뉴클레오타이드에 대하여 상류(코딩된 바이러스 단백질의 N 말단쪽) 또는 하류(C-말단쪽), 예를 들면 적게는 1 내지 3, 5 내지 10, 많게는 15 뉴클레오타이드 이상에 가하여 기존의 cis 조절 요소를 제작 또는 제거한다.For example, by identifying specific attenuating mutations associated with a preferred phenotype such as the cp, ts phenotype and introducing it into an infectious recombinant viral clone, the present invention is directed to other site specific at or near the identified mutation. Causes mutations. While most of the attenuating mutations made in biologically induced viruses are single amino acid substitutions, other "site specific" mutations can be introduced into the recombinant virus of the present invention by recombinant techniques. As used herein, site specific mutations include the insertion, substitution, deletion, rearrangement of at least one to three to as many as five to fifteen or more modified nucleotides (e.g., wild type sequence, sequence of selected mutant strain or mutagenesis). Modified from recombinant parent strains). The site specific mutations can be introduced to or within the selected attenuating mutations. The mutation can also be introduced at or near viral clones, eg, nucleotide sequences encoding protein active sites, binding sites, immune epitopes, or the like, or regulatory sequences that serve as cis. Site-specific viral mutants typically possess the desired attenuating phenotype, but can exhibit modified phenotypes that are mostly independent of attenuation (eg, enhanced or banded or improved growth, etc.). . Examples of preferred site specific mutants include recombinant viruses comprising additional stabilizing nucleotide mutations in the codons designating the attenuating mutations. If possible, two or more nucleotide substitutions, in this case, may be introduced into the codon that defines the attenuating amino acid changes within the parent strain or recombinant clones to produce a recombinant with genetic resistance to the return from the tenated phenotype. Can be. In other embodiments, site specific nucleotide substitutions, additions, deletions or rearrangements may be performed upstream (the N terminus of the encoded viral protein) or downstream (C-terminus), for example 1 to 3, relative to the target nucleotide. , 5 to 10, more than 15 nucleotides are added to construct or remove existing cis regulatory elements.

단일 및 다중 점 돌연변이 및 부위 특이적 돌연변이와 함께, 본 발명의 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스의 변화에는 전체 유전자 또는 그 단편의 결실, 삽입, 치환 또는 재정렬도 포함한다. 이들 돌연변이는 변화의 성질에 따라 공급자 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈의 약간의 염기(예: 15-30, 많게는 35-50 이상) 또는 많은 뉴클레오타이드(예: 50-100, 100-300, 300-500, 500-1000 염기)를 변화시킬 수 있다. 즉, 작은 유전자 단편을 변화시키거나 면역원성 에피토프를 삽입 또는 제거하기 위하여 변화시키는 경우에는 염기 약간만 변화시키는 반면, 유전자 또는 대형 유전자 단편을 첨가, 치환, 결실, 재정렬하는 경우에는 염기를 많이 변화시킨다.In addition to single and multiple point mutations and site specific mutations, the altered recombinant viruses of the present invention also include deletion, insertion, substitution or rearrangement of the entire gene or fragment thereof. Depending on the nature of the change, these mutations can result in a few bases (eg 15-30, more than 35-50 or more) or many nucleotides (eg 50-100, 100-300, 300-500, 500-1000 bases). In other words, when changing small gene fragments or inserting or removing an immunogenic epitope, only a small change in base is made, whereas in case of addition, substitution, deletion and rearrangement of a gene or a large gene fragment, the base is changed a lot.

다른 일면에 의하면, 본 발명은 더 변형된 재조합 바이러스 내의 동일 또는 다른 유전자들을 포함하는 추가 형태의 돌연변이(cp, ts 등)가 있는 이형의 바이러 스에서 유래한 재조합 네가티브 스트랜드 바이러스 cDNA 내에 도입된 돌연변이를 보충하는 것을 제공한다. 이와 관련혀아, 바이러스 단백질들은 발현율을 선택적으로 변화시킬 수도 있고, 단독으로 또는 다른 형태의 원하는 돌연변이와 조합하여, 전체 또는 부분적으로 첨가, 결실, 치환 또는 재정렬되어 신규의 백신 특성을 가진 재조합 어테뉴에이티드된 바이러스를 만들 수 있다.In another aspect, the invention provides a mutation introduced into a recombinant negative strand virus cDNA derived from a heterologous virus with additional forms of mutations (cp, ts, etc.) comprising the same or different genes in a more modified recombinant virus. Provide to supplement. In this regard, viral proteins may optionally change the expression rate, alone or in combination with other forms of the desired mutation, in whole or in part, added, deleted, substituted or rearranged to bring recombinant vaccines with novel vaccine properties. Can make a virus.

따라서, 이형의 바이러스 돌연변이체로부터 얻어진 어테뉴에이팅 돌연변이 이외에 또는 그와 함께 본 발명은 재조합 공학에 기초하여 재조합 백신 후보를 어테뉴에이팅시키고 다른 방식으로 변형시키기 위한 추가의 방법들을 제공한다. 본 발명의 일면에 의하면, 재조합 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 다양한 변형이 일어날 수 있다. 더 구체적으로는, 재조합 PIV 내에 바람직한 구조적 및 표현형질적 변화를 일으키기 위해서, 본 발명은 모 게놈 또는 안티게놈 내에 전체 유전자 또는 유전자 단편을 결실, 치환, 도입 또는 재정렬시키는 돌연변이 뿐만 아니라 모 게놈 또는 안티게놈으로부터 얻어진 선택된 뉴클레오타이드 또는 다수의 뉴클레오타이드를 결실, 치환, 도입 또는 개벼열하는 돌연변이도 도입시킨다. Thus, in addition to or in conjunction with the attenuating mutations obtained from heterologous viral mutants, the present invention provides additional methods for attenuating and otherwise modifying recombinant vaccine candidates based on recombinant engineering. According to one aspect of the present invention, various modifications may occur within an isolated polynucleotide sequence encoding a recombinant genome or antigenome. More specifically, in order to produce desirable structural and phenotypic changes in recombinant PIVs, the present invention is directed from parental genomes or antigenomes as well as mutations that delete, substitute, introduce or rearrange entire genes or gene fragments within the parent genome or antigenome. Mutations that delete, replace, introduce, or sequence the resulting selected nucleotides or multiple nucleotides are also introduced.

어테뉴에이티드된 재조합 바이러스의 바람직한 변형은 통상적으로 바람직한 표현형질(예: 바이러스 성장 특성, 온도 감수성, 숙주의 면연 반응 유도능, 어테뉴에이션 등)이 변화되도록 선택된다. 이들 변형은 예를 들어 특정 유전자 또는 유전자 부분(예: 세포질, 막간 또는 세포외 도메인, 면역원성 에피토프, 결합 영역, 활성 부위 등과 같은 단백질 구조적 도메인을 코딩하는 유전자 단편)을 제거, 도입 또는 재정렬하는 모 균주의 돌연변이 유발법에 의해 공급자 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 내에 일으킬 수 있다. 이와 관련하여 관심 대상이 될만한 유전자에는 다른 바이러스로부터 유래된 이형의 유전자들 뿐만 아니라 RSV의 경우를 예로 들면, 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5' 등이 포함된다.Preferred modifications of the recombinant recombinant virus are typically selected such that the desired phenotype (eg, viral growth properties, temperature sensitivity, host's ability to induce marginal reactions, attenuation, etc.) is changed. These modifications include, for example, a parent that removes, introduces, or rearranges certain genes or gene parts (eg, gene fragments encoding protein structural domains such as cytoplasmic, transmembrane or extracellular domains, immunogenic epitopes, binding regions, active sites, etc.). Mutagenesis of the strain may result in the supplier or receptor genome or antigenome. Genes of interest in this regard include heterologous genes derived from other viruses, as well as the case of RSV, for example, 3'-NS1-NS2-NPM-SH-GF-M2-L-5 '. .

또한 선택된 유전자의 발현을 변화시키거나 제거하는 재조합 백신 후보의 변형도 제공된다. 예를 들면, 이러한 변형은, 선택된 RSV 코딩 서열 내에 종료 코돈을 도입하고, 기능적으로 연결된 프로모터 주변에서 유전자의 위치를 변형시키고, 발현율을 변형시키기 위한 상류 개시 코돈을 도입하고, 표현형질(성장 특성, 전사의 온도 제한성 등)을 변형시키기 위한 전사 시그날을 변형(위치를 바꾸거나, 기존 서열을 변형시키거나 이형의 서열로 기존의 서열을 치환하는 방식 등에 의함) 또는 치환하고, 바이러스 복제, 선택된 유전자의 전사, 선택된 단백질의 번역을 정량적 또는 정성적으로 변화시키는 기타 다른 결실, 치환, 첨가 및 재정렬을 하여 수행할 수 있다.Also provided is a modification of a recombinant vaccine candidate that alters or eliminates the expression of a selected gene. For example, such modifications may include introducing an end codon within a selected RSV coding sequence, modifying the position of the gene around a functionally linked promoter, introducing an upstream initiation codon for modifying the expression rate, phenotypes (growth characteristics, Transcriptional signals for modifying the transcriptional restriction (such as by altering positions, altering existing sequences or replacing existing sequences with heterologous sequences), or viral replication, Transcription, other deletions, substitutions, additions, and rearrangements that quantitatively or qualitatively change the translation of a selected protein can be performed.

다른 유형의 어테뉴에이팅 돌연변이를 재조합 백신 후보에 도입할 수 있다면 의 재조합 클론 내의 표적 변형의 광범위 조합이 가능하다. 예를 들어, RSV 내의 SH 유전자를 결시키면 성장이 향상되는 등의 신규의 표현형질을 갖는 재조합체가 만들어진다. 즉, 본 발명의 재조합 RSV의 경우, SH 유전자 결실(비필수 유전자 또는 유전자 단편의 결실 등)은 어테뉴에이티드된 표현형질을 특정하는 1 이상의 추가의 돌연변이(예: 생물학적으로 유도된 어테뉴에이티드된 돌연변이체로부터 얻어진 추가의 어테뉴에이팅 돌연변이 1 이상에 의해 임의적으로 보완된 이형의 바이러 스로부터 얻어진 1 이상의 점 돌연변이 등)는 재조합 바이러스 내에 도입된다. 한 실시태양에서는, RSV의 SH 또는 NS2 유전자는 cpts248/404, cpys530/1009, cpts530/1030 또는 다른 선택된 RSV 돌연변이체로부터 얻어진 1 이상의 cp 및/또는 ts 돌연변이와 조합하여 결실되는데, 이러한 다른 돌연변이의 조합된 효과 때문에 바이러스 수율이 높고, 어테뉴에이션이 향상되고, 표현형질 복귀에 내성을 가지는 RSV 돌연변이체가 만들어진다.If other types of attenuating mutations can be introduced into a recombinant vaccine candidate, a wide range of combinations of target modifications within the recombinant clone of is possible. For example, binding of the SH gene in RSV results in recombinants with novel phenotypes such as enhanced growth. That is, for the recombinant RSV of the present invention, the SH gene deletion (such as deletion of non-essential genes or gene fragments) is one or more additional mutations (e.g., biologically induced attenuated) that specify an attenuated phenotype. One or more point mutations obtained from heterologous viruses optionally complemented by one or more additional attenuating mutations obtained from the mutant, etc.) are introduced into the recombinant virus. In one embodiment, the SH or NS2 gene of RSV is deleted in combination with one or more cp and / or ts mutations obtained from cpts248 / 404, cpys530 / 1009, cpts530 / 1030 or other selected RSV mutants, a combination of these other mutations The resulting effects result in RSV mutants that have high viral yield, improved attenuation and resistant to phenotypic reversion.

SH 결실(마이너스) RSV 클론의 경우, 변형된 바이러스 게놈은 뉴클레오타이드 14,825개 길이인데, 그 야생형보다 398개나 적다. 게놈 크기를 감소시키는 유사한 돌연변이를 수행하여(예: P, M, F 및 M2 유전자와 같이 RSV 게놈 내의 다른 코딩 또는 비코딩 영역 내에서) 본 발명은 키메릭 RSV의 성장을 향상시키기 위한 몇가지 쉬운 방법과 재료를 제공한다.For the SH deletion (minus) RSV clone, the modified viral genome is 14,825 nucleotides in length, 398 fewer than its wild type. By performing similar mutations that reduce genome size (eg, within other coding or non-coding regions within the RSV genome, such as the P, M, F, and M2 genes), the present invention provides several easy ways to enhance the growth of chimeric RSV. And materials.

또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 어테뉴에이티드된 감염성 바이러스 내로 도입하기 위한 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서 다양한 유전적 변화가 일어날 수 있다. 추가의 이형 유전자 또는 그 단편(상이한 바이러스 유전자로부터 유래되거나 상이한 바이러스 균주 또는 유형으로부터 유래된 것 등)은 전체 또는 부분적으로 삽입될 수 있다. 또한 변형된 유전자의 순서가 바뀔 수도 있고, 오버랩 유전자가 제거될 수도 있으며 게놈 프로모터가 안티게놈 애응체로 치환될 수도 있으며, 유전자 일부가 제거되거나 치환될 수도 있으며, 전체 유전자가 결실될 수도 있다. 서열 내의 상이한 또는 추가의 변형은 유전자 내의 여러 영역 또는 다른 곳에 특이한 제한 부위를 삽입하는 등의 조작을 용이하게 할 수 있다. 번역되지 않은 유전 자 서열을 제거하여 외래 서열을 삽입하기 쉽게 할 수도 있다.In addition, various genetic changes may occur within the recombinant genome or antigenome for introduction into the infectious virus attenuated by the method according to the invention. Additional heterologous genes or fragments thereof (such as those derived from different viral genes or from different virus strains or types) may be inserted in whole or in part. In addition, the sequence of the modified gene may be reversed, the overlap gene may be removed, the genomic promoter may be replaced with an antigenome, a portion of the gene may be removed or replaced, or the entire gene may be deleted. Different or additional modifications in the sequence can facilitate manipulations such as inserting specific restriction sites in various regions or elsewhere in the gene. Untranslated gene sequences may be removed to facilitate insertion of foreign sequences.

또한 본 발명에서는 재조합 클론으로부터 얻어진 유전자 또는 그 단편의 제거 없이 어테뉴에이티드된 재조합 백신 후보 바이러스 내의 유전자 변형도 제공된다. 예를 들어, 이는 선택된 코딩 서열 내에 종료 코돈을 삽입하고, 유전자 위치를 바꾸거나 발현율을 변경시키기 위해 상류 개시 코돈을 삽입하거나, 표현형질(예: 성장 특성, 전사의 온도 제한성 등)을 변화시키기 위해 전사 시그날을 변형시켜 달성할 수 있다.Also provided herein are genetic modifications within the recombinant vaccine candidate virus attenuated without removal of the gene or fragment thereof obtained from the recombinant clone. For example, it inserts an end codon within a selected coding sequence, inserts an upstream initiation codon to change gene position or change expression rate, or to change a phenotype (eg, growth characteristics, temperature limit of transcription, etc.). It can be achieved by modifying the transcription signal.

본 발명에서 바람직한 돌연변이에는 cis로 작용하는 시그날을 향한 돌연변이가 포함되는데, 이는 바이러스 미니게놈의 돌연변이 검사법 등으로 확인 가능하다. 예를 들어, 리더와 트레일러(trailer) 및 플랭킹 서열의 삽입 및 결실 검사한 결과, 바이러스 프로모터와 전사 시그날이 확인되었고, RNA 복제 또는 전사의 감소도가 다양한 일련의 돌연변이가 제공되었다. cis 시그날을 포화 돌연변이 유발(이에 의해 각 위치가 차례로 변형되어 각 뉴클레오타이드 대체물로 됨)함으로써 RNA 복제 또는 전사를 감소시키는 돌연변이가 많이 생기는 것이 확인되었다. 이들 돌연변이 중 그 어느 것도 본 발명의 재조합 게놈 또는 안티게놈 내로 삽입될 수 있다.Preferred mutations in the present invention include mutations directed to signals acting as cis, which can be confirmed by mutational testing of viral minigenomes. For example, insertion and deletion testing of leader, trailer and flanking sequences confirmed viral promoters and transcriptional signals and provided a series of mutations with varying degrees of RNA replication or transcriptional reduction. By saturating mutagenesis of the cis signal, whereby each position is altered in turn to each nucleotide replacement, it has been confirmed that many mutations occur that reduce RNA replication or transcription. Any of these mutations can be inserted into the recombinant genome or antigenome of the present invention.

바이러스 미니게놈을 사용하는 것은 완전 안티게놈 cDNA를 사용한 trans- 작용 단백질 및 cis- 작용 RNA 서열의 평가 및 조작에 도움이 되는데[Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686 (1995)], 이는 복제 의존성 감염성 바이러스 내의 회복이 크게 저해된 이들 돌연변이체의 특성 파악에 유용하다.The use of viral minigenomes aids in the evaluation and manipulation of trans-acting protein and cis-acting RNA sequences using fully antigenome cDNA [Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686 (1995)], which is useful for the characterization of these mutants which significantly inhibited recovery in replication dependent infectious viruses.

본 발명의 재조합 바이러스 내의 다른 돌연변이로는 게놈의 3' 말단을 안티 게놈의 대응체로 치환하는 것이 포함되는데, 이는 RNA 복제 및 전사의 변형과 관계가 있다. 또한, 유전자간 영역[Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598 (1986)]은 서열 함량에서 짧아지거나 길어지거나 변경될 수 있으며, 자연적으로 발생하는 유전자 오버랩[Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5134-5138 (1987)]은 제거되거나 본 발명의 방법에 의해 다른 유전자간 영역으로 변경될 수 있다.Other mutations in the recombinant virus of the present invention include substituting the 3 'end of the genome with a counterpart of the anti genome, which involves alterations in RNA replication and transcription. In addition, intergenic regions [Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598 (1986)] can be shortened, lengthened or altered in sequence content and naturally occurring gene overlap [Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5134-5138 (1987) may be removed or altered to other intergenic regions by the methods of the present invention.

한 실시태양에서는, RSV 방어성 F 및 G 항원과 같은 특정 단백질의 발현율은 효율적인 번역이 되도록 설계되어 합성 cDNA와 결합된 것으로 천연 코돈을 치환함으로써 증가될 수 있다. 코돈 사용율은 포유류 바이러스 단백질의 번역율에 있어서 주요 요인일 수 있다는 보고가 있다[Haas et al., Current Biol. 6: 315-324 (1996))]. 주된 방어성 항원인 RSV의 F 및 G 단백질을 코딩하는 mRNA의 코돈 사용율을 검사한 결과, 사용율은 낮은 발현율과 일치한다. 따라서, 코돈 사용율은 선택된 유전자의 발현을 향샹시키는 본 발명의 재조합 방법을 사용하여 향상시킬 수 있다.In one embodiment, the expression rate of certain proteins, such as RSV protective F and G antigens, can be increased by substituting natural codons for binding with synthetic cDNAs designed to be efficient translation. It has been reported that codon utilization may be a major factor in the translation rate of mammalian viral proteins [Haas et al., Current Biol. 6: 315-324 (1996)). As a result of examining the codon usage rate of mRNA encoding F and G proteins of RSV, which is a major protective antigen, the utilization rate is consistent with the low expression rate. Thus, the codon utilization can be improved using the recombinant method of the present invention which enhances the expression of the selected gene.

다른 실시태양에서는, 선택된 바이러스 유전자의 번역 개시 부위 주변의 서열(바람직하게는 -3 위치의 뉴클레오타이드 포함)은 단독으로 또는 상부 개시 코돈의 도입과 함께 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스의 유전자 발현율이 (번역을 + 조절하거나 - 조절함으로써) 조절되도록 변형한다.In another embodiment, the sequence around the translational initiation site of the selected viral gene (preferably with the nucleotide at the -3 position) is the gene expression rate of the recombinant virus that is incorporated alone or with the introduction of the upper initiation codon (translation By adjusting + or-adjusting).

또다른 실시태양에서는, 어테뉴에이티드된 RSV 유전자 발현은 바이러스의 선택된 유전자의 전사 GS 시그날을 변형시킴으로써 조절할 수 있다. 다른 실시태양 에서는, NS2의 GS 시그날은 특정 돌연변이(예: 하기 404(M2) 돌연변이)를 포함하도록 변형하여 바이러스 복제에 ts 제한을 부가한다. 또한 추가의 어테뉴에이티드된 RSV 클론은 전사 GE 시그날에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, N 유전자의 GE 시그날을 NS1 및 NS2 유전자의 GE 시그날로 치환하거나 돌연변이시킨 RSV 클론을 만들 수 있고, 그 결과 RNA의 검정율은 저하되고 하류 유전자로부터의 단백질의 발현율은 증가된다. 이렇게 하여 제조된 재조합 바이러스는 성장 속도가 증가하고 플레이크 크기도 커진다. In another embodiment, attenuated RSV gene expression can be regulated by modifying the transcriptional GS signal of a selected gene of the virus. In other embodiments, the GS signal of NS2 is modified to include a specific mutation (eg, the following 404 (M2) mutation) to add ts restriction to viral replication. Further attenuated RSV clones also include a modification to the transcriptional GE signal. For example, an RSV clone can be made in which the GE signal of the N gene is substituted or mutated with the GE signals of the NS1 and NS2 genes, resulting in a lower assay rate of RNA and an increased expression rate of the protein from the downstream gene. The recombinant virus thus produced increases the growth rate and increases the flake size.

다른 실시예에 의하면, 어테뉴에이티드된 재조합 RSV의 G 단백질의 특정 발현은 G mRNA의 변형에 의해 증가된다. G 단백질은 막으로 둘러싸이고 분비된 형태고 발현되는데, 후자는 G 번역 오픈 리딩 프레임 내의 개시 부위의 번역 개시에 의해 발현된 것이다. 분비된 형태는 발현된 G 단백질의 절반 이상을 차지한다. 내부 개시 부위의 제거(상부 개시 부위의 서열 변경과 함께 일어날 수도 있고 단독으로 일어날 수도 있음)에 의해 G 단백질 발현이 바람직한 방향으로 변화된다. G의 분비된 형태의 제거에 의해 숙주의 면역 반응의 수준이 향상되는데, 이는 용해성 G가 중화력을 지닌 항체를 속이는 "미끼"로서 역할하기 때문인 것으로 여겨진다. 또한, 용해성 G 단백질은 Th2- 편중된 반응의 촉진을 선호하기 때문에 면역병리성 증가 현상과 관련이 있다.In another embodiment, the specific expression of the G protein of the synthesized recombinant RSV is increased by modification of the G mRNA. The G protein is expressed in a membrane-enclosed and secreted form, the latter being expressed by the onset of translation of the initiation site within the G translation open reading frame. The secreted form makes up more than half of the expressed G protein. Removal of the internal initiation site (which may occur with or without sequence changes in the upper initiation site) alters G protein expression in the desired direction. The elimination of the secreted form of G improves the level of the host's immune response because it is believed that soluble G acts as a "bait" to deceive neutralizing antibodies. In addition, soluble G proteins are associated with increased immunopathology because they favor the promotion of Th2-biased responses.

다른 실시태양에 의하면, 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스 유전자 발현율은 전사율로 변형된다. 일면으로는, RSV 유전자 맵 내의 선택된 유전자의 위치는 프로모터와 가까운 위치 또는 먼 위치로 변경될 수 있는데, 이 경우 유전자는 각각 더 또는 덜 효율적으로 발현된다. 이러한 일면에 의하면, 특정 유전자의 발현 조절은 야생형의 발현율에 비하여 2배, 더 전형적으로는 4배, 많게는 10배 이상 감소 또는 증가한다. 한 실시태양에 의하면, RSV의 NS2 유전자(RSV 유전자 맵 중 두번째)는 SH 유전자로 치환되고 그 결과 예상된 NS2 발현 감소가 일어난다. 위치 변경으로 인한 선택된 RSV 유전자의 발현 증가는 10배 이상 달성될 수 있으나, 가끔은 상호간에 위치적으로 치환된 유전가의 경우 발현율 감소가 나타나기도 한다.In another embodiment, the attenuated recombinant viral gene expression rate is modified to transcription rate. In one aspect, the position of a selected gene in the RSV gene map can be changed to a position near or far from the promoter, where the gene is expressed more or less efficiently, respectively. According to this aspect, the regulation of expression of a particular gene is reduced or increased by 2 times, more typically 4 times, more than 10 times compared to the expression rate of wild type. In one embodiment, the NS2 gene (second in the RSV gene map) of RSV is replaced with the SH gene resulting in the expected decrease in NS2 expression. Increases in expression of selected RSV genes due to repositioning can be achieved by more than 10-fold, but sometimes expression rates decrease in the case of genetically substituted positions.

다른 실시태양에 의하면, 바이러스 유전자는 단독으로 또는 함께 재조합 바이러스 유전자 맵 내에서 프로모터와 가까운 위치 또는 먼 위치로 위치 변화를 하여 각각 유전자 발현율이 더 높아지거나 더 낮아질 수 있다. 이들 및 기타 다른 위치 변화는 어테뉴에이티드된 표현형질을 갖는 신규 클론을 만든다. 이는 예를 들면 RNA 복제에 수반된 선택된 바이러스 단백질의 발현이 감소된 것으로부터 기인된다.In other embodiments, viral genes, alone or in combination, may be shifted to positions near or far from the promoter within the recombinant viral gene map, resulting in higher or lower gene expression rates, respectively. These and other positional changes result in novel clones with the associated phenotype. This is due to, for example, reduced expression of selected viral proteins involved in RNA replication.

본 발명의 다른 일면에 의하면, 바이러스 유전자(예: RSV의 NS2 유전자)를 유전자나 그 단편의 결실없이 번역 단계에서 제거(예: 번역 오픈 리딩 프레임 내에 2개의 탄뎀(tandem) 번역 종결 코돈을 도입)함으로써 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스를 더 변형시킨다. 이는 선택된 유전자가 결실되지는 않고 번역 단계에서 사일런트 상태로 유지된 살아있는 바이러스를 만든다. 이러한 형태의 "녹-아웃" 바이러스는 성장율이 저하되고 플레이크 크기가 작아질 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 추가적인 신규 형태의 어테뉴에이팅 돌연변이(바이러스 성장에 필수적이거나 바이러스 방어성 주요 항원이 아닌 바이러스 유전자의 발현을 제 거한 돌연변이)를 제공한다. 본 명세서에서, 유전자나 그 단편의 결실없이 제조된 "녹-아웃" 바이러스 표현형질은 결실 돌연변이 유발법에 의해서도 제조될 수 있다. 녹-아웃 바이러스의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다[Kretzschmar et al., Virologv 216: 309-316 (1996); Radecke et al., Virology 217: 418-412 (1996); and Kato et al., EMBO J. 16: 178-587 (1987); Schneider et al., Virologv 277: 314-322 (1996)].According to another aspect of the invention, viral genes (e.g., the NS2 gene of RSV) are removed at the translation stage without deletion of the gene or fragments thereof (e.g., two tandem translation termination codons are introduced into the translation open reading frame). Thereby further modifying the recombinant recombinant virus. This creates a live virus in which the selected gene is not deleted and remains silent at the translation stage. This type of "knock-out" virus may have a low growth rate and a smaller flake size. Thus, the methods and compositions of the present invention provide additional novel forms of attenuating mutations (mutations that remove expression of viral genes that are not essential for virus growth or that are not viral protective major antigens). In this specification, "knock-out" viral phenotypes prepared without deletion of genes or fragments thereof can also be produced by deletion mutagenesis. Methods of making knock-out viruses are known in the art [Kretzschmar et al., Virologv 216: 309-316 (1996); Radecke et al., Virology 217: 418-412 (1996); and Kato et al., EMBO J. 16: 178-587 (1987); Schneider et al., Virologv 277: 314-322 (1996).

본 발명의 감염성 바이러스 클론은 본 발명의 방법에 의해 야생형 또는 모 재조합 균주보다 면역원성이 강화되고 방어능이 커지도록 가공될 수 있다. 예를 들면, 이형의 바이러스 균주(예 PIV)로부터 유래된 에피토프는 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 적적하게 뉴클레오타이드 변형을 일으킴으로써 재조합체 클론(예: RSV)에 첨가될 수 있다. 또는, 바이러스는 바람직하거나 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 면역 에피토프를 첨가 또는 제거(아미노산 삽입, 치환 또는 결실 등)하도록 가공될 수 있다.Infectious virus clones of the present invention can be processed by the method of the present invention to enhance immunogenicity and increase defense ability than wild-type or parental recombinant strains. For example, epitopes derived from heterologous virus strains (e.g. PIV) can be added to recombinant clones (e.g., RSV) by causing appropriate nucleotide modifications within the polynucleotide sequence encoding the chimeric genome or antigenome. . Alternatively, the virus can be processed to add or remove an immune epitope associated with a desired or undesirable immune response (amino acid insertion, substitution or deletion, etc.).

본 발명의 방법에 의하면, 추가의 유전자 또는 그 단편은 수용체 게놈 또는 안티게놈 내로 또는 가까이에 삽입될 수 있다. 이들 유전자는 수용체 유전자와 함게 공통적으로 조절되거나 독립된 전사 시그날 세트의 조절을 받을 수 있다. 관심의 대상이 되는 유전자에는 시토킨(예: IL-2 내지 IL5(특히, IL2), IL-6 및 IL-12 등), 감마-인터페론 및 T-헬퍼 세포 에피토프가 풍부한 단백질을 코딩하는 것들이 포함된다. 이들 추가의 단백질들은 독립된 형태로 발현되거나 (예: SH로부터의) 키메라 형태로 발현된다. 이는 바이러스에 대한 면역 반응을 정량적 및 정성적으 로 변형시키고 개선시킨다.According to the method of the invention, additional genes or fragments thereof can be inserted into or near the receptor genome or antigenome. These genes may be regulated by a set of transcriptional signals that are commonly regulated or independent with the receptor genes. Genes of interest include those encoding proteins rich in cytokines (eg, IL-2 to IL5 (especially IL2), IL-6 and IL-12), gamma-interferon and T-helper cell epitopes. do. These additional proteins are expressed in isolated form or in chimeric form (eg from SH). This modifies and improves the immune response to the virus quantitatively and qualitatively.

본 발명의 실시태양에 의하면, 외래 유전자 또는 유전자 단편을 재조합 바이러스 게놈 내로 삽입하면, 비코딩 뉴클레오타이드 서열의 경우, 게놈 크기가 증가하고 그 결과 추가의 바람직한 표현형질이 발생한다. 게놈 길이가 길어지면 부분적으로는 삽입체의 길이에 따라 그 바이러스의 어테뉴에이션이 생기게 된다. 또한, 이형의 공급원으로부터 특정 단백질(예: 시토킨)을 재조합 어테뉴에이티드된 바이러스 내에서 발현하면 단백질의 작용으로 인해 바이러스의 어테뉴에이션이 생기게 된다. 이는 우두 바이러스 내에서 발현된 IL-2에 관한 문헌을 참조하라: Flexner et al., Nature 33 :-259-62 (1987). 또한 이는 감마 인테페론에 대해서도 마찬가지로 믿어진다.In accordance with an embodiment of the present invention, insertion of a foreign gene or gene fragment into the recombinant viral genome results in an increase in genome size for non-coding nucleotide sequences, resulting in additional desirable phenotypes. Longer genome lengths result in attenuation of the virus, in part depending on the length of the insert. In addition, expression of certain proteins (eg, cytokines) from heterologous sources in recombinant attenuated viruses results in viral attenuation due to the action of the proteins. See the literature on IL-2 expressed in vaccinia virus: Flexner et al., Nature 33: -259-62 (1987). It is also believed for gamma inteferon as well.

본 발명의 재조합 바이러스 내에서 전체 바이러스 유전자 또는 단편의 변형을 일으키는 결실, 삽입, 치환 및 기타 돌연변이는 매우 안정한 백신 후보를 제공한다. 특히 면역억제 개체의 경우 이는 매우 중요하다. 이들 변형들 대다수는 백신 균주의 어테뉴에이션을 일으킴에 반해, 다른 것들은 다른 형태의 바람직한 표현형질을 특정한다. 예를 들면, 특정 바이러스 유전자는 숙주 면역성을 특이적으로 방해하는 단백질을 코딩하는 것으로 알려져 있다[EMBO. J. 16: 578-87 (1997)]. 재조합 백신 바이러스 내에 존재하는 그러한 유전자를 제거하면 병독성 및 발병을 감소시키고 면역원성을 향상시킬 것으로 기대된다. Deletions, insertions, substitutions and other mutations that cause modification of the entire viral gene or fragment within the recombinant virus of the present invention provide very stable vaccine candidates. This is particularly important for immunosuppressive individuals. Many of these modifications result in the attenuation of vaccine strains, while others specify other forms of preferred phenotypes. For example, certain viral genes are known to encode proteins that specifically interfere with host immunity [EMBO. J. 16: 578-87 (1997). Elimination of such genes present in recombinant vaccine viruses is expected to reduce virulence and onset and improve immunogenicity.

본 발명의 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스에 대한 추가의 돌연변이에는 숙주 범위 제한성 및 기타 백신으로 사용하는 데에 유용한 바람직한 표현형질을 부 여하는 이형의 유전자 또는 cis 요소들의 도입이 포함된다. 본 발명의 실시태양에 의하면, 하기 문헌에는 소 RSV의 구조와 기능이 잘 알려져 있으므로인간 RSV내로 도입하는 것으로서 B RSV를 선택한다: Pastey et al., J. Gen. Virol. 76: 193-197 (1993); Pastey et al., Virus Res. 29: 195-202 (1993); Zamora et al., J. Gen. Virol. 73: 737-741 (1992) ; Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 74: 2001-2004 (1993); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73: 2441-2444 (1992); Zamora et al., Virus Res. 24: 115-121 (1992)]. 본 발명의 실시태양에 의하면, 키메릭 RSV 내에 도입할 돌연변이는 조직 배양에 적응된 비병원성 쥐 폐렴 바이러스(G 단백질의 세포질 꼬리가 결핍됨)를 따라 모델링된다[Randhawa et al., Virology 207: 240-245 (1995)]. 따라서, 본 발명의 일면에 의하면, 1 이상의 인간 RSV 당단백질, F, G, SH의 세포질 및/또는 막간 도메인들은 이형 대응체 서열(예: 쥐 폐렴 바이러스의 F, G, SH 단백질의 세포질 또는 막간 도메인으로부터 유래한 서열)을 사용하여 어테뉴에이티드된 재조합 RSV 내에서 첨가, 결실, 변형 또는 치환되어 바람직한 어테뉴에이션을 형성한다. 다른 실시예에 의하면, F 단백질의 절단 부위 또는 그 근저에 있는 뉴클레오타이드 서열 또는 G 단백질의 추정 부착 도메인을 점 돌연변이, 부위 특이적 변형 또는 전체 유전자 또는 그 단편이 수반되는 변화에 의하여 변형시킴으로써 조직 배양시의 바이러스 성장 및/또는 감염 및 발병성에 대한 신규한 효과를 일으킨다.Further mutations to the attenuated recombinant virus of the present invention include the introduction of heterologous genes or cis elements conferring host range restriction and desirable phenotypes useful for use with other vaccines. In accordance with an embodiment of the present invention, B RSV is selected for introduction into human RSV because the structure and function of bovine RSV is well known in the following literature: Pastey et al., J. Gen. Virol. 76: 193-197 (1993); Pastey et al., Virus Res. 29: 195-202 (1993); Zamora et al., J. Gen. Virol. 73: 737-741 (1992); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 74: 2001-2004 (1993); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73: 2441-2444 (1992); Zamora et al., Virus Res. 24: 115-121 (1992). In accordance with an embodiment of the present invention, the mutations to be introduced into the chimeric RSV are modeled following nonpathogenic murine pneumonia virus (lacking the G protein's cytoplasmic tail) adapted to tissue culture [Randhawa et al., Virology 207: 240-. 245 (1995). Thus, according to one aspect of the invention, the cytoplasm and / or transmembrane domains of one or more human RSV glycoproteins, F, G, SH may be heterologous counterpart sequences (e.g., cytoplasmic or transmembrane of F, G, SH proteins of murine pneumonia virus). Sequences derived from the domain) are used to add, delete, modify, or substitute in the synthesized recombinant RSV to form the desired attenuation. In another embodiment, tissue culture by modifying the nucleotide sequence or putative attachment domain of the G protein at or near the cleavage site of the F protein by point mutations, site specific modifications or changes involving the entire gene or fragment thereof Cause new effects on viral growth and / or infection and pathogenicity.

재조합 백신 바이러스에 대한 상기한 변형 이외에도, 바이러스 클론의 다른 또는 추가의 변형이 가능한데, 여러 유전자간 영역 또는 다른 영역에 있는 독특한 제한 부위의 삽입과 같이 조작을 용이하게 하는 변형들이다. 번역되지 않은 유전자 서열을 제거하여 외래 서열의 삽입이 쉽도록 할 수 있다.In addition to the modifications described above for recombinant vaccine viruses, other or additional modifications of the virus clones are possible, such as modifications that facilitate manipulation, such as insertion of unique restriction sites in several intergenic regions or other regions. Untranslated gene sequences can be removed to facilitate insertion of foreign sequences.

본 발명의 다른 일면에 의하면, 단리된 어테뉴에이티드된 감염성 바이러스를 제조하기 위한 조성물(예: 이형의 바이러스 내에서 확인된 돌연변이를 함유하는 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 게놈을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 벡터들)이 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 감염성 바이러스 서브 바이러스 입자들을 재조합 게놈 또는 안티게놈 및 선택된 바이러스 단백질(예: N, P, L, 및 RSV의 경우 RNA 폴리머라제 신장 요소 등)로부터 만들 수 있다. 또한 본 발명의 조성물과 방법들은 상기의 구조 및 표현형질 변화를 재조합 바이러스에 도입하여 감염성 어테뉴에이티드된 백신 바이러스를 제공하는 것을 포함한다.According to another aspect of the invention, an isolated polynucleotide and vector comprising a recombinant negative strand RNA viral genome containing a mutation identified in a heterologous virus, such as a composition for producing an isolated attenuated infectious virus Are provided. Using these compositions and methods, infectious viral subviral particles can be made from recombinant genomes or antigenomes and selected viral proteins (eg, RNA polymerase elongation elements, for N, P, L, and RSV, etc.). The compositions and methods of the present invention also include introducing such structural and phenotypic changes into recombinant viruses to provide infectious attenuated vaccine viruses.

상기 정의한 돌연변이들을 감염성 재조합 바이러스에 도입하는 것은 본 명세서에 인용된 많은 문헌들에 기재된 방법들에 의한다. "감염성 클론"이란 합성되었건 천연의 것이건 불문하고 cDNA 또는 그 산물을 의미하고 이는 감염성 바이러스 또는 서브 바이러스 입자르 ㄹ생산하기 위한 템플레이트로서 작용할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA로 전사될 수 있다. 따라서, 상기 정의된 돌연변이는 통상의 기법(예: 부위 특이적 돌연변이유발법)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA로 도입될 수 있다. 안티게놈 또는 게놈 cDNA 서브 단편을 사용하여 상기한 완전 안티게놈 또는 게놈 cDNA를 조합하는 것은 각 영역을 독립적으로 조작할 수 있고 따라서 완전 cDNA로 쉽게 조합할 수 있다는 장점을 제공한다. 즉, 완전 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 그의 서브 단편은 올리고뉴클레오타이드 특이적 돌연변이 유발을 위한 템플레이트로 사용할 수 있다. 이는 바이오라드 래버로토리즈(캘리포니아주 리치몬드 소재)의 상품명 무타-진 키트 등을 사용하거나 이중 스트랜드 플라스미드를 직접 템플레이트로 하여 스트라타진(라졸라 소재)의 카멜레온 돌연변이유발 키트 등을 사용하거나 관심의 대상인 돌연변이를 포함한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 템플레이트를 사용하는 PCR 반응을 사용하여 단일 스트랜드 파지미드 형태의 중간체를 통해 가능하다. 돌연변이된 서브 단편을 조합하여 오나전 게놈 또는 안티게놈 cDNA를 만들 수 있다. 그 밖의 돌연변이 유발법들은 당업계에 잘 알려져 있으므로 게놈 또는 안티게놈 cDNA 내에 돌연변이를 만드는 데에 쉽게 사용할 수 있다. 돌연변이는 단일 뉴클레오타이드 치환부터 1 이상의 유전자 또는 게놈 영역을 포함하는 대형 cDNA 단편의 치환까지 다양한 것들이 있다.Introduction of the above defined mutations into an infectious recombinant virus is by the methods described in many of the documents cited herein. "Infectious clone" means a cDNA or a product, whether synthesized or natural, which can be transcribed into genomic or antigenomic RNA, which can act as a template for producing infectious virus or subviral particles. Thus, the mutations defined above can be introduced into the genome or antigenome's cDNA by conventional techniques (eg site specific mutagenesis). Combining the above-described complete antigenome or genomic cDNA using an antigenome or genomic cDNA subfragment offers the advantage that each region can be manipulated independently and thus easily combined into a complete cDNA. That is, the complete antigenome or genomic cDNA, or subfragments thereof, can be used as a template for oligonucleotide specific mutagenesis. Mutations of interest include using the Muta-Gin kit from Biorad Laboratories (Richmond, Calif.), Or using the Strandazine (Lazola) chameleon mutagenesis kit, using a double strand plasmid as a template. It is possible through an intermediate in the form of a single strand phagemid using a PCR reaction using an oligonucleotide primer or template. The mutated subfractions can be combined to make an onna genome or an antigenome cDNA. Other mutagenesis methods are well known in the art and can be readily used to make mutations in the genome or antigenome cDNA. Mutations can range from single nucleotide substitutions to substitution of large cDNA fragments comprising one or more gene or genomic regions.

RSV 게놈 또는 안티게놈의 일부분을 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U 내로 클로닝한 후 CJ236 세포(라이프 테크놀로지스)들을 형질전환한다. 파지미드의 제조는 제조자가 추천한 바에 따른다. 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이 유발을 위해 게놈 또는 안티게놈의 원하는 위치에 변형된 뉴클레오타이드를 도입함으로써 만든다. 유전적으로 변형된 게놈 또는 안티게놈 단편을 함유하는 플라스미드를 증폭시키고 돌연변이된 부분들을 다시 전장 게놈 또는 안티게놈 클론 내로 재도입한다.The cDNAs encoding portions of the RSV genome or antigenome are cloned into plasmid pTZ18U and then transformed to CJ236 cells (Life Technologies). Preparation of the phagemid is according to the manufacturer's recommendations. Oligonucleotides are made by introducing modified nucleotides at the desired location in the genome or antigenome for mutagenesis. Plasmids containing genetically modified genomes or antigenome fragments are amplified and the mutated portions are reintroduced back into the full length genome or antigenome clones.

본 발명은 또한 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드(1 이상의 cDNA 등)로부터 얻은 이형의 바이러스 내에서 확인된 돌연변이를 함유하는 어테뉴에이티드된 감염성 재조합 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 대상 바이러스 게놈 또는 안 티게놈을 코딩하는 cDNA를 제조하여 필수 바이러스 단백질과 생체내에서 공발현하여 감염성 바이러스를 제조한다. "안티게놈"이란 자손 바이러스 게놈의 합성을 위한 템플레이트로서 역할하는 단리된 (+) 센스 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 바람직하게는 (+) 센스 버젼의 게놈의 합성을 위한 템플레이트인 cDNA는 전사, 복제성 뉴클레오캡시드의 생산을 용이하게 하는 단백질을 코딩하는 상보 서열의 (+) 센스 전사체와 하이브리드될 가능성을 최소화하도록 제조된다. 본 발명의 목적을 위해, 재조합 바이러스의 게놈 또는 안티게놈은 바이러스 또는 서브 바이러스 입자가 감염성을 갖는데 필요한 유전자 또는 그 일부분을 포함할 필요가 있다. 또한, 유전자 또는 그 일부는 폴리뉴클레오타이드 분자를 2 개 이상에 의해 제공될 수 있다. 즉, 별개의 뉴클레오타이드 분자로부터 상보화됨으로써 제조될 수 있다.The present invention also provides a method for producing an integrated infectious recombinant virus containing mutations identified in heterologous viruses obtained from one or more isolated polynucleotides (such as one or more cDNAs). Infectious viruses are prepared by preparing cDNA encoding the viral genome or antigenome of interest and co-expressing them in vivo with essential viral proteins. "Antigenome" refers to an isolated (+) sense polynucleotide molecule that serves as a template for the synthesis of the progeny virus genome. Preferably, the cDNA template for the synthesis of the positive sense version of the genome minimizes the possibility of hybridization with the positive sense transcript of the complementary sequence encoding a protein that facilitates the production of transcriptional, replicable nucleocapsids. It is made to. For the purposes of the present invention, the genome or antigenome of the recombinant virus needs to contain the gene or portion thereof necessary for the virus or subviral particle to be infectious. In addition, the gene or part thereof may be provided by two or more polynucleotide molecules. That is, they can be prepared by complementation from separate nucleotide molecules.

재조합체란 바이러스 또는 그로부터 만들어진 서브 바이러스로부터 파생되거나 재조합체 발현 시스템으로부터 직접 또는 간접적으로 유도된 완전 바이러스 또는 바이러스류 서브 바이러스 입자를 말한다. 재조합체 발현 시스템은 바이러스 유전자 발현에 있어서 조절 역할을 갖는 유전적 요소를 포함하는 재조합 발현 벡터를 사용한다. 즉, 프로모터, 구조 또는 코딩 서열(이것은 바이러스 RNA로 전사됨), 적절한 전사 개시 및 종료 서열을 포함한다.Recombinant refers to a complete virus or viral subviral particle derived from a virus or a subvirus made therefrom or derived directly or indirectly from a recombinant expression system. Recombinant expression systems use recombinant expression vectors that contain genetic elements that have regulatory roles in viral gene expression. That is, a promoter, structure or coding sequence, which is transcribed into viral RNA, and appropriate transcription initiation and termination sequences.

cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 바이러스를 제조하기 위해, 게놈 또는 안티게놈을 공지의 방법에 따라 발현시켜 (i) RNA 복제가 가능한 뉴클레오캡시드를 제조하고 (ii) 자손 뉴클레오캡시드가 RNA 복제 및 전사 모두에 적합하도록 만든다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 단백질을 제조하고 생산성 감염을 개시한다. 또는 생산성 감염을 위해 필수적인 추가의 바이러스 단백질은 공발현에 의해 공급될 수 있다.To prepare infectious viruses from cDNA expressing genomes or antigenomes, the genomes or antigenomes are expressed according to known methods to (i) produce nucleocapsids capable of RNA replication and (ii) progeny nucleocapsids to perform RNA replication and Make it suitable for both warriors. Transcription by genomic nucleocapsids produces other proteins and initiates productive infections. Or additional viral proteins essential for a productive infection can be supplied by coexpression.

본 발명의 바이러스 안티게놈은, 예를 들면 클로닝된 cDNA 단편을 조립하고, 바이러스 mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사 카피의 PCR에 의해 완전 안티게놈을 조립한다[미국특허 4,683,195; 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990)]. 예를 들어, 안티게놈 또는 그 일부를 포함하는 cDNA들을 적절한 발현 벡터(플라스미드, 코스미드, 파지, DNA 바이러스 벡터 등)내에 조립한다. 벡터는 돌연변이 유발법 및/또는 조립이 용이해지도록 설계된 독특한 제한 부위를 포함하는 합성 폴리링커의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 경우(RSV 등)에 따라서는, 특정 벡터(pBR322)를 사용하면 그렇지 않을 경우 뉴클레오타이드 결실이나 삽입이 유지될 수 있는 바이러스 서열을 안정화시킨다. 마찬가지로, 플라스미드의 증식은 특정 박테리아 균주(예: DH10B)를 선택하여 그렇지 않으면 (예: RSV의 4499 뉴클레오타이드 근처에서) 생길 수 있는 인위적인 복제 및 삽입을 방지함으로써 용이해진다.The viral antigenome of the present invention assembles a complete antigenome, for example by assembling a cloned cDNA fragment and by PCR of a reverse transcription copy of viral mRNA or genomic RNA [US Pat. No. 4,683,195; 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego (1990). For example, cDNAs containing the antigenome or parts thereof are assembled into appropriate expression vectors (plasmids, cosmids, phages, DNA viral vectors, etc.). Vectors can be modified by insertion of synthetic polylinkers comprising unique restriction sites designed to facilitate mutagenesis and / or assembly. In some cases (RSV, etc.), the use of a particular vector (pBR322) stabilizes viral sequences that would otherwise maintain nucleotide deletions or insertions. Likewise, propagation of plasmids is facilitated by selecting specific bacterial strains (eg DH10B) to prevent artificial replication and insertion that may otherwise occur (eg near the 4499 nucleotides of RSV).

다른 실시태양에 의하면, 전사, 복제 바이러스 뉴클레오캡시드를 만드는데에 필수적인 단백질을 코딩하는 서열의 보충은 1 이상의의 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 이러한 헬퍼 바이러스는 야생형일 수도 있고 돌연변이주일 수도 있다. 바람직하게는 cDNA에 의해 코딩되는 바이러스와 표현형질적으로 구별될 수 있다. 예를 들어, cDNA에 의해 코딩되는 바이러스가 아니라 헬퍼 바이러스와 면역학적으로 반응하는 모노클로날 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 중성화 항 체일 수 있다. 일부 실시예에 의하면, 항체를 친화성 크로마토그래피에 사용하여 재조합 바이러스로부터 헬퍼 바이러스를 분리해 내고 있다. 이러한 항체의 조달을 돕기 위해, 돌연변이를 cDNA에 도입하여 헬퍼 바이러스(예: RSV HN 또는 F 당단백질 유전자)로부터 항원 다양성이 제공되도록 할 수 있다.In another embodiment, supplementation of a sequence encoding a protein necessary to make a transcriptional, replication viral nucleocapsid is provided by one or more helper viruses. Such helper viruses may be wild type or mutant. Preferably it can be phenotypically distinguished from the virus encoded by the cDNA. For example, it is desirable to provide a monoclonal antibody that immunologically reacts with a helper virus but not the virus encoded by the cDNA. Such antibodies may be neutralizing antibodies. In some embodiments, the antibody is used for affinity chromatography to separate the helper virus from the recombinant virus. To aid in the procurement of such antibodies, mutations can be introduced into the cDNA so that antigenic diversity is provided from helper viruses (eg, RSV HN or F glycoprotein genes).

바이러스 게놈 또는 안티게놈 내에 다양한 뉴클레오타이드 삽입 및 결실을 일으켜 변형된 어테뉴에이티드된 바이러스 클론을 만들 수 있다. 파라믹소바이러스 및 모르빌리바이러스 속의 멤버들은 전형적으로 "6 원칙"을 따른다. 즉, 게놈(미니게놈)들은 뉴클레오타이드 길이가 6의 배수인 경우에만 효율적으로 복제된다(캡싱된 N 단백질에 대하여 정확하게 뉴클레오타이드 잔기가 스페이싱되기 위한 요건으로 생각됨).A variety of nucleotide insertions and deletions in the viral genome or antigenome can result in modified attenuated viral clones. Members of the genus paramyxovirus and morbilivirus typically follow the "six principles". In other words, genomes (minigenomes) replicate efficiently only if the nucleotide length is a multiple of six (thought to be a requirement for precisely nucleotide residues to be spaced for the captured N protein).

이형의 바이러스 내에서 확인된 돌연변이를 함유하는 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 코딩하는 cDNA를 제작하는 다른 방법에는 1 또는 2 조각 정도로 서브뉴잇 cDNA 구성 요소들의 수를 줄이는 역전사 PCR 방법이 포함된다[Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994)]. 다른 실시예에 의하면, 다른 프로모터(T3, SP6 등) 또는 다른 리보자임(헤파티티스 델타 바이러스의 것 등)이 사용될 수 있다. 다른 DNA 벡터들(예: 코스미드)은 크기가 비교적 큰 게놈 또는 안티게놈을 보다 잘 수용하는 증식에 사용될 수 있다.Other methods of constructing cDNAs encoding recombinant negative strand RNA viruses containing mutations identified in heterologous viruses include reverse transcription PCR methods that reduce the number of subnewit cDNA components by one or two fragments [Cheng et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994). In other embodiments, other promoters (T3, SP6, etc.) or other ribozymes (such as those of the hepatitis delta virus) can be used. Other DNA vectors (e.g. cosmids) can be used for propagation to better accommodate larger genomes or antigenomes.

버아로수 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드(예: cDNA)와 바이러스 필수 단백질을 각각 또는 함께 형질감염, 전기투과, 기계적 삽입, 형질도입 등의 방법으로 바이러스 감염을 유지할 수 있는 세포(예: HEp-2, FRhL-DBS2, MRC, Vero 세포 등)내에 삽입한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열의 형질 감염은 칼슘 포스페이트를 사용하는 형질 감염법[Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham and Van der Eb, Virolosv 52: 456 (1973)], 전기투과법[Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845 (1982)], DEAE-덱스트란을 사용한 형질감염법[Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)], 양이온 지질을 사용한 형질감염법[Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79 (1993)) or a commercially available transfection regent, e. g., LipofectACE (Life Technologies)]에 의하여 배양 세포 내에 도입할 수 있다.Isolated polynucleotides (such as cDNAs) and viral essential proteins encoding the Berarosus genome or antigenome, respectively or together, which can sustain viral infection by transfection, electrotransmission, mechanical insertion, transduction, etc. Eg HEp-2, FRhL-DBS2, MRC, Vero cells, etc.). Transfection of isolated polynucleotide sequences is described by transfection using calcium phosphate [Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham and Van der Eb, Virolosv 52: 456 (1973)], electropermeation [Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845 (1982)], transfection using DEAE-dextran [Ausubel et al. ., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)], transfection using cationic lipids [Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79 (1993) ) or a commercially available transfection regent, e. g., LipofectACE (Life Technologies)].

게놈 또는 안티게놈, 기타 다양한 이들의 조합을 코딩하는 것과 동일하거나 별개의 것일 수 있는 1 이상의 발현 벡터에 의해 바이러스 단백질을 코딩한다. 필수 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터 또는 그 자체 벡터에 의해 코딩되는 추가의 단백질을 포함한다. 게놈 또는 안티게놈, 형질감염된 플라스미드로부터 유래된 단백질의 발현은 예를 들어 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터의 조절을 받고 이어서 T7 RNA 폴리머라제를 위한 발현 시스템(예: T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 우두 바이러스 MVA 돌연변이주 등)으로 감염, 형질감염 또는 형질도입시킴으로 인해 제공되는 cDNA에 의해 달성될 수 있다[Wyatt et al., Virology, 210: 202-205 (1995)]. 바이러스 단백질 및/또는 T7 RNA 폴리머라제는 mRNA 또는 단백질을 형질 도입시키거나 형질전환된 포유류 세포로부터 제공될 수 있다.The viral protein is encoded by one or more expression vectors, which may be the same or separate from that encoding the genome or antigenome, or a variety of other combinations thereof. Vector encoding an essential viral protein or additional protein encoded by the vector itself. Expression of proteins derived from genomes or antigenomes, transfected plasmids is regulated, for example, by promoters for T7 RNA polymerase, and then vaccinia virus expressing an expression system for T7 RNA polymerase (e.g., expressing T7 RNA polymerase). MVA mutants, etc.), which can be achieved by cDNA provided by infection, transfection or transduction (Wyatt et al., Virology, 210: 202-205 (1995)). Viral protein and / or T7 RNA polymerase may be provided from a mammalian cell that has transfected or transformed an mRNA or protein.

게놈 또는 안티게놈의 합성은 시험관 내(무세포)에서 전사-번역 반응, 이어 서 세포 내로의 형질감염에 의해 수행할 수 있다. 또는, 게놈 또는 안티게놈 RNA는 시험관내에서 합성하여 바이러스 단백질을 발현하는 세포 내로 형질 감염시킬 수 있다.Synthesis of the genome or antigenome can be performed by a transcription-translation reaction in vitro (cell-free), followed by transfection into cells. Alternatively, genomic or antigenome RNA can be synthesized in vitro and transfected into cells expressing viral proteins.

본 발명의 후보 백신 바이러스를 선택함에 있어서, 생존 능력, 어테뉴에이션 및 면역원성 기준에 의해 결정된다. 본 발명의 백신에 있어서 가장 요구되는 바이러스는 생존 능력이 유지되고 안정한 어테뉴에이션 표현형질을 가지고, 면역화된 숙주 내에 복제를 일으키고, 야생형 바이러스로부터 연이어 감염됨에 의해 발생하는 심각한 질병에 대한 방어능을 부여하는 데에 충분한 면역 반응을 효과적으로 일으키는 바이러스이다. 본 발명의 바이러스는 생존 능력이 있고 이전의 돌연변이체보다 어테뉴에이션이 더 되어 있을 뿐만 아니라 이전 돌연변이보다 생체 내에서 유전적으로 더 안정적이다. 즉, 여러 차례의 변형에 의해 방어성 면역 반응을 촉진하고 경우에 따라서는 방어능을 확장할 수 있다. 다른 바이러스 균주 또는 서브 그룹에 대한 방어능 또는 즉, 분비성 혈청 임뮤노글로불린, 세포성 면역과 같은 기타 면역원이 다른 것에 의한 방어능도 유도된다.In selecting the candidate vaccine virus of the present invention, it is determined by viability, attenuation and immunogenicity criteria. The most required viruses in the vaccines of the invention have a viable and stable attenuation phenotype, which replicate in immunized hosts and confer protection against serious diseases caused by subsequent infection from wild-type viruses. It is a virus that effectively produces a sufficient immune response. The virus of the present invention is not only viable and more attenuated than the previous mutant, but also genetically more stable in vivo than the previous mutant. In other words, it is possible to promote the protective immune response by several modifications and in some cases to expand the protective ability. The ability to protect against other viral strains or subgroups, or ie other immunogens such as secretory serum immunoglobulins, cellular immunity, is also induced.

이형의 바이러서 내에서 확인된 돌연변이를 함유하는 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 증식시키기 위해, 바이러스 성장이 가능한 여러 가지 세포주를 사용할 수 있다. 백신으로 사용하기 위한 어테뉴에이티드된 바이러스를 증식시키기 위한 세포주로서 바람직한 것에는 DBS-FRhL-2, MRC-5, Vero 세포가 포함된다. RSV 최고 수율은 일반적으로 Vero 세포와 같은 상피 세포주에서 달성된다. 바이러스 접종은 통상 0.001 내지 0.1 이상의 감염 중첩도로 한다. 그리고, 바이러스 복 제가 일어날 수 있는 조건, 예를 들면 온도 30-37℃, 305일간 배양하거나 적절한 역가에 도달하는데 필요한 정도로 배양한다. 바이러스를 세포 배양액으로부터 제거한 후, 당업계에 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 원심 분리법 등을 사용하여 세포 구성 성분으로부터 분리하고, 역시 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 더 정제한다.To propagate recombinant negative stranded RNA viruses containing mutations identified in heterologous viruses, various cell lines capable of viral growth can be used. Preferred cell lines for propagating attenuated viruses for use as vaccines include DBS-FRhL-2, MRC-5, Vero cells. RSV peak yield is generally achieved in epithelial cell lines such as Vero cells. Viral inoculation is usually at an infection overlap of 0.001 to 0.1 or more. Then, incubate conditions for which virus replication can occur, for example, temperature 30-37 ° C., 305 days or to the extent necessary to reach the appropriate titer. After the virus has been removed from the cell culture, it is separated from the cell components using methods well known in the art, such as centrifugation, and the like, and further purified by methods well known in the art.

상기한 바와 같이 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스는 여러가지 잘 알려지고 일반적으로 시험관 내에서 받아들여지는 시험관 및 생체 모델로 테스트하여 적절한 어테뉴에이션, 표현형질 복귀에 대한 내성, 면역원성을 확인할 수 있다. 시험관 분석에서는, 변형된 바이러스(예: 여러 차례 어테뉴에이티드된 생물학적으로 유도된 바이러스 또는 재조합 바이러스)의 바이러스 복제의 온도 감수성, 소형 플레이크 표현형질을 테스트한다. 변형된 바이러스는 바이러스 감염의 동물 모델로도 테스트한다. RSV에 대한 여러 가지 동물 모델은 하기 문헌에 요약 기재되어 있다: Animal Models of Respiratory Syncvtial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991). RSV 감염에 대한 코튼 랫 모델에 관해서는 문헌[미국특허 4,800,078, Prince et al., Virus Res. 3: 193-206 (1985)]에 기재되어 있는데, 인간 및 인간 이외의 영장류에 있어서 어테뉴에이션과 효능이 합리적으로 예측할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 침팬지를 사용한 RSV 감염에 대한 영장류 모델은 인간에 있어서의 어테뉴에이션과 효능을 합리적으로 예측할 수 있게 한다[Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright et al., Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe et al., Vaccine 11: 1395-1404 (1993)]. 광범위한 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대한 기타 모델들이 잘 알려져 있다. 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 어테뉴에이션 및 면역원성의 정도와 관련된 동물 모델로부터 얻은 데이터의 상관성은 일반적으로 받아들여진다. 예를 들면, 감염시킨 코튼 랫 내에서의 RSV 중성화 항체의 치료 효과는 RSV로 감염된 원숭이와 인간의 면역 치료와 관련된 후속 처리와 크게 관련있는 것으로 나타났다. 실제로, 코튼 랫은 RSV 중성화 항체로 한 면역 치료에 대한 감염 원숭이, 침팬지 및 인간의 반응에 대한 합리적으로 믿을만한 실험 대용물으로 여겨진다. 예를 들어, 코튼 랫에서의 치료 효과에 관련된 RSV 중성화 항체의 양(처리된 동물의 혈청 내의 상기 항체 양을 측정한 것임)은 원숭이, 또는 영아나 소아에 대한 값고 같은 범위에 있다. 코튼 랫에서의 치료 효과는 폐에서의 바이러스 역가 감소 보다 100배 컸음에 비해[Prince et al., J Virol. 61: 1851-1854], 원숭이의 경우에는 폐의 바이러스 역가 감소 50배인 것으로 관찰되었다[Hemming et al., J. Infect. Dis. 152: 1083-1087(1985)]. 마지막으로, RSV 세기관지염 또는 폐렴으로 입원한 영아나 소아에 있어서의 치료 효과는 산소화가 크게 증가하였으나 상부 호흡관으로부터 회수가능한 RSV의 양은 크게 줄은 것으로 나타났다[Hemming et al., Antimicrob, Agents Chemother. 31: 1882-1886(1987)]. 따라서, 이들 연구에 의하면, 코튼 랫은 영아 및 소아에 대한 키메릭 및 비키메릭 RSV 백신의 성공여부를 예측할 수 있는 적절한 모델이다. 쥐를 포함한 그밖의 설치류도 마찬가지로 유용한데, 왜냐하면 이들 동물은 RSV 복제가 허용되고 인간의 온도와 비슷한 온도를 가지고 있기 때문이다[Wright et al., J. Infect. Dis. 122: 501-512 (1970), Anderson et al., J. Gen. Virol. 71 (1990)]. 다른 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스들에 대한 모델들도 잘 알려져 있다.As described above, the attenuated recombinant virus can be tested in a variety of well-known and generally accepted in vitro and in vivo models to confirm appropriate attenuation, resistance to phenotypic reversion, and immunogenicity. In vitro assays test the temperature sensitive, small flake phenotype of viral replication of a modified virus (eg, attenuated biologically induced virus or recombinant virus). The modified virus is also tested with an animal model of viral infection. Several animal models for RSV are summarized in the following literature: Animal Models of Respiratory Syncvtial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991). For cotton rat models for RSV infection, see US Pat. No. 4,800,078, Prince et al., Virus Res. 3: 193-206 (1985), it is believed that attenuation and efficacy are reasonably predictable in humans and non-human primates. In addition, primate models for RSV infection using chimpanzees can reasonably predict attenuation and efficacy in humans [Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright et al., Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe et al., Vaccine 11: 1395-1404 (1993). Other models for a wide range of negative strand RNA viruses are well known. Correlation of data from animal models relating to the extent of immunogenicity and the attenuation of recombinant negative strand RNA viruses is generally accepted. For example, the therapeutic effect of RSV neutralizing antibodies in infected cotton rats has been shown to be highly correlated with subsequent treatment associated with immunotherapy in monkeys and humans infected with RSV. Indeed, cotton rats are considered reasonably reliable experimental substitutes for the response of infected monkeys, chimpanzees and humans to immunotherapy with RSV neutralizing antibodies. For example, the amount of RSV neutralizing antibodies involved in the therapeutic effect in cotton rats (as measured for the amount of said antibody in the serum of treated animals) is in the same range as for monkeys, infants, or children. The therapeutic effect in cotton rats was 100 times greater than the virus titer reduction in lungs [Prince et al., J Virol. 61: 1851-1854], a 50-fold reduction in lung virus titer was observed in monkeys [Hemming et al., J. Infect. Dis. 152: 1083-1087 (1985). Finally, treatment effects in infants and children hospitalized with RSV bronchiolitis or pneumonia significantly increased oxygenation, but significantly reduced the amount of RSV recoverable from the upper respiratory tract [Hemming et al., Antimicrob, Agents Chemother. 31: 1882-1886 (1987). Therefore, according to these studies, cotton rats are an appropriate model for predicting the success of chimeric and non-chimeric RSV vaccines for infants and children. Other rodents, including rats, are equally useful because these animals are allowed to replicate RSV and have a temperature similar to that of humans [Wright et al., J. Infect. Dis. 122: 501-512 (1970), Anderson et al., J. Gen. Virol. 71 (1990). Models for other negative strand RNA viruses are also well known.

상기 기재 내용 및 하기 실시예에 따르면, 본 발명은 백신으로 사용가능한 단리된 감염성 어테뉴에이티드 바이러스 조성물도 제공한다. 백신의 한 구성 성분인 어테뉴에이티드 바이러스는 단리되고 통상적으로는 정제된 형태이다. 단리되었다는 것은 감염된 개체의 비강인두(nasopharynx)와 같은 야생형 바이러스의 본래 환경과 다른 RSV를 의미한다. 더 일반적으로는, 세포 배양액 기타 인위적인 매질 내의 한 성분으로서의 어테뉴에이티드된 바이러스를 포함하는 의미이다. 예를 들어, 본 발명의 어테뉴에이티드 RSV는 감염된 세포 배양액 내에서 생산되어 세포 배양액으로부터 분리되고 안정화제가 첨가된다.In accordance with the above description and the following examples, the present invention also provides an isolated infectious attenuated virus composition for use as a vaccine. Attenuated viruses, one component of the vaccine, are isolated and usually in purified form. Isolated means RSV that is different from the native environment of the wild type virus, such as the nasopharynx of the infected individual. More generally, it is meant to include attenuated viruses as a component in cell culture or other artificial media. For example, the attenuated RSV of the present invention is produced in infected cell culture, separated from the cell culture, and stabilizers are added.

본 발명의 백신은 이형의 바이러스 내에서 확인된 돌연변이를 갖는 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 면역 유효량을 활성 성분으로 포함한다. 재조합 백신은 직접 백신 제제로 사용되거나 친액화된다. 친액화된 바이러스는 통상적으로 약 4℃에 보관된다. 사용할 준비가 된 경우, 친액화된 바이러스는 하기하는 바와 같이 안정화 용액(예: 염수 또는 SPG, Mg2+ 및 HEPES를 포함하는 용액(보조제가 있을 수도 있고 없을 수도 있음))내에서 재구성된다. 생물학적으로 유도되거나 재조합 방법으로 변형된 바이러스는 생리적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 사용하여 숙주 내로 도입될 수 있다. 유용한 담체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 포함된다. 이렇게 만들어진 수용액은 사용을 위하여 포장되거나 친액화되는데, 친액화 제제는 투여하기 전 에 멸균수와 혼합될 수 있다. 조성물은 제약학적으로 허용가능한 보조제를 포함할 수 있는데, 이 보조제에는 pH 조절제, 완충제, 강장 조절제, 습윤제(예: 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소윰 클로라이드, 호타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등) 등이 포함된다. 허용 가능한 부형제에는 불완전 프로인트 부형제, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 또는 알룸 등이 포함되는데, 이들은 당업계에 잘 알려져 있는 물질들이다. 바람직한 부형제에는 또 상품명 스티물론 QS-21(매릴랜드주 워체스터 소재 아퀼라 바이오파마슈티칼즈사), 상품명 MPL (3-0-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 매사츄세주주 해밀톤 소재, 리비 임뮤노켐 리서치) 및 IL-12(매릴랜드주 캠브리지 소재, 제네틱스 인스티튜트)도 포함된다.The vaccine of the present invention comprises as an active ingredient an immunologically effective amount of a recombinant negative strand RNA virus having a mutation identified in a heterologous virus. Recombinant vaccines are used as direct vaccine formulations or lyophilised. The lyophilised virus is typically stored at about 4 ° C. When ready for use, lyophilised virus is reconstituted in a stabilizing solution (eg, with or without a brine or a solution comprising SPG, Mg 2+ and HEPES, as described below). Viruses that are biologically derived or modified by recombinant methods can be introduced into the host using physiologically acceptable carriers and / or adjuvants. Useful carriers are well known in the art and include water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine, hyaluronic acid and the like. The aqueous solution thus prepared is packaged or lyophilised for use, which may be mixed with sterile water prior to administration. The composition may comprise a pharmaceutically acceptable adjuvant, which includes pH adjusting agents, buffers, tonicity adjusting agents, wetting agents (e.g. sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolau) Latex, triethanolamine oleate, and the like). Acceptable excipients include incomplete Freud excipients, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, or alum, and the like which are well known in the art. Preferred excipients further include the tradename Stimulon QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Worcester, MD), the trade name MPL (3-0-deacylated monophosphoryl lipid A; Hamilton, Mass., Libby Immunochem Research ) And IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MD).

에어로졸, 드롭릿, 경구, 국부 기타 다른 경로를 통해 어테뉴에이티드된 바이러스 백신 조성물을 사용하여 면역화하면, 숙주의 면역 시스템은 1 예를 들어 RSV F 및/또는 G 당단백질과 같이 1 이상의 바이러스 단백질에 특이적인 항체들을 생산함으로써 백신에 대하여 반응한다. 이러한 백신 접종 결과, 숙주는 대상 바이러스의 감염에 대하여 부분적으로 또는 완전히 면역 반응을 보이거나 이와 관련된 평범하거나 심각한 질병의 발병에 대해 내성을 나타낸다. When immunized with attenuated viral vaccine compositions via aerosol, droplet, oral, topical or other routes, the host's immune system is directed to one or more viral proteins such as, for example, RSV F and / or G glycoproteins. Respond to the vaccine by producing specific antibodies. As a result of this vaccination, the host is partially or fully immune to the infection of the virus of interest and is resistant to the development of a common or severe disease associated with it.

본 발명의 백신은 단일 바이러스 균주 또는 항원성 서브 그룹(예: RSV A 또는 B)에 대하여 또는 여러 균주 또는 서브 그룹에 대하여 면역 반응을 유도하는 어테뉴에이티드된 바이러스를 포함할 수 있다. 키메릭 백신 바이러스는 다중 특이적 면역 반응 또는 여러 균주 또는 서브 그룹에 대하여 다중 특이적 면역 반응을 일으 킬 수 있다. 또는 다른 면역 특성을 가진 키메릭 바이러스는 백신 혼합물과 함께 또는 별도로 투여되어 RSV 하나 또는 여러 RSV 균주 및 서브그룹에 대한 보다 효과적인 방어능을 유도할 수 있다.Vaccines of the invention may comprise attenuated viruses that induce an immune response against a single virus strain or antigenic subgroup (eg RSV A or B) or against several strains or subgroups. Chimeric vaccine viruses can give rise to multi-specific immune responses or multi-specific immune responses against several strains or subgroups. Alternatively, chimeric viruses with other immune properties can be administered together or separately with the vaccine mixture to induce more effective defense against one or several RSV strains and subgroups.

상기 백신이 투여될 수 있는 숙주는 대상 바이러스 또는 그와 밀접한 관련이 있는 바이러스에 감염되기 쉽고 백신 접종된 바이러스의 항원에 대하여 방어성 면역 반응을 일으키는 포유류면 어떤 것이어도 상관없다. 따라서, 적절한 숙주에는 인간, 인간 이외의 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 소, 라가모프(lagamorph), 설치류 등이 포함된다. 즉, 본 발명은 인간 및 척추 동물에 사용하기 위한 백신을 제조하는 방법을 제공한다.The host to which the vaccine can be administered may be any mammal that is susceptible to the subject virus or a virus closely related thereto and that develops a protective immune response against the antigen of the vaccinated virus. Thus, suitable hosts include humans, non-human primates, cattle, horses, pigs, sheep, cattle, lagamorphs, rodents, and the like. That is, the present invention provides a method of making a vaccine for use in humans and vertebrates.

본 발명의 어테뉴에이티드된 재조합 바이러스를 함유하는 백신 조성물은 대상 바이러스에 감염되기 쉬운 환자에게 면역 유효 투여량(대상 바이러스에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화하는 데에 충분한 양)으로 투여될 수 있다. 인간의 경우, 본 발명의 바이러스는, RSV의 경우, 잘 알려져 있는 백신 프로토콜에 따라 투여된다[Wright et al., Infect Immun. 37: 397-400 (1982), Kim et al., Pediatrics 52: 56-63 (1973), Wright et al., J. Pediatr. 88: 931-936 (1976)]. 요약하면, 성인 또는 아동은 면역 유효 투여량의 RSV 백신을 비강내로 투여하는데, 생리적으로 허용가능한 희석제 또는 담체 0.5 ml에 담아 드롭릿으로 투여한다. 이는 비복제 백신으로 비경구 투여하는 것에 비하여 보다 간단하고 안정하다는 장점이 있다. 또한 호흡관 면역능을 국소적으로 촉진하여 RSV에 대한 내성에 관한 중요한 역할을 한다. 이러한 백신 접종 방식은 매우 어린 아이한테서 통상적으로 발 견되는, RSV 특이성 모체 유래 혈청 항체의 면역 억제 효과를 효과적으로 피한다. 또한, RSV 항원의 비경구 투여가 경우에 따라 면역병리적으로 복잡성을 나타낼 수 있음에 반해 생 바이러스가 발견되지 않는다. Vaccine compositions containing the recombinant recombinant virus of the present invention may be administered to a patient susceptible to the subject virus at an immunologically effective dose (a sufficient amount to induce or enhance an immune response against the subject virus). In humans, the virus of the present invention, in the case of RSV, is administered according to well-known vaccine protocols [Wright et al., Infect Immun. 37: 397-400 (1982), Kim et al., Pediatrics 52: 56-63 (1973), Wright et al., J. Pediatr. 88: 931-936 (1976). In summary, adults or children are administered intranasally with an immunologically effective dose of RSV vaccine, which is administered as a droplet in 0.5 ml of a physiologically acceptable diluent or carrier. This has the advantage of being simpler and more stable than parenteral administration with non-replicating vaccines. It also plays an important role in resistance to RSV by locally promoting respiratory immune function. This vaccination mode effectively avoids the immunosuppressive effects of RSV-specific maternally derived serum antibodies commonly found in very young children. In addition, no live virus is found, whereas parenteral administration of RSV antigens can sometimes present an immunopathological complexity.

모든 대상에 있어서, 투여될 바이러스의 정확한 양과 시간, 반복 투여 회수는 환자의 건강 상태와 체중, 투여 방식, 제제의 특성 등을 고려하여 결정된다. 투여량은 통상적으로 환자 1인당 바이러스 수가 약 10³ 내지 약 10⁶ PFU 이상, 더 바람직하게는 10⁴ 내지 10⁵개의 비율이다. 어떤 경우이든, 백신 제제는 면역 반응을 효과적으로 일으키거나 촉진하는데에 충분한 양이어야 한다는 점이다. 이와 관련하여, 환자는 상부 호흡기 질병의 증상이 모니터된다. 침팬지에게 투여하는 경우, 백신 바이러스는 야생형에 비하여 약 10 배 이상, 불완전하게 어테뉴에이티드된 바이러스에 비하여 약 10배 이상 낮게 성장한다(백신 비강인두에서).For all subjects, the exact amount and time of virus to be administered and the number of repeated doses are determined by taking into account the patient's state of health and weight, mode of administration, and the nature of the formulation. Dosages typically range from about 10 ³ to about 10 ⁶ PFU or more, more preferably 10 ⁴ to 10 ⁵ viruses, per patient. In either case, the vaccine formulation should be sufficient to effectively elicit or promote an immune response. In this regard, the patient is monitored for symptoms of upper respiratory disease. When administered to chimpanzees, the vaccine virus grows at least about 10 times lower than wild type and at least about 10 times lower than incompletely attenuated virus (in vaccine nasopharynx).

신생아 및 유아의 경우에는, 충분한 면역성을 일으키기 위해 여러 차례 투여할 필요가 있을 수 있다. RSV 감염의 경우, 야생형 RSV 감염에 대하여 충분한 방어능이 유지하기 위해 태어난지 제1 개월 내에 투여를 시작하여 아동기 동안 계속하여(2달, 6달, 1년, 2년 등) 투여할 필요가 있다. 마찬가지로, 특히 RSV에 감염되기 쉽거나 자주 감염되는 성인의 경우에도 방어성 면역 반응을 유지하기 위해 여러 차례 투여가 필요할 수 있다. 유도된 면역성의 정도는 중성화 분비 혈청 항체의 양, 투여량, 반복 접종 회수를 기준으로 모니터할 수 있다. 다른 수용체 그룹에 대한 투여를 위해 다른 백신 바이러스를 지시할 수 있다. 예를 들어, 시토킨 또는 T 세포 에피토프가 풍부한 추가의 단백질을 발현하는 재조합체는 유아보다는 특히 성인에게 유리하다. 본 발명에 따라 제조된 백신은 다른 서브 그룹 도는 균주의 항체를 발현하는 바이러스와 결합 사용하여 여러 서브 그룹이나 균주에 대하여 보호능을 부여할 수 있다. 또는, 백신 바이러스는 여러 바이러스 균주 또는 서브 그룹(하나의 클론으로 됨)의 방어성 에피토프를 포함할 수도 있다.In newborns and infants, multiple doses may be necessary to produce sufficient immunity. In the case of RSV infection, it is necessary to begin administration within the first month of birth to continue sufficient protection against wild-type RSV infection and continue throughout the childhood (2 months, 6 months, 1 year, 2 years, etc.). Likewise, multiple administrations may be necessary to maintain a protective immune response, especially in adults susceptible to or frequently infected with RSV. The degree of immunity induced can be monitored based on the amount, dose, and number of repeat inoculations of neutralizing secreted serum antibodies. Other vaccine viruses can be directed for administration to other receptor groups. For example, recombinants expressing additional proteins rich in cytokine or T cell epitopes are particularly advantageous for adults rather than infants. Vaccines prepared according to the invention can be used in combination with viruses expressing antibodies of other subgroups or strains to confer protection against several subgroups or strains. Alternatively, the vaccine virus may comprise protective epitopes of several virus strains or subgroups (in one clone).

다른 백신 바이러스를 사용하는 경우 통상적으로는 혼합물 형태로 동시 투여되지만, 별도로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 2 RSV 서브그룹의 F 당단백질들은 아미노산 서열이 약 11% 밖에 차이가 나지 않으므로, 이러한 유사성은 RSV 또는 F 항체로 면역화되고 이형 균주로 챌린징된 동물에서 관찰되는 바와 같이 교차 방어성 면역 반응의 기초가 된다. 따라서, 한 균주로 면역화시키면 동일 또는 다른 서브 그룹의 다른 균주를 방어할 수도 있다. 그러나, 백신에 존재하는 RSV 항원 서브 그룹 A 또는 B의 G 및 F 당단백질들을 갖는 것이 바람직하다.When other vaccine viruses are used, they are usually co-administered in the form of a mixture, but can also be administered separately. For example, since the F glycoproteins of the 2 RSV subgroups differ only by about 11% in amino acid sequence, this similarity is cross-protective as observed in animals immunized with RSV or F antibodies and challenged with heterologous strains. It is the basis of the immune response. Thus, immunization with one strain may protect other strains of the same or different subgroups. However, it is preferred to have G and F glycoproteins of RSV antigen subgroup A or B present in the vaccine.

본 발명의 재조합 백신은 그 투여 후에 환자가 야생형 바이러스에 감염되는 경우 폐렴 및 세기관지염과 같은 심각한 질병에 대한 보호 기능을 하는 면역 반응을 일으킨다. 자연적으로 돌아다니는 바이러스는 여전히 감염을 일으킬 수 있지만, 백신 접종 및 야생형의 후속 감염에 대한 내성이 증가한 결과, 질병의 발병 확률은 크게 저하된다. 백신 접종 후, 숙주는 검출될 수 있을 정도로 혈청과 분비성 항체가 발생하는데, 이들은 생체내 및 시험관내(즉, 생체외)에서 상동형 야생형 바이러스를 무력화(중성화)시킬 수 있다. 많은 경우에 있어서 숙주 항체는 다른, 비백신 서브그룹의 야생형 바이러스도 무력화시킨다. The recombinant vaccines of the present invention produce an immune response that protects against serious diseases such as pneumonia and bronchiolitis when a patient is infected with a wild type virus after its administration. Naturally roaming viruses can still cause infection, but as a result of increased resistance to vaccination and subsequent infection of the wild type, the probability of developing the disease is greatly reduced. After vaccination, the host develops serum and secretory antibodies to detectable levels, which can neutralize (neutralize) homologous wild type virus in vivo and in vitro (ie ex vivo). In many cases, host antibodies also neutralize other, non-vaccine subgroups of wild-type viruses.

본 발명의 바람직한 바이러스는 자연계에 존재하는 야생형에 비하여 생존 능력이 낮다. 키메릭 바이러스는 감염 증상이 대부분의 면역화된 환자에게서 나타나지 않을 정도로 충분히 어테뉴에이티드되어 있다. 일부 경우에 있어서는, 어테뉴에이티드된 바이러스는 백신 접종을 하지 않은 환자에게 보급될 수 있다. 그러나, 백신 접종된 숙주에게서는 심각한 하부 호흡관 감염이 일어나지 않을 정도로 그 생존 능력은 낮다.Preferred viruses of the present invention have lower viability compared to wild type in nature. The chimeric virus is attenuated enough so that symptoms of infection do not appear in most immunized patients. In some cases, the attenuated virus can be spread to patients who have not been vaccinated. However, its viability is low in vaccinated hosts so that severe lower respiratory tract infections do not occur.

본 발명의 백신 바이러스의 어테뉴에이션 정도는 예를 들면 면역 주사된 숙주의 호흡관 내에 존재하는 바이러스의 양을 야생형 또는 후보 백신 균주로서 평가된 다른 어테뉴에이티드된 바이러스의 경우와 비교하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 RSV는 매우 감염되기 쉬운 숙주(예: 침팬지 등)의 상부 호흡관 내의 복제의 제한 정도가 야생형의 복제율에 비하여 더 클 것이다(예를 들어, 약 10 내지 1000배 이하). 또한, 침팬지의 상부 호흡관 내의 어테뉴에이티드된 RSV 백신 균주의 복제율은 (혈청 음성 반응을 보이는 영아에서 불완전하게 어테뉴에이티드된 것을 이미 설명된 바 있는) RSV A2 ts-1 돌연변이체의 것보다 작다. 상부 호흡관의 바이러스 복제와 관련된 리노르히어(rhinorrhea)의 발생을 더 줄이기 위해서는 이상적인 백신 부호 바이러스는 상부 및 하부 호흡관 모두에서 복제율이 제한되어야 한다. 그러나, 본 발명의 어테뉴에이티드된 바이러스는 인간에게 감염성 및 면역원성이 충분하여 백신 접종된 환자에게 방어능을 부여한다. 감염시킨 숙주의 비강인두 내의 RSV 양을 측정하는 방법은 문헌에 잘 알려져 있다. 시료를 비강인두 분비물을 흡입 또는 세척함으로써 얻어 조직 배양을 하여 바이러스를 정량화한다[Belshe et al., J. Med. Virologv 1: 157-162 (1977), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969); Wright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41: 238-247 (1973)]. 바이러스는 침팬지와 같은 숙주 동물의 비강인두 내에서 쉽게 측정할 수 있다. 추가의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 생존 능력을 측정하는 다른 방법들은 당업계에 잘 알려져 있고 용이하게 실시할 수 있다.The degree of attenuation of the vaccine virus of the invention can be assessed, for example, by comparing the amount of virus present in the respiratory tract of an immunoinjected host with that of other attenuated viruses evaluated as wild type or candidate vaccine strains. For example, the RSV of the present invention will have a greater degree of restriction in replication in the upper respiratory tract of highly susceptible hosts (eg, chimpanzees, etc.) compared to the wild type replication rate (eg, about 10-1000 fold or less). . In addition, the replication rate of the attenuated RSV vaccine strain in the chimpanzee's upper respiratory tract is less than that of the RSV A2 ts-1 mutant (which has already been described as incompletely attenuated in infants with serum negative responses). . To further reduce the incidence of rhinorrhea associated with viral replication of the upper respiratory tract, the ideal vaccine code virus should be limited in replication rate in both the upper and lower respiratory tract. However, the attenuated virus of the present invention has sufficient infectivity and immunogenicity in humans to confer protection against vaccinated patients. Methods of measuring the amount of RSV in the nasopharynx of infected hosts are well known in the literature. Samples are obtained by inhalation or washing of nasopharyngeal secretions, followed by tissue culture to quantify the virus [Belshe et al., J. Med. Virologv 1: 157-162 (1977), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969); Wright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41: 238-247 (1973). Viruses can easily be measured in the nasopharynx of host animals such as chimpanzees. Other methods of measuring the viability of additional negative strand RNA viruses are well known in the art and can be readily implemented.

본 발명은 하기 실시예를 통하여 더 상세하게 설명될 것이다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적이지 제한하기 위한 목적이 아니다. 본 발명을 기술하기 위한 목적에서 본 명세서의 모든 문헌과 특허 문헌는 참고로 인용하였다.The invention will be explained in more detail through the following examples. However, the following examples are for the purpose of illustrating the present invention and not for the purpose of limitation. All documents and patent documents herein are incorporated by reference for the purpose of describing the present invention.

<실시예 I>Example I

이형 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 중의 보존 서열 요소에 대한 HPIV3 JS HPIV3 JS for Conservation Sequence Elements in Heterologous Negative Strand RNA Virus cpcp 45 및 RSV 45 and RSV cpcp 530 및 센다이 바이러스에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이의 맵핑Mapping of Attenuation Mutations Identified in 530 and Sendai Virus

본 실시예는 하나의 돌연변이체 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에서 확인된 돌연변이를 모노네가바이랄(Mononegavirales) 목 내의 이형 바이러스 중의 상응하는 보존 아미노산 서열 요소에 쉽게 맵핑할 수 있음을 증명하여 준다. 이들 돌연변이는 1 이상의 이형 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 중에서 보존된 (동일 또는 보존성으로) 부모형 서열과 비교하여 구조적으로 변화되는 것을 특징으로 하고, 부모형 단백질 서열 요소를 공유하는 재조합 바이러스 내에 삽입되기 위한 후보 돌연 변이를 제공하는 것으로 보인다.This example demonstrates that the mutations identified in one mutant negative strand RNA virus can be easily mapped to the corresponding conserved amino acid sequence elements in heterologous viruses in the neck of Mononegavirales. These mutations are characterized by structural changes compared to the parental sequence conserved (either identically or conservatively) among one or more heterologous negative strand RNA viruses, and are candidate mutations for insertion into recombinant viruses sharing parental protein sequence elements. It seems to provide variation.

본 발명의 이러한 양태를 예증하기 위하여, HPIV 돌연변이 균주 JS cp45 내의 공지된 돌연변이 패널을 분석하였다. 이 돌연변이 패널은 부모형 잔기/서열 위치 Tyr₉₄₂, Leu₉₉₂ 및(또는) Thr₁₅₅₈에서 폴리머라제 L 유전자 중에서 ts 어테뉴에이션 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 구체적으로는, JS cp45 돌연변이 L 단백질은 부모형 Tyr₉₄₂가 His로 대체, Leu₉₉₂가 Phe로 대체, 및(또는) Thr₁₅₅₈이 Ile로 대체된 어테뉴에이션 돌연변이를 나타낸다 (본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 특허출원 제08/083,793호 및 상응하는 국제 출원 WO 제98/53078호 참조). 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 이러한 돌연변이는 부모형 서열에 대하여 맵핑하여 변화를 확인하였을 뿐만 아니라, PIV 재조합체 (r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558 및 r942/992/1558)에 단독으로 및 조합하여 삽입하여 그 어테뉴에이션 효과 및 클로닝된 전염성 바이러스로의 회수성을 확인하였다.To illustrate this aspect of the invention, a panel of known mutations in the HPIV mutant strain JS cp 45 was analyzed. This panel of mutations includes ts attenuation amino acid substitutions in the polymerase L gene at the parental residue / sequence positions Tyr ₉₄₂ , Leu ₉₉₂ and / or Thr ₁₅₅₈ . More specifically, the JS cp 45 mutant L protein indicates an attenuation mutation in which the parental type Tyr ₉₄₂ is replaced by His, Leu ₉₉₂ is replaced by Phe, and / or Thr ₁₅₅₈ is replaced by Ile (herein incorporated by reference). See, incorporated US patent application Ser. No. 08 / 083,793 and corresponding international application WO 98/53078. According to a preferred embodiment of the present invention, these mutations not only map to the parental sequence to confirm changes, but also PIV recombinants (r942, r992, r1558, r942 / 992, r992 / 1558, r942 / 1558 and r942 / 992). / 1558) alone and in combination to confirm its attenuation effect and recoverability to the cloned infectious virus.

추가 돌연변이 예는 맵핑되고, HPIV3의 F 및 C 단백질에서의 어테뉴에이션 아미노산 치환을 코딩하는 것을 특징으로 하는 HPIV3 JS cp45 돌연변이체에서 평가하였다. 이들 돌연변이는 Ile₉₆이 Thr로 치환되는 것에 의해 예시된, JS HPIV3의 부모형 잔기/위치 Ile₉₆에서 C 단백질 중의 비-ts 어테뉴에이션 아미노산 치환을 포함한다. HPIV3의 F 단백질에서 확인된 추가 돌연변이 예는 Ile₄₂₀의 Val로 치환 및 Ala₄₅₀의 Thr로의 치환에 의해 예시된, 부모형 잔기/위치 Ile₄₂₀ 및 Ala₄₅₀에서의 아미 노산 치환을 코딩힌다.Further mutation examples were assessed in the HPIV3 JS cp 45 mutant, which was mapped and encoded an attenuation amino acid substitution in the F and C proteins of HPIV3. These mutations include non-ts attenuation amino acid substitutions in the C protein at the parental residue / position Ile ₉₆ of JS HPIV3, exemplified by the substitution of Ile ₉₆ with Thr. Additional identified in the HPIV3 mutant F protein example hinda encoding an amino acid substitution in substituted and the parent-type residue / position illustrated by a substitution to Ala ₄₅₀ Thr Ile ₄₂₀ Ala ₄₅₀ to Val, and Ile ₄₂₀ of.

따라서, HPIV3에서 확인된 각 어테뉴에이션 돌연변이는 다른 네가티브 스트랜드 바이러스에서 동종 단백질에 대한 서열 비교용 지표를 제공한다. 본 발명의 이러한 양태를 설명하기 위해서, 통상의 서열 정렬을 상기 약술한 방법에 따라서 수행하여 HPIV3 L 및 F 단백질에서 이형 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 (HPIV 1, 센다이 바이러스, HPIV2, BPIV3, MeV 및 RSV)의 패널 중의 상응하는 부위에 대해 맵핑하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 실도는 선택된 돌연변이체의 부모형 서열 요소 및 이와 비교되는 이형 바이러스의 야생형 서열 간의 상당히 놀라운 높은 정도의 보존성을 밝혔다. 진화적으로 보존된 서열 요소는 단순한 어테뉴에이션보다는 돌연변이에 의해 더욱 중대한 표현형 효과 (예를 들면, 생존성 또는 감염성의 상실)를 야기할 것으로 예상될 수 있는 중요한 기능적 의미를 가지므로, 이러한 결과는 놀랍다. Thus, each attenuation mutation identified in HPIV3 provides an index for sequence comparison for homologous proteins in different negative strand viruses. To illustrate this aspect of the invention, conventional sequence alignments were performed according to the methods outlined above to determine the heterologous stranded RNA virus (HPIV 1, Sendai virus, HPIV2, BPIV3, MeV and RSV) in HPIV3 L and F proteins. Mapping for the corresponding site in the panel. As shown in Table 2, this figure revealed a surprisingly high degree of conservativeness between the parental sequence elements of the selected mutants and the wild-type sequences of the heterologous virus compared thereto. These results are surprising because evolutionarily conserved sequence elements have important functional meanings that can be expected to cause greater phenotypic effects (eg, loss of viability or infectivity) by mutations than simple attenuation. .

* 는 HPIV3 cp45 내의 돌연변이된 아미노산을 나타낸다. 밑줄은 다른 바이러스들 사이에 공유된 아미노산 잔기들을 나타낸다.* Represents a mutated amino acid in HPIV3 cp45. Underlined indicates amino acid residues shared between different viruses.

¹전장 단백질 내에 나타낸 제1 아미노산 서열의 위치를 나타낸다.
The position of the 1st amino acid sequence shown in ¹ full-length protein is shown.

표 2에 나타낸 정렬예를 검토한 결과, 나타낸 바이러스 군에서 상응하는 위치에 동일 또는 보존성 아미노산 서열의 존재에 의해 표시된, 분석된 각 L 및 F 돌연변이가 실질상 보존된 모서열 요소를 변화시킨다는 것을 주목하였다. 예를 들면, 부모형 잔기 Tyr₉₄₂를 His로 변화시킨 cp45 L 단백질 돌연변이는 센다이, HPIV2, HPIV3, BPIV3 및 MeV L 단백질 (표 2) 각각에서 상응하는 야생형 위치의 동일한 티로신 잔기의 유지에 의해 표시된 바와 같이 매우 보존되어 맵핑되었다. 유사하게, Leu₉₉₂가 Phe로 대체된 것을 특징으로 하는 cp45 L 돌연변이는 센다이, HPIV3, BPIV3 및 Me V L 단백질 간에 동일하게 보존된 부모형 잔기/위치를 맵핑한다. cp45 F 단백질에서의 2 개의 확인된 돌연변이인 Ile₄₂₀의 Val로의 치환 및 Ala₄₅₀의 Thr로의 치환은 또한 HPIV3 및 BPIV3 간에 동일하게 보존된 잔기/위치를 나타내는 반면, ILe₄₂₀의 Val로의 돌연변이 모잔기는 HPIV1에서 더 동일하게 보존된다. HPIV3 JS cp45에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이 부위에 상응하는 추가 보존된 서열 요소는 표 2에 나타내었다.Examining the alignment examples shown in Table 2, it is noted that each L and F mutation analyzed, indicated by the presence of identical or conservative amino acid sequences at corresponding positions in the indicated virus groups, substantially altered conserved sequence elements. It was. For example, a cp 45 L protein mutation that changed the parental residue Tyr ₉₄₂ to His was indicated by the maintenance of the same tyrosine residue at the corresponding wild type position in Sendai, HPIV2, HPIV3, BPIV3 and MeV L proteins (Table 2), respectively. As preserved and mapped. Similarly, the cp 45 L mutation, characterized by Leu ₉₉₂ being replaced by Phe, maps identically conserved parental residues / locations between Sendai, HPIV3, BPIV3 and Me VL proteins. Two identified mutations in the cp 45 F protein, substitution of Ile ₄₂₀ with Val and substitution of Ala ₄₅₀ with Thr also indicated identically conserved residues / locations between HPIV3 and BPIV3, whereas mutations in ILe ₄₂₀ with Val Is preserved more identically in HPIV1. Additional conserved sequence elements corresponding to the attenuation mutation sites identified in HPIV3 JS cp 45 are shown in Table 2.

다른 이형 서열 정렬을 수행하여 돌연변이 균주 RSV cp530에서 확인된 예시적 RSV 어테뉴에이션 돌연변이의 보존성을 평가하였다. 이 돌연변이는 cp530의 L 폴리머라제의 521 위치에서 페닐알라닌이 류신으로 치환된 것으로 표시되며, 이 돌연변이는 단백질의 더 큰 보존된 구조 도메인 내에서 발생한다. 표 3에 나타낸 바 와 같이, Phe₅₂₁에서의 돌연변이 역시 각 13 개의 군의 상응하는 야생형 위치에서의 동일한 페닐알라닌 잔기의 유지에 의해 표시된 바와 같이 높게 보존되어 맵핑된다표 3, 도 1, 패널 A)Other heterologous sequence alignments were performed to assess the conservation of the exemplary RSV attenuation mutations identified in the mutant strain RSV cp 530. This mutation is indicated by the substitution of phenylalanine with leucine at position 521 of the L polymerase of cp 530, which occurs within the larger conserved structural domain of the protein. As shown in Table 3, the mutations in Phe ₅₂₁ are also highly conserved and mapped, as indicated by the maintenance of the same phenylalanine residues at the corresponding wild type positions in each of the 13 groups (Table 3, Figure 1, Panel A).

굵은 글씨체로 나타낸 아미노산은 분석한 모든 바이러스 종 내에서 보존적이었다.Amino acids in bold type were conserved in all virus species analyzed.

또 다른 이형 서열 정렬을 수행하여 공지된 어테뉴에이션 돌연변이 부이에 상응하는 보존된 구조 요소를 확인하는 능력을 입증하였다. 이 실시예에서, 센다이 바이러스의 C 단백질의 170 위치에서 확인된 어테뉴에이션 돌연변이는 이형 바이러스 HPIV-1, HPIV-3 및 BPIV-3의 C 단백질의 상응하는 서열에 대해 맵핑하였다 (표 4 참조; 상응하는 서열 중의 첫번째 잔기의 위치에 번호를 매겼다). 다시 한 번, 이 돌연변이는 여러가지의 군 중에서 동일하게 보존된 부모형 잔기/서열 위치에서의 아미노산 변화에 의해 표시된다. Another heterologous sequence alignment was performed to demonstrate the ability to identify conserved structural elements corresponding to known attenuation mutants. In this example, the attenuation mutations identified at position 170 of the C protein of Sendai virus were mapped to the corresponding sequences of the C protein of the heterologous viruses HPIV-1, HPIV-3 and BPIV-3 (see Table 4; corresponding). Numbering the position of the first residue in the sequence). Once again, this mutation is indicated by amino acid changes at the same conserved parental residue / sequence position among the various groups.

이러한 총괄적인 발견은 어테뉴에이션 돌연변이 부위에 상응하는 서열 요소의 놀라운 보존성을 예시한다. 이에 기초하여, 본 발명의 이론적 고안 방법은 한 이형 바이러스에서 확인된 어테뉴에이션 서열 변화를 다른 재조합 바이러스에 (재조합 유전체 또는 안티게놈의 동일 또는 보존성 변경에 의해서) 수입하여 어테뉴에이션된 재조합 클론을 생성하였다. 이러한 방법의 실제적 개발은 하기의 실시예에 직접 나타내었다.This collective finding illustrates the surprising conservation of sequence elements corresponding to attenuation mutation sites. Based on this, the theoretical design method of the present invention imports the attenuation sequence changes identified in one heterologous virus to another recombinant virus (by the same or conservative alteration of the recombination genome or antigenome) to produce the synthesized recombinant clones. . The practical development of this method is shown directly in the examples below.

<실시예 II>Example II

RSV RSV cptscpts 530L로부터 재조합 HPIV3 백신 후보물로의 어테뉴에이션 돌연변이의 이형 전달Heterologous Delivery of Attenuation Mutations from 530L to Recombinant HPIV3 Vaccine Candidates

모노네가바이랄 내의 이형 군 간의 보존된 구조 요소에 상응하는 부위에서의 어테뉴에이션 돌연변이를 확인하고, 계통발생적 경게에 걸친 어테뉴에이션 돌연변이의 이형 전달 개념을 모델로 중요한 질병 바이러스 RSV를 이용하여 시험하였다. 이러한 관계에서, 본 실시예는 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) 과의 뉴모바이러스 (pneumovirus) 속의 바이러스인 RSV에서 확인된 어테뉴에이션 (att) 돌연변이가 멀리 연관된 레스피로바이러스 (Respirovirus) 속의 멤버인 PIV3로 전달될 수 있음을 입증하였다. 이들 바이러스는 파라믹소비리다에 과 내의 2 개의 상이한 아과(subfamily)인 뉴모비리나에 (Pneumovirinae) 및 파라믹소비리나에 (Paramyxovirinae)를 각각 대표한다.Attenuation mutations at sites corresponding to conserved structural elements between heterologous groups in mononegaviral were identified and tested using the critical disease virus RSV as a model for the concept of heterologous transfer of attenuation mutations across phylogenetic pathways. In this regard, the present example is directed to PIV3, a member of the Respirovirus genome, which is associated with attenuation mutations identified in RSV, a virus of the pneumovirus family of the family Pararamyxoviridae. It has been demonstrated that it can be delivered. These viruses represent two different subfamily in the family Paramyxoviridae, Pneumovirinae and Paramyzovirinae, respectively.

더욱 구체적으로는, 돌연변이의 확정 부위 (RSV L 단백질의 Phe₅₂₁)에서의 부모형 RSV 서열을 변화시켜 어테뉴에이션된 표현형을 구체화시킨 첫번째 이형 바이러스 (RSV cpts530)에서의 어테뉴에이션 돌연변이를 선택한 표적 바이러스 HPIV 3 (표 3)의 L 단백질에서 상응하는 위치 (F456L)의 동일한 보존된 잔기에 맵핑하였다. 따라서, 보존된 야생형 HPIV3 서열 요소는 RSV 및 HPIV3 간의 어테뉴에이션 돌연변이의 이형 전달에 대한 잠재적 표적으로 시험하였다. More specifically, the target virus selected an attenuation mutation in the first heterologous virus (RSV cpts 530) that changed its parental RSV sequence at the definite site of the mutation (Phe ₅₂₁ of the RSV L protein) to incorporate the attenuated phenotype. In the L protein of HPIV 3 (Table 3) it was mapped to the same conserved residue at the corresponding position (F456L). Thus, conserved wild type HPIV3 sequence elements were tested as potential targets for heterologous delivery of attenuation mutations between RSV and HPIV3.

이 전달을 수행하기 위하여, 돌연변이에 의한 변화를 수반하는 보존 서열 요소(들) 모두 또는 일부는 바람직하게는 재조합 바이러스로 복제 또는 유입되어 신규 어테뉴에이션 유도체를 생성한다. 돌연변이에 의한 변화를 재조합 바이러스로 동일하게 복제하는 것이 바람직한 반면, 이러한 수준의 충실도는 요구되지 않는다. 반대로, 표적으로 확인된 부모형 또는 야생형 잔기는 돌연변이를 표시하는 잔기(들)과 연관되지 않은 것일 수 있는 1 이상의 잔기를 포함하는 돌연변이 부위에 아미노산을 삽입하는 것에 의해 대체되거나 또는 결실될 수 있다. 바람직하게는, 대상 돌연변이가 1 이상의 아미노산 치환에 의해 표시되는 경우, 돌연변이 부위의 위치에서 상응하는 재조합 바이러스의 부모형 클론 중의 잔기(들)은 돌연변이 서열에서 확인된 치환된 잔기(들)과 보존적으로 연관된 1 이상의 잔기에 의해 대체된다. 더욱 바람직하게는, 돌연변이 부위에 상응하는 재조합 바이러스의 부모형 클론 중의 잔기(들)은 돌연변이 서열 중에 존재하는 것과 동일한 잔기 1 이상에 의해 대체된다.In order to carry out this delivery, all or part of the conserved sequence element (s) accompanying the change by mutation is preferably replicated or introduced into the recombinant virus to create a novel attenuation derivative. While it is desirable to replicate the changes by mutation equally into recombinant viruses, this level of fidelity is not required. In contrast, the parental or wild-type residues identified as targets may be replaced or deleted by inserting an amino acid at a mutation site comprising one or more residues that may not be associated with the residue (s) indicating the mutation. Preferably, if the subject mutation is indicated by one or more amino acid substitutions, the residue (s) in the parental clone of the corresponding recombinant virus at the position of the mutation site is conservative with the substituted residue (s) identified in the mutation sequence. Replaced by one or more residues associated with More preferably, the residue (s) in the parental clone of the recombinant virus corresponding to the mutation site is replaced by one or more residues identical to those present in the mutant sequence.

따라서, 본 실시예에서는, cpts530의 L 폴리머라제의 aa 521 위치에서의 페닐알라닌의 류신으로의 돌연변이는 ts 및 어테뉴에이션(att) 표현형을 구체화하는 것을 특징으로 한다. 다수의 멀리 연관된 파라믹소바이러스 (표 3)의 L 단백질 중의 이 구역의 서열 정렬은 이 페닐알라닌이 광범위하게 보존되었음을 밝혔다. 역(reverse) 유전학을 사용하여, 야생형 PIV3의 L 단백질 중의 456 위치에서의 유사한 페닐알라닌을 류신으로 돌연변이를 일으켰다 (F456L). r456_L로 지정한 얻은 바이러스는 ts (플라크 형성의 차단 온도는 40℃)였으며, 햄스터의 상기도 (하기도는 아님)에서의 복제는 재조합 야생형 (rtw) PIV3에서와 비교하여 10 배 감소하였다. 이러한 결과는 전달딘 페닐알라닌의 류신으로의 돌연변이는 유사한 수준의 온도 민감성 및 2 개의 멀리 연관된 파라믹소바이러스에서의 어테뉴에이션를 구체화함을 나타낸다.Thus, in this example, the mutation of phenylalanine to leucine at position aa 521 of the L polymerase of cpts 530 is characterized by specifying the ts and attain phenotype. Sequence alignment of this region in the L proteins of many distantly related paramyxoviruses (Table 3) revealed that this phenylalanine was widely conserved. Using reverse genetics, a similar phenylalanine at position 456 in the L protein of wild type PIV3 was mutated to leucine (F456L). The resulting virus designated r456 _L was ts (blocking temperature of plaque formation was 40 ° C.), and replication in the upper airway (not below) of hamsters was reduced 10-fold compared to that in recombinant wild type (rtw) PIV3. These results indicate that the mutation of transferdine phenylalanine to leucine specifies a similar level of temperature sensitivity and attenuation in two distantly related paramyxoviruses.

또한, 본 실시예 내에서는, F456L 돌연변이를 2 개의 rPIV3 후보 백신 바이러스 (하나는 L 단백질 (rcp45_L에 3 개의 cp45 ts 미스센스 돌연변이를 수반하며, 다른 것은 모든 cp45 돌연변이 (rcp45)를 수반함)로 도입하는 것은 생체내에서 바이러스를 더 어테뉴에이션시킴을 입증하였다. 더욱 구체적으로는, F456L 돌연변이를 2 개의 최근에 개발된 재조합 PIV3 백신 후보물에 삽입하였다. 하나는 생물적 유래의 PIV3 백신 후보 cp45의 재조합 버전인 rcp45이고, 다른 것은 나타난 유일한 cp45 돌연변이가 L 단백질 중의 3 아미노산 치환인 버전인 rcp45L이다 (국제 출원 공개 제98/53078호, Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73(2):1374-1381, (1999), 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 삽입됨). rcp45 또는 rcp45L로의 F456L 돌연변이의 첨가는 온도 민감성 및 생체내 어테뉴에이션 수준을 증가시키고, rcp45-456은 면역유발성이며, 표현형적으로 안정하다. rcp45_L-456 및 rcp45-456 바이러스는 그들의 rcp45_L 및 rcp45 부모형보다 햄스터에서의 복제가 100 내지 1000배 더 제한되어 있다. rcp45-456과의 면역화는 PIV3 감염 바이러스의 복제에 대한 내성을 중간 수준으로 유도한다. 침팬지에서는, rcp45-456은 rcp45보다 호흡기에서 5배 더 제한되고, 상대적으로 중간 내지 높은 수준의 PIV-특이적 혈청 항체를 유도한다. 2 주간의 복제를 통해 침팬지에서 단리한 rcp45 및 rcp45-456 바이러스는 그 각각의 투입 바이러스의 온도 민감성 수준을 유지하며, 이는 그 표현형의 안정성을 나타낸다.In addition, within this example, the F456L mutant may contain two rPIV3 candidate vaccine viruses (one with L protein (3 cp 45 ts missense mutations in rcp45 _L , and the other with all cp45 mutations (rcp45)). Introduction into the virus demonstrated further attenuation of the virus in vivo More specifically, the F456L mutation was inserted into two recently developed recombinant PIV3 vaccine candidates, one of which is a biologically derived PIV3 vaccine candidate cp. The recombinant version of 45 is rcp45, the other is rcp45L, the version of which is the only 3 cp 45 mutation in the L protein (International Application Publication No. 98/53078, Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3)). : 1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381, (1999), each of which is incorporated herein by reference) Addition of F456L mutation to rcp45 or rcp45L Is temperature sensitive and in vivo Increase the level and tenyu recreation, rcp45-456 immune induced, and is phenotypically stable. Rcp45 _L -456 and rcp45-456 viruses and their rcp45 _L rcp45 replication in hamsters further 100 to 1000 times higher than the parent type Immunization with rcp45-456 leads to moderate levels of resistance to replication of the PIV3 infected virus In chimpanzees, rcp45-456 is five times more restricted in the respiratory system than rcp45 and is relatively moderate to high. Induce PIV-specific Serum Antibodies rcp45 and rcp45-456 viruses isolated from chimpanzees through two weeks of replication maintain the temperature sensitive level of their respective input virus, indicating the stability of their phenotype.

따라서, RSVF521L 돌연변이에 상응하는 F456L 돌연변이를 cp45 재조합 바이러스로 전달하는 것은 재조합 바이러스의 어테뉴에이션를 증가시키는 결과가 되고, 이는 PIV 백신 후보에서의 미세 조율 어테뉴에이션에 대한 이 전달 돌연변이의 유용성을 증명한다. 이 경우 상이한 아과(subfamily)를 나타내는 이형 파라믹소바이러스에서 확인된 전달 돌연변이 능력은 신규 파라인플루엔자 바이러스 백식 개발 능력을 크게 향상시킨다.Thus, delivery of the F456L mutation corresponding to the RSVF521L mutation to the cp45 recombinant virus results in increased attenuation of the recombinant virus, demonstrating the usefulness of this transfer mutation for fine tuning attenuation in PIV vaccine candidates. In this case, the ability of transfer mutations identified in heterologous paramyxoviruses representing different subfamily greatly enhances the ability to develop new parainfluenza virus bleaching.

바이러스 및 세포Viruses and cells

본 실시예에서 대조로 사용한 rPIV3 JS wt (본원에서 rwt로 지칭함), rcp45_L 및 rcp45 바이러스는 앞서 생성하였다 (국제 출원 공개 제98/53078; Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998); Skiadapoulos et al., J. Virol. 73(2):1374-1381 (1999), 본원에 참고문헌으로 삽입됨). rPIV3s는 앞서 기술된 대로 유인원 LLC-MK2 세포 (ATCC CCL 7.1)에서 성장시켰다 (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; Hall et al., Virus Res. 22(3):173-184, 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998), 본원에 참고문헌으로 삽입됨). T7 폴리머라제를 발현하는 개질된 우두 (vaccinia) 바이러스 안카라(Ankara) (MVA-T7) (Wyatt et al., Virology 210(1):202-205 (1995))는 린다 와이어트(Linda Wyatt) 및 버나드 모스(Bernard Moss)에 의해 친절히 제공되었다. HEp-2 (ATCC CCL 23) 및 LLC-MK2 세포는 2% FBS 및 겐타마이신 술페이트 (50 ㎍/㎖)를 보강한 OptiMEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 또는 10% FBS, 겐타마이신 술페이트 (50 ㎍/㎖) 및 4 mM 글루타민을 보강한 EMEM에서 유지하였다.The rPIV3 JS wt (referred to herein as rwt), rcp 45 _L and rcp 45 viruses used as controls in this example were generated previously (International Publication No. 98/53078; Durbin et al., Virology 235: 323-332 ( 1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Skiadapoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999), hereby incorporated by reference. Inserted). rPIV3s were grown in apes LLC-MK2 cells (ATCC CCL 7.1) as described previously (Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173-184 , 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998), incorporated herein by reference). Modified vaccinia virus Ankara (MVA-T7) (Wyatt et al., Virology 210 (1): 202-205 (1995)) expressing T7 polymerase is described by Linda Wyatt and Kindly provided by Bernard Moss. HEp-2 (ATCC CCL 23) and LLC-MK2 cells were either OptiMEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD) or 10% FBS, gentamicin sulfate supplemented with 2% FBS and gentamycin sulfate (50 μg / ml) (50 μg / ml) and 4 mM glutamine were maintained in EMEM supplemented.

rwt에서의 점 돌연변이의 구성composition of point mutations in rwt

PIV3 nt 7437 내지 11312 (Xho I - Sph I)를 포함하는 감염성 바이러스를 회수하는데 종전에 사용되었던 PIV 3 JS의 안티게놈 cDNA 클론, p3/7(131)2G+의 서브게놈 단편 (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8, 1998; Skiadopoulos et al., J. Virol. 73(2):1372-1381, 1999)를 표준 분자 클로닝 기술을 이용하여 이 단편을 수용하도록 변형된 pUC19 벡터로 클로닝하였다. cDNA는 상기 기술한 트랜스포머 돌연변이유발 키트 (Clontech, CA)를 사용하여 2 개의 점 돌연변이를 삽입하는 것에 의해 개질하였다 (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8, 1998; Skiadopoulos et al., J. Virol. 73(2):1374-1381, 1999). 이들 2 변화는 rPIV3 안티게놈 RNA의 완전한 파지티브 센스 서열에 따라서 번호를 매긴 10011 (T 내지 C) 및 10013 (C 내지 G) 위치에 있다. 이는 F456L 코돈 변화 뿐만 아니라 오버래핑, 마커로서 잠재적(silent) XmnI 부위를 삽입시킨다 (도 1). 돌연변이 유발 후, 제한 엔도뉴클레아제 단편을 완전히 시퀀싱석하고, 전체 길이 클론 p3/7(131)2G+내, 또는 cp45 돌연변이를 수반하는 유도체 내로 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 직접 클로닝하였다.Antigenomic cDNA clone of PIV 3 JS, a subgenomic fragment of p3 / 7 (131) 2G +, previously used to recover infectious viruses including PIV3 nt 7437 to 11312 ( Xho I- Sph I) (Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8, 1998; Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1372-1381, 1999). Cloning into a pUC19 vector modified to accommodate this fragment was carried out using standard molecular cloning techniques. cDNA was modified by inserting two point mutations using the transformer mutagenesis kit (Clontech, CA) described above (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8, 1998; Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381, 1999). These two changes are at the 10011 (T to C) and 10013 (C to G) positions numbered according to the complete positive sense sequence of the rPIV3 antigenomic RNA. This inserts a latent X mn I site as overlapping, marker as well as F456L codon changes (FIG. 1). After mutagenesis, restriction endonuclease fragments were fully sequenced and cloned directly using standard molecular cloning techniques into full length clone p3 / 7 (131) 2G + or into derivatives with cp 45 mutations.

F456L 돌연변이를 지닌 재조합 PIV3s의 회수Recovery of Recombinant PIV3s with the F456L Mutation

F456L 돌연변이를 지닌 전체 길이 안티게놈 cDNA 유도체 및 3 개의 지지 플라스미드 pTM(N), pTM (P no C) 및 pTM(L) (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997)을 리포펙트ACE(LipofectACE) (Life Technologies, MD)를 사용하여 6-웰 플래이트 (Costar, MA)의 HEp-2 단층으로 트랜스펙션하고, 단층은 상기 기술한 MVA-T7로 감염시켰다 (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998)). 플라스미드 pTM (P no C)은 C ORF 가 그 번역 개시 코돈이 AUG에서 ACG로 (메티오닌이 트레오닌으로) 변화된 것과 같이 개질된 상기 기술한 pTM(P) (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997)) 플라스미드의 버전이다. 32℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 트랜스펙션 수확물은 32℃에서 4 내지 8일 동안 인큐베이션한 T-25 플라스크 중의 LLC-MK2 세포 상으로 통과시켰다. 명료해진 배지 상층액은 상기 기술한 LLC-MK2 세포 상에서 플라크 정제를 3회 하였다 (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997); Hall et al., Virus Res. 22(3):173-184 (1992); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998)). 각 생물학적 클로닝 재조합 바이러스는 32℃에서 LLC-MK2 세포에서 2회 증폭하여 더 특성화하기 위한 바이러스를 생산하였다. 바이러스는 폴리에틸렌글리콜 침강에 의해 명료해진 배지로부터 농축하고 (Mbiguino and Menezes, J. Virol. Methods 31:161-170 (1991)), 바이러스 RNA (vRNA)는 TRIzol 시약 (Life Technologies)로 추출하였다. 역 전사를 무작위 헥사머 프라이머를 갖는 슈퍼스크립트 II 전증폭 시스템(Superscript II Preamplification System)을 사용하여 vRNA에서 수행하였다. 어드밴티지(Advantage) cDNA PCR 키트 (Clontech, CA) 및 PIV3 게놈의 다양한 부분에 특이적인 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 소화 및(또는) 서열 분석용 단편을 증폭하였다. PCR 단편을 시퀀싱 및(또는) 각 제한 효소의 인식 부위가 돌연변이 구성 동안 발생 또는 제거된 제한효소 분석으로 분석하였다.Lipofect ACE with full-length antigenome cDNA derivatives with F456L mutation and three support plasmids pTM (N), pTM (P no C) and pTM (L) (Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997) (LipofectACE) (Life Technologies, MD) was used to transfect with a HEp-2 monolayer of 6-well plate (Costar, Mass.) And the monolayer was infected with MVA-T7 as described above (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998)). Plasmid pTM (P no C) is the pTM (P) described above wherein C ORF was modified as its translation initiation codon changed from AUG to ACG (methionine to threonine) (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)) is a version of the plasmid. After incubation at 32 ° C. for 4 hours, the transfection harvest was passed onto LLC-MK2 cells in T-25 flasks incubated at 32 ° C. for 4-8 days. Clarified media supernatants were subjected to three plaque purifications on the LLC-MK2 cells described above (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173 -184 (1992); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998)). Each biological cloning recombinant virus amplified twice in LLC-MK2 cells at 32 ° C. to produce a virus for further characterization. Virus was concentrated from the medium clarified by polyethylene glycol precipitation (Mbiguino and Menezes, J. Virol. Methods 31: 161-170 (1991)) and viral RNA (vRNA) was extracted with TRIzol reagent (Life Technologies). Reverse transcription was performed in vRNA using the Superscript II Preamplification System with random hexamer primers. Fragments for restriction endonuclease digestion and / or sequencing were amplified using the Advantage cDNA PCR Kit (Clontech, Calif.) And sense and antisense primers specific to various parts of the PIV3 genome. PCR fragments were analyzed by sequencing and / or restriction enzyme analysis in which the recognition site of each restriction enzyme was generated or eliminated during mutation construction.

허용 및 제한 온도에서 F456L 돌연변이를 지닌 rPIV3s의 플라크 형성 효율(EOP)Plaque Formation Efficiency (EOP) of rPIV3s with F456L Mutation at Allowable and Limit Temperatures

대조 및 재조합 바이러스의 시험관내 플라크 형성의 온도 민감성 수준을 32℃에서 및 35℃ 내지 41℃의 온도 범위에서 상기 기술한 6일간 배양한 LLC-MK2 세포 단층 배양에서 측정하였다 (Hall et al., Virus Res. 22(3):173-184, 1992). 플라크는 기니아 피그 (guinea pig) 적혈구와의 혈구흡착(hemadsorption)으로 계수하고 이어서 메틸셀룰로오스 오버레이를 제거하거나, 별법으로 단층에 존재하는 바이러스 플라크를 1:250으로 희석된 2 개의 PIV3-특이적 항-HN 쥐과동물의 mAbs 101/1 및 454/11의 혼합물로 면역퍼옥시다제 염색에 의해 확인하였다 (Murphy et al., Vaccine 8(5):497-502 (1990); Murphy et al. (1990); van Wyke Coelingh, Winter, and Murphy Virology 143(2):569-582, (1985), 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨).Temperature sensitivity levels of in vitro plaque formation of control and recombinant viruses were measured in LLC-MK2 cell monolayer cultures described above at 32 ° C. and in the temperature range of 35 ° C. to 41 ° C. described above (Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173-184, 1992). Plaques were counted by hemadsorption with guinea pig erythrocytes followed by removal of the methylcellulose overlay, or alternatively two PIV3-specific anti-dilutions of virus plaque present in monolayer 1: 250. A mixture of mAbs 101/1 and 454/11 of HN murines was confirmed by immunoperoxidase staining (Murphy et al., Vaccine 8 (5): 497-502 (1990); Murphy et al. (1990) van Wyke Coelingh, Winter, and Murphy Virology 143 (2): 569-582, (1985), each incorporated herein by reference).

햄스터에서의 att 표현형에 대한 rPIV3 돌연변이 바이러스의 평가Evaluation of rPIV3 Mutant Virus for the att Phenotype in Hamsters

PIV에 대해 혈청반응 음성(seronegative)인 4주령 금색 시리안(Syrian) 햄스터 (Charles River Laboratories, NY)에 10^6.0 TCID₅₀ rwt 또는 돌연변이 rPIV3s 중 하나를 함유하는 0.1 ㎖ L 15 배지를 비강내에 접종하였다. 감염 후 4일 째에, 햄스터를 희생시키고, 폐 및 비갑개를 수확하였으며, 앞서 기술한 대로 바이러스를 정량하였다 (Dubin et al., Virology 235:323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8, 1998). 32℃에서의 평균 log₁₀ TCID₅₀/g을 각 햄스터 군에 대하여 계산하였다.Four-week-old gold Syrian hamsters (Charles River Laboratories, NY), seronegative to PIV, were intranasally inoculated with 0.1 ml L 15 medium containing either 10 ^6.0 TCID ₅₀ rwt or mutant rPIV3s. . Four days after infection, hamsters were sacrificed, lungs and nasal turbinates were harvested, and the virus was quantified as previously described (Dubin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J. Virol 72 (3): 1762-8, 1998). The average log ₁₀ TCID ₅₀ / g at 32 ° C was calculated for each hamster group.

햄스터에서의 rcp45-456의 면역유발성 및 효능Immunogenicity and Efficacy of rcp45-456 in Hamsters

5마리 햄스터의 군 3 개에 0.1 ㎖의 (i) L15 배지 (위약), (ii) 10^6.0 TCID₅₀ rcp45, 또는 (iii) 10^6.0 TCID₅₀ rcp45-456를 비강내에 접종하였다. 햄스터에서 감염 전 및 감염 42일 후 채혈하고, PIV에 대한 혈청 혈구응집-억제 (HAI) 항체를 상기 기술한 대로 측정하였다 (van Wyke Coelingh, Winter, and Murphy, 1985). 44일째에, 햄스터에 10^6.0 TCID₅₀ rwt를 비강내 투여로 감염시켰다. 비갑개 및 폐를 4일 후에 수확하였으며, 조직 균등물 중의 rwt 역가를 상기 기술한 대로 측정하였다.Three groups of five hamsters were inoculated intranasally with 0.1 ml of (i) L15 medium (placebo), (ii) 10 ^6.0 TCID ₅₀ rcp 45, or (iii) 10 ^6.0 TCID ₅₀ rcp45-456. Hamsters were bled before infection and 42 days post infection and serum hemagglutination-inhibiting (HAI) antibodies against PIV were measured as described above (van Wyke Coelingh, Winter, and Murphy, 1985). On day 44, hamsters were infected with intranasal administration of 10 ^6.0 TCID ₅₀ rwt. The nasal turbinates and lungs were harvested after 4 days and rwt titers in tissue equivalents were measured as described above.

침팬지에서의 att 표현형에 대한 rPIV3 돌연변이 바이러스의 평가Evaluation of rPIV3 Mutant Virus for the att Phenotype in Chimpanzees

RSV 및 PIV3에 대해 혈청반응 음성이고, 무게가 6.6 내지 10.0 kg인 어린 수 컷 및 암컷 침팬지를 큰 유리 분리 방에서 쌍을 지워 수용하고, 앞서 기술한 대로 유지하였다 (Crowe et al., 1994a; Hall et al., J. Infect. Dis. 167:958-962 (1993)). 침팬지 군들을 각 부위에 10^6.0 TCID₅₀ rcp45또는 rcp45-456을 함유하는 1 ml 접종물로 비강내 (IN) 및 기관내 (IT) 경로로 감염시켰다. 바이러스로 접종한 후, 비인두 스웝 및 기관 세척 시료를 상기 기술한 대로 바이러스 세딩(shedding)을 정량화하기 위해 수집하였다 (Hall et al., 1993; Karron et al., 1997). 비인두 스웝 시료는 제1일 내지 제10일 및 제13일에 수집하였고, 기관 세척 시료는 2, 4, 6, 8 및 10일에 수집하였다. 비루의 양을 날마다 평가하고, 0-4의 스코어를 매겼다 (0=비루 없음; 1=미량; 2=가벼움; 3=보통; 4=심함). rcp45 및 rcp45-446 바이러스는 동일한 프로토콜에 따라서 2 개의 별개의 실험에서 평가하였다. 실험 1에서는, 2마리 침팬지를 rcp45로 접종하고, 4 마리를 rcp45-456으로 접종하였으며, 실험 2에서는 각 바이러스를 2 마리 동물에 주었다. 2차 실험을 첫번째 실험에서 관찰된 2 바이러스 간의 성장 차이를 확인하기 위해 수행하였다. 2 세트의 데이타는 바이러스 성장 및 면역유발성을 고려할 때 구분할 수 없었으며, 함께 평균을 내었다. IN 및 IT 경로로 PIV3의 wt JS 균주 10⁴ TCID₅₀을 받은 4 마리 동물로부터의 데이타는 앞서 기술되었고 (Hall et al., 1993), 비교 목적으로 본원에 나타내었다.Young male and female chimpanzees, seropositive to RSV and PIV3, weighing between 6.6 and 10.0 kg were housed in pairs in a large glass separation room and maintained as previously described (Crowe et al., 1994a; Hall et al., J. Infect. Dis. 167: 958-962 (1993)). Chimpanzee groups were infected with the intranasal (IN) and endotracheal (IT) routes with 1 ml inoculum containing 10 ^6.0 TCID ₅₀ rcp 45 or rcp 45-456 at each site. After inoculation with virus, nasopharyngeal swabs and tracheal lavage samples were collected to quantify virus shedding as described above (Hall et al., 1993; Karron et al., 1997). Nasopharyngeal swabs samples were collected on days 1-10 and 13, and tracheal lavage samples were collected on days 2, 4, 6, 8, and 10. The amount of rhinorrhea was evaluated daily and scored 0-4 (0 = no rhinoceros; 1 = trace; 2 = light; 3 = normal; 4 = severe). rcp 45 and rcp 45-446 viruses were evaluated in two separate experiments following the same protocol. In Experiment 1, two chimpanzees were inoculated with rc p45, four were inoculated with rcp 45-456, and in Experiment 2 each virus was given to two animals. A second experiment was performed to confirm the growth difference between the two viruses observed in the first experiment. The two sets of data were indistinguishable when considering virus growth and immunogenicity and averaged together. Data from four animals that received wt JS strain 10 ⁴ TCID ₅₀ of PIV3 by IN and IT pathways were described above (Hall et al., 1993) and presented herein for comparison purposes.

침팬지에서의 rPIVs의 복제 특성Replication Characteristics of rPIVs in Chimpanzees

비인두 스웝 및 비강 세척 시료 중의 바이러스의 양을 32℃에서 LLC-MK2 단층에서 측정하였고, 앞서 기술한 대로 log₁₀ TCID₅₀/ml로 표현하였다 (Crowe et al., 1994a; Hall et al., 1993). 침팬지 비인두 및 비강 세척 시료에 존재하는 바이러스를 24 웰 플레이트 중에서 32℃에서 LLC-MK2 단층으로 상당한 세포병변 효과가 검출될 때까지 키웠다. 3 가지 rPIV3 단리물의 온도 감수성 수준을 앞서 기술한 대로 LLC-MK2 단층에서 플라크 형성의 효율을 측정하여 평가하였다. 침팬지 검체 또는 단리물로의 모든 연구는 클린다마이신 (100 ㎍/ml), 시플로플록사신 (100 ㎍/ml), 겐타마이신 (100 ㎍/ml) 및 암포테리신 B (2.5 ㎍/ml)로 구성된 항생제 칵테일을 포함하였다.The amount of virus in nasopharyngeal swabs and nasal wash samples was measured in LLC-MK2 monolayers at 32 ° C. and expressed as log ₁₀ TCID ₅₀ / ml as described above (Crowe et al., 1994a; Hall et al., 1993 ). Viruses present in chimpanzee nasopharynx and nasal wash samples were grown in a 24-well plate at 32 ° C. with LLC-MK2 monolayer until significant cytopathic effect was detected. The temperature sensitivity levels of the three rPIV3 isolates were evaluated by measuring the efficiency of plaque formation in the LLC-MK2 monolayer as described above. All studies with chimpanzee samples or isolates consisted of clindamycin (100 μg / ml), ciflofloxacin (100 μg / ml), gentamycin (100 μg / ml), and amphotericin B (2.5 μg / ml) Antibiotic cocktails were included.

<결과><Result>

rwt로 F456L 돌연변이를 도입한 것은 ts 표현형을 수반한다. Introducing the F456L mutation into rwt involves the ts phenotype .

상기 언급한 대로, RSV cpts530은 ts이었고, 생쥐의 호흡기에서의 복제가 어테뉴에이션되었다 (Crowe et al., 1994b). RSV cpts530의 L 단백질 중의 페닐알라닌-521에서의 단일 아미노산 치환이 온도 민감성 (플라크 형성의 차단이 39℃) 및 어테뉴에이션 (생쥐의 상기도에서의 복제가 10 배 감소)를 초래하였다 (Crowe et al., 1994b; Juhasz et al., 1997). RSV 및 PIV3를 포함하는 13 가지 상이한 파라믹소바이러스의 L 단백질의 서열 정렬은 RSV L중의 521 위치에서 페닐알라닌이 고도로 보존되어 있음을 밝혔다 (표 3, 도 1, 패널 A). HPIV3의 경우에, 상응하는 아미노산은 PIV3 L 폴리머라제 중의 456 위치에 발생한다. RSV (521)과 PIV3 (456)에서의 이 잔기의 위치 숫자의 차이는 RSV의 L 단백질이 다른 속의 파라믹소바이러스의 것과 비교하여 약 70 개의 아미노산이 아미노 말단 연장을 갖는다는 앞선 관찰과 일치한다 (Stec et al., Virology 183:273-287 (1991)). PIV의 L 단백질 중의 456 위치에서의 돌연변이가 이형성 RSV cpts530 돌연변이체의 경우와 비교하여 ts 및 att 표현형을 수반하는 가를 확인하기 위하여, rwt 중의 456 위치에서 페닐알라닌을 동일하게 류신으로 돌연변이시켰다 (F456L). wt에 대한 전환의 가능성을 감소시키기 위하여 2 개의 뉴클레오타이드 치환을 포함하도록 코딩 변화를 고안하였다. 또한, 돌연변이는 잠재성 Xmn I 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 도입에 의해 표시하였다 (도 1, 패널 C). 돌연변이는 전체 길이 감염성 rwt cDNA 플라스미드에 도입하였고, 재조합 바이러스는 앞서 기술한 대로 회수하였다 (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997), Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998) 및 Skiadopoulos et al., J. Virol. 73(2):1374-1381 (1999)). 회수한 r456L 돌연변이 (도 1, 패널 b)는 정제된 vRNA의 RT-PCR 및 제한 효소 소화 및 시퀀싱에 의한 분석에 기초하여 Xmn I 마커 및 F456L 돌연변이를 갖는다는 것을 확인하였다. rwt로의 F456L 돌연변이의 도입은 RSV cpts530의 경우보다 1℃ 높은 40℃의 차단 온도를 수반하고 (표 5), 이는 뉴모바이러스에서 확인된 ts 돌연변이가 멀리 연관된 레스피로바이러스(Respirovirus)에 전달되어 유사하나 동일하지는 않은 ts 표현형을 수반할 수 있음을 나타낸다. As mentioned above, RSV cpts530 was ts and replication in the respiratory tract of mice was attenuated (Crowe et al., 1994b). Single amino acid substitutions in phenylalanine-521 in the L protein of RSV cpts 530 resulted in temperature sensitivity (blockade of plaque formation at 39 ° C.) and attenuation (10-fold reduction in replication in the upper airways of mice) (Crowe et al. , 1994b; Juhasz et al., 1997). Sequence alignment of the L proteins of 13 different paramyxoviruses, including RSV and PIV3, revealed that phenylalanine was highly conserved at position 521 in RSV L (Table 3, FIG. 1, Panel A). In the case of HPIV3, the corresponding amino acid occurs at position 456 in the PIV3 L polymerase. The difference in the positional numbers of these residues in RSV 521 and PIV3 456 is consistent with previous observations that the L protein of RSV has amino terminal extension about 70 amino acids compared to that of paramyxoviruses of other genera ( Stec et al., Virology 183: 273-287 (1991)). To determine if the mutation at position 456 in the L protein of PIV involved the ts and att phenotypes compared to the heterologous RSV cpts 530 mutant, phenylalanine was mutated equally to leucine at position 456 in rwt (F456L) . Coding changes were designed to include two nucleotide substitutions to reduce the likelihood of conversion to wt. Mutations were also indicated by the introduction of latent X mn I restriction endonuclease recognition sites (FIG. 1, Panel C). Mutations were introduced into the full length infectious rwt cDNA plasmid and recombinant virus was recovered as described previously (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997), Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3) : 1762-8 (1998) and Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)). The recovered r456L mutant (FIG. 1, panel b) was confirmed to have an X mn I marker and F456L mutant based on analysis by RT-PCR and restriction enzyme digestion and sequencing of the purified vRNA. The introduction of the F456L mutation into rwt involves a blocking temperature of 40 ° C., which is 1 ° C. higher than that of RSV cpts 530 (Table 5), indicating that the ts mutations identified in pneumovirus are transferred to a far associated Respirovirus. However, it may involve ts phenotypes that are not identical.

(^a플라크는 지정된 온도에서 6일 동안 인큐베이션 한 후, 면역퍼옥시다제 염색으로 계산하였다. 3회 이상 실험의 평균을 나타내었다. 밑줄 및 굵게 나타낸 수치는 플라크 형성의 차단 온도로 규정되는 플라킹 효율의 100 배 감소인 최저 제한 온도를 대표한다. 역가의 감소는 허용 온도 (32℃)의 역가로부터 지정도니 온도에서의 역가를 빼는 것에 의해 측정하였다.)( ^a plaque was counted by immunoperoxidase staining after 6 days of incubation at the indicated temperature. The average of three or more experiments was shown. The underlined and bold values indicated the plaque efficiency defined by the blocking temperature of plaque formation. Representing the lowest limiting temperature, which is a 100-fold reduction in, the decrease in titer is measured by subtracting the titer at the designated temperature from the titer of the allowable temperature (32 ° C.)

F456L 돌연변이를 재조합 rcp 45 기재 어테뉴에이션 바이러스에 도입하는 것은 온도 민감성을 증가시킨다. Incorporating the F456L mutation into a recombinant rcp 45 based attenuation virus increases temperature sensitivity .

cp45는 ts 및 att 표현형의 주요 결정요소라고 앞서 밝혀진 L 단백질 중의 3 개의 구체적 아미노산 치환을 갖는다 (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998)). cp45는 또한 ts 및 att 돌연변이를 포함하는 L 외부의 12 가지 다른 돌연변이를 포함한다 (Skiadopoulos et al., J. Virol. 73(2):1374-1381 (1999)). F456L 돌연변이를 rcp45에 도입하였으며, 또한 단지 3 개의 rcp45_L 유전 자 돌연변이 (rcp45_L)을 지닌 바이러스에 도입하였다. 이는 F456L 돌연변이에 의해 특정된 온도 민감성이 3 개의 cp45 L 돌연변이에 의해서 또는 전체 세트 15 cp45 돌연변이에 의해서 특정된 것과 상가적(additive)인지를 확인하기 위하여 수행하였다. 현저하게도, rcp45_L-456 돌연변이는 rcp45_L의 39℃와 비교하여 35℃의 차단 온도로 매우 향상된 온도 민감성 수준을 나타내었다 (표 5). rcp45-456 돌연변이체는 rcp45의 38℃와 비교하여 37℃의 중간 차단 온도를 갖는다. F456L 돌연변이에 의해 특정된 온도 감수성이 rcp45_L 및 rcp45에서의 돌연변이에 의해 특정된 것과 상가적이라 할지라도, 효과의 강도는 2 바이러스에 대해 명백히 상이하다. 따라서, 더 많은 수의 돌연변이를 포함하는 rcp45-456이 rcp45_L-456보다 예상외로 덜 ts이다. 비록 이들 효과의 근거는 밝혀지지 않았을지라도, cp45 ts 중의 복합적 상호작용의 증거는 다양한 cp45 돌연변이의 조합을 포함하는 다른 rPIV3 바이러스에 대해 앞서 관찰되었다 (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998) 및 Skiadopoulos et al., J. Virol. 73(2):1374-1381 (1999)).cp45 has three specific amino acid substitutions in the L protein previously found to be key determinants of the ts and att phenotypes (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998)). cp 45 also includes 12 other mutations outside of L, including ts and att mutations (Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)). The F456L mutation was introduced into rcp 45 and also into the virus with only three rcp 45 _L gene mutations ( rcp 45 _L ). This was done to confirm that the temperature sensitivity specified by the F456L mutation is additive to that specified by the three cp 45 L mutations or by the full set 15 cp 45 mutations. Remarkably, the rcp 45 _L- 456 mutant showed a significantly improved temperature sensitivity level with a blocking temperature of 35 ° C. compared to 39 ° C. of rcp 45 _L (Table 5). The rcp 45-456 mutant has a median blocking temperature of 37 ° C. compared to 38 ° C. of rcp45. Although the temperature sensitivity specified by the F456L mutation is additive to that specified by the mutations in rcp 45 _L and rcp45, the intensity of the effect is clearly different for 2 viruses. Thus, rcp 45-456 containing a greater number of mutations is unexpectedly less ts than rcp 45 _L -456. Although the rationale for these effects is not known, evidence of multiple interactions in cp 45 ts has been previously observed for other rPIV3 viruses, including combinations of various cp 45 mutations (Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 ( 3): 1762-8 (1998) and Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)).

햄스터에서의 돌연변이체 rPIV3s의 복제 및 면역유발성Replication and Immunogenicity of Mutant rPIV3s in Hamsters

햄스터를 F456L 돌연변이를 단독으로 또는 cp45 특정 돌연변이와 병용하여 지닌 바이러스를 포함하는 다수의 돌연변이체 rPIV3's 중 하나로, 또는 rwt 10^6.0 TCID₅₀으로 IN 접종하였다 (표 6). 4일 후, 폐 및 비갑개를 수확하고, 각 바이러스의 복제 수준을 측정하였다. F456L 돌연변이 단독으로는 r456_L 복제에 보통의 효과 를 가지고, 비갑개에서 약 10 배 감소되고, 폐에서는 명백한 복제 제한을 나타내지 않았다. 어테뉴에이션의 수준은 생쥐의 상기도 중의 RSV cpts530 돌연변이체의 것과 유사하다 (Crowe et al., Vaccine 12(8), 691-699 (1994a)). 놀랍게도, F456L 돌연변이를 rcp45_L 또는 rcp45에 부가한 결과 상기도에서의 복제가 더욱 명백히 제한된 재조합체가 생겼다. 이는 F456L 돌연변이는 햄스터의 상기도에서의 이들 돌연변이체 바이러스 모두의 복제가 어테뉴에이션되는 것을 크게 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.Hamsters were IN inoculated with one of a number of mutant rPIV3's, including viruses with the F456L mutation alone or in combination with a cp 45 specific mutation, or with rwt 10 ^6.0 TCID ₅₀ (Table 6). After 4 days, lung and nasal turbinates were harvested and the replication level of each virus was measured. The F456L mutation alone had a modest effect on r456 _L replication, about 10-fold reduced in nasal turbinates, and did not show obvious replication restrictions in the lungs. The level of attenuation is similar to that of the RSV cpts530 mutant in the upper airway of mice (Crowe et al., Vaccine 12 (8), 691-699 (1994a)). Surprisingly, the addition of the F456L mutation to rcp 45 _L or rcp 45 resulted in a recombinant with more clearly limited replication in the upper airways. This indicates that the F456L mutation can greatly enhance the attenuation of replication of both of these mutant viruses in the upper airway of hamsters.

^a1.0mL 부피의 바이러스 10^6.0TCID₅₀을 햄스터들에게 비강내 투여하였다. 4일 후 폐와 비갑개를 수득하여 바이러스 역가를 32℃에서 측정하였다. 2 실험의 평균치로 나타내었다. ^a 1.0 mL volume of virus 10 ^6.0 TCID ₅₀ was intranasally administered to hamsters. After 4 days lungs and nasal turbinates were obtained and virus titers were measured at 32 ° C. The average value of 2 experiments is shown.

^bS.E.는 표준 오차를 의미한다.
^b SE means standard error.

rcp45-456 전달 돌연변이체가 면역 반응을 유발하는지를 측정하기 위하여, 혈청반응 음성 햄스터에 10^6.0 TCID₅₀의 rcp45-456, rcp45, 또는 L 15 배지를 IN 투여하였다. 42일 후, 혈청 시료를 수집하고, 동물을 44일 째 rwt로 감염시켰다. rcp45-456 또는 rcp45의 면역화하는 것은 각각 보통 내지 높은 역가의 혈청 HAI 항체를 유발하였으며, rwt 감염 바이러스의 복제 제한을 유도하였다 (표 7). rcp45-456으로 감염시킨 것에 의해 유도된 내성 및 항체의 수준은 rcp45에 의해 유도된 것들에 비해 적었다. rcp45-456에 의해 수여된 낮은 수준의 면역 반응 및 보호는 햄스터의 호흡기 중에서의 명백히 낮은 복제 수준을 반영하는것 같다.To determine if the rcp 45-456 delivery mutant elicited an immune response, sero-negative hamsters were dosed IN with 10 ^6.0 TCID ₅₀ of rcp 45-456, rcp 45, or L 15 medium. After 42 days, serum samples were collected and animals were infected with rwt on day 44. Immunization of rcp 45-456 or rcp 45 resulted in moderate to high titers of serum HAI antibodies, respectively, and induced replication restriction of rwt infected virus (Table 7). The levels of resistance and antibodies induced by infection with rcp 45-456 were less than those induced by rcp 45. The low level of immune response and protection conferred by rcp 45-456 seems to reflect the apparently low level of replication in the hamster's respiratory tract.

^a햄스터 1 마리당 1.0mL 부피의 바이러스 10^6.0TCID₅₀을 햄스터 5군에게 비강내 투여하였다. 44일 후, rwt 10^6.0TCID₅₀을 동물에게 가하고, 4일 후 폐와 비갑개를 수득하였다. ^a 1.0 mL volume of virus 10 ^6.0 TCID ₅₀ per hamster was administered intranasally to group 5 hamsters. After 44 days, rwt 10 ^6.0 TCID ₅₀ was added to the animals and after 4 days lungs and nasal turbinates were obtained.

^b 각 조직 샘플 내에 존재하는 바이러스의 양은 32℃에서 LLC-MK2에 대하여 측정하였다. ^b The amount of virus present in each tissue sample was measured for LLC-MK2 at 32 ° C.

^c 42일째(즉 rwt 접종 2일 전) PIV3에 대한 혈청 응집 억제 항체 역가 ^c Serum aggregation inhibitory antibody titers against PIV3 on day 42 (ie 2 days before rwt inoculation)

S.E.는 표준 오차를 나타낸다. 감염전 혈청의 HAI 상호(reciprocal) 평균 log2 역가는 2 미만이었다.
SE represents standard error. The HAI reciprocal mean log2 titer of pre-infection serum was less than 2.

침팬지에서 From the chimpanzee rcprcp 45-456 돌연변이체는 45-456 mutants rcprcp 45보다 더욱 어테뉴에이션된다. More than 45 attenuated.

rcp45-456 돌연변이체는 햄스터에서 과도하게 어테뉴에이션되기 때문에, 본 발명자들은 그 면역유발성 및 복제수준을 인간과 가장 밀접히 연관된 비인간 영장류인 침팬지에서 측정하기로 하였다. 2 개의 개별적 확인 실험에서 침패지 군들은 rcp45-456 또는 rcp45의 부위 당 10^6.0 TCID₅₀으로 IN 및 IT 접종하였다. 기관 세척 및 비인두 스웝 시료는 각각 감염 후 10 및 13일의 기간에 걸쳐 수집하였고, 각 검체 중의 바이러스 역가를 측정하였다. rcp45-456 및 rcp45는 PIV3 wt와 비교하여 상기도 및 하기도에서 복제가 크게 제한되었으며 (표 8), 이는 각 돌연변이체 바이러스가 침팬지에서 복제가 어테뉴에이션되었음을 나타낸다. 상기 기술한 대로 (표 6), F456L 돌연변이를 cp45에 첨가하는 효과는 햄스터의 상기도에서의 25500 배 이상 복제를 감소시켰다. 반대로, 침팬지에서 평가하였을 때, 효과는 상기도 및 하기도에서 단지 5 배 감소되었다 (표 8 및 도 2). 한 실험은 2 마리 동물이 rcp45를 받고, 4 마리가 rcp45-456을 받았으며, 두번째 실험은 각 바이러스를 2 마리 동물에 투여한, 2 개의 독립적 실험에서 이러한 차이를 관찰하였다. Since the rcp 45-456 mutant is excessively attenuated in hamsters, we decided to measure its immunogenicity and replication levels in chimpanzees, the non-human primates most closely associated with humans. In two separate validation experiments, the chimpanzee groups were inoculated with IN and IT at 10 ^6.0 TCID ₅₀ per site of rcp 45-456 or rcp45. Tracheal lavage and nasopharyngeal swabs samples were collected over a period of 10 and 13 days post infection, respectively, and virus titers in each sample measured. rcp 45-456 and rcp 45 had significantly limited replication in the upper and lower airways as compared to PIV3 wt (Table 8), indicating that each mutant virus attenuated replication in chimpanzees. As described above (Table 6), the effect of adding the F456L mutation to cp45 reduced replication more than 25500 times in the upper airway of hamsters. In contrast, when evaluated in chimpanzees, the effect was reduced only five-fold in the upper and lower airways (Table 8 and Figure 2). One experiment observed two differences in two independent experiments in which two animals received rcp 45, four received rcp 45-456, and the second experiment administered each virus to two animals.

^a 표시된 양의 바이러스를 코와 기관 내에 각 부위마다 1ml 접종하였다. ^{a The} indicated amount of virus was inoculated 1 ml at each site in the nose and trachea.

^b 평균 피이크 바이러스 역가(log₁₀ TCID₅₀/ml). 바이러스 역가는 32℃에서 LLC-MK2 세포상의 TCID₅₀에 의하여 결정하였다. ^b Average peak virus titer (log ₁₀ TCID ₅₀ / ml). Virus titers were determined by TCID ₅₀ on LLC-MK2 cells at 32 ° C.

^c 표시된 값들 간의 통계적 유효차: p < 0.025 (스튜던트 t-검정) ^c Statistical valid difference between the indicated values: p <0.025 (Student's t-test)

^d 표시된 값들 간의 통계적 유효차: p < 0.01 (스튜던트 t-검정) ^d Statistical valid difference between the indicated values: p <0.01 (Student's t-test)

^e piv3의 Wt JS (1992년 홀 등이 제시한 데이타 참조)
^e Wt JS from piv3 (see data from 1992 et al.)

매일 상기도에 바이러스를 세딩한 패턴을 비교한 것은 rcp45-456 바이러스가 rcp45와 비교하여 더 낮은 피크 역가에 도달하나, 그 세딩은 더 천천히 감소함을 나타내었다 (도 2). 이 패턴은 비인간 영장류에서의 RSV 돌연변이체에 대한 증가된 어테뉴에이션 수준의 특징을 보여준다 (Prince et al., Infect. Immun. 26(3):1009-13, 1979). 이러한 증가된 어테뉴에이션 수준은 또한 명백히 낮은 평균 피크 비루 스코어에 반영되었다 (표 8). 따라서, rcp45로의 F456L 돌연변이의 도입은 침팬지의 호흡기에 대한 어테뉴에이션의 증가를 가져온다.Comparing the pattern of virus seeding in the upper airway daily showed that the rcp 45-456 virus reached a lower peak titer compared to rcp 45, but the seeding decreased more slowly (FIG. 2). This pattern is characterized by increased attenuation levels for RSV mutants in nonhuman primates (Prince et al., Infect. Immun. 26 (3): 1009-13, 1979). This increased attenuation level was also reflected in the apparently low mean peak virucity score (Table 8). Thus, the introduction of the F456L mutation into rcp 45 results in increased attenuation of the chimpanzee's respiratory tract.

rcprcp 45 및 45 and rcprcp 45-456의 ts 표현형은 침팬지에서 복제 후에 유지된다. The ts phenotype of 45-456 is maintained after replication in chimpanzees.

rcp45-456 및 rcp45로 감염시킨 침팬지로부터 얻은 단리물의온도 감수성 수준을 2 개의 재조합체가 그 ts 표현형을 복제 후에도 고수용성 숙주에서 유지하는지를 측정하기 위하여 검사하였다. 다량의 단리물을 얻었으므로, 2 연구로부터의 단리물을 별도로 평가하였다. 실험 1에서의 2 마리 개별 동물로부터의 단리물 분석을 표 9에 나타내었고, 모든 동물의 요약을 표 10에 나타내었다. 동일한 대조 바이러스 현탁액의 온도 민감성 수준은 2 실험에서 1℃ 다르며 (표 10), 이는 검정에서 실험의 가변성을 나타낸다. 실시예에 대해서는, rcp45-456 대 rcp45에 대해 플라크가 관찰되지 않는 온도는 실험 2에서 각각 39℃ 및 40℃인 것과 비교하여 실험 1에서 각각 38℃ 및 39℃였다 (표 10). 이러한 실험의 가변성 수준은 종종 관찰된다. 중요하게는, 모든 실험에서 rcp45-456과 rcp45 간의 플라크 형성의 차단 온도 차이는 1℃로 일관된다. 2 연구 간의 실험의 가변성 때문에, 이들을 표 10에 별도로 요약하였다. 각 단리물은 ts 표현형을 유지하였고, 단리물의 온도 민감성 수준은 침팬지의 호흡기에서의 복제 도중에 걸쳐서 대조 주입 바이러스의 것과 다르지 않았다. 명백하게는, 38℃ 및 39℃에서의 rcp45-456 단리물의 플라킹(plaquing) 퍼센트는 rcp45 단리물의 것보다 낮으며, 이는 시험관내에서 관찰된 rcp45-456의 더 높은 수준의 온도 민감성이 생체내에서 복제 후 유지됨을 나타낸다. Temperature susceptibility levels of isolates from chimpanzees infected with rcp 45-456 and rcp 45 were examined to determine if two recombinants retained their ts phenotype in a highly water soluble host even after replication. Since a large amount of isolates were obtained, the isolates from the 2 studies were evaluated separately. Isolates from two individual animals in Experiment 1 are shown in Table 9 and a summary of all animals is shown in Table 10. The temperature sensitivity level of the same control virus suspension differed by 1 ° C. in 2 experiments (Table 10), which indicates the variability of the experiments in the assay. For the examples, the temperatures at which no plaques were observed for rcp 45-456 versus rcp 45 were 38 ° C. and 39 ° C. in Experiment 1, respectively, compared to 39 ° C. and 40 ° C. in Experiment 2 (Table 10). The level of variability of these experiments is often observed. Importantly, in all experiments the blocking temperature difference in plaque formation between rcp 45-456 and rcp 45 is consistent at 1 ° C. Because of the variability of the experiments between the two studies, they are summarized separately in Table 10. Each isolate maintained the ts phenotype, and the temperature sensitivity level of the isolate was not different from that of the control injection virus during replication in the chimpanzee's respiratory tract. Clearly, the percent plaking of rcp 45-456 isolates at 38 ° C. and 39 ° C. is lower than that of rcp 45 isolates, indicating that higher levels of temperature sensitivity of rcp 45-456 observed in vitro It is maintained after replication in vivo.

^a 대조군 바이러스 현탁액(연구 번호 1) ^a control virus suspension (study number 1)

^b 대조군 바이러스 현탁액(연구 번호 2; 표 10 참조) ^b control virus suspension (study number 2; see Table 10)

^c 32℃의 LLC-MK2 세포 내에 침팬지 비강인두 스웝과 기관 세척 시료를 통과시킨 후 바이러스 단리물을 수득하였다. ^c Virus isolates were obtained after passing chimpanzee nasopharyngeal swabs and tracheal lavage samples into LLC-MK2 cells at 32 ° C.

^d 표시된 온도에서 6일 동안 LLC-MK2 단일층 배양물 상에서 바이러스 단리물의 역가를 측정하고, 항 HPOV3 HN 모노클로날 항체를 사용하여 임뮤노퍼옥시다아제를 사용하여 플라크의 수를 세었다. ND = 검출 안함. ^d Titer of virus isolates on LLC-MK2 monolayer cultures at the indicated temperatures for 6 days and plaques were counted using immunooxidase using anti-HPOV3 HN monoclonal antibody. ND = not detected.

단리물을 실험 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 하여 수득하였고 표시된 온도에서의 플라크 형성 효율에 의하여 플라크 형성의 셧-오프 온도를 측정하였다(실험재료 및 방법 및 표 9 참조). The isolate was obtained as described in Experimental Materials and Methods and the shut-off temperature of plaque formation was measured by plaque formation efficiency at the indicated temperatures (see Experimental Materials and Methods and Table 9).

^a 총수는 18개의 비강인두와 2개의 기관 세척 단리물이 포함한다. ^A total number includes 18 nasal pharynx and two tracheal lavage isolates.

^b 총수는 39개의 비강인두와 3개의 기관 세척 단리물이 포함한다. ^b Total number includes 39 nasal pharynx and 3 tracheal lavage isolates.

^c 총수는 20개의 비강인두와 5개의 기관 세척 단리물이 포함한다. ^{c The} total number includes 20 nasal pharynx and 5 tracheal lavage isolates.

^d 총수는 21개의 비강인두와 1개의 기관 세척 단리물이 포함한다.
^d Total number includes 21 nasal pharynx and 1 tracheal lavage isolate.

상기 결과는 RSV cpts530에서의 돌연변이, 즉 L 단백질 중의 521 위치의 부모형 페닐알라닌의 치환은 PIV3의 L 단백질 중의 상응하는 위치 (456)에 도입되었을 때 유사한 수준의 온도 민감성 및 어테뉴에이션를 부여함을 증명한다. RSV 및 PIV3는 파라믹소바이러스 과 내의 별개의 아과, 즉 각각 뉴모비리나에 및 파라믹소비리나에를 대표한다. 2 바이러스는 특히 아미노 말단 (RSV의 aa 422-938 및 PIV3의 357-896)에 인접한 약 540-570 아미노산 구역에 그들의 L 단백질에 대해 명료하고 통계적으로 유의성 있는 서열 연관성을 공유하고 (Stec et al., virology. 183:273-287 (1991)), 포치(Poch) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 5:1153-62 (1990); 및 Stec et al. Virology 183:273-287 (1991)]에 기술된 4 개의 고도로 보존된 폴리머라제 모티프를 포함한다. RSV의 521 위치 및 PIV3의 456 위치에서 본원에 기술한 돌연변이는 이 일반적 구역 내에 있으나, 포치(Poch) 등에 의해 확인된 첫번째 보존 모티프의 약 175 잔기 상류에 있다. 현저히, 본 연구에서 시험한 13 개의 이형 파라믹소바이러스 중에서 이 잔기는 이 위치의 12 잔기 C-말단에 위치한 류신 잔기 로서 (도 1, 패널 A) 엄격히 보존되어 있다. 이러한 엄격한 보존에도 불구하고, RSV cpts530 돌연변이체 중의 521 L 돌연변이를 먼저 확인하는 것 및 이 돌연변이를 HPIV3 L 단백질 중의 보존된 위치에 성공적으로 전달하는 것 없이는, PIV3 L 단백질의 아미노산 서열 중의 2233 위치 중에서도 이 잔기가 잠정적 치사 어테뉴에이션 재조합체를 생성하는 돌연변이 발생의 적합한 표적 부위임을 예측하는 것이 가능할 수 없다. 이들 결과를 고려하여, 본 발명의 방법을 다양한 모노네가바이랄 멤버, 특히 파라믹소바이러스에서 근래 확인된 다수의 어테뉴에이션 돌연변이를 포함하도록 확장하는 것이 가능하다 (Bukreyev et al., J. Virol. 71(12), 8973-8982 (1997); Garcin et al., Virology 238(2):424-431 (1997); Juhasz et al., Vaccin 17:1416-1424 (1999); Juhasz et al., J. Virol. 71(8):5814-5819 (1997); Kato et al., EMBO J. 16(3):578-587(1997a); Kato et al., J. Virol. 71(10):7266-7272(1997b); Kondo et al., J. Biol Chem. 268(29):21924-21930(1993); Kurotani et al., Genes Cells 3(2):111-124 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3):1762-8 (1998); Whitehead et al., J. Virol. 73:871-899 및 73:3438-3442 (1999); Whitehead et al., Virology 247(2):232-239 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 73(2):871-877 (1999b); Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471 (1998b), 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 삽입됨).The results demonstrate that mutations in RSV cpts530, ie substitutions of the parental phenylalanine at position 521 in the L protein, confer similar levels of temperature sensitivity and attenuation when introduced at the corresponding position 456 in the L protein of PIV3. . RSV and PIV3 represent separate subfamily within the Paramyxovirus family, namely Pneumovirinae and Paramyxovirena, respectively. 2 viruses share a clear and statistically significant sequence association for their L protein, particularly in the about 540-570 amino acid region adjacent to the amino terminus (aa 422-938 of RSV and 357-896 of PIV3) (Stec et al. , virology. 183: 273-287 (1991)), Poch et al. Gen. Virol. 5: 1153-62 (1990); And Stec et al. Virology 183: 273-287 (1991), which includes four highly conserved polymerase motifs. The mutations described herein at position 521 of RSV and position 456 of PIV3 are within this general region, but about 175 residues upstream of the first conserved motif identified by Poch et al. Notably, among the 13 heterologous paramyxoviruses tested in this study, this residue is strictly conserved as a leucine residue located at the 12 residue C-terminus of this position (FIG. 1, Panel A). Despite this stringent conservation, among the 2233 positions in the amino acid sequence of the PIV3 L protein, without first identifying the 521 L mutation in the RSV cpts 530 mutant and successfully delivering this mutation to the conserved position in the HPIV3 L protein, It may not be possible to predict that this residue is a suitable target site for mutagenesis to generate potential lethal attenuated recombinants. In view of these results, it is possible to extend the method of the present invention to include a number of attenuation mutations that have been recently identified in various mononegaviral members, particularly paramyxoviruses (Bukreyev et al., J. Virol. 71). (12), 8973-8982 (1997); Garcin et al., Virology 238 (2): 424-431 (1997); Juhasz et al., Vaccin 17: 1416-1424 (1999); Juhasz et al., J Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); Kato et al., EMBO J. 16 (3): 578-587 (1997a); Kato et al., J. Virol. 71 (10): 7266 -7272 (1997b); Kondo et al., J. Biol Chem. 268 (29): 21924-21930 (1993); Kurotani et al., Genes Cells 3 (2): 111-124 (1998); Skiadopoulos et al J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Whitehead et al., J. Virol. 73: 871-899 and 73: 3438-3442 (1999); Whitehead et al., Virology 247 ( 2): 232-239 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 73 (2): 871-877 (1999b); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b Each of which is incorporated herein by reference).

본 발견은 신규 PIV 백신 후보물을 제공하고, 또한 돌연변이가 보존된 모잔기/위치에 맵핑된 RSV에서 다른 파라믹소바이러스로의 어테뉴에이션 돌연변이의 전달을 가능케한다. 이러한 관점에서 또한, RSV의 521 L 돌연변이는 근래 개발된 헤 마글루티닌-뉴라미니다제 (HN) 및 PIV1의 것에 의해 대체된 JS wt PIV3의 F 유전자를 갖는 키메릭 PIV3 재조합체로 수입될 여지가 있다 (Tao et al., J. Virol. 72(4), 2955-2961 (1998), 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 이 키메릭 재조합체는 그 돌연변이가 총체적으로 PIV HN 및 JS wt PIV3 배경 내에 치환된 F 유전자를 지닌 감염성, 어테뉴에이션 키메릭 PIV3-1 클론 내에 삽입된 (F 및 HN 유전자에서 발생한 3 개의 돌연변이를 제외함), cp45 돌연변이체에서 확인된 1 이상의 추가 돌연변이를 삽입함으로써 더 어테뉴에이션될 수 있다.This finding provides new PIV vaccine candidates and also enables the transfer of attenuation mutations from RSV to other paramyxoviruses mapped to the mozan group / location where mutations were conserved. In this regard, too, the 521 L mutation of RSV has room to be imported into chimeric PIV3 recombinants with the F gene of JS wt PIV3 replaced by the recently developed hemagglutinin-neuramidase (HN) and PIV1's. (Tao et al., J. Virol. 72 (4), 2955-2961 (1998), incorporated herein by reference). This chimeric recombinant excludes three mutations that occurred in the F and HN genes whose mutations were inserted in an infectious, attenuated chimeric PIV3-1 clone with the F gene totally substituted within the PIV HN and JS wt PIV3 backgrounds. Can be further attenuated by inserting one or more additional mutations identified in the cp45 mutant.

<실시예 III>Example III

센다이 바이러스의 C 단백질 중의 어테뉴에이션된 돌연변이를 재조합 HPIV3 백신 후보물에 이형 전달Heterologous delivery of attenuated mutations in the C protein of Sendai virus to recombinant HPIV3 vaccine candidates

본 실시예는 170 위치가 페닐알라닌 (F)에서 세린 (S)로 치환된 것으로 표시된 센다이 바이러스 (SeV)의 C 단백질에서의 공지된 어테뉴에이션된 돌연변이 (Itoh et al., J. Gen. Virol. 78:3207-3215 (1997), 본원에 참고문헌으로 삽입됨)를 재조합 HPIV3 클론의 상응하는 위치로 이형 전달하는 것을 설명한다. 상기 기술하고, 표 4에서 설명한 바와 같이, F170 부모형 서열 요소는 그 요소가 SeV 및 BPIV-3에서 또한 보존된 HPIV3 C 단백질 중의 동일하게 보존된 서열 위치/잔기 F164로 맵핑된다.This example shows a known attenuated mutation (Itoh et al., J. Gen. Virol. 78) in the C protein of Sendai virus (SeV) indicated that the 170 position is substituted with serine (S) in phenylalanine (F). : 3207-3215 (1997), incorporated herein by reference, describes heterologous delivery to the corresponding position of the recombinant HPIV3 clone. As described above and described in Table 4, the F170 parental sequence element maps to an identically conserved sequence position / residue F164 in the HPIV3 C protein whose elements are also conserved in SeV and BPIV-3.

SeV의 F170S 돌연변이를 164 위치의 아미노산을 페닐알라닌 (F)에서 세린 (S)로 변화시키는 HPIV3의 C ORF로의 점 돌연변이의 도입에 의해 재조합 HPIV3 바이러스 rF164S로 전달하였다. 얻어진 rF164S 재조합체는 놀랍게도 하기도 보다 상 기도에서 더 어테뉴에이션되었다. 이 패턴은 온도 민감성 어테뉴에이션 돌연변이에서 나타난 바와 반대되며, 이에 의하면 재조합, 생-어테뉴에이션 백신 바이러스의 본 신규 돌연변이에 포함되는 것은 상기도에서의 잔여 병독성을 감소시키는데 유용할 것이다. rF164S 재조합체는 또한 야생형 HPIV3로의 감염에 대해 보호를 제공한다.The F170S mutation of SeV was transferred to recombinant HPIV3 virus rF164S by the introduction of a point mutation of HPIV3 into the C ORF, which changes the amino acid at position 164 from phenylalanine (F) to serine (S). The rF164S recombinants obtained were surprisingly more attenuated in the upper airways than surprisingly. This pattern is reversed to that seen in temperature sensitive attenuation mutations, whereby inclusion in this new mutation of a recombinant, live-attenuation vaccine virus would be useful to reduce residual virulence in the upper airways. rF164S recombinants also provide protection against infection with wild type HPIV3.

HPIV3의 P 및 C 단백질은 mRNA 중의 별개의 오버래핑 ORFs로부터 번역된다 (도 3). 모든 파라믹소바이러스가 P 단백질을 코딩하는 반면, 단지 레스피로바이러스 (Respirovirus) 및 모르빌리바이러스 (Morbillivirus) 속의 멤버만이 C 단백질을 코딩한다. 개별 바이러스는 C ORF로부터 발현되는 단백질의 수 및 바이러스의 시험관내 및 생체내 복제의 중요성에서 다르다. 센다이 바이러스 (SeV)는 C ORF로부터 4 개의 독립적으로 개시되는 단백질인 C', C, Y1 및 Y2를 발현하고, 그 번역 개시 부위는 mRNA에서 이 순서대로 나타나는 반면 (Curran, et al., Enzyme 44:244-9 (1990); Lamb et al., p. 181-214, in D. Kingsbury (ed.), The Paramyxoviruses, Plenum Press, New York (1991)), HPIV3 및 홍역 바이러스 (MeV)는 단지 단일 C 단백질을 발현한다 (Bellini et al., J. Virol. 53:908-19 (1985); Sanchez et al., Virology. 147:177-86 (1985); Spriggs et al., J. Gen. Virol. 67:2705-2719 (1986)).P and C proteins of HPIV3 are translated from separate overlapping ORFs in mRNA (FIG. 3). While all paramyxoviruses encode P proteins, only members of the genus Respirovirus and Morbillivirus encode C proteins. Individual viruses differ in the number of proteins expressed from the C ORF and the importance of in vitro and in vivo replication of the virus. Sendai virus (SeV) expresses four independently initiated proteins C ′, C, Y1 and Y2 from C ORF, and their translation initiation sites appear in this order in mRNA (Curran, et al., Enzyme 44 : 244-9 (1990); Lamb et al., P. 181-214, in D. Kingsbury (ed.), The Paramyxoviruses, Plenum Press, New York (1991)), HPIV3 and measles virus (MeV) Expresses a single C protein (Bellini et al., J. Virol. 53: 908-19 (1985); Sanchez et al., Virology. 147: 177-86 (1985); Spriggs et al., J. Gen. Virol. 67: 2705-2719 (1986)).

모든 4 가지 C-유도 단백질이 제거된 가변성 재조합 SeV는 시험관내에서 극도로 비효율적으로 복제되는 것이 발견된 반면 (Kurotani et al., Genes Cells 3:111-124 (1998)), 개별 C 단백질의 제거는 복합 효과를 갖는다 (Cadd et al., J. Virol. 70:5067-74 (1996); Curran et al., Virology 189:647-56 (1992); Latorre et al., J. Virol. 72:5984-93 (1998)).Variable recombinant SeVs with all four C-derived proteins removed have been found to replicate extremely inefficiently in vitro (Kurotani et al., Genes Cells 3: 111-124 (1998)), whereas removal of individual C proteins Has a complex effect (Cadd et al., J. Virol. 70: 5067-74 (1996); Curran et al., Virology 189: 647-56 (1992); Latorre et al., J. Virol. 72: 5984-93 (1998).

C 단백질의 170 위치 아미노산에서 페닐알라닌 (F)가 세린 (S)로 치환된 단일 점 돌연변이를 지닌 재조합 SeV는 생쥐에서 어테뉴에이션되었으나, 세포 배양에서의 복제는 손상되지 않았다 (Garcin et al., Virology 238:424-431 (1997); Itoh et al., J. Gen. Virol. 78:3207-15 (1997)). SeV와 현저히 다르게, C-마이너스 홍역 바이러스 (MeV)는 인간 말초 혈액 세포에서는 복제의 제한을 나타내고, 생체내에서는 단지 다소 어테뉴에이션되어 나타나기는 하지만 (Escoffier et al., J. Virol. 73:1695-8 (1999); Valsamakis et al., J. Virol. 72:7754-61 (1998)), 베로(Vero) 세포에서 효과적으로 복제된다 (Radecke et al., Virology 217:418-21 (1996)).Recombinant SeV with a single point mutation with phenylalanine (F) substituted with serine (S) at position 170 amino acid of C protein was attenuated in mice, but replication in cell culture was not impaired (Garcin et al., Virology 238). : 424-431 (1997); Itoh et al., J. Gen. Virol. 78: 3207-15 (1997)). Significantly different from SeV, C-minus measles virus (MeV) represents a restriction of replication in human peripheral blood cells and appears only somewhat attenuated in vivo (Escoffier et al., J. Virol. 73: 1695- 8 (1999); Valsamakis et al., J. Virol. 72: 7754-61 (1998)), which are effectively replicated in Vero cells (Radecke et al., Virology 217: 418-21 (1996)).

동물에서의 다양한 MeV 및 SeV C 돌연변이의 변경된 복제는 이 단백질이 생 어테뉴에이션 HPIV3 백신의 개발에 유용한 어테뉴에이션 돌연변이의 도입을 위한 잠재적 표적임을 암시한다. 본 실시예에서, 역 유전적 방법을 사용하여 이형 어테뉴에이션 SeV 돌연변이체 중의 아미노산 170 위치에서의 F→S 변화에 상응하는 아미노산 164 위치에서의 F→S 변화를 발생시키는 HPIV3의 C ORF로 돌연변이를 도입하였다.Altered replication of various MeV and SeV C mutations in animals suggests that this protein is a potential target for the introduction of attenuation mutations useful in the development of live attenuation HPIV3 vaccines. In this example, the mutation is reversed using a reverse genetic method to C ORF of HPIV3 which results in a F → S change at amino acid 164 corresponding to a F → S change at amino acid 170 in a heterologous attenuation SeV mutant. Introduced.

세포 및 바이러스Cells and viruses

HEp-2 및 유인원 LLC-MK2 단층 세포 배양을 2% 소 태아 혈청, 겐타마이신 술페이트 (50 ㎍/ml), 및 4 mM 글루타민을 보강한 OptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 유지시켰다. 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 개질된 우두 균주 안카라(Ankara) (MVA) 재조합 바이러스는 와이어트 (L. Wyatt) 및 모스 (B. Moss) 박사에 의해 관대하게 제공된다 (Wyatt et al., Virology 210:202-205 (1995)). PIV의 JS 야생형 (wt) 균주 및 그 약독하된 ts 유도체인 JS cp45는 앞서 기술한 대로 LLC-MK2 세포에서 증식시켰다 (Hall et al., Virus Res. 22:173-184 (1992)).HEp-2 and apes LLC-MK2 monolayer cell cultures were maintained in OptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) supplemented with 2% fetal bovine serum, gentamycin sulfate (50 μg / ml), and 4 mM glutamine. Modified vaccinia strain Ankara (MVA) recombinant virus expressing bacteriophage T7 RNA polymerase is generously provided by Dr. L. Wyatt and B. Moss (Wyatt et al., Virology 210: 202-205 (1995). JS wild type (wt) strain of PIV and its attenuated ts derivative JS cp45 were propagated in LLC-MK2 cells as described above (Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992)).

cDNAscDNAs

JS wt 바이러스의 완전 15462 nt 안티게놈 {p3/7(131)2G}를 코딩하는 전체 길이 cDNA는 앞서 기술하였다 (진뱅크 평가 #Z11575) (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997)). 이 클론은 C ORF의 아미노산 164 위치에서 페닐알라닌의 세린으로의 변화를 코딩하는 돌연변이된 cDNA의 구성용 주형으로서 사용하였다 (표 11, 도 3). p3/7(131)2G (PIV3 안티게놈의 nt 1215-3903)의 PmII 내지 BamHI 단편을 다중 클로닝 구역에 PmII 부위를 포함하도록 개질된 플라스미드 pUC19 {pUC119(PmII-BamHI)}로 서브클로닝하였다. 이어서, 위치-지정 돌연변이유발 (Site-directed mutagenesis)을 쿤켈(Kunkel)의 방법 (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382,1987)을 사용하여 pUC119(PmII-BamHI)에 수행하여 C ORF에 돌연변이를 도입하였다. Full length cDNA encoding the full 15462 nt antigenome {p3 / 7 (131) 2G} of the JS wt virus was described above (Genbank Assessment # Z11575) (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997) ). This clone was used as a constituent template for mutated cDNA encoding the change of phenylalanine to serine at amino acid 164 position of C ORF (Table 11, Figure 3). PmII to BamHI fragments of p3 / 7 (131) 2G (nt 1215-3903 of PIV3 antigenome) were subcloned into plasmid pUC19 {pUC119 (PmII-BamHI)} modified to include PmII sites in multiple cloning zones. Site-directed mutagenesis were then performed on pUC119 (PmII-BamHI) using Kunkel's method (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382,1987). Mutations were introduced in the ORF.

(¹ 돌연변이된 구역의 뉴클레오타이드 서열을 나타내고 야생형 (wt) 서열과 비교하였다. 서열의 첫번째 뉴클레오타이드는 완전 항게놈 RNA 중의 위치에 따라서 번호를 매겼다. 봉쇄된 서열은 P 오픈 리딩 프레임이다. 밑줄친 뉴클레오타이드는 HP103에 대해 아미노산 164 위치에서의 C ORF에 대한 코돈이다.)
⁽¹ shows the nucleotide sequence of the mutated zone were compared with wild type (wt) sequence. The first nucleotides of the sequence are priced the number according to the position of full anti-genomic RNA. The blocked sequence is P open reading frame. The underlined nucleotides Codon for C ORF at amino acid 164 position for HP103.)

C ORF에 F164S 돌연변이를 갖는 바이러스를 코딩하는 안티게놈 cDNA의 구성 (rF164S)Construction of Antigenome cDNA Coding Virus with F164S Mutation in C ORF (rF164S)

C ORf의 아미노산 164 위치에서의 페닐알라닌 (F)의 세린 (S)로의 변화는 전체 길이 안티게놈의 nt 2284 위치에서 A의 G로의 변화를 도입한 돌연변이유발성 프라이머를 사용하여 생성하였다. 이 돌연변이는 또한 P ORF에서는 잠재적이었다. 전체 길이 클론의 PmII 내지 BamHI 단편을 전체로 시퀀싱하여 도입한 돌연변이의 존재를 확인하고, 다른 돌연변이가 부수적으로 도입되지 않았음을 확인하였다. 이어서, 단편을 상기 기술한 전체 길이 클론 p3/7(131)2G로 다시 별개로 클로닝하여 (Durbin et al., Viroloty. 235:323-332 (1997)) 안티게놈 cDNA 클론을 창조하였 다.The change of phenylalanine (F) to serine (S) at the amino acid 164 position of C ORf was generated using a mutagenic primer that introduced a change from A to G at the nt 2284 position of the full length antigenome. This mutation was also latent in P ORF. The PmII to BamHI fragments of full length clones were sequenced in whole to confirm the presence of the introduced mutations and to confirm that no other mutations were incidentally introduced. The fragments were then separately cloned back into the full length clone p3 / 7 (131) 2G described above (Durbin et al., Viroloty. 235: 323-332 (1997)) to create an antigenomic cDNA clone.

cDNA로부터 재조합 C F164S 돌연변이체의 회수Recovery of Recombinant C F164S Mutant from cDNA

C F164S 돌연변이를 지닌 전체 길이 안티게놈 cDNA를 6-웰 플레이트 상의 HEp-2세포로 리포펙트ACE (LipofectACE) (Life Technologies)를 사용하여 지지 플라스미드 {pTM(N), pTM (P no C), 및 pTM (L)}와 함께 트랜스펙션하고, 상기 기술한 MVA-T7으로 감염시켰다 (Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997). pTM (P no C)은 C ORF의 첫번째 아미노산을 메티오닌에서 트레오닌으로 변화시키는 것인, C 전사 개시 부위가 ATG에서 ACG로 돌연변이된 것을 제외하면, 상기 기술한 pTM(P) 플라스미드와 동일하다 (Durbin et al., Virology 234:74-83 (1997)). 32℃에서 3일 동안 인큐베이션한 후, 트랜스펙션 수확물을 T25 플라스크 중의 신선한 LLC-MK2 세포 단층으로 통과시켰고, 5일 동안 32℃에서 인큐베이션하였다 (통과 1로 지칭). F164S 수확물 중에 존재하는 바이러스의 양은 앞서 기술한 대로 PIV3 HN-특이적 모노클로날 항체로 면역퍼옥시다제 염색하여 플라크를 시각화하는 것으로 LLC-MK2 단층 배양에서의 플라크 타이트레이션에 의해 측정하였다 (Durbin et al., Virology. 235:323-332 (1997)).Full-length antigenome cDNA with C F164S mutations into HEp-2 cells on 6-well plates using support plasmids {pTM (N), pTM (P no C), and LipofectACE (Life Technologies), and pTM (L)} and infected with MVA-T7 as described above (Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997). pTM (P no C) is identical to the pTM (P) plasmid described above, except that the C transcription initiation site is mutated from ATG to ACG, which changes the first amino acid of C ORF from methionine to threonine (Durbin et al., Virology 234: 74-83 (1997)). After incubation at 32 ° C. for 3 days, the transfection harvest was passed through fresh LLC-MK2 cell monolayers in T25 flasks and incubated at 32 ° C. for 5 days (called Pass 1). The amount of virus present in the F164S harvest was determined by plaque titration in LLC-MK2 monolayer cultures by visualizing plaques by immunoperoxidase staining with PIV3 HN-specific monoclonal antibodies as described above (Durbin et al. al., Virology. 235: 323-332 (1997)).

이어서, 통과 1 수확물의 상층액에 존재하는 F164S 재조합 바이러스를 앞서 기술한 대로 LLC-MK2 세포에서 3회 플라크 정제하였다 (Hall et al., Virus Res. 22:173-184 (1992)). 이어서, 플라크 정제 3회에서 얻은 생물학적으로 클로닝한 재조합 바이러스를 32℃에서 LLC-MK2 세포에서 2회 증폭하여 더 특성화하기 위한 바이러스를 생산하였다. The F164S recombinant virus present in the supernatant of the Pass 1 harvest was then plaque purified three times in LLC-MK2 cells as described above (Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992)). The biologically cloned recombinant virus obtained from three plaque purifications was then amplified twice in LLC-MK2 cells at 32 ° C. to produce a virus for further characterization.

회수된 재조합 바이러스의 서열 분석Sequence analysis of recovered recombinant virus

바이러스를 앞서 기술한 대로 폴리에틸렌 글리콜 침강법에 의해 감염된 세포 단층으로부터 명료한 배지로부터 농축하였다 (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997)). RNA를 제조자가 추천하는 과정에 따라서 TRIzol 시약 (Life Technologies)로 정제하였다. RT-PCR을 추천된 프로토콜에 따라서 어드벤티지 (Advantage) PCR 용 RT 키트 (Clontech, Palo Alto, CA)로 수행하였다. 대조 반응은 PCR 생성물이 단지 바이러스 RNA로부터만 유래하고, 가능한 오염성 cDNA 플라스미드로부터 유래하지 않는다는 것을 확인하기 위하여 반응으로부터 역 전사효소를 제외시킨 것 외에는 동일하였다. 프라이머는 전체 길이 항게놈의 뉴클레오타이드 1595-3104에 걸친 PCR 단편을 생성하기 위해 사용하였다. 이 단편은 재조합 바이러스의 완전한 C, D 및 V ORF를 포함한다. 이어서, 얻은 PCR 생성물을 시클릭 디데옥시뉴클레오타이드 서열 분석을 이용하여 시퀀싱하였다 (New England Biolabs, Beverly, MA).Virus was concentrated from clear media from infected cell monolayers by polyethylene glycol settling as described previously (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)). RNA was purified with TRIzol reagent (Life Technologies) following the procedure recommended by the manufacturer. RT-PCR was performed with the RT kit for Advantage PCR (Clontech, Palo Alto, CA) according to the recommended protocol. The control reaction was the same except that the reverse transcriptase was excluded from the reaction to confirm that the PCR product was only derived from viral RNA and not from possible contaminating cDNA plasmids. Primers were used to generate PCR fragments over nucleotides 1595-3104 of full length antigens. This fragment contains the complete C, D and V ORFs of the recombinant virus. The resulting PCR product was then sequenced using cyclic dideoxynucleotide sequencing (New England Biolabs, Beverly, Mass.).

면역침강에 의한 단백질 분석Protein Analysis by Immunoprecipitation

2 개의 PIV3 C-특이적 항혈청을 2 개의 상이한 C 펩티드 (Research Genetics, Huntsville, AL)에 대하여 다중 항원 펩티드 (MAP) 기술에 의해 토끼에서 모았다. 2 개의 펩티드는 C 단백질의 아미노산 구역 30-44 및 60-74에 걸쳤다. 각 C 펩티드의 카피 8 개를 분지쇄 담체 코어에 놓았으며, 별도로 토끼 (펩티드 당 2 마리 토끼)에 프로인트 아주반트와 주사하였다. 토끼는 2 및 4 주에 지정한 MAP로 부양(boost)하였으며, 4, 8 및 10 주에 채혈하였다. 각 항혈청은 고역가에서 면원원으로 사용된 C 펩티드를 인식하였으며, 방사성면역침강 검정 (RIPA)에서 HPIV3 감염된 세포로부터 C 단백질을 침강시켰다.Two PIV3 C-specific antiserum were collected in rabbits by multiple antigen peptide (MAP) technique against two different C peptides (Research Genetics, Huntsville, AL). The two peptides span the amino acid regions 30-44 and 60-74 of the C protein. Eight copies of each C peptide were placed in a branched chain carrier core and injected separately with Freund's adjuvant in rabbits (two rabbits per peptide). Rabbits were boosted with designated MAP at 2 and 4 weeks and blood was collected at 4, 8 and 10 weeks. Each antiserum recognized a C peptide used as a source for high titers and precipitated C protein from HPIV3 infected cells in a radioimmunoprecipitation assay (RIPA).

LLC-MK2 세포의 T25 세포 단층은 각각 rF164S, 재조합 JS wt 바이러스 (rJS)로 복수 감염 (MOI) 5로 감염시키거나 또는 거짓 감염시켰고, 32℃에서 인큐베이션하였다. 감염 후 24 시간에, 단층을 메티오닌-마이너스 DMEM (Life Technologies)로 세척하고, 메티오닌-마이너스 DMEM 중의 10 μCi/㎕ 의 35S 메티오닌의 존재 중에서 추가 6 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수확하고, 3회 세척하였으며, 1 ml RIPA 완충액 {1% (w/v) 나트륨 디옥시콜레이트, 1% (v/v) 트리톤 X-100, 0.2% (w/v) SDS, 150 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4} 중에 재현탁하고, 동결-해빙하였으며, 6500XG에서 펠렛화하였다. 세포 추출물을 신선한 에펜도르프 관에 전달하였으며, 양 C 항혈청 (각각 5 ㎕)의 혼합물을 각 시료에 가하고, 2 시간 동안 4℃에서 일정하게 혼합하면서 인큐베이션하였다. HPIV3의 HN 당단백질을 인식하는 mAB 454/11 및 101/1의 혼합물 10 ㎕를 각 시료에 가하여 회수된 바이러스가 실제로 HPIV3임을 확인하였다. 면역 복합체를 각 시료에 200 ㎕의 단백질 A 세파로즈 비드의 10% 현탁액 (Sigma, St. Louis, MO)을 가하고, 이어서 4℃에서 밤새 일정하게 혼합하여 침강시켰다. 각 시료를 제조자의 추천에 따라서 4-12% 폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE, Novex, San Diego, CA) 상에서 변성, 감소 및 분석하였다. 겔을 건조시키고 오토라디오그라피로 분석하였다.T25 cell monolayers of LLC-MK2 cells were infected or falsely infected with multiple infections (MOI) 5 with rF164S, recombinant JS wt virus (rJS), respectively, and incubated at 32 ° C. Twenty four hours after infection, monolayers were washed with methionine-minus DMEM (Life Technologies) and incubated for an additional 6 hours in the presence of 10 μCi / μl of 35S methionine in methionine-minus DMEM. Cells were then harvested, washed three times, 1 ml RIPA buffer {1% (w / v) sodium dioxycholate, 1% (v / v) Triton X-100, 0.2% (w / v) SDS, Resuspend in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4}, freeze-thaw and pellet at 6500 × G. Cell extracts were delivered to fresh Eppendorf tubes, and a mixture of both C antiserum (5 μl each) was added to each sample and incubated with constant mixing at 4 ° C. for 2 hours. 10 μl of a mixture of mAB 454/11 and 101/1 that recognizes the HN glycoprotein of HPIV3 was added to each sample to confirm that the recovered virus was indeed HPIV3. The immune complex was precipitated by adding 200 μl of a 10% suspension of Protein A Sepharose beads (Sigma, St. Louis, Mo.) to each sample followed by constant mixing overnight at 4 ° C. Each sample was denatured, reduced and analyzed on 4-12% polyacrylamide gel (NuPAGE, Novex, San Diego, Calif.) According to the manufacturer's recommendations. The gel was dried and analyzed by autoradiography.

rPIV3s의 다순환 복제Multicyclic Replication of rPIV3s

T25 플라스크 중의 LLC-MK2 세포의 단층을 0.1의 MOI에서 rF164S 또는 rJS로 이중으로 감염시키고, 32℃에서 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 250 ㎕ 시료를 각 플라스크로부터 24시간 간격으로 5일의 보존일 동안 제거하였고, 플래시 동결하였다. 당량 부피의 신선한 배지를 각 시간점에서 대체하였다. 각 시료를 7일 동안 32℃에서 인큐베이션한 96-웰 플레이트 중의 LLC-MK2 세포 단층에서 역가하였다. 바이러스를 혈구흡착(hemadsorption)으로 검출하고, log₁₀ TCID₅₀/ml로 보고하였다. Monolayers of LLC-MK2 cells in T25 flasks were double infected with rF164S or rJS at MOI of 0.1 and incubated at 32 ° C. with 5% CO ₂ . 250 μL samples were removed from each flask at 24 hour intervals for 5 days of retention and flash frozen. Equivalent volume of fresh medium was replaced at each time point. Each sample was titered in LLC-MK2 cell monolayers in 96-well plates incubated at 32 ° C. for 7 days. Virus was detected by hemadsorption and reported as log ₁₀ TCID ₅₀ / ml.

동물 연구Animal research

21 군의 4-6 주령 금색 시리안 햄스터를 rF164S, rJS, cp45 (JS wt 바이러스의 생물학적 유래 생 어테뉴에이션 유도체) 또는 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV) 10⁵ PFU를 함유하는 EMEM (Life Technologies)를 동물당 0.1 ml로 비강내 접종하였다. 접종 후 3, 4 및 5일 째에 RSV를 투여받은 것을 제외하고 각 군으로부터 5 마리의 햄스터를 희생시키고, 폐 및 비갑개를 수확하였다. 비갑개 및 폐를 균질화하여 L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD) 중의 각각 10% 또는 20% w/v 현탁액을 제조하고, 시료를 급속 동결하였다. 시료 중에 존재하는 바이러스를 32℃에서 7일 동안 인큐베이션시킨 LLC-MK2 세포 단층의 96 웰 플레이트에 역가하였다. 바이러스를 혈구흡착으로 검출하고, 각 날짜마다 5 마리 햄스터 각 군에 대해 평균 log₁₀ TCID₅₀/g을 계산하였다. 접종 후 0 및 28일에 각 군의 나머지 6마리 햄스터로부터 혈청을 수집하였다. 각 바이러스에 반응한 혈청 항체를 앞서 기술한 대로 혈구응집-억제 (HAI) 검정으로 평가하였다 (van Wyke Coelingh et al., Virology 143:569-582 (1985)). 28일 째에, RSV로 면역화한 것을 포함하여 각 군의 나머지 햄스터들을 생물학적 유래의 pIV3 JS wt 바이러스 10⁶ PFU를 비강내 감염시켰다. 동물을 감염 4일 째에 희생시키고, 폐 및 비갑개를 수집하고, 상기 기술한 대로 진행하였다. 시도 시료 중에 존재하는 바이러스의 양을 상기 기술한 대로 측정하였다.Groups of 4-6 week old gold Syrian hamsters were treated with rF164S, rJS, cp45 (a biologically derived live attenuation derivative of JS wt virus) or EMEM (Life Technologies) containing respiratory synstium virus (RSV) 10 ⁵ PFU. Intranasally inoculated at 0.1 ml per animal. Five hamsters were sacrificed from each group and lungs and nasal turbinates were harvested except that RSV was administered on days 3, 4 and 5 post inoculation. The nasal turbinates and lungs were homogenized to prepare 10% or 20% w / v suspension in L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, Md.), Respectively, and the samples were rapidly frozen. Virus present in the sample was titered into 96 well plates of LLC-MK2 cell monolayers incubated at 32 ° C. for 7 days. Virus was detected by hemocytosis and an average log ₁₀ TCID ₅₀ / g was calculated for each group of 5 hamsters each day. Serum was collected from the remaining 6 hamsters in each group at 0 and 28 days post inoculation. Serum antibodies in response to each virus were evaluated by hemagglutination-inhibition (HAI) assay as described previously (van Wyke Coelingh et al., Virology 143: 569-582 (1985)). On day 28, the remaining hamsters of each group, including immunization with RSV, were intranasally infected with pIV3 JS wt virus 10 ⁶ PFU from biological origin. Animals were sacrificed on day 4 of infection, lungs and nasal turbinates were collected and progressed as described above. The amount of virus present in the trial sample was measured as described above.

각 4 마리 동물의 군의 아프리카 그린 원숭이 (AGMs)를 레서스 원숭에에서의 선행 연구에 대해 앞서 기술한 바와 같이 각각 rF164S, JSwt 또는 cp45 10⁶ PFU로 비강내 또는 기관내에 접종하였다 (Durbin et al., Vaccin 16:1324-30 (1998)). 비인두 스웝 시료를 접종 후 연속적으로 12일 동안 매일 수집하였고, 기관 세척 시료를 접종 후 2, 4, 6, 8 및 10일 째에 수집하였다. 검체를 모든 검체가 수집될 때까지 플래시 동결하고 -70℃에서 저장하였다. 시료 중에 존재하는 바이러스를 32℃에서 7일 동안 인큐베이션시킨 96 웰 플레이트중의 LLC-MK2 세포 단층에서 역가하였다. 바이러스를 혈구흡착으로 검출하고, 각 날에 대해 평균 log₁₀ TCID₅₀/ml을 계산하였다. 시료를 0 및 28일 째에 각 원숭이로부터 수집하였고, 다양한 돌연변이체 및 PIV3 야생형 (JS) 로 실험적으로 감염시킨 것에 반응한 pIV3 HAI 항체를 측정하였다. 접종 후 28일째에, AGMs를 비강내 및 기관내로 1 ml 접종물 중에서 투여한 생물학적 유래의 PIV3 야생형 바이러스 10⁶ PFU로 감염시켰다. 비인두 스웝 시료를 시도 후 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 및 12일 째에 수집하였고, 기관 세척 시료를 시도 후 2, 4, 6, 8 및 10일 째에 수집하였다. 검체를 플래시 동결,저장하였고, 존재하는 바이러스를 상기 기술한 대로 역가하였다.African green monkeys (AGMs) from each of the four animal groups were inoculated intranasally or intratracheally with rF164S, JSwt or cp 45 10 ⁶ PFU, respectively, as described above for previous studies in rhesus monkeys (Durbin et al. al., Vaccin 16: 1324-30 (1998)). Nasopharyngeal swabs samples were collected daily for 12 consecutive days after inoculation, and tracheal lavage samples were collected 2, 4, 6, 8 and 10 days after inoculation. Samples were flash frozen until all samples were collected and stored at -70 ° C. Virus present in the samples was titered in LLC-MK2 cell monolayers in 96 well plates incubated at 32 ° C. for 7 days. Virus was detected by hemocytosis and an average log ₁₀ TCID ₅₀ / ml was calculated for each day. Samples were collected from each monkey on days 0 and 28, and pIV3 HAI antibodies were measured in response to experimental infection with various mutants and PIV3 wild type (JS). At 28 days post inoculation, AGMs were infected with biologically derived PIV3 wild type virus 10 ⁶ PFU administered in 1 ml inoculation intranasally and intratracheally. Nasopharyngeal swabs samples were collected on days 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, and 12 days after challenge, and tracheal lavage samples were collected on days 2, 4, 6, 8, and 10 days after challenge. Samples were flash frozen and stored and the virus present was titered as described above.

<결과><Result>

재조합 돌연변이 rF164S의 회수Recovery of Recombinant Mutant rF164S

HPIV3 항게놈 cDNA를 C 단백질 aa 잔기 164가 F에서 S로 변화된 돌연변이 바이러스 rF164S를 코딩하도록 제조하였다. 돌연변이는 오버래핑 P ORF에서 번역시 잠재적이다 (표 11).HPIV3 antigenomic cDNA was prepared to encode mutant virus r F164S with C protein aa residue 164 changed from F to S. Mutations are potential upon translation in overlapping P ORFs (Table 11).

안티게놈 cDNA를 3 개의 PIV3 지지 플라스미드 {pTM(P no C), pTM(N), pTM(L)와 함께 HEp-2 세포로 트랜스펙션시켰고, 세포를 동시에 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 MVA로 감염시켰다. C ORF에 돌연변이를 포함하는 rPIV3의 회수 효율을 재조합 JSwt PIV3 (rJS)로부터 상기 기술한 (Durbin et al., Virology 235:323-332 (1997)) 전체 길이 PIV3 항게놈을 발현하는 플라스미드인 p3/7(131)2G를 이용하여 유사하게 트랜스펙션-감염시킨 HEp-2 세포 배양의 것과 비교하였다. 3일 동안 32℃에서 인큐베이션한 후, 트랜스펙션된 세포를 수집하고, 상층액을 T25 플라스크 중의 LLC-MK2 세포의 신선한 단층을 통과시켰으며, 5일 동안 32℃에서 인큐베이션하였다 (통과 1). 32℃에서 5일 후, rJS 및 rF164S의 LLC-MK2 세포 단층은 3-4+ 세포병변 효과 (CPE)를 나타내었다. 플라크 단리에 의해 생물학적 클로닝 3 회 후, 재조합 돌연변이체를 LLC-MK2 세포에서 2회 증폭시켜 더 특성화하기 위한 현탁액을 제조하였다.Antigenome cDNA was transfected with HEp-2 cells with three PIV3 support plasmids {pTM (P no C), pTM (N), pTM (L), and cells were simultaneously transfected with MVA expressing T7 RNA polymerase. Infected. The recovery efficiency of rPIV3 containing mutations in the C ORF was determined from recombinant JSwt PIV3 (rJS) (Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)), p3 /, a plasmid expressing the full-length PIV3 antigenome described above. 7 (131) 2G was used to compare with that of similarly transfected-infected HEp-2 cell cultures. After incubation at 32 ° C. for 3 days, the transfected cells were collected and the supernatant passed through fresh monolayers of LLC-MK2 cells in T25 flasks and incubated at 32 ° C. for 5 days (pass 1). After 5 days at 32 ° C., LLC-MK2 cell monolayers of rJS and rF164S showed 3-4 + cytopathic effect (CPE). After three biological clonings by plaque isolation, the recombinant mutants were amplified twice in LLC-MK2 cells to prepare suspensions for further characterization.

회수된 바이러스가 실제로 예상된 rF164S 돌연변이체인지 확인하기 위하여, 클로닝된 바이러스를 C, D 및 V ORFs를 포함하는 P 유전자 부분을 포함하는 HPIV3 안티게놈의 DNA 스패닝 nt 1595-3104의 단편을 증폭하는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR에 의해 분석하였다. PCR 산물의 생성은 RT의 포함에 의존하며, 이는 오염된 cDNA가 아닌 RNA로부터 유래함을 나타낸다. 뉴클레오타이드 시퀀싱을 RT-PCR 산물에 대해 수행하여 도입한 돌연변이의 존재를 확인하였다. 도입한 돌연변이는 클로닝된 재조합체로부터 증폭된 RT-PCR 단편 스패닝 nt 1595-3104에 존재함을 학인하였고, 다른 부수적인 돌연변이는 발견되지 않았다.To confirm that the recovered virus is indeed the expected rF164S mutant, a pair of primers that amplify the cloned virus amplifying fragments of DNA spanning nt 1595-3104 of HPIV3 antigenome comprising a P gene portion comprising C, D and V ORFs. It was analyzed by RT-PCR. The production of the PCR product is dependent on the inclusion of RT, indicating that it is from RNA rather than contaminated cDNA. Nucleotide sequencing was performed on the RT-PCR product to confirm the presence of the introduced mutation. It was recognized that the introduced mutations were present in RT-PCR fragment spanning nt 1595-3104 amplified from cloned recombinants, and no other minor mutations were found.

방사성면역침강 검정 (RIPA)를 수행하여 rF164S 돌연변이 바이러스를 rJS wt 바이러스와 비교하였다. 세포를 감염시키고, 감염 후 24 내지 30 시간 35S 메티오닌의 존재 중에서 인큐베이션하고, 세포 용균물을 제조하였다. 당량의 총 단백질을 항-C 및 항-HN 항체와 인큐베이션하고, 이어서 항체를 단백질 A 세파로즈 비드에 결합시켰다. rJS 및 rF164S는 각각 HN 및 C 단백질 모두를 코딩하였다 (도 4). rF164S에 의해 발현된 C 단백질은 모 rJS에 의해 발현된 것과 동일한 크기로 나타났으며, 또한 유사한 양으로 발현되었다 (도 4).Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) was performed to compare rF164S mutant virus with rJS wt virus. Cells were infected and incubated in the presence of 35S methionine 24-30 hours post infection and cell lysates were prepared. Equivalent total protein was incubated with anti-C and anti-HN antibodies, and the antibody was then bound to Protein A Sepharose beads. rJS and rF164S encoded both HN and C proteins, respectively (FIG. 4). The C protein expressed by r F164S appeared to be the same size as expressed by the parent r JS and also expressed in similar amounts (FIG. 4).

세포 배양물 중의 In cell culture rr F164S의 복제Replication of the F164S

LLC-MK2 세포 단층의 이중 배양물을 0.1의 MOI에서 rF164S 또는 rJS로 감염시키고, 5일 동안 32℃에서 배양하였다. 각 배양으로부터의 배지를 24 시간 간격으로 시료를 취하였으며, 이 물질을 연속적으로 역가하여 세포 배양물 중의 각 바이러스의 복제를 평가하였다. rF164S의 복제는 바이러스 생산 속도 및 최종 역가 모두 (도 5) 뿐만 아니라 승온에서의 복제 능력을 고려할 때 부모형 rJS wt의 것과 본질적으로 구별할 수 없었다. Dual cultures of LLC-MK2 cell monolayers were infected with rF164S or rJS at a MOI of 0.1 and incubated at 32 ° C. for 5 days. Samples of media from each culture were taken at 24 hour intervals, and the material was titered continuously to assess replication of each virus in cell culture. Replication of r F164S was inherently indistinguishable from that of parental r JS wt given both virus production rate and final titer (FIG. 5) as well as replication ability at elevated temperatures.

햄스터에서의 Hamster rr F164S의복제Replica of F164S

rF164S 돌연변이 바이러스를 다음에 부모형 rJS wt와 햄스터의 상기도 및 하기도에서의 복제 능력에 대하여 비교하였다. 햄스터 군들을 생물학적 유래의 백신 후보물, rF164S 또는 cp45로 동물당 10⁵ PFU로 비강내 접종하였다. rJS와 비교하여, ^rF164S의 복제는 상기도에서는 100 내지 500 배 감소하였고, 햄스터의 하기도에서는 10 배 더 감소하였다 (표 12). rF164S 및 rJS로 감여시킨 햄스터는 HPIV3에 명백한 항체 반응을 가지며, PIV3 시도 바이러스의 복제 제한을 고수준으로 나타내었다 (표 13). r F164S mutant virus was then compared for replication ability in the upper and lower airways of the parental rJS wt and hamsters. Hamster groups were intranasally inoculated at 10 ⁵ PFU per animal with vaccine candidates of biological origin, r F164S or cp 45. Compared to rJS, replication of ^r F164S was reduced by 100-500 fold in the upper airways and 10-fold further in the lower respiratory tract of hamsters (Table 12). Hamsters wound with r F164S and r JS had a clear antibody response to HPIV3 and showed high levels of replication restriction of PIV3 challenge virus (Table 13).

¹ 표시된 바이러스 10⁵ pfu를 햄스터 5군에게 비강내 투여하였다. cp45는 생 물학적으로 유도된 바이러스이고, 다른 것들은 재조합 바이러스들이다.10 ⁵ pfu of ¹ indicated virus was administered intranasally to the hamster 5 group. cp45 is a biologically induced virus, others are recombinant viruses.

² 표준 오차 ² standard error

³ 다른 문자로 된 각 칼럼의 평균치들은 던칸의 다중 범위 검정에 의하여 유효한 차이(a=0.05)를 보임에 반해, 같은 문자로 된 것들은 유효한 차이를 보이지 않는다.The mean values for each column of ³ different characters show a valid difference (a = 0.05) by Duncan's multirange test, whereas those with the same character do not show a valid difference.

¹ 0일째 6 햄스터 군을 면역화시키는 데에 사용한 바이러스 ¹⁰ days after virus used for solidifying the immune hamster 6 group

² 28일째, 모든 햄스터들로부터 피를 뽑아 혈청 HAI 항체 역가를 측정하고 10⁶ pfu의 생물학적으로 유도된 JS wt HPIV3를 접종하였다. 접종 4일째 폐와 비갑개를 수득하였다.
On day ² 28, blood was drawn from all hamsters to measure serum HAI antibody titers and inoculated with 10 ⁶ pfu of biologically induced JS wt HPIV3. Lungs and nasal turbinates were obtained on day 4 of inoculation.

영장류에서의 In primates rr F164S의 복제Replication of the F164S

rF164의 어테뉴에이션 표현형 및 보호 효능을 더 평가하기 위하여, 이 재조합 돌연변이체를 4 마리 AGMs 군에 투여하였으며, 상기도 및 하기도에서의 복제를 cp45 및 JSwt와 비교하였다. rF164S의 복제는 AGMs의 상기도에서 100 배 이상 감소하였다. 상기도에서 이 바이러스에 대해 관찰된 어테뉴에이션를 cp45의 경우와 비교하였다 (표 14). rF164S는 AGMs의 하기도에서 중간 정도로 (<10 배) 제한되었다. 재조합 바이러스는 HPIV3에 반응하는 HAI 항체를 유도하였다 (표 14). 면역화된 AGMs는 28일 째에 IN 및 IT 투여로 생물학적 유래의 JS wt 바이러스 10⁶ PFU를 감염시켰다. rF164S 또는 cp45 백신 후보물을 받은 동물은 AGMs의 상기도 및 하기도 모두에서 시도 바이러스 복제에 대해 완전히 보호되었다.To further evaluate the attenuation phenotype and protective efficacy of rF164, this recombinant mutant was administered to a group of four AGMs, and replication in the upper and lower airways was compared with cp45 and JSwt. Replication of rF164S decreased more than 100-fold in the upper airway of AGMs. The attenuation observed for this virus in the upper air was compared with that of cp45 (Table 14). rF164S was moderately (<10 fold) limited in the lower airways of AGMs. Recombinant virus induced HAI antibodies in response to HPIV3 (Table 14). Immunized AGMs were infected with biologically derived JS wt virus 10 ⁶ PFU at 28 days with IN and IT administration. Animals receiving r F164S or cp 45 vaccine candidates were fully protected against challenge virus replication in both the upper and lower airways of AGMs.

¹ 0일째, AGMs에 대하여 표시된 바이러스 10⁶ pfu를 비강내, 기관내 투여하였다. ¹⁰ days, were administered in the virus within the 10 ⁶ pfu shown with respect to the AGMs nasal, institutions.

² 표준 오차 ² standard error

₃ 0일째의 평균 혈청 HAI 항체 역가는 ±2.0이었다.The average of serum HAI antibody titer was ₃₀ days ± 2.0.

⁴ 10⁶ pfu HPIV3 JS wt 바이러스를 모든 동물에게 28일째에 비강내, 기관내 투여하였다. ⁴ 10 ⁶ pfu HPIV3 JS wt virus was administered intranasally, intratracheally to all animals on day 28.

⁵ 다른 문자로 된 각 칼럼의 평균치들은 던칸의 다중 범위 검정에 의하여 유효한 차이(a=0.05)를 보임에 반해, 같은 문자로 된 것들은 유효한 차이를 보이지 않는다. ⁵ Mean values for each column of different characters show a valid difference (a = 0.05) by Duncan's multiple range test, whereas those with the same character do not show a valid difference.

⁶ 이 군의 동물 2 마리는 재조합 JS wt 바이러스 rJS를 투여하고 4마리는 생물학적으로 유도된 JS wt 바이러스를 투여하였다. 두 바이러스들의 피이크 평균 역가는 다르지 않았다(상부 호흡관에서는 6.4 대 6.3, 하부 호흡관에서는 6.6 대 6.7). 피크 역가가 다르지 않았기 때문에 이 군들은 추가의 분석을 위해 모았다.
⁶ Two animals in this group received recombinant JS wt virus rJS and four received biologically induced JS wt virus. Peak average titers of the two viruses were not different (6.4 vs 6.3 in the upper respiratory tract and 6.6 vs 6.7 in the lower respiratory tract). Because the peak titers did not differ, these groups were collected for further analysis.

상기 실시예를 요약하며, SeV에서의 F170S 돌연변이는 바이러스를 LLC-MK2 유인원 세포에서 성장하도록 적응시키는 것에 의해 생물학적으로 생성하였다 (Garcin et al., Virology 238:424-431 (1997), 및 Itoh etal., J. Gen. Virol. 78:3207-15 (1997)). F170S 돌연변이를 지닌 재조합 SeV가 시험관내에서 증가된 복제를 나타내더라도, 이 돌연변이는 SeV C'/C 돌연변이체로 복제에서 손상된 바와 같이 생쥐에서 복제가 크게 제한된다 (Garcin et al., Virology 238:424-431 (1997) 및 Latorre et al., J. Virol. 72:5984-93 (1998)). SeV 및 HPIV3의 C 단백질이 단지 38%만 상동성이므로, SeV의 F170S 돌연변이를 HPIV3로 수입하는 것이 생체내에서 어테뉴에이션를 초래한다는 발견은 놀라웠다.Summarizing the above examples, F170S mutations in SeV were generated biologically by adapting the virus to grow in LLC-MK2 apes cells (Garcin et al., Virology 238: 424-431 (1997), and Itoh etal). , J. Gen. Virol. 78: 3207-15 (1997). Although recombinant SeVs with F170S mutations show increased replication in vitro, these mutations are highly limited in mice as impaired in replication with SeV C ′ / C mutants (Garcin et al., Virology 238: 424-). 431 (1997) and Latorre et al., J. Virol. 72: 5984-93 (1998). Since only 38% of the C proteins of SeV and HPIV3 are homologous, the discovery that importing the F170S mutation of SeV into HPIV3 results in attenuation in vivo.

SeV의 170 위치에 상응하는 HPIV3의 아미노산 잔기에 돌연변이를 수반하는 HPIV3 재조합 rF164S는 생체내에서 복제가 제한되지는 않으나, 햄스터의 상기도 및 하기도에서, 및 AGMs의 상기도 및 하기도에서 명백히 어테뉴에이션되었다. rF164S는 wt PIV3 감염의 경우와 비교하여 혈청 항체반응을 유도하였고, wt HPIV3로 시도한 것에 대해 햄스터 및 AGMs 모두를 완전히 보호하였다. 이러한 결과는 F164S 돌연변이가 HPIV3에 대한 생 어테뉴에이션 백신을 개발하는데 유용할 것임을 나타내다.HPIV3 recombinant rF164S, which carries a mutation in the amino acid residue of HPIV3 corresponding to position 170 of SeV, is clearly attenuated in the upper and lower airways of hamsters and in the upper and lower airways of AGMs, although replication is not limited in vivo . rF164S induced serum antibody responses as compared to the case of wt PIV3 infection and completely protected both hamsters and AGMs against attempts with wt HPIV3. These results indicate that F164S mutations would be useful for developing live attenuation vaccines for HPIV3.

<생물학적 물질의 기탁>Depositing Biological Substances

다음 물질을 부타페스트 조약의 규정에 의거하여 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (미국 20110-2209 버지니아주 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 기탁하였다.The following materials were deposited in the American Type Culture Collection (University Boulevard 10801, Virginia, USA 20110-2209) under the provisions of the Butafest Treaty.

상기 발명은 예시하는 방법으로 일부 상술하였으며, 이해를 명료하게 할 목적으로 실시예들을 기술하였으나, 어떠한 변화 및 변경은 첨부된 청구항의 범위내에 실행될 수 있음이 명백할 것이다.While the invention has been described above in part by way of illustration, and has been described with examples for purposes of clarity of understanding, it will be apparent that any change or modification may be made within the scope of the appended claims.

SEQUENCE LISTING <110> The Government Of the United States Of America as represented by the Department Of Human Services <120> Production Of Attenuated Negative Stranded RNA Virus Vaccines From Cloned 뉴클레오타이드 Sequences <130> NIH-0111 <140> PCT/US00/09695 <141> 2000-04-12 <150> 60/129,006 <151> 1999-04-13 <160> 53 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 1 Gln Gly Val Lys Ile Ile Thr His Lys Glu Cys Ser Thr Ile Gly Ile 1 5 10 15 Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Lys Glu Gly Thr Leu Ala Phe Tyr 20 25 30 Thr Pro Asn Asp Ile Thr Leu Asn Asn Ser Val Ala Leu Asp Pro Ile 35 40 45 Asn Ile Ser Ile Glu 50 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Bovine parainfluenza virus 3 <400> 2 Gln Gly Ile Lys Ile Ile Thr His Lys Glu Cys Gln Val Ile Gly Ile 1 5 10 15 Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Arg Glu Gly Thr Leu Ala Thr Tyr 20 25 30 Thr Phe Asp Asp Ile Ile Leu Asn Asn Ser Val Ala Leu Asn Pro Ile 35 40 45 Asp Ile Ser Met Glu 50 <210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 1 <400> 3 Arg Gly Val Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Asn Cys Gly Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Asn Gly Ile Glu Leu Tyr Ala Asn Lys Arg Gly Arg Asp Thr Thr Arg 20 25 30 Gly Asn Gln Ile Ile Lys Val Gly Pro Ala Val Ser Ile Arg Pro Val 35 40 45 Asp Ile Ser Leu Asn 50 <210> 4 <211> 53 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 4 Gln Gly Ile Ser Ile Ile Asp Ile Lys Arg Cys Ser Glu Met Met Leu 1 5 10 15 Asp Thr Phe Ser Phe Arg Ile Thr Ser Thr Phe Asn Ala Thr Tyr Val 20 25 30 Thr Asp Phe Ser Met Ile Asn Ala Asn Ile Val His Leu Ser Pro Leu 35 40 45 Asp Leu Ser Asn Gln 50 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 5 gcaaatgttc caagcgagat atc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 뉴클레오타이드 sequence encoding F164S mutation <400> 6 gcaaatgtcc caagcgagat atc 23 <210> 7 <211> 53 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 7 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 1 5 10 15 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr 20 25 30 Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro 35 40 45 Ser Asp Gln Phe Asp 50 <210> 8 <211> 53 <212> PRT <213> Measles virus <400> 8 Lys Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val 1 5 10 15 Asn Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val 20 25 30 Tyr Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu 35 40 45 Asp Val Gly Thr Asn 50 <210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 9 Asn Pro Asn Arg Met Gln Tyr Ala Ser Leu Ile Pro Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Phe Asn Tyr Met Ala Met Ser Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly 20 25 30 Asp Pro Ser Val Ala Ala Leu Ala Asp 35 40 <210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Bovine parainfluenza virus 3 <400> 10 Asn Ile His Trp Met Gln Tyr Ala Ser Leu Ile Pro Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Phe Asn Tyr Met Ala Met Ser Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly 20 25 30 Asp Pro Thr Val Ala Ala Leu Ala Asp 35 40 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 11 Gly Leu Asn Trp Leu Arg Cys Ala Val Leu Ile Pro Ala Asn Val Gly 1 5 10 15 Gly Phe Asn Tyr Met Ser Thr Ser Arg Cys Phe Val Arg Asn Ile Gly 20 25 30 Asp Pro Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp 35 40 <210> 12 <211> 41 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 12 His Pro Arg Leu Ile Ser Arg Ile Val Leu Leu Pro Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Asn Tyr Leu Ala Cys Ser Arg Leu Phe Asn Arg Asn Ile Gly 20 25 30 Asp Pro Leu Gly Thr Ala Val Ala Asp 35 40 <210> 13 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 13 Asn Asn Asp Leu Leu Ile Arg Met Ala Leu Leu Pro Ala Pro Ile Gly 1 5 10 15 Gly Met Asn Tyr Leu Asn Met Ser Arg Leu Phe Val Arg Asn Ile Gly 20 25 30 Asp Pro Val Thr Ser Ser Ile Ala Asp 35 40 <210> 14 <211> 44 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 14 Leu Asp Asn Ile Asp Thr Ala Leu Thr Leu Tyr Met Asn Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Phe Gly Gly Gly Asp Pro Asn Leu Leu Tyr Arg Ser Phe Tyr Arg 20 25 30 Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ala Ile Val His 35 40 <210> 15 <211> 46 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 15 Leu Asp Arg Ser Val Leu Tyr Arg Ile Met Asn Gln Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro 20 25 30 Gln Ser Gln Asn Ile Thr Thr Met Ile Lys Asn Ile Thr Ala 35 40 45 <210> 16 <211> 46 <212> PRT <213> Bovine parainfluenza virus 3 <400> 16 Leu Asp Arg Gly Val Leu Tyr Arg Ile Met Asn Gln Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro 20 25 30 Gln Ser Gln Asn Ile Thr Thr Met Ile Lys Asn Ile Thr Ala 35 40 45 <210> 17 <211> 46 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 17 Leu Asp Lys Gln Val Leu Tyr Arg Val Met Asn Gln Glu Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro 20 25 30 His Ser Gln Ser Ile Thr Thr Ile Ile Lys Asn Ile Thr Ala 35 40 45 <210> 18 <211> 46 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 18 Leu Gly Ser Trp Ile Leu Tyr Asn Leu Leu Ala Arg Lys Pro Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ala Ala Asp Pro Tyr Ser Leu Asn Gln Glu 20 25 30 Tyr Leu Tyr Pro Pro Thr Thr Ile Leu Lys Arg His Thr Gln 35 40 45 <210> 19 <211> 46 <212> PRT <213> Measles virus <400> 19 Met Pro Glu Glu Thr Leu His Gln Val Met Thr Gln Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Ala Asn Leu Val 20 25 30 Cys Val Gln Ser Ile Thr Arg Leu Leu Lys Asn Ile Thr Ala 35 40 45 <210> 20 <211> 46 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 20 Leu Asn Lys Phe Leu Thr Cys Ile Ile Thr Phe Asp Lys Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ala Glu Phe Val Thr Leu Met Arg Asp Pro Gln Ala Leu Gly Ser Glu 20 25 30 Arg Gln Ala Lys Ile Thr Ser Gly Ile Asn Arg Leu Ala Val 35 40 45 <210> 21 <211> 47 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 21 His Pro Lys Val Phe Lys Arg Phe Trp Asp Cys Gly Val Leu Asn Pro 1 5 10 15 Ile Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Ser Gln Asp Gln Ile Lys Leu Ala Leu 20 25 30 Ser Ile Cys Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Phe Met Arg Glu Trp Leu 35 40 45 <210> 22 <211> 47 <212> PRT <213> Bovine parainfluenza virus 3 <400> 22 His Pro Lys Val Phe Lys Arg Phe Trp Asp Cys Gly Val Leu Asp Pro 1 5 10 15 Ile Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Ser Gln Asp Gln Val Lys Leu Ala Leu 20 25 30 Ser Ile Cys Glu Tyr Ser Leu Asp Leu Phe Met Arg Glu Trp Leu 35 40 45 <210> 23 <211> 47 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 23 His Pro Lys Ile Phe Lys Arg Phe Trp Asn Ala Gly Val Val Glu Pro 1 5 10 15 Val Tyr Gly Pro Asn Leu Ser Asn Gln Asp Lys Ile Leu Leu Ala Leu 20 25 30 Ser Val Cys Glu Tyr Ser Val Asp Leu Phe Met His Asp Trp Gln 35 40 45 <210> 24 <211> 47 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 24 His Pro Lys Leu Leu Arg Arg Ala Met Asn Leu Asp Ile Ile Thr Pro 1 5 10 15 Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala Ser Leu Asp Tyr Val Lys Leu Ser Ile 20 25 30 Asp Ala Ile Gln Trp Gly Val Lys Gln Val Leu Ala Asp Leu Ser 35 40 45 <210> 25 <211> 47 <212> PRT <213> Measles virus <400> 25 His Pro Lys Ile Tyr Lys Lys Phe Trp His Cys Gly Ile Ile Glu Pro 1 5 10 15 Ile His Gly Pro Ser Leu Asp Ala Gln Asn Leu His Thr Thr Val Cys 20 25 30 Asn Met Val Tyr Thr Cys Tyr Met Thr Tyr Leu Asp Leu Leu Leu 35 40 45 <210> 26 <211> 47 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 26 Glu Gln Lys Val Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gln Asp Ala Ser Leu His 1 5 10 15 Arg Val Glu Gly Cys His Ser Phe Lys Leu Trp Phe Leu Lys Arg Leu 20 25 30 Asn Val Ala Glu Phe Thr Val Cys Pro Trp Val Val Asn Ile Asp 35 40 45 <210> 27 <211> 41 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 27 Asn Ala Tyr Gly Ser Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Ala Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gln Ser Phe Ile Gly Ile Lys Phe Asn Lys Phe Ile Glu Pro 20 25 30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr 35 40 <210> 28 <211> 41 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 28 Tyr Tyr Lys Leu Asn Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Thr Glu Arg 1 5 10 15 Asp Leu Ile Val Leu Ser Gly Leu Arg Phe Tyr Arg Glu Phe Arg Leu 20 25 30 Pro Lys Lys Val Asp Lys Glu Met Ile 35 40 <210> 29 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 29 Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr His Glu Gln Cys Val Asp 1 5 10 15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Val Lys Phe Gly Cys Phe Met Pro Leu 20 25 30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr 35 40 <210> 30 <211> 41 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 30 Asn Ala Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ile Ser Tyr Glu Cys Ala Val Asp 1 5 10 15 Asn Tyr Thr Ser Phe Ile Gly Phe Lys Phe Arg Lys Phe Ile Glu Pro 20 25 30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr 35 40 <210> 31 <211> 41 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 31 Glu Phe Gln His Asp Asn Ala Glu Ile Ser Tyr Glu Tyr Thr Leu Lys 1 5 10 15 His Trp Lys Glu Ile Ser Leu Ile Glu Phe Arg Lys Cys Phe Asp Phe 20 25 30 Asp Pro Gly Glu Glu Leu Ser Ile Phe 35 40 <210> 32 <211> 41 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 32 Asn Ala His Ala Ser Gly Glu Gly Ile Thr Tyr Ser Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Ile Arg Phe Lys Cys Phe Met Pro Leu 20 25 30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr 35 40 <210> 33 <211> 41 <212> PRT <213> Simian virus 41 <400> 33 Glu Leu His His Asp Asn Ser Glu Ile Ser Tyr Glu Tyr Thr Leu Arg 1 5 10 15 His Trp Lys Glu Leu Ser Leu Ile Glu Phe Lys Lys Cys Phe Asp Phe 20 25 30 Asp Pro Gly Glu Glu Leu Ser Ile Phe 35 40 <210> 34 <211> 41 <212> PRT <213> Phocine distemper virus <400> 34 Asn Ala Cys Val Ser Gly Glu Gly Ile Thr Tyr Ser Gln Cys Val Glu 1 5 10 15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Ile Lys Phe Arg Cys Phe Met Pro Leu 20 25 30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr 35 40 <210> 35 <211> 41 <212> PRT <213> Hendra virus <400> 35 Arg Leu Lys Asn Ser Gly Glu Ser Leu Thr Val Asp Asp Cys Val Lys 1 5 10 15 Asn Trp Glu Ser Phe Cys Gly Ile Gln Phe Asp Cys Phe Met Glu Leu 20 25 30 Lys Leu Asp Ser Asp Leu Ser Met Tyr 35 40 <210> 36 <211> 41 <212> PRT <213> Simian virus 5 <400> 36 Glu Leu Met Asn Asp Asn Thr Glu Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Leu Lys 1 5 10 15 His Trp Lys Glu Val Ser Leu Ile Lys Phe Lys Lys Cys Phe Asp Ala 20 25 30 Asp Ala Gly Glu Glu Leu Ser Ile Phe 35 40 <210> 37 <211> 41 <212> PRT <213> Rinderpest virus <400> 37 Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr Tyr Glu Gln 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<213> Bovine parainfluenza virus 3 <400> 41 Met Lys Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Leu Leu Arg Gly Lys Cys Asp 1 5 10 15 Asn Leu Lys Met Phe Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Val Met Pro Phe Leu 20 25 30 Gln Gln Asn Lys Met Glu Thr Val Met Met Glu Glu Ala Trp Asn Leu 35 40 45 Ser Val His Leu Ile Gln Asp Ile Pro Ala 50 55 <210> 42 <211> 55 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 42 Met Lys Thr Glu Arg Trp Leu Arg Thr Leu Ile Arg Gly Glu Lys Thr 1 5 10 15 Lys Leu Lys Asp Phe Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Val His Pro Tyr Leu 20 25 30 Met Lys Glu Lys Val Glu Gln Ile Ile Met Glu Glu Ala Trp Ser Leu 35 40 45 Ala Ala His Ile Val Gln Glu 50 55 <210> 43 <211> 55 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 1 <400> 43 Met Lys Thr Glu Arg Trp Leu Arg Thr Leu Ile Arg Gly Lys Lys Thr 1 5 10 15 Lys Leu Arg Asp Phe Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Val His Pro Tyr Leu 20 25 30 Met Met Glu Arg Val Glu Gln Ile Ile Met Glu Glu Ala Trp Lys Leu 35 40 45 Ala Ala His Ile Val Gln Glu 50 55 <210> 44 <211> 41 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 44 Tyr Tyr Lys Leu Asn Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Thr Glu Arg 1 5 10 15 Asp Leu Ile Val Leu Ser Gly Leu Arg Phe Tyr Arg Glu Phe Arg Leu 20 25 30 Pro Lys Lys Val Asp Leu Glu Met Ile 35 40 <210> 45 <211> 41 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 45 Asn Ala Tyr Gly Ser Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Glu Asn Ala Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gln Ser Phe Ile Gly Ile Lys Phe Asn Lys Phe Ile Glu Pro 20 25 30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr 35 40 <210> 46 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 46 Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr His Glu Gln Cys Val Asp 1 5 10 15 Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Val Lys Phe Gly Cys Phe Met Pro Leu 20 25 30 Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr 35 40 <210> 47 <211> 41 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 47 Asn Ala Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ile Ser Tyr Glu Cys Ala Val Asp 1 5 10 15 Asn Tyr Thr Ser Phe Ile Gly Phe Lys Phe Arg Lys Phe Ile Glu Pro 20 25 30 Gln Leu Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr 35 40 <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 48 Asn Ala Ser Glu Val Asp Ser Phe Gly Lys Phe Phe Leu Asp Asp Leu 1 5 10 15 Thr Tyr <210> 49 <211> 12 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 49 ttcaataaat tc 12 <210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 뉴클레오타이드 sequence encoding F456L mutation <400> 50 ctgaataaat tc 12 <210> 51 <211> 11 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 51 aaaaaagggg g 11 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 52 gttgatggaa agcgatgcta 20 <210> 53 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified editing site of P mRNA <400> 53 aaaaaagggg ggg 13 SEQUENCE LISTING <110> The Government Of the United States Of America as represented by the Department Of Human Services <120> Production Of Attenuated Negative Stranded RNA Virus Vaccines From Cloned Nucleotide Sequences <130> NIH-0111 <140> PCT / US00 / 09695 <141> 2000-04-12 <150> 60 / 129,006 <151> 1999-04-13 <160> 53 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 1 Gln Gly Val Lys Ile Ile Thr His Lys Glu Cys Ser Thr Ile Gly Ile 1 5 10 15 Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Lys Glu Gly Thr Leu Ala Phe Tyr 20 25 30 Thr Pro Asn Asp Ile Thr Leu Asn Asn Ser Val Ala Leu Asp Pro Ile 35 40 45 Asn Ile Ser Ile Glu 50 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Bovine parainfluenza virus 3 <400> 2 Gln Gly Ile Lys Ile Ile Thr His Lys Glu Cys Gln Val Ile Gly Ile 1 5 10 15 Asn Gly Met Leu Phe Asn Thr Asn Arg Glu Gly Thr Leu Ala Thr Tyr 20 25 30 Thr Phe Asp Asp Ile Ile Leu Asn Asn Ser Val Ala Leu Asn Pro Ile 35 40 45 Asp Ile Ser Met Glu 50 <210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 1 <400> 3 Arg Gly Val Thr Phe Leu Thr Tyr Thr Asn Cys Gly Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Asn Gly Ile Glu Leu Tyr Ala Asn Lys Arg Gly Arg Asp Thr Thr Arg 20 25 30 Gly Asn Gln Ile Ile Lys Val Gly Pro Ala Val Ser Ile Arg Pro Val 35 40 45 Asp Ile Ser Leu Asn 50 <210> 4 <211> 53 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 4 Gln Gly Ile Ser Ile Ile Asp Ile Lys Arg Cys Ser Glu Met Met Leu 1 5 10 15 Asp Thr Phe Ser Phe Arg Ile Thr Ser Thr Phe Asn Ala Thr Tyr Val 20 25 30 Thr Asp Phe Ser Met Ile Asn Ala Asn Ile Val His Leu Ser Pro Leu 35 40 45 Asp Leu Ser Asn Gln 50 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 5 gcaaatgttc caagcgagat atc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding F164S mutation <400> 6 gcaaatgtcc caagcgagat atc 23 <210> 7 <211> 53 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 7 Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val 1 5 10 15 Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr 20 25 30 Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro 35 40 45 Ser Asp Gln Phe Asp 50 <210> 8 <211> 53 <212> PRT <213> Measles virus <400> 8 Lys Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Asp His Cys Pro Val Val Glu Val 1 5 10 15 Asn Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg 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parainfluenza virus 3 <400> 16 Leu Asp Arg Gly Val Leu Tyr Arg Ile Met Asn Gln Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro 20 25 30 Gln Ser Gln Asn Ile Thr Thr Met Ile Lys Asn Ile Thr Ala 35 40 45 <210> 17 <211> 46 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 17 Leu Asp Lys Gln Val Leu Tyr Arg Val Met Asn Gln Glu Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Cys Asn Leu Pro 20 25 30 His Ser Gln Ser Ile Thr Thr Ile Ile Lys Asn Ile Thr Ala 35 40 45 <210> 18 <211> 46 <212> PRT <213> Human parainfluenza virus 2 <400> 18 Leu Gly Ser Trp Ile Leu Tyr Asn Leu Leu Ala Arg Lys Pro Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ala Ala Asp Pro Tyr Ser Leu Asn Gln Glu 20 25 30 Tyr Leu Tyr Pro Pro Thr Thr Ile Leu Lys Arg His Thr Gln 35 40 45 <210> 19 <211> 46 <212> PRT <213> Measles virus <400> 19 Met Pro Glu Glu Thr Leu His Gln Val Met Thr Gln Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Ser Phe Leu Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Ala Asn Leu Val 20 25 30 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mutation <400> 50 ctgaataaat tc 12 <210> 51 <211> 11 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 51 aaaaaagggg g 11 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Human parainfluenza virus 3 <400> 52 gttgatggaa agcgatgcta 20 <210> 53 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified editing site of P mRNA <400> 53 aaaaaagggg ggg 13

Claims

재조합 게놈 또는 안티게놈, 및 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 제조하는 데에 필요한 필수 바이러스 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 세포 또는 무세포 시스템 내에서 공발현시키되, Co-expressing one or more expression vectors in a cell or cell-free system comprising a recombinant genome or an antigenome and one or more polynucleotide molecules encoding essential viral proteins required to prepare infectious viral particles of a recombinant negative strand RNA virus Let's say

상기 재조합 게놈 또는 안티게놈은 2 이상의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 종(species) 간에 보존된 아미노산 서열 요소(element)내에서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈내의 약독화 아미노산 치환 위치에서 상기 재조합 바이러스에 약독화를 부여하는 하나 이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 감염성 약독화된 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스를 제조하는 방법. The recombinant genome or antigenome is within an amino acid sequence element conserved between two or more negative strand RNA virus species, within the genome or antigenome of a negative strand RNA virus belonging to a different species than the recombinant negative strand RNA virus. Infectious attenuated recombinant negative strand from one or more isolated polynucleotide molecules encoding the negative strand RNA virus, characterized by encoding at least one amino acid substitution at said attenuated amino acid substitution site to attenuate said recombinant virus. Method of making RNA virus.

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제1항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 서브 바이러스 입자인 방법.The method of claim 1, wherein said recombinant negative strand RNA virus is a subviral particle.

재조합 게놈 또는 안티게놈, 및 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 제조하는 데에 필요한 필수 바이러스 단백질을 포함하되, 상기 재조합 게놈 또는 안티게놈은 2 이상의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 종(species) 간에 보존된 아미노산 서열 요소(element)내에서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈내의 약독화 아미노산 치환 위치에서 상기 재조합 바이러스에 약독화를 부여하는 하나 이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 감염성 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스. Recombinant genome or antigenome, and essential viral proteins necessary to prepare infectious viral particles of recombinant negative strand RNA virus, wherein the recombinant genome or antigenome is an amino acid conserved between two or more negative strand RNA virus species Within a sequence element, encode one or more amino acid substitutions that confer attenuation to the recombinant virus at an attenuated amino acid substitution position in the genome or antigenome of a negative strand RNA virus belonging to a different species than the recombinant negative strand RNA virus. Infectious recombinant negative strand RNA virus, characterized in that.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)인 바이러스.47. The virus of claim 46, wherein said recombinant negative strand RNA virus is respiratory syncytial virus (RSV).

제47항에 있어서, 상기 RSV가 인간 RSV 서브 그룹 A, 인간 RSV 서브 그룹 B, 소 RSV, 쥐 RSV, 또는 조류 RSV인 바이러스.48. The virus of claim 47, wherein said RSV is human RSV subgroup A, human RSV subgroup B, bovine RSV, murine RSV, or avian RSV.

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제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 RSV cpts248 (ATCC VR 2450), RSV cpts248/404 (ATCC VR 2454), RSV cpts248/955 (ATCC VR 2453), RSV cpts530 (ATCC VR 2452), RSV cpts530/1009 (ATCC VR 2451), RSV cpts 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), 또는 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)인 바이러스. 47. The method of claim 46, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is RSV cpts248 (ATCC VR 2450), RSV cpts248 / 404 (ATCC VR 2454), RSV cpts248 / 955 (ATCC VR 2453). , RSV cpts530 (ATCC VR 2452), RSV cpts530 / 1009 (ATCC VR 2451), RSV cpts 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52 / 2B5 (ATCC VR 2542), or RSV B-1 cp- 23 (ATCC VR 2579).

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 상기 아미노산 치환의 위치가 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 및 G 유전자로 구성된 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 요소내에 있는 바이러스.47. The method of claim 46, wherein the position of said amino acid substitution of said recombinant negative strand RNA virus is respiratory syncytial virus (RSV) NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1), M2 (ORF2), L, Virus within an amino acid sequence element selected from the group consisting of F and G genes.

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제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)이고, 그 부위가 L 단백질인 바이러스.47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is human respiratory syncytial virus (RSV) and the site is an L protein.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) cpts530 (ATCC VR 2452)이고, 그 부위가 L 단백질인 바이러스.47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is human respiratory syncytial virus (RSV) cpts530 (ATCC VR 2452), and the site is an L protein.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스(PIV)인 바이러스.49. The virus of claim 46, wherein said recombinant negative strand RNA virus is parainfluenza virus (PIV).

제55항에 있어서, 상기 PIV가 인간 PIV 1(HPIV1), 인간 PIV2(HPIV2), 인간 PIV3(HPIV3), 소 PIV(BPIV), 또는 쥐 PIV(MPIV)인 바이러스.The virus of claim 55, wherein said PIV is human PIV 1 (HPIV1), human PIV2 (HPIV2), human PIV3 (HPIV3), bovine PIV (BPIV), or murine PIV (MPIV).

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스(PIV)인 바이러스. 47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is parainfluenza virus (PIV).

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 상기 아미노산 치환의 위치가 파라인플루엔자 바이러스(PIV) N, P, C, D, V, M, F, HN 및 L 단백질로 구성된 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 요소내에 있는 바이러스.47. The amino acid sequence of claim 46, wherein the position of said amino acid substitution of said recombinant negative strand RNA virus is selected from the group consisting of parainfluenza virus (PIV) N, P, C, D, V, M, F, HN and L proteins. Virus in the element.

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제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)인 바이러스.47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3). .

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질인 바이러스. 47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), A virus whose site is L protein.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 942번 위치 타이로신인 바이러스.47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is L protein and the position is 942 position tyrosine.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 992번 위치 류신인 바이러스.47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is L protein and the position is 992 position leucine.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 1558번 위치 트레오닌인 바이러스.47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is L protein and the position is threonine at position 1558.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 F 단백질인 바이러스. 47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), A virus whose site is the F protein.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 F 단백질이며, 상기 위치가 420번 위치 이소류신인 바이러스.47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is an F protein and the position is isoleucine at position 420.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 F 단백질이며, 상기 위치가 450번 위치 알라닌인 바이러스.47. The method according to claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is an F protein and the position is alanine at position 450.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) cpts530 (ATCC VR 2452)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 521번 위치 페닐알라닌인 바이러스.47. The method of claim 46, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is human respiratory syncytial virus (RSV) cpts530 (ATCC VR 2452), the site is an L protein, and the location is 521 Virus which is position phenylalanine.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 456번 위치 페닐알라닌인 바이러스.47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species from said recombinant negative strand RNA virus is human parainfluenza virus 3 (HPIV3), the site is an L protein, and the position is 456 phenylalanine.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 센다이 바이러스(SeV)이고, 그 부위가 C 단백질이며, 상기 위치가 170번 위치 페닐알라닌인 바이러스. 47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is Sendai virus (SeV), the site is a C protein, and said position is phenylalanine at position 170.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)이고, 그 부위가 C 단백질이며, 상기 위치가 164번 위치 페닐알라닌인 바이러스. 47. The virus of claim 46, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is human parainfluenza virus 3 (HPIV3), the site is a C protein, and the position is position 164 a phenylalanine.

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 홍역 바이러스(MeV)인 바이러스.47. The virus of claim 46, wherein said recombinant negative strand RNA virus is measles virus (MeV).

제46항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 센다이 바이러스(SeV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 원숭이 바이러스 5(SV5), 볼거리 바이러스(MuV), 강아지 디스템퍼(distemper) 바이러스(CDV), 광견병 바이러스(RaV), 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV)인 바이러스. 47. The method of claim 46, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is Sendai virus (SeV), Newcastle disease virus (NDV), monkey virus 5 (SV5), mumps virus (MuV), puppy distemper. (distemper) A virus that is a virus (CDV), rabies virus (RaV), or bullous stomatitis virus (VSV).

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2 이상의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 종 간에 보존된 아미노산 서열 요소(element)내에서, 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈내의 약독화 아미노산 치환 위치에서 상기 재조합 바이러스에 약독화를 부여하는 하나 이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 재조합 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자. Attenuates the recombinant virus at an attenuated amino acid substitution site in the genome or antigenome of a negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus, within an amino acid sequence element conserved between two or more negative strand RNA virus species An isolated polynucleotide molecule encoding a recombinant genome or an antigenome of a recombinant negative strand RNA virus, characterized by encoding one or more amino acid substitutions that confer saturation.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said recombinant negative strand RNA virus is respiratory syncytial virus (RSV).

제78항에 있어서, 상기 RSV가 인간 RSV 서브 그룹 A, 인간 RSV 서브 그룹 B, 소 RSV, 쥐 RSV, 또는 조류 RSV인 폴리뉴클레오타이드 분자. 79. The polynucleotide molecule of claim 78, wherein said RSV is human RSV subgroup A, human RSV subgroup B, bovine RSV, murine RSV, or avian RSV.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스(PIV)인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is parainfluenza virus (PIV).

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 상기 아미노산 치환의 위치가 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 및 G 유전자로 구성된 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 요소내에 있는 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The method of claim 77, wherein the position of said amino acid substitution of said recombinant negative strand RNA virus is respiratory syncytial virus (RSV) NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1), M2 (ORF2), L, A polynucleotide molecule within an amino acid sequence element selected from the group consisting of F and G genes.

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제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)이고, 그 부위가 L 단백질인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is human respiratory syncytial virus (RSV) and the site is an L protein.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) cpts530 (ATCC VR 2452)이고, 그 부위가 L 단백질인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a different species than said recombinant negative strand RNA virus is human respiratory syncytial virus (RSV) cpts530 (ATCC VR 2452), and the site is an L protein.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스(PIV)인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said recombinant negative strand RNA virus is parainfluenza virus (PIV).

제85항에 있어서, 상기 PIV가 인간 PIV 1(HPIV1), 인간 PIV2(HPIV2), 인간 PIV3(HPIV3), 소 PIV(BPIV), 또는 쥐 PIV(MPIV)인 폴리뉴클레오타이드 분자.86. The polynucleotide molecule of claim 85, wherein said PIV is human PIV 1 (HPIV1), human PIV2 (HPIV2), human PIV3 (HPIV3), bovine PIV (BPIV), or murine PIV (MPIV).

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 센다이 바이러스(SeV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 원숭이 바이러스 5(SV5), 볼거리 바이러스(MuV), 강아지 디스템퍼(distemper) 바이러스(CDV), 광견병 바이러스(RaV), 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV)인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is Sendai virus (SeV), Newcastle disease virus (NDV), monkey virus 5 (SV5), mumps virus (MuV), puppy distemper. (distemper) A polynucleotide molecule that is a virus (CDV), rabies virus (RaV), or bullous stomatitis virus (VSV).

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 상기 아미노산 치환의 위치가 파라인플루엔자 바이러스(PIV) N, P, C, D, V, M, F, HN 및 L 단백질로 구성된 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 요소내에 있는 것인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The amino acid sequence of claim 77, wherein the position of said amino acid substitution of said recombinant negative strand RNA virus is selected from the group consisting of parainfluenza virus (PIV) N, P, C, D, V, M, F, HN and L proteins. The polynucleotide molecule being in the element.

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제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The poly according to claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3). Nucleotide molecule.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), A polynucleotide molecule whose site is L protein.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 942번 위치 타이로신인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is an L protein, the polynucleotide molecule is the position 942 tyrosine.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 992번 위치 류신인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The site is an L protein and the position is 992 position leucine polynucleotide molecule.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 1558번 위치 트레오닌인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The polynucleotide molecule whose site is L protein and the position is threonine of the 1558 position.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 F 단백질인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), The polynucleotide molecule whose site is F protein.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 F 단백질이며, 상기 위치가 420번 위치 이소류신인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), Wherein said site is an F protein and said position is isoleucine at position 420, the polynucleotide molecule.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)이고, 그 부위가 F 단백질이며, 상기 위치가 450번 위치 알라닌인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is a cold-adaptive mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419) of a JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3), Wherein said site is an F protein and said position is an alanine at position 450.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) cpts530 (ATCC VR 2452)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 521번 위치 페닐알라닌인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The method of claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is human respiratory syncytial virus (RSV) cpts530 (ATCC VR 2452), the site is an L protein, and the location is 521 The polynucleotide molecule which is position phenylalanine.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)이고, 그 부위가 L 단백질이며, 상기 위치가 456번 위치 페닐알라닌인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide of claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is human parainfluenza virus 3 (HPIV3), the site is an L protein, and the position is 456 phenylalanine molecule.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 센다이 바이러스(SeV)이고, 그 부위가 C 단백질이며, 상기 위치가 170번 위치 페닐알라닌인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said negative strand RNA virus belonging to a species different from said recombinant negative strand RNA virus is Sendai virus (SeV), its site is a C protein, and said position is phenylalanine at position 170.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)이고, 그 부위가 C 단백질이며, 상기 위치가 164번 위치 페닐알라닌인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The polynucleotide of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is human parainfluenza virus 3 (HPIV3), the site is a C protein, and the position is position 164 a phenylalanine molecule.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 홍역 바이러스(MeV)인 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said recombinant negative strand RNA virus is measles virus (MeV).

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제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스는, 한 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 종, 서브그룹 또는 균주의 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈이 상이한 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 종, 서브그룹 또는 균주로부터의 이형 유전자 또는 유전자 단편과 결합된 재조합 게놈 또는 안티게놈을 갖는 키메릭 바이러스인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the recombinant negative strand RNA virus is heterologous from a species, subgroup or strain of a negative strand RNA virus that differs in part or complete genome or antigenome of a species, subgroup or strain of one negative strand RNA virus. A polynucleotide molecule that is a chimeric virus having a recombinant genome or antigenome associated with a gene or gene fragment.

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제107항에 있어서, 상기 키메릭 바이러스가 한 파라인플루엔자 바이러스(PIV)의 종, 서브그룹 또는 균주의 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈이 이형의 PIV의 종, 서브그룹 또는 균주의 HN 및 F 당단백질 유전자들의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 단편과 결합된 재조합 게놈 또는 안티게놈을 갖는 PIV인 폴리뉴클레오타이드 분자. 107. The HN and F glycoproteins of claim 107, wherein the chimeric virus is a partial or complete genome or antigenome of a species, subgroup or strain of one parainfluenza virus (PIV) of the species, subgroup or strain of heterologous PIV. A polynucleotide molecule that is PIV with a recombinant genome or antigenome associated with one or more genes or gene fragments of genes.

제109항에 있어서, 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 HN 및 F 유전자가 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(HPIV1)의 HN 및 F 유전자들에 의해 치환된 것인 폴리뉴클레오타이드 분자. 109. The polynucleotide molecule of claim 109, wherein the HN and F genes of human parainfluenza virus 3 (HPIV3) are substituted by the HN and F genes of human parainfluenza virus 1 (HPIV1).

제107항에 있어서, 상기 키메릭 바이러스가 한 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 종, 서브그룹 또는 균주의 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈이 이형의 RSV의 종, 서브그룹 또는 균주의 F, G 및 SH 당단백질 유전자들의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 단편과 결합된 재조합 게놈 또는 안티게놈을 갖는 RSV인 폴리뉴클레오타이드 분자. 108. The method according to claim 107, wherein the chimeric virus is a partial or complete genome or antigenome of one species, subgroup or strain of one respiratory syncytial virus (RSV) of the species, subgroup or strain of heterologous RSV. A polynucleotide molecule that is RSV with a recombinant genome or antigenome associated with one or more genes or gene fragments of SH glycoprotein genes.

제111항에 있어서, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 서브그룹 A의 F 및 G 당단백질 유전자들이 인간 RSV 서브그룹 B의 F 및 G 당단백질 유전자들에 의해 치환된 폴리뉴클레오타이드 분자.112. The polynucleotide molecule of claim 111, wherein the F and G glycoprotein genes of human respiratory syncytial virus (RSV) subgroup A are substituted by the F and G glycoprotein genes of human RSV subgroup B.

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제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 상기 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 RSV cpts248 (ATCC VR 2450), RSV cpts248/404 (ATCC VR 2454), RSV cpts248/955 (ATCC VR 2453), RSV cpts530 (ATCC VR 2452), RSV cpts530/1009 (ATCC VR 2451), RSV cpts 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), 또는 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein the negative strand RNA virus belonging to a species different from the recombinant negative strand RNA virus is RSV cpts248 (ATCC VR 2450), RSV cpts248 / 404 (ATCC VR 2454), RSV cpts248 / 955 (ATCC VR 2453). , RSV cpts530 (ATCC VR 2452), RSV cpts530 / 1009 (ATCC VR 2451), RSV cpts 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52 / 2B5 (ATCC VR 2542), or RSV B-1 cp- 23 (ATCC VR 2579) polynucleotide molecule.

제77항에 있어서, 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스(PIV)이고, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 상기 약독화 아미노산 치환에 더하여 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV3)의 JS 야생형 균주의 저온-적응성 돌연변이 JS cp45(ATCC PTA-2419)내에 존재하는 하나 이상의 약독화 돌연변이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The method of claim 77, wherein said recombinant negative strand RNA virus is parainfluenza virus (PIV) and the recombinant genome or antigenome is cold-adaptive of the JS wild type strain of human parainfluenza virus 3 (HPIV3) in addition to said attenuated amino acid substitutions. A polynucleotide molecule encoding one or more attenuating mutations present in mutant JS cp45 (ATCC PTA-2419).

제77항에 있어서, 상기 재조합 게놈 또는 안티게놈이 돌연변이를 특정하는 코돈 내의 다중 뉴클레오타이드 치환에 의해 안정화되는 하나 이상의 약독화 돌연변이를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein said recombinant genome or antigenome further comprises one or more attenuated mutations that are stabilized by multiple nucleotide substitutions in the codon specifying the mutation.

제77항에 있어서, 상기 재조합 게놈 또는 안티게놈이 성장 특성 변화, 약독화, 온도-감수성, 저온-적응성, 작은 플라크 사이즈, 숙주 범위 제한성 및 면역원성 변화 중에서 선택된 표현형 변화를 특정하는 뉴클레오타이드 변형에 의해 더 변형된 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The method of claim 77, wherein said recombinant genome or antigenome is modified by a nucleotide modification that specifies a phenotypic change selected from among growth property changes, attenuation, temperature-sensitive, cold-adaptability, small plaque size, host range restriction, and immunogenicity changes. More modified polynucleotide molecules.

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제77항에 있어서, SH, NS1 또는 NS2 유전자가 결실되거나 유전자 발현이 손상(제거)된 폴리뉴클레오타이드 분자.78. The polynucleotide molecule of claim 77, wherein the SH, NS1 or NS2 gene is deleted or gene expression is impaired (removed).

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작동가능하게 연결된 전사 프로모터, 제77항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자 및 전사 종결인자를 포함하되, A operably linked transcriptional promoter, a polynucleotide molecule according to claim 77 and a transcription terminator,

상기 폴리뉴클레오타이드 분자가 코딩하는 재조합 게놈 또는 안티게놈은 2 이상의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 종 간에 보존된 아미노산 서열 요소(element)내에서, 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 종에 속하는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈내의 약독화 아미노산 치환 위치에서 상기 재조합 바이러스에 약독화를 부여하는 하나 이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터. The recombinant genome or antigenome encoded by the polynucleotide molecule is a genome or anti genome of a negative strand RNA virus belonging to a different species from the recombinant negative strand RNA virus, within an amino acid sequence element conserved between two or more negative strand RNA virus species. An expression vector encoding at least one amino acid substitution conferring attenuation to said recombinant virus at an attenuated amino acid substitution position in the genome.

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제46항에 있어서, 상기 서열 요소가 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 아과(subfamily)에 속하는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈내의 약독화 아미노산 치환 위치에서 2 이상의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 속(genus) 간에 보존된 것이 특징인 바이러스. 47. The genus of claim 46, wherein said sequence element is at an attenuated amino acid substitution position in the genome or antigenome of a negative strand RNA virus belonging to a subfamily different from said recombinant negative strand RNA virus. Viruses that are conserved in the liver.

제77항에 있어서, 상기 서열 요소가 상기 재조합 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스와 상이한 아과(subfamily)에 속하는 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈내의 약독화 아미노산 치환 위치에서 2 이상의 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스 속(genus) 간에 보존된 것이 특징인 폴리뉴클레오타이드 분자. 78. The genus of claim 77, wherein said sequence element is at an attenuated amino acid substitution position in the genome or antigenome of a negative strand RNA virus belonging to a subfamily different from said recombinant negative strand RNA virus. Polynucleotide molecules characterized by conserved in the liver.