KR100760247B1 - Methods or kits for diagnosing recurrent spontaneous abortion - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 습관성 유산환자와 대조군으로부터 분리한 난포액에서 추출된 단백질들의 2차원 전기영동 분석 결과이고;1 is a result of two-dimensional electrophoresis analysis of proteins extracted from follicular fluid isolated from habitual abortion patients and controls;
도 2a 및 도 2b는 습관성 유산환자와 대조군에서 피브리노오겐 α, β, 및 γ의 웨스턴 블럿팅 결과이고;2A and 2B show Western blotting results of fibrinogen α, β, and γ in habitual abortion patients and controls;
도 3a 및 도 3b는 습관성 유산환자와 대조군에서 안티트롬빈의 웨스턴 블럿팅 결과이고;3A and 3B are Western blotting results of antithrombin in habitual abortions and controls;
도 4a 및 도 4b는 습관성 유산환자와 대조군에서 컴플리멘트 컴포넌트 C3c 체인 E, 피브리노오겐 γ, 안티트롬빈, 및 안지오텐시노오겐의 유전자 발현 정도를 분석한 결과이고;4A and 4B show the results of analyzing gene expression levels of complement component C3c chain E, fibrinogen γ, antithrombin, and angiotensinogen in habitual abortion patients and controls;
도 5는 습관성 유산환자와 대조군에서 피브리노오겐 γ와 안티트롬빈의 발현 정도를 실시간 PCR (real time PCR)로 정량한 결과이다.5 is a result of quantitative expression of fibrinogen γ and antithrombin in a habitual abortion patient and a control group by real time PCR.
본 발명은 습관성 유산의 진단방법 또는 진단용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a diagnostic method or kit for diagnosing a habitual miscarriage.
습관성 유산(recurrent spontaneous abortion)이라 함은 2∼3회 이상 연속해서 약 임신 20주 이전에 유산되는 질환을 말한다. 습관성 유산은 전체 여성의 약 1%에 영향을 미치며, 임상적으로 인정된 임신여성의 10-15%가 습관성 유산으로 임신이 종결된다. 또한 아이를 갖고자 하는 부부들 중 약 5%까지 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. Recurrent spontaneous abortion refers to a disease that is aborted about 20 weeks before pregnancy for two or three consecutive times. Habitual miscarriage affects about 1% of all women, with 10-15% of clinically recognized pregnant women ending in habitual miscarriage. It is also reported to affect about 5% of couples who want to have children.
임신 기간 동안 습관성 유산을 일으키는 요인을 찾고자 수많은 연구가 수행되어 왔다. 이들 연구에 의하면 자가 면역, 유전적 또는 염색체 이상, 해부학적 이상, 내분비 또는 호르몬 이상, 혈액 응고 관련 단백질 결핍 등이 습관성 유산과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 습관성 유산과 관련된 분자유전 기전에 대한 몇몇 연구에 의하면, 면역, 혈관 형성, 세포사멸 관련 유전자들이 습관성 유산 발병과 관련이 있음이 보고되고 있으나, 아직까지도 대부분에 경우에 있어서는 습관성 유산의 병인과 그와 관련된 분자 기전에 대해서는 알려진 바가 없다.Numerous studies have been conducted to find factors that cause habitual miscarriage during pregnancy. These studies report that autoimmune, genetic or chromosomal abnormalities, anatomical abnormalities, endocrine or hormonal abnormalities, and blood clotting related protein deficiencies are associated with habitual miscarriage. Several studies of molecular genetic mechanisms associated with habitual miscarriage have reported that genes related to immunity, angiogenesis, and apoptosis have been associated with the development of habitual miscarriage. There is no known molecular mechanism involved.
한편, 본 발명자들은 정상인과 비교하여 습관성 유산 환자로부터 유래한 융모막 내에 전사 단계에서 다르게 발현되는 몇 개의 유전자들을 확인하여 이를 면역 억제, 혈관 형성, 배아 착상 그리고 세포 사멸 관련 유전자들로 분류하여 발표한 바 있다(Choi, H. K., Choi, B. C., Lee, S. H., Kim, J. W. et al., Mol. Reprod. Dev. 2003, 66, 24-31.; Baek, K. H., Choi, B. C., Lee, J. H., Choi, H. K. et al., Reprod. Fertil. Dev. 2002, 14, 235-240).On the other hand, the present inventors identified several genes expressed differently at the transcriptional stage in the chorion from habitual abortion patients compared to normal people, and classified them as genes related to immunosuppression, angiogenesis, embryonic implantation and cell death. (Choi, HK, Choi, BC, Lee, SH, Kim, JW et al., Mol. Reprod. Dev. 2003, 66, 24-31 .; Baek, KH, Choi, BC, Lee, JH, Choi, HK et al., Reprod.Fertil. Dev. 2002, 14, 235-240).
그러나, 상기 밝혀진 유전자 또는 이들로부터 발현되는 단백질 이외에도 습관성 유산 환자에서 특이적인 발현양상을 나타내는 단백질을 밝혀내는 것은 습관성 유산 환자를 조기에 진단하거나, 습관성 유산 여부를 진단할 수 있는 진단 키트의 개발에 유용할 것이다.However, in addition to the above-described genes or proteins expressed therefrom, identifying proteins that exhibit specific expression patterns in patients with habitual miscarriage may be useful for the development of diagnostic kits for early diagnosis or diagnosis of habitual miscarriage. something to do.
본 발명자들은 정상인과 습관성 유산 환자로부터 얻은 난포액을 대상으로 2차원 전기영동(2-dimensional electrophoresis), MALDLI TOF-MS 또는 단백질 서열분석 등을 수행한 결과, 습관성 유산 환자에서만 특이적으로 발현이 감소되는 단백질을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors performed 2-dimensional electrophoresis, MALDLI TOF-MS or protein sequencing on follicular fluids obtained from normal and habitual abortion patients. The discovery of the protein led to the completion of the present invention.
따라서, 본 발명은 습관성 유산 환자에서만 특이적으로 발현이 감소되는 단백질을 이용한 습관성 유산 환자의 진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Therefore, an object of the present invention is to provide a method for diagnosing a habitual abortion patient using a protein whose expression is specifically reduced only in a habitual abortion patient.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 습관성 유산의 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is also an object of the present invention to provide a diagnostic kit for habitual miscarriage comprising a molecule capable of measuring the expression level of the gene encoding the protein.
본 발명의 일 태양에 따라, 임산부로부터 분리된 시료 중, 서열번호 1 내지 5의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 습관성 유산의 진단방법이 제공된다.In accordance with an aspect of the present invention, a method of diagnosing a habitual miscarriage, comprising measuring an expression level of a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of proteins of SEQ ID NOs: 1 to 5 in a sample isolated from a pregnant woman This is provided.
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 5의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 습관성 유산 진단용 키트로서, 상기 분자가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인, 습관성 유산 진단용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, a habitual miscarriage diagnostic kit comprising a molecule capable of measuring the expression level of a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins of SEQ ID NOs: 1 to 5, wherein the molecule is the protein Antibodies, substrates, ligands, or cofactors that specifically bind to; Or there is provided a kit for diagnosing habitual miscarriage, which is a primer having a complementary sequence specific for the gene encoding the protein.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들은 습관성 유산 환자에서 특이적으로 발현이 감소되는 유전자를 찾기 위해 정상인과 습관성 유산 환자로부터 얻은 융모막 조직을 대상으로 cDNA 제외 혼성화(subtractive hybridization) 분석을 수행하였다. The inventors performed cDNA exclusion hybridization analysis on chorionic tissues obtained from normal and habitual miscarriage patients in order to find genes specifically reduced in habitual miscarriage patients.
난포액은 난자 성숙 시기 동안에 난자에 적절한 생체 내(in vivo) 환경을 제공한다. 다양한 연구에 의하면 난포액은 포유류의 생식 과정에 있는 여포 성장 및 난자 수정에 관여하는 중요한 물질들을 포함하고 있다. 또한, 난소에 과립층 세포(granulosa cells)와 막 세포(theca cell)에 의해 생성된 단백질을 포함하고 있다. 마크로파지 염증성 단백질-3α(Macrophage inflammatory protein-3α), 폴리스타틴(follistatin), 액티빈(activin), 및 TGFβ superfamily 등이 여포세포의 증식 및 분화에 관여하는 것으로 증명되었다. 성숙한 여포로부터 생성된 용액의 화학적 조성은 난포 세포들의 분비활동과 신진대사에 관한 표식자로서 난포의 품질과 관련이 있기 때문에 중요하다. 이것은 난포액 내에 존재하는 단백질 조성이 세포 및 난자 성장과 성숙에 중요하다는 것을 시사한다.Follicle fluid is appropriate for the egg during egg maturation In vivo (in in vivo ) environment. Various studies have shown that follicle fluids contain important substances involved in follicle growth and egg fertilization in mammalian reproductive processes. In addition, the ovary contains proteins produced by granulosa cells and theca cells. Macrophage inflammatory protein-3α, follistatin, activin, and TGFβ superfamily have been shown to be involved in the proliferation and differentiation of follicle cells. The chemical composition of the solution from mature follicles is important because it is related to the quality of follicles as markers for the secretion and metabolism of follicular cells. This suggests that the protein composition present in the follicular fluid is important for cell and egg growth and maturation.
본 발명자들은 2차원 전기영동(2-dimensional electrophoresis) 즉 2D-PAGE, MALDLI TOF-MS 및 단백질 서열분석을 통하여, 습관성 유산 환자로부터 얻은 난포액에서 습관성 유산 관련 단백질을 동정하였고, 웨스턴 블럿팅(Western blotting), 역전사-PCR(Reverse Transcription-PCR, RT-PCR), 실시간 PCR (real-time PCR) 등의 생화학적 분석을 통하여 상기 단백질들이 습관성 유산 환자에서만 비정상적으로 발현됨을 확인하였다. The inventors have identified addictive lactic acid-related proteins in follicular fluids from addictive abortion patients through 2-dimensional electrophoresis, ie 2D-PAGE, MALDLI TOF-MS and protein sequencing, and Western blotting Biochemical analysis, such as reverse transcription-PCR (RT-PCR), real-time PCR (PCR), confirmed that the proteins were abnormally expressed only in patients with habitual miscarriage.
상기와 같이 얻어진 단백질들은 서열번호 1 내지 5의 단백질로서, 하기 표1과 같다.The proteins obtained as described above are the proteins of SEQ ID NOs: 1 to 5, shown in Table 1 below.
따라서, 본 발명의 일 태양에 따라, 본 발명은 임산부로부터 분리된 시료 중, 서열번호 1 내지 5의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 습관성 유산의 진단방법을 제공한다.Thus, according to one aspect of the invention, the present invention comprises the step of measuring the expression level of a gene encoding one or more proteins selected from the group consisting of the proteins of SEQ ID NO: 1 to 5 of samples isolated from pregnant women, Provide diagnostic methods for habitual miscarriage
본 발명의 진단방법에 있어서, 상기 임산부로부터 분리된 시료는 혈액, 뇨, 난포액 등을 포함하며, 바람직하게는 혈액을 사용할 수 있다. 통상적으로 임산부는 임신 사실을 알게 되거나 통보받은 때부터 산부인과 병원에서 정기적 또는 비정기적 검사를 받게 되며, 임상의는 각종 검사를 위해 혈액, 뇨, 난포액 등의 시료를 채취하게 된다. 산부인과 병원에서는 예를 들어 채취된 혈액을 가지고 유전적 질환 검사 등의 검사를 수행하게 되는데, 본 발명의 진단방법은 상기 채취·분리된 혈액을 대상으로 습관성 유산 여부를 판정하는데 사용될 수 있다.In the diagnostic method of the present invention, the sample separated from the pregnant woman includes blood, urine, follicular fluid, and the like, and preferably blood may be used. Normally, pregnant women undergo regular or irregular examinations at a gynecology hospital when they are informed or notified of pregnancy, and clinicians take samples of blood, urine and follicular fluid for various tests. In the obstetrics and gynecology hospital, for example, a test for genetic diseases is performed with the collected blood, and the diagnostic method of the present invention can be used to determine whether a habitual miscarriage is performed on the collected and separated blood.
본 발명의 진단방법은 서열번호 1 내지 5의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 서열번호 1 내지 5의 단백질 및 그 유전자 서열은 이미 진 뱅크 등에 공지되어 있다. The diagnostic method of the present invention includes measuring the expression level of a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins of SEQ ID NOs: 1-5. The proteins of SEQ ID NOS: 1 to 5 and their gene sequences are already known from Gene Bank and the like.
상기 유전자의 발현량의 측정은 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질(즉, 서열번호 1 내지 5의 단백질)의 수준(level)을 생명공학 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 측정함으로써 수행될 수 있다. 서열번호 1 내지 5의 단백질 양의 측정은 웨스턴 블럿팅 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. 웨스턴 블럿팅 방법으로 단백질의 양을 측정하는 경우, 측정된 단백질 발현량이 정상인의 단백질 발현량에 비하여 약 50% 이하, 바람직하게는 약 40% 이하, 더욱 바람직하게는 약 30∼35% 인 경우 습관성 유산으로 판정할 수 있다.Determination of the expression level of the gene can be performed by measuring the level of the mRNA or protein (ie, the protein of SEQ ID NO: 1 to 5) of the gene according to the method commonly used in the field of biotechnology. The determination of the protein amount of SEQ ID NOs: 1 to 5 can be determined by methods such as western blotting. When measuring the amount of protein by Western blotting method, when the measured protein expression amount is about 50% or less, preferably about 40% or less, and more preferably about 30 to 35% compared to the protein expression level of a normal person It can be determined by miscarriage.
또한, 서열번호 1 내지 5의 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 양의 측정은 역전사-PCR(Reverse Transcription PCR) 또는 실시간-PCR (Real Time PCR) 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. 역전사-PCR 또는 실시간-PCR 방법으로 mRNA 양을 측정하는 경우, 측정된 mRNA 양이 정상인의 mRNA 양에 비하여 30% 이하인 경우 습관성 유산으로 판정할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 컴플리멘트 컴포넌트 C3c 체인 E를 코딩하는 유전자의 mRNA 양이 정상인의 mRNA 양에 비하여 30% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하인 경우, 습관성 유산으로 판정할 수 있고, 서열번호 2의 피브리노오겐 γ를 코딩하는 유전자의 mRNA 양이 정상인의 mRNA 양에 비하여 30% 이하인 경우, 습관성 유산으로 판정할 수 있다. 또한, 서열번호 3 의 안티트롬빈을 코딩하는 유전자의 mRNA 양이 정상인의 mRNA 양에 비하여 30% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 3% 이하인 경우, 습관성 유산으로 판정할 수 있고, 서열번호 4의 안지오텐시노오겐을 코딩하는 유전자의 mRNA 양이 정상인의 mRNA 양에 비하여 30% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하인 경우, 습관성 유산으로 판정할 수 있다.In addition, the mRNA amount of the gene encoding the protein of SEQ ID NO: 1 to 5 can be measured by a method such as Reverse Transcription PCR (PCR) or Real Time PCR (Real Time PCR). When mRNA amount is measured by reverse transcriptase-PCR or real-time-PCR method, it can be determined as habitual miscarriage if the measured mRNA amount is 30% or less than the normal mRNA amount. For example, if the mRNA amount of the gene encoding the complement component C3c chain E of SEQ ID NO: 1 is 30% or less, preferably 10% or less, more preferably 5% or less compared to the mRNA amount of a normal person, Abortion can be determined, and if the mRNA amount of the gene encoding the fibrinogen γ of SEQ ID NO: 2 is 30% or less compared to that of a normal person, it can be determined as a habitual miscarriage. In addition, when the mRNA amount of the gene encoding the antithrombin of SEQ ID NO: 3 is 30% or less, preferably 10% or less, more preferably 3% or less compared to the mRNA amount of a normal person, it can be determined as a habitual miscarriage, If the mRNA amount of the gene encoding angiotensinogen of SEQ ID NO: 4 is 30% or less, preferably 10% or less, and more preferably 5% or less compared to the mRNA amount of a normal person, it can be determined as a habitual miscarriage. .
본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 5의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 습관성 유산 진단용 키트로서, 상기 분자가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인, 습관성 유산 진단용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, a habitual miscarriage diagnostic kit comprising a molecule capable of measuring the expression level of a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins of SEQ ID NOs: 1 to 5, wherein the molecule is the protein Antibodies, substrates, ligands, or cofactors that specifically bind to; Or there is provided a kit for diagnosing habitual miscarriage, which is a primer having a complementary sequence specific for the gene encoding the protein.
본 발명에 따라 밝혀진 상기 5개의 단백질(즉, 서열번호 1 내지 5의 단백질)을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자로는, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머일 수 있다.As a molecule capable of measuring the expression level of a gene encoding the five proteins (ie, the proteins of SEQ ID NOS: 1 to 5) found in accordance with the present invention, an antibody, a substrate, a ligand, Or cofactors; Or a primer having a complementary sequence specific for the gene encoding the protein.
서열번호 1 내지 5의 단백질은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체를 제조할 수 있으며, 해당 항체를 포함하는 진단용 키트를 제조할 수 있다. 또한, 서열번호 1 내지 5의 단백질은 각각 그 기능이 밝혀져 있으므로, 각각의 단백질에 대한 기질, 리간드, 또는 보조인자를 포함하도록 본 발명의 키트를 제작할 수도 있다. 또한, 서열번호 1 내지 5의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머를 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조할 수 있으며, 해당 프라이머를 포함한 진단용 키트를 제조할 수도 있다.Proteins of SEQ ID NOs: 1 to 5 can be prepared according to the methods commonly used in the field of biotechnology, polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, it can be prepared a diagnostic kit containing the antibody. In addition, since the functions of the proteins of SEQ ID NOS: 1 to 5 are each revealed, the kit of the present invention may be prepared to include a substrate, a ligand, or a cofactor for each protein. In addition, primers having complementary sequences specific for the genes encoding the proteins of SEQ ID NOS: 1 to 5 may be prepared according to methods commonly used in the field of biotechnology, and diagnostic kits containing the primers may be prepared. .
본 발명의 진단용 키트에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자는 검출가능한 표지(예를 들어, 발색단 등)로 표지될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 키트는 상기 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태를 가짐으로써 DNA 칩 등의 칩(chip) 형태일 수도 있다.In the diagnostic kit of the present invention, a molecule capable of measuring the expression level of the gene encoding the protein of SEQ ID NOS: 1 to 5 may be labeled with a detectable label (eg, a chromophore). In addition, the diagnostic kit of the present invention may be in the form of a chip such as a DNA chip by having a microarray in which the primer is immobilized on a substrate.
본 발명에 따라 새롭게 밝혀진 상기 서열번호 1 내지 5의 단백질 발현량 감소와 습관성 유산과의 관련성에 대한 구체적인 메카니즘에 관해서는 아직 확실히 밝혀진 것은 아니나, 다음과 같이 추정할 수 있다.The specific mechanism of the relationship between the protein expression amount reduction and the habitual miscarriage of
중요한 혈액 당단백질인 피브리노오겐은 3개의 폴리펩티드 사슬들이 이중 복합체를 이루고 있다: α, β, 및 γ. 간 실질 세포(Hepatic parenchymal cell)에서 합성되고, 반감기는 3에서 4.5일이다. 저섬유소원혈증(Hypofibrinogemic) 및 무섬유소원혈증(afibrinogenmic) 실험쥐는 출혈 현상과 비슷한 특징, 유산, 그리고 비정상적인 응고판 형성을 보인다. 마우스를 이용한 실험에서, 모성 피브리노오겐(maternal fibrinogen)이 없거나, 상당히 감소하게 되면, 혈관의 형성을 방해하여 배아 영양막(trophoblast) 침윤에 영향을 주거나, 출혈성 유산을 일으킨다. 그러므로 임신 기간 동안 피브리노오겐 γ가 감소하게 되면, 태아가 비정상적으로 성장하거나 유산을 일으키는 것으로 추정된다.Fibrinogen, an important blood glycoprotein, is a double complex of three polypeptide chains: α, β, and γ. It is synthesized in hepatic parenchymal cells and has a half-life of 3 to 4.5 days. Hypofibrinogemic and afibrinogenmic mice show bleeding-like features, miscarriage, and abnormal clot formation. In experiments with mice, the absence or significant reduction of maternal fibrinogen interferes with the formation of blood vessels, affecting invasive trophoblast infiltration or causing hemorrhagic abortion. Therefore, if fibrinogen γ decreases during pregnancy, it is estimated that the fetus grows abnormally or causes miscarriage.
안티트롬빈은 플라스믹 세린 프로테아제(plasmic serine protease) 저해제로서 트롬빈의 단백분해(proteolytic) 부분에 공유적으로 결합하여 영구적으로 트롬빈을 저해하여, 혈액의 용해성을 유지하는데 관여한다. 1965년에 처음 알려진 안티트롬빈 결핍증(antithrombin deficiency)은 안티트롬빈이 없거나, 기능장애 형태( dysfunctional form)로 규정된 상염색체성 유전 질환이다. 안티트롬빈 결핍증과 더불어 다른 트롬보필릭 변이(thrombophilic mutation)가 함께 일어나게 되면 이 단백질 소실과 관련된 질환이 더욱 증가하게 된다. 안티트롬빈이 거의 없는 여성은 임신기간 동안 혈전증의 발병율이 더욱 증가한다고 보고되어 있다. 따라서, 안티트롬빈과 피브리노오겐 γ의 발현양 감소가 임신과 관련된 질병에 상승적 효과를 나타내는 것으로 추정된다.Antithrombin is a plasma serine protease inhibitor that covalently binds to the proteolytic part of thrombin and permanently inhibits thrombin, which is involved in maintaining blood solubility. Antithrombin deficiency, first known in 1965, is an autosomal hereditary disease that is either free of antithrombin or defined as a dysfunctional form. The combination of antithrombin deficiency and other thrombophilic mutations further increases the disease associated with this protein loss. Women with little antithrombin are reported to have an increased incidence of thrombosis during pregnancy. Therefore, it is estimated that the decrease in the expression levels of antithrombin and fibrinogen γ has a synergistic effect on diseases associated with pregnancy.
안지오텐시노오겐은 혈관수축제(vasopressor), 전해질(electrolyte), 및 체액 항상성(fluid hemostasis)을 조절하는 레닌-안지오텐신 시스템(rennin-angiotensin system, RAS) 내에서 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 배아 발달 단계에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 안지오텐시노오겐, 안지오텐신(AT) II, ATII 리셉터 (AT1 and AT2)가 임신 기간 동안에 배아에서 발현되며, 기관 발생과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 마우스 모델에서, 안지오텐시노오겐 유전자가 없는 마우스는 초기 배아 발달이 실패할 확률이 높은 것은 것으로 알려져 있다. 보체 성분(Complemnet component)의 경우에는, 약 20%에 해당하는 초기(3개월) 임신 실패는 저보체혈증(hypocomplementemia) 발병에 의해 특성화될 수 있고, 어떤 경우에는 태반에 보체 침착과 관련이 있다. 보체 활성화 역시 항-인지질 항체와 관련된 유산 증가와 습관성 유산으로 특성화된 습관성 태아 소실의 마우스 모델에 요구된다. 따라서, 상기 혈액 응고 인자 및 안지오텐시노오겐과 보체성분의 감소가 습관성 유산과 관련이 있을 것으로 추정된다. Angiotensinogen is known to function in the rennin-angiotensin system (RAS), which regulates vasopressors, electrolytes, and fluid hemostasis. It is also known to play an important role in the developmental stage. Angiotensiniogen, angiotensin (AT) II, ATII receptors (AT 1 and AT 2 ) are expressed in embryos during pregnancy and are known to be associated with organ development. In mouse models, mice without the angiotensinogen gene are known to have a high probability of failing early embryonic development. In the case of the Complemnet component, about 20% of early (3 months) pregnancy failures can be characterized by the development of hypocomplementemia, and in some cases associated with complement deposition in the placenta. Complement activation is also required in mouse models of habitual fetal loss characterized by increased miscarriage and habitual miscarriage associated with anti-phospholipid antibodies. Therefore, it is assumed that the decrease of the blood coagulation factor and angiotensinogen and complement components may be related to the habitual miscarriage.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the present invention is not limited by these examples.
실시예 Example
1. 시험방법1. Test Method
습관성 유산 환자 및 정상인으로부터의 난포액 및 융모막의 분리, 면역친화성 컬럼 크로마토그래피(Immunoaffinity column chromatography)를 통한 다량 단백질 제거, 2-차원 전기영동 및 상 분석, 단백질 동정, 웨스턴 블롯 분석, RT-PCR, 및 데이터 처리 및 통계학적 분석은 하기 시험방법에 의해 수행하였다.Isolation of follicular fluid and chorion from habitual abortion patients and normal subjects, removal of large amounts of protein by immunoaffinity column chromatography, 2-dimensional electrophoresis and phase analysis, protein identification, Western blot analysis, RT-PCR, And data processing and statistical analysis were performed by the following test methods.
(1) 난포액 및 융모막의 분리(1) Separation of follicular fluid and chorionic membrane
(1-1) 난포액의 분리(1-1) Separation of follicular liquid
습관성 유산 환자로는 3회 이상 원인을 알 수 없는 초기 3개월 이내에 유산 경력을 가지고 있는 3명의 여성(평균 나이: 34세)을 선정하였다. 이 환자들은 임신 4개월에서 6개월 사이에 유산 그리고 혈전색전증이 없었다. 이미 알려진 습관성 유산의 원인을 배제하기 위해 사전에 정규 진단 검진을 실시하였으며, 구체적인 항목으로는 자궁경검사(hysteroscopy), 양친 및 모성 핵형(parental and maternal karyotype), 클라미디아에 대한 자궁경부 배양(cervival cultures for Clamydia), 뇨 혈장 및 마이코플라스마(urea plasma and mycoplasma), 종합 호르몬 상태(comprehensive hormonal status), 및 IgM 및 IgG 항-카디오리핀 항체 평가를 포함한 항-인지질 증후근(antiphospholipid syndrome)의 평가를 실시하였다.Three women with habitual miscarriage were selected for three women (mean age: 34 years) who had a miscarriage history within the first three months of unknown cause. These patients had no abortion and thromboembolism between 4 and 6 months of pregnancy. In order to rule out known causes of habitual miscarriage, a routine diagnostic checkup has been carried out in advance. Evaluation of antiphospholipid syndrome, including Clamydia, urine plasma and mycoplasma, comprehensive hormonal status, and IgM and IgG anti-cardiolipin antibody evaluation.
대조군으로는 적어도 두 번 이상 출산 경험이 있고, 유산 경력이 없는 정상 여성 (평균 나이: 33세)을 대상으로 하였다. 실험에 참여한 모든 여성으로부터 참여동의서를 받았다.The control group included normal women (average age: 33 years) with at least two births and no miscarriage. All women who participated in the experiment received a consent form.
난포액은 공지의 방법(Chi, H. J., Kim, D. H., Koo, J. J., Chang, S. S., Fertil. Steril. 1998, 70, 871-877)에 따라 채취하였으며, 차병원 불임연구소의 인체 IVF 프로그램에 근거하여 사람 난포액을 3인의 정상여성과 3인 습관성 유산 경험이 있는 여성으로부터 얻었다. 다양한 크기의 난포로부터 얻은 난포액을 K-EDTA 또는 소듐 헤파린이 포함된 멸균된 튜브 용기에 합쳐서, 수집하였다. 얻어진 난포액을 3,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 59 ℃에서 35분 동안 가온-불활성화(heat-inactvation)시켰다. 얻어진 난포액을 얼음 상에서 냉각한 후, 멸균여과기(0.22 μm 공극 여과기)로 멸균하였다. 모든 시료는 사용될 때까지 -80℃에 저장하였다.Follicle fluids were collected according to known methods (Chi, HJ, Kim, DH, Koo, JJ, Chang, SS, Fertil. Steril. 1998, 70, 871-877), based on the human IVF program of the Infertility Research Center of Cha Hospital. Follicle fluid was obtained from three normal women and three women with habitual miscarriage experience. Follicle fluids from various sized follicles were collected and combined in sterile tube containers containing K-EDTA or sodium heparin. The obtained follicle solution was centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes and then the supernatant was taken and heated-inactvated at 59 ° C. for 35 minutes. The resulting follicle solution was cooled on ice and then sterilized with a sterile filter (0.22 μm pore filter). All samples were stored at -80 ° C until used.
(1-2) 융모막의 분리(1-2) Separation of Chorion
정상 여성과 습관성 유산 환자로부터 공지의 방법(Choi, H. K., Choi, B. C., Lee, S. H., Kim, J. W. et al., Mol. Reprod. Dev. 2003, 66, 24-31)에 따라 융모막을 채취하였다. 총 6개의 태아 융모막 샘플(3명의 습관성 유산 환자와 3명의 선택적으로 종결된 임신 여성)을 임신 6주에서 8주된 6명의 임신 여성으로부터 획득하였다. 습관성 유산 환자의 융모막은 적어도 3회 이상 원인을 알 수 없는 유산을 겪은 환자로부터 얻었고, 대조군은 유산, 비정상적 임신, 조산(preterm delivery)와 사산(死産) 경험이 없는 여성으로부터 얻었다. 습관성 유산 환자와 정상 임신 여성의 평균 나이는 각각 34세, 32세였다. Chorionic membranes were taken from normal women and patients with habitual miscarriage according to known methods (Choi, HK, Choi, BC, Lee, SH, Kim, JW et al., Mol. Reprod. Dev. 2003, 66, 24-31). . A total of six fetal chorionic villus samples (three habitual abortion patients and three selectively terminated pregnant women) were obtained from six pregnant women from six to eight weeks of gestation. Chorionic membranes from habitual abortions were obtained from patients who had at least three unexplained abortions, and controls were from women who had never experienced abortion, abnormal pregnancy, preterm delivery and stillbirth. The mean ages of habitual miscarriage patients and normal pregnant women were 34 and 32 years old, respectively.
증식 세포 핵 항원(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)을 이용한 면역세포화학적 분석과 헤마톡실린 및 에오신(H/E) 염색방법을 이용한 조직학적 실험에 의해 확인된 융모막을 RT-PCR 분석에 사용되었다. 총 46개, XX 염색체 유전형을 보여주는 핵형분석(Karyotyping)은 G-밴딩 기술(G-banding technique)을 이용하여 모든 샘플에 대해 수행되었다. 공식적인 환자 동의서를 모든 환자들로부터 받았다. 모든 시료들은 30분 내에 수집, 동결되었고, 사용될 때까지 -80℃에 저장하였다.The chorion confirmed by immunocytochemical analysis using proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and histological experiments using hematoxylin and eosin (H / E) staining method was used for RT-PCR analysis. Karyotyping showing a total of 46 XX chromosomal genotypes was performed on all samples using the G-banding technique. Formal patient consent was obtained from all patients. All samples were collected, frozen within 30 minutes and stored at -80 ° C until used.
(2) 면역친화성 컬럼 크로마토그래피(Immunoaffinity column chromatography)를 통한 다량 단백질 제거(2) Removal of large amounts of protein through immunoaffinity column chromatography
실시예 1에서 얻은 사람 난포액 중의 6개의 다량 단백질 즉, 알부민, 트랜스페린, IgG, IgA, 합토글로빈(haptoglobin), 및 안티트립신의 제거는 다중 친화성 제거 컬럼(Multiple Affinity Removal Column, MARC)을 이용하여 수행하였다. 20 μl의 사람 난포액과 결합할 수 있는 4.6×50 mm MARC를 사용하였으며, MARC에 의한 다량 단백질의 크로마토그래픽 분리는 제조사에서 제공된 표준 LC 방법에 따라 이동상 시약 키트(mobile phase reagent kit)를 사용하여 수행하였다. 즉, 인간 난포액 시료를 프로테아제 저해제(protease inhibitor)가 포함된 완충액 A로 5번 희석한 다음, RT상에서 1-2분간 16,000g에서 원심 분리하여 0.22-μm 스핀 필터(spin filter)로 필터링하였다. 시료를 주사하여, 관통 분획(flow-through fraction)을 모아서 그 다음 실험에 사용될 때까지 -20℃에 보관되었다. 양이 줄어든 난포액 단백질을 2-D 겔 상에서 분석하기 위해, MARC로부터 얻은 관통 분획(flow-through fraction)을 합쳐서 -20 ℃에서 1시간 동안 미리 냉각시킨 10% 트리클로로아세트산 용액으로 침전시켰다. 찬 아세톤 용액으로 세척한 후 펠렛을 2-DE용 샘플 완충액에 다시 녹였다.Removal of six large proteins, namely albumin, transferrin, IgG, IgA, haptoglobin, and antitrypsin from human follicles obtained in Example 1, was carried out using a multiple affinity removal column (MARC). It was performed by. 4.6 × 50 mm MARC was used to bind 20 μl of human follicles, and chromatographic separation of large amounts of protein by MARC was performed using a mobile phase reagent kit according to the standard LC method provided by the manufacturer. It was. That is, the human follicular fluid sample was diluted five times with buffer A containing a protease inhibitor, and then centrifuged at 16,000 g for 1-2 minutes on RT and filtered with a 0.22-μm spin filter. Samples were injected and flow-through fractions collected and stored at −20 ° C. until used in the next experiment. In order to analyze the reduced amount of follicular protein on a 2-D gel, the flow-through fractions obtained from MARC were combined and precipitated with 10% trichloroacetic acid solution, which was pre-cooled at -20 ° C for 1 hour. After washing with cold acetone solution the pellet was again dissolved in sample buffer for 2-DE.
(3) 2차원 전기영동 및 상 분석(image analysis)(3) 2D electrophoresis and image analysis
우선 1차원 분석을 위해, 공지의 방법(Cho, Y. M., Bae, S. H., Choi, B. K., Cho, S. Y. et al., Proteomics 2003, 3, 1883-1894)에 따라, 1 mg 난포액 단백질을 고정된 pH 3-10 비선형 구배 스트립에 올렸다. 이차원적 분리는 9-16% 선형 구배 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 수행하였다. 40% 메탄올과 5% 인산이 포함된 용액으로 1시간 동안 단백질을 고정한 후, 그 겔을 12시간 동안 CBB G-250으로 염색하였다. 이렇게 염색된 겔을 GS-710 이미징 덴시토메터(imaging densitometer)로 스캔한 후 Imge MasterTM 2D Platinum 컴퓨터 소프트웨어 프로그램으로 분석하였다. 스팟들의 발현 정도는 겔상에 하나의 스팟 부피와 비교하여 상대적인 단백질 부피로 결정하였다.First, for one-dimensional analysis, according to known methods (Cho, YM, Bae, SH, Choi, BK, Cho, SY et al.,
(4) 단백질 동정(4) Protein Identification
(4-1) 겔 내 소화(In gel digestion) 및 질량 스펙트럼 분석(4-1) In gel digestion and mass spectrum analysis
절제된 스팟을 더욱 조그만 조각으로 자른 후, 공지의 방법(Cho, S. Y., Lee, E. Y., Lee, J. S., Kim, H. Y. et al., Proteomics 2005, 5, 3386-3396)에 따라, 트립신을 사용하여 소화시켰다. MALDI-TOF MS 분석을 위하여 트립신 펩타이드를 포러스(poros) R2와 올리고 R3 컬럼으로 응축한 다음 α-시아노-4-히드록시신남산으로 추출하였다. 스펙트럼 값은 4700 TOF/TOF 스펙트로포토메터(spectrophotometer)로 얻었다. 단백질들은 모노아이소토픽(monoisotopic) 피크들의 값을 MASCOT와 MS-Fit에 적용하여 펩티드 질량 지도(peptide mass maps)로부터 확인하였다.The excised spot is cut into smaller pieces and then digested with trypsin according to known methods (Cho, SY, Lee, EY, Lee, JS, Kim, HY et al., Proteomics 2005, 5, 3386-3396). I was. For MALDI-TOF MS analysis, trypsin peptide was condensed with poros R2 and oligo R3 column and extracted with α-cyano-4-hydroxycinnamic acid. Spectral values were obtained with a 4700 TOF / TOF spectrophotometer. Proteins were identified from peptide mass maps by applying values of monoisotopic peaks to MASCOT and MS-Fit.
(4-2) LC-MS/MS(4-2) LC-MS / MS
Nano-LC-ESI-MS/MS 분석과 관련하여, 트립신으로 소화된 펩타이드를 포러스(poros) R2와 올리고 R3 컬럼으로 응축시켰다. 모든 LC-MS/MS 실험은 Agilent 1100 시리즈 LC/MSC Trap XCT 이온 질량 스펙트로메터에 오르쏘고날 나노스프레이 이온 소스(orthogonal nanospray ion source)를 통해 연결된 MS/MS용 Agilent 1100 시리즈 nano-LC를 특징으로 하는 Agilent Nanoflow Proteomics Solution을 사용하여 수행하였다. Nano-LC 시스템은 ZORBAX 300SB-C18 enrichment column (0.3 x 50 mm, 5 μm)을 사용하여 sample enrichment/desalting mode로 작동시켰다. 크로마토그래피는 ZORBAX 300 SB-C18 (75 μm x 150 mm) 나노컬럼을 사용하여 수행하였다. 용매 구배는 3% 용매 B (0.1% 아세토니트릴 중의 포름산) 및 97% 용매 A (0.1% 포름산 수용액) 상에서 출발하였다. 구배는 다음과 같다; 3% B 등전위적(isocratically) 0 내지 5 분, 3∼10% B 5 내지 10 분, 10∼45% B 10 내지 50 분, 45∼90% B 50 내지 55 분, 90% B 55 내지 61 분, 및 3% B로 10 분간 세척.In connection with the Nano-LC-ESI-MS / MS analysis, trypsin digested peptides were condensed with poros R2 and oligo R3 columns. All LC-MS / MS experiments feature Agilent 1100 Series nano-LC for MS / MS, connected via an orthogonal nanospray ion source to the Agilent 1100 Series LC / MSC Trap XCT ion mass spectrometer It was performed using Agilent Nanoflow Proteomics Solution. The Nano-LC system was operated in sample enrichment / desalting mode using a ZORBAX 300SB-C18 enrichment column (0.3 x 50 mm, 5 μm). Chromatography was performed using ZORBAX 300 SB-C18 (75 μm × 150 mm) nanocolumns. The solvent gradient started on 3% solvent B (formic acid in 0.1% acetonitrile) and 97% solvent A (0.1% formic acid aqueous solution). The gradient is as follows; 3% B isocratically 0 to 5 minutes, 3 to 10% B 5 to 10 minutes, 10 to 45
LC/MSD Trap XCT는 특정한 펩타이드 스캔 자동-MS/MS 모드(peptide scan auto-MS/MS mode)상에서 작동시켰다. 이온화 모드(Ionization mode)는 Agilent orthogonal source와 함께 양성 나노일렉트로스프레이(positive nanoelectrospray)였다. 건조 가스(Drying gas)는 5 L/min로 흐르고, 건조 가스의 온도는 300℃이다. Vcap은 전형적으로 1800-1900V (1 at 30 V, and capillary exit offset at 75V). Trap drive는 평균적으로 1 또는 2로 85V로 설정하였다. ICC는 최대 축적 시간(maxium accumulation time) 150ms 으로 설정하였고, 스마트 타겟(smart target)은 125,000였으며, MS 스캔 범위는 300-2200 였다. 자동 MS/MS는 울트라 스캔 모드(ultra scan mode), number of parents 2, 평균(averages) 2, 프래그멘테이션 진폭(fragmentation amplitude) 1.15V, SmartFrag on (30-200%), active exclusion on (after 2 spectra for 1 min), prefer +2 on, MS/MS scan range of 100-1800, 및 ultra scan on로 설정하였다. LC / MSD Trap XCT was run on a specific peptide scan auto-MS / MS mode. Ionization mode was positive nanoelectrospray with an Agilent orthogonal source. Drying gas flows at 5 L / min, and the temperature of the drying gas is 300 ° C. Vcap is typically 1800-1900V (1 at 30V, and capillary exit offset at 75V). The trap drive was set to 85V with 1 or 2 on average. The ICC was set to a maximum accumulation time of 150ms, a smart target was 125,000, and the MS scan range was 300-2200. Auto MS / MS features ultra scan mode, number of
(4-3) 바이오인포테틱스(Bioinformatics)(4-3) Bioinformatics
각각 얻어진 MS/MS 스텍트럼은 Spectrum Mill 소프트웨어를 사용하여 nonredundant protein sequence database에 대하여 분석하였다. 해석이 되지 않는 CID 스펙트럼 서열은 Spectrum Mill MS Proteomics Workbench를 이용하여 단백질 서열 데이터베이스(NCBInr 2005, 10)에 존재하는 펩티드 서열과 비교하여 확인하였다. 우선적으로 Spectrum Mill 분석 결과는 'score' 및 'SPI (Scored Peak Intensity)'로 평가하였다. 그 프로그램은 모든 또는 한정된 군의 데이터베이스 단백질들에 대한 이론적인 펩티드 만들어 이에 상응하는 MS/MS 스펙트럼 값을 계산해서 실험을 통해 밝혀진 스펙트럼 값과 비교하여 매치되는지를 확인하였다. Score란 맞는 (Bonus) 그리고 맞지 않는 (Penalty) 피크 값을 의미한다. Bouns points 란 각 맞는 피크 높이와는 상관없이 피크당 한 포인트 상에 맞는 값을 말한다. 맞지 않는 피크 값은 가장 높은 피크 값에 피크 높이/높이에 근거로 한 것이다. SPI 값은 다음과 같이 계산된다: 피크 확인 후 남아 있는 피크 값으로부터, 이것은 인용된 라이브러리 스펙트럼 피크 값과 일치하는 세트 스펙트럼에 전체 밀도의 백분율이다. 50% 보다 낮은 SPI 값은 낮은 매치 값이거나 인용된 일련의 스펙트럼에서 아이소 타입이 맞는 것이 없음을 의미한다. 50% (default value) 이하의 최소 매치 피크 값을 조정하여 poorer qaultity match 값을 보고할 수 있다. 일반적으로 단백질 히트(hit) 값을 보고하기 위해서는 단백질 score >13, 펩티드 score > 10 그리고 SPI (%) > 70 값이 제조사의 추천에 의한 결과 분석 과정을 통해 적용되었다. 본 발명에서 규명된 모든 단백질들은 적어도 2번 펩티드 평가를 수행하였다.Each MS / MS spectrum was analyzed against a nonredundant protein sequence database using Spectrum Mill software. Uninterpreted CID spectral sequences were identified by comparison with peptide sequences present in the protein sequence database (NCBInr 2005, 10) using the Spectrum Mill MS Proteomics Workbench. First of all, Spectrum Mill analysis results were evaluated as 'score' and 'SPI (Scored Peak Intensity)'. The program generated theoretical peptides for all or a limited group of database proteins and calculated the corresponding MS / MS spectral values to compare them with the spectral values found in the experiments. Score means Bones and Penalty peak values. Bouns points are the values that fit on one point per peak, regardless of each fitted peak height. Mismatched peak values are based on peak height / height at the highest peak value. The SPI value is calculated as follows: From the peak values remaining after peak identification, this is the percentage of total density in the set spectrum that matches the cited library spectral peak values. SPI values lower than 50% mean that there is no low match or that the isotype fits in the cited series of spectra. The poorer qaultity match value can be reported by adjusting the minimum match peak value below 50% (default value). In general, to report protein hit values, protein scores> 13, peptide scores> 10 and SPI (%)> 70 values were applied through the manufacturer's recommendation analysis. All proteins identified in the present invention were subjected to peptide evaluation at least twice.
(5) 웨스턴 블롯 분석(5) Western blot analysis
40 μg의 사람 난포액 단백질을 PBS 완충액으로 1/10로 희석한 다음 SDS-PAGE상에 적용하였다. 3개의 피브리노오겐 사슬(fibrinogen chain) (α, β, 및 γ)과 안티트롬빈을 확인하기 위해 Aurum serum protein mini kit를 사용하여 난포액으로부터 알부민을 제거하였다. 난포액 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 블롯팅하였다. 그 멤브레인을 항-피브리노오겐 항체 (α, β, 및 γ 각각)가 1:500으로 포함된 블록킹 용액(blocking solution)상에서 반응시킨 후, 서양고추냉이 퍼옥시다아제-컨쥬게이티드 항-염소 이뮤노글로블린 G 2차 폴리클로날 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-goat immunogloblin G (IgG) secondary polyclonal 항체)가 1:5,000로 포함된 블록킹 용액(blocking solution)에 두었다. 이외에 안티트롬빈 항체가 1:1,000으로 포함된 블록킹 용액(blocking solution)과 항-마우스 2차 단일 항체가 사용되었다. ECL 시스템이 시그날을 확인하기 위해 사용되었다. 웨스턴 블롯 상에 밴드는 Fluor-STM MultiImager로 스캔한 후 밀도를 측정하였다. 그 값은 평균±표준편차(SEM)로 표시하였다.40 μg of human follicle protein was diluted 1/10 with PBS buffer and then applied on SDS-PAGE. Albumin was removed from the follicular fluid using Aurum serum protein mini kit to identify three fibrinogen chains (α, β, and γ) and antithrombin. Follicle proteins were blotted onto nitrocellulose membranes. The membrane was reacted on a blocking solution containing 1: 500 anti-fibrinogen antibodies (α, β, and γ, respectively), followed by horseradish peroxidase-conjugated anti-chlorine It was placed in a blocking solution containing 1: 5,000 munoglobulin G secondary polyclonal antibody (horseradish peroxidase-conjugated anti-goat immunogloblin G (IgG) secondary polyclonal antibody). In addition, a blocking solution containing an antithrombin antibody of 1: 1,000 and an anti-mouse secondary single antibody were used. An ECL system was used to confirm the signal. Bands on Western blots were scanned with Fluor-S ™ MultiImager and the density measured. The values are expressed as mean ± standard deviation (SEM).
(6) RT-PCR(6) RT-PCR
(6-1) 총 RNA 조제 및 cDNA 합성(6-1) Total RNA Preparation and cDNA Synthesis
총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 -80℃에 저장된 사람 융모막으로부터 분리하였다. cDNA 합성은 SuperScriptTM Frist-Strand Synthsis System 방법에 따라 수행하였다. 3 μg의 총 RNA와 0.5 μg의 올리고 (dT)12-18 프라이머를 함께 70℃에서 10분 동안 반응시킨 후 5 × first strand 완충액 (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 및 15 mM MgCl2), 10 mM DTT, 0.5 mM dNTP가 포함된 20 μl 상에서 반응을 수행하였다. 이 혼합물이 든 튜브를 2분 동안 42℃에서 배양한 후 SuperscriptTM II RT (50 units/μl)를 넣고, 42℃에서 50분간 반응하였다. 반응 후 그 효소는 70℃에서 15분간 변성시켰다.Total RNA was isolated from human chorion membrane stored at −80 ° C. using TRIzol reagent. cDNA synthesis was performed according to the SuperScript ™ Frist-Strand Synthsis System method. 3 μg total RNA and 0.5 μg oligo (dT) 12-18 primers were reacted together at 70 ° C. for 10 minutes before 5 × first strand buffer (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, and 15 mM MgCl 2 ) The reaction was carried out on 20 μl containing 10 mM DTT, 0.5 mM dNTP. After incubating the tube containing the mixture at 42 ° C. for 2 minutes, Superscript TM II RT (50 units / μl) was added thereto and reacted at 42 ° C. for 50 minutes. After the reaction, the enzyme was denatured at 70 ° C. for 15 minutes.
(6-2) 반-정량 RT-PCR 분석(Semi-quantitative RT-PCR analysis)(6-2) Semi-quantitative RT-PCR analysis
실시예 1에서 분리한 융모막에 컴플리멘트 컴포넌트 C3c 체인 E( complement component C3c chain E), 피브리노오겐 γ, 안티트롬빈, 안지오텐시노오겐, 및 헤모펙신 프리커서의 상대적인 발현 정도는 대조군인 GAPDH 유전자의 발현량에 의거하여 결정하였다. 이들 유전자들의 프라이머는 National Center of Biotechnology Information (NCBI) GenBank에 등록된 유전자 서열에 기초하여 만들어졌다. 프라이머 서열 및 PCR 산물의 예상되는 크기는 하기 표 2와 같다. The relative expression levels of the complement component C3c chain E, fibrinogen γ, antithrombin, angiotensinogen, and hemopexin in the chorion separated in Example 1 were the control groups. The determination was based on the expression level of the GAPDH gene. Primers of these genes were made based on gene sequences registered in the National Center of Biotechnology Information (NCBI) GenBank. The expected sizes of the primer sequences and PCR products are shown in Table 2 below.
PCR 조건은 다음 아래와 같다: 94℃에서 3분 동안 끓인 후, 94℃, 1분(변성), 54-58℃ 1분 (어닐링), 및 72℃, 1분 30초(중합)를 30-35회 동안 반복하여 수행하였다; 다음에 그 반응물은 최종단계를 완전하게 마무리하기 위해 72℃에서 10분 동안 방치한 후 4℃에 저장하였다. PCR 생성물의 서열은 ABI prism을 이용한 자동화 서열 분석 장치에 의해 확인하였다. PCR 생성물의 크기는 1.5% 아가로즈 겔 상에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 UV하에서 확인하였다. DNA 밴드 밀도는 Fluor-STM MultiImage로 측정하였다. 밀도는 대조군으로 사용된 GAPDH의 밀도로 비교하였다. PCR conditions were as follows: boil at 94 ° C. for 3 minutes, then 94 ° C., 1 minute (denatured), 54-58 ° C. 1 minute (annealed), and 72 ° C., 1 minute 30 seconds (polymerization) 30-35 Repeated for one time; The reaction was then left at 72 ° C. for 10 minutes to complete the final step and then stored at 4 ° C. The sequence of the PCR product was confirmed by an automated sequencing apparatus using ABI prism. The size of the PCR product was confirmed under UV by electrophoresis on 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide. DNA band density was measured by Fluor-S ™ MultiImage. Density was compared by the density of GAPDH used as a control.
(6-3) 실시간 PCR (real time PCR) 분석(6-3) Real time PCR analysis
RT PCR 분석은 수정된 Taq DNA 폴리머라아제, SYBR 그린, 최적의(optimum) PCR 완충액, 5 mM MgCl2, dUTP가 포함된 dNTP 혼합물들이 들어있는 DyNAmo SYBR green qPCR 키트의 방법에 따라 DNA engine Opticon 2 fluorescence detection 시스템에서 수행되었다. 10분 동안 95℃에서 변성시킨 후, 유전자 증폭은 95℃에서 30초, 55℃/59℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 30-35회 반복하였고, melting curve 프로그램이 사용되었다 (65℃~95℃, 초당 가온 속도 0.2℃ 그리고 지속적인 형광 측정과 함께). 이들 생성물들을 4℃에서 냉각하였다. 형광 자료는 SYBR Green 1이 포함된 PCR 반응 동안 연장(extension) 단계 후에 획득하였다. PCR 생성물은 발생된 melting curve에 의해 분석하였다. 생성물의 melting curve 값은 서열 특이적이기 때문에 비특이적과 특이적 PCR 생성물을 구별하는데 사용될 수 있다. 유전자 발현의 상대적인 양은 2ddCt 방법으로 분석하였다. PCR 생성물의 크기 정도는 1.5% 아가로즈 겔 상에 전기영동 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 UV 상에서 확인하였다. RT PCR analysis was performed using
(7) 데이터 처리 및 통계학적 분석(7) data processing and statistical analysis
두 개의 실험 군을 비교할 때, 실험 결과에 대한 통계 분석은 Student's t-test로 수행하였다. 수치 자료는 평균±표준편차로 표시하였고, 0.005보다 낮은 P 값은 통계적으로 유의성이 있음을 의미한다.When comparing the two groups, statistical analysis of the experimental results was performed by Student's t-test. Numerical data are expressed as mean ± standard deviation, and P values lower than 0.005 indicate statistical significance.
2. 시험 결과2. Test result
상기 시험방법에 의한 분석결과는 다음과 같다.The analysis results by the test method are as follows.
(1) 습관성 유산 환자의 난포액 내에 존재하는 단백질에 대한 2-차원 분석(1) Two-dimensional analysis of proteins present in follicular fluid of habitual abortion patients
습관성 유산환자와 대조군으로서 정상 여성으로부터 분리한 난포액에서 추출된 단백질들을 pH 3-10 에서 2차원 전기영동 분석한 결과는 도 1과 같다. 3명의 습관성 유산 환자와 3명 정상여성 (대조군)의 난포액 내에 단백질 발현 정도를 비교한 결과, 5가지 종류의 단백질이 RSA 환자군에서 비정상적으로 발현되었다. The results of two-dimensional electrophoresis analysis of proteins extracted from follicular fluid isolated from a habitual abortion patient and a normal female as a control are shown in FIG. 1. As a result of comparing the degree of protein expression in the follicular fluid of three habitual abortions and three normal women (control), five kinds of proteins were abnormally expressed in the RSA patient group.
상기 5개의 단백질의 동정은 MALDI-TOF-MS와 Nano LC MS/MS에 의해 수행하였으며, 이들 단백질들은 컴플리멘트 컴포넌트 C3c 체인 E( complement component C3c chain E)(서열번호 1), 피브리노오겐 γ(서열번호 2), 안티트롬빈(서열번호 3), 안지오텐시노오겐(서열번호 4), 및 헤모펙신 프리커서(서열번호 5)로 확인되었다 (표 3).Identification of the five proteins was carried out by MALDI-TOF-MS and Nano LC MS / MS, these proteins were complement component C3c chain E (SEQ ID NO: 1), fibrinogen gamma (SEQ ID NO: 2), antithrombin (SEQ ID NO: 3), angiotensinogen (SEQ ID NO: 4), and hemopexin precursor (SEQ ID NO: 5) were identified (Table 3).
(2) 혈액응고 인자인 피브리노오겐과 안티트롬빈에 대한 웨스턴 블롯 분석(2) Western blot analysis of the coagulation factors fibrinogen and antithrombin
규명된 스팟들을 검증하기 위해, 난포액 내에 피브리노오겐과 안티트롬빈의 발현 정도를 각각의 해당하는 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, 피브리노오겐 α- , β-, 및 γ-체인이 습관성 유산환자와 대조군의 난포액에서 검출되었다. 피브리노오겐 α- (95 kDa)와 β- (56 kDa) 발현 수준은 습관성 유산 환자와 대조군에서 차이가 없었다 (100% 대 107%±19% 그리고 100% 대 98%±17%, 도 2b). 그러나, 습관성 유산 환자군에서 피브리노오겐 γ의 발현률이 대조군의 난포액에서 보다 상당히 낮게 발현되었다 (100% 대 37%±11%, *p < 0.005, 도 3b). 도 3a는 습관성 유산 환자와 정상군의 난포액에서 각각 확인된 안티트롬빈 (48 kDa)에 대한 웨스턴 블럿팅 결과를 나타낸다. 마찬가지로 습관성 유산 환자에서 안티트롬빈 발현율이 대조군에 비해 약 3배 정도 낮게 발현되었다 (100% 대 33%±1%, *p < 0.005, 도 3b).To verify the identified spots, the expression levels of fibrinogen and antithrombin in the follicular fluid were confirmed by Western blotting using the respective antibodies. As can be seen in Figure 2a, fibrinogen α-, β-, and γ-chain was detected in the follicular fluid of the habitual abortion and control. Fibrinogen α- (95 kDa) and β- (56 kDa) expression levels were not different between habitual abortion patients and controls (100% vs. 107% ± 19% and 100% vs. 98% ± 17%, FIG. 2B). ). However, the expression rate of fibrinogen γ was significantly lower in the follicular fluid of the control group in the habitual abortion patient group (100% vs. 37% ± 11%, * p <0.005, FIG. 3B). FIG. 3A shows Western blotting results for antithrombin (48 kDa) identified in the follicular fluid of the habitual abortion patients and the normal group, respectively. Similarly, antithrombin expression rate in patients with habitual miscarriage was about 3 times lower than in the control group (100% vs. 33% ± 1%, * p <0.005, FIG. 3B).
(3) 습관성 유산환자로부터 유래된 융모막 내에 특이적인 유전자 발현(3) Specific gene expression in chorionic membranes derived from habitual abortion patients
상기에서 규명된 5개의 단백질 즉, 컴플리멘트 컴포넌트 C3c 체인 E( complement component C3c chain E)(서열번호 1), 피브리노오겐 γ(서열번호 2), 안티트롬빈(서열번호 3), 안지오텐시노오겐(서열번호 4), 및 헤모펙신 프리커서(서열번호 5)을 암호화하는 유전자들의 발현이 습관성 유산 환자의 융모막에서 비정상적으로 발현되는지를 조사하기 위해, 반-정량적 RT-PCR을 수행한 결과는 도 4b와 같다. Five proteins identified above, namely complement component C3c chain E (SEQ ID NO: 1), fibrinogen γ (SEQ ID NO: 2), antithrombin (SEQ ID NO: 3), angio Semi-quantitative RT-PCR was performed to investigate whether the expression of the genes encoding tensinogen (SEQ ID NO: 4), and the hemopexin precursor (SEQ ID NO: 5) is abnormally expressed in the chorion of patients with habitual miscarriage. The results are shown in Figure 4b.
습관성 유산 환자의 컴플리멘트 컴포넌트 C3c 체인 E, 피브리노오겐 γ, 안티트롬빈, 및 안지오텐시노오겐의 유전자 발현 정도가 정상인에 비해 낮게 발현되었다 (100% 대 3%±1.6%, 100% 대 26%±6.6%, 100% 대 1%±0.4%, 그리고 100% 대 4%±2.0% 각각, *p < 0.005, 도 4b). 반면에 헤모펙신 프리커서의 mRNA 발현 정도는 습관성 유산 환자와 정상인과 비교하였을 때 큰 차이를 보이지는 않았다. 이는 동정된 다른 단백질과 달리 헤모펙신 프리커서의 mRNA 수준과 단백질의 수준이 상이하다는 것을 시사한다.Gene expression levels of complement component C3c chain E, fibrinogen γ, antithrombin, and angiotensinogen in addictive abortion patients were lower than those of normal subjects (100% vs. 3% ± 1.6%, 100%). Vs. 26% ± 6.6%, 100% vs. 1% ± 0.4%, and 100% vs. 4% ± 2.0%, respectively, * p <0.005, FIG. 4b). On the other hand, the mRNA expression level of the hemopexin precursor did not show a big difference when compared with the patients with habitual abortion. this is Unlike the other proteins identified, the mRNA levels of the hemopexin precursor and the protein levels are different.
피브리노오겐 γ와 안티트롬빈의 발현 정도를 정량적으로 분석하기 위해, 실시간 PCT (real time PCR)을 수행하였다. PCR 반응의 효율성을 일반화하기 위해 GAPDH를 대조군으로 사용하였다. GAPDH mRNA로 일반화한 후에 피브리노오겐 γ와 안티트롬빈의 mRNA 발현률이 습관성 유산 환자의 융모막에서 정상인에 비해 낮게 발현됨을 다시 한 번 확인하였다 (*p < 0.005, 도 5).In order to quantitatively analyze the expression levels of fibrinogen γ and antithrombin, real time PCR (PCT) was performed. GAPDH was used as a control to generalize the efficiency of the PCR reaction. After generalization with GAPDH mRNA, it was again confirmed that the mRNA expression rates of fibrinogen γ and antithrombin were lower in the chorion of patients with habitual miscarriage compared to normal persons (* p <0.005, FIG. 5).
본 발명에 따른 진단방법 및 진단용 키트는 습관성 유산 환자를 조기에 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.The diagnostic method and kit for diagnosis according to the present invention can be usefully used for early diagnosis of habitual abortion patients.
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