KR100754952B1

KR100754952B1 - 에바리스트라 리니아타 ｃｍ602(ｋｃｔｃ 10945ｂｐ) 및그로부터 생산되는 파이타아제

Info

Publication number: KR100754952B1
Application number: KR1020060092419A
Authority: KR
Inventors: 이영규; 최성현
Original assignee: 청미바이오(주)
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2006-09-22
Publication date: 2007-09-04
Also published as: US20100009037A1; US7927860B2; WO2008035945A1

Abstract

본 발명은 신규한 효모 균주인 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP), 상기 균주에 의하여 생산되는 파이타아제(phytase)에 관한 것이다.

본 발명의 파이타아제는 가축의 체온과 더 가까운 온도에서 우수한 활성을 나타내고 또한 열 안정성 및 pH 안정성도 우수하므로, 사료첨가제로서 가축 동물에게 섭취될 경우 우수한 파이타아제 활성을 나타낼 수 있고, 이로써 유기태인의 이용성을 더욱 효과적으로 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주는 유전자 재조합 기술 및 발효 최적화를 통해 파이타아제 효소의 생합성을 증대시킴으로써 효소 대량생산을 위해 사용될 수 있다.

에바리스트라 리니아타, 효모, 파이타아제

Description

에바리스트라 리니아타 ＣＭ602(ＫＣＴＣ 10945ＢＰ) 및 그로부터 생산되는 파이타아제{Eballistra lineata CM602(KCTC 10945BP) and phytase produced therefrom}

도 1은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)의 전자현미경 사진이다.

도 2는 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)의 리보솜 DNA의 ITS 유전자 염기서열 분석 결과이다.

도 3은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)의 계통도이다.

도 4는 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주와 쉬바니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) KCTC 7196으로부터 생산되는 파이타아제의 활성도 비교측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주로부터 생산되는 파이타아제의 온도에 따른 활성도를 나타낸 그래프이다.

도 6은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주로부터 생산되는 파이타아제의 온도에 따른 열 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주로부터 생산되는 파이타아제의 pH에 따른 활성도를 나타낸 그래프이다.

도 8은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주로부터 생산되는 파이타아제의 pH에 따른 pH 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주의 균체 내 효소정제를 위한 DEAE 세파로즈(Sepharose) 이온교환 크로마토그래피 결과이다.

도 10은 상기 이온교환 크로마토그래피에서 나온 분획의 전기영동에 의한 단백질 밴드 양상을 나타낸 도이다.

도 11은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주의 균체 내 효소정제 단계로서 모노 Q (Mono Q) 이온교환 액체 크로마토그래피 결과이다.

<기술분야>

본 발명은 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 및 그로부터 생산되는 파이타아제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 마른 호박잎으로부터 분리된 파이타아제 생산 효모인 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 및 상기 균주로부터 생산되며 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 특징을 지니고 있는 파이타아제에 관한 것이다.

<종래기술>

식물성 사료에 함유된 인은 총 인의 약 75%가 파이테이트(phytate)의 형태로 존재한다(참조: Cromwell et al., J. Anim. Sci., 71:1831-1840, 1993). 식물 유기태 인산의 저장 화합물인 파이테이트(myo-inositol 1,2,3,4,5,6,-hexakis dihydrogen phosphate)는 식물성 사료의 주요성분으로 이노시톨(inositol)과 인산염(phosphate)이 결합되어 있는 형태로 존재하며, 이에 대한 가축의 활용은 매우 중요하다(참조: Maga, J. A., J. Agric. Food Chem., 30:1-9, 1982).

또한, 사료에 함유되어 있는 파이테이트는 화학적으로 미오-이노시톨 헥사포스페이트(myo-inositol hexaphosphate)에 칼슘, 마그네슘, 철, 아연 등이 결합된 상태로 존재하는데, 이것은 가축이 필요로 하는 중요한 무기이온을 흡착하는 항-영양인자(anti-nutritional factor)로서 작용할 뿐만 아니라(참조: Qian et al., J. Anim. Sci. , 74:1288-1297, 1996), 단백질과 결합하여 소화율을 감소시키고 사료 이용율을 낮추므로, 사료 중에 존재하는 파이테이트를 분해하는 것은 사료의 효율을 극대화하기 위하여 필수적이다(참조: Lei et al., J. Anim. Sci., 71:3368-3375, 1993).

그러나, 가금류나 돼지와 같은 단위 동물들은 소화기관 내에 파이테이트를 분해하여 인산을 유리시키는 효소인 파이타아제(phytase)가 결여되어 있어 사료 중의 유기인을 가용 유기 인의 형태로 전환하지 못하므로, 파이테이트를 거의 이용하지 못하고 대부분 분뇨로 배출하고 있다(참조: Yi et al., Poultry Sci., 75:240-249, 1996).

이러한 파이타아제(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8)는 식물, 미생물, 진균 등에 존재하며, 식물의 중요한 유기인산 저장 화합물인 파이테이트(myo-inositol hexaphosphoric acid)를 가수분해하여 미오-이노시톨과 포스페이트(free ortho-phosphate)를 생산하는 효소이다(참조: Reddy et al., Adv. Food Res., 28:1-92, 1982).

이와 같은 파이타아제는 사료 첨가제로 사용시, 사료 내 유기태 인의 이용성을 60% 이상 증가시키고, 무기질의 체내 흡수를 증가시킬 뿐만 아니라, 단백질 이용률 및 소화흡수율 증진효과를 나타내어 사료의 영양 가치를 증진시키는 것으로 알려져 있다(참조: Denbow et al., Poultry Sci., 74:1831-1842, 1995). 이에 따라 미생물에서 분리하여 상업적으로 대량 생산한 파이타아제를 가축사료에 첨가함으로써 사료에 첨가하는 무기인의 함량을 줄이고, 하천이나 담수호의 녹조현상을 일으키는 주요 원인이 되는 가축 배설물 중의 유기태 인의 함량을 감소시킨 결과를 얻었다고 하였다(참조: Yi et al., Poultry Sci., 75:240-249, 1996).

따라서, 지금까지 파이타아제를 얻기 위하여 이 효소를 생산하는 미생물에 대하여 많은 연구들이 보고되어 왔다.

한편, 파이타아제를 생산하는 유전자 변형 돼지에 관한 연구도 있었는데, 고로반 SP 등은 파이타아제 유전자를 가지고 사육 돼지 25마리의 유전자를 변형하여, 돼지 침선에서 인 성분을 소화시키는 파이타아제를 만들어 내게 한 결과 배설물에 함유된 인 성분을 75%까지 줄였다고 보고한 바도 있다(Golovan SP et al., Nat Biotechnol 19(8):741-5, 2001).

그러나, 현재까지 알려진 아스퍼질러스 피컴(Aspergillus ficcum) 등의 곰팡이와 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등의 박테리아에서 발견된 파이타아제는 i) 효소의 생산량이 적은 문제점과 ii) 이들 효소가 갖는 고유의 특성 (specific activity), iii) 내열성 등이 낮은 단점 때문에 산업적으로 이용되지 못하고 있는 현실이다. 특히 곰팡이의 경우 대량 배양시 배양기간이 길고 통기, 교반 등의 발효조건이 까다로워 대량설비가 증가되어야 하는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 가축이 섭취시 가축의 체내에서 우수한 효소 작용을 나타낼 수 있는 파이타아제를 찾고자 동물의 체온과 가까운 온도에서 비교적 높은 활성을 가지면서도, 광범위한 열 안정성 및 pH 안정성을 나타내는 파이타아제를 개발하기 위해 노력한 결과, 파이타아제를 생산하는 효모인 에바리스트라 리니아타 (Eballistra lineata) CM602를 마른 호박잎에서 분리 동정하고, 상기 균주로부터 생산된 파이타아제가 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 개선된 특징을 지니고 있는 파이타아제임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 파이타아제를 생산하는 효모인 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주로부터 생산된 파이타아제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 열 안정성, pH 안정성이 우수하고, 단위 동물 체내 온도인 39℃ 부근에서 활성이 우수한 파이타아제를 생산하는 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)가 생산하는 효소로, 최적 온도는 55℃이고 70℃에서도 우수한 열 안정성을 보이며, 단위 동물 체내 온도인 39℃ 부근에서 충분한 활성을 나타내며, 최적 pH는 pH 7.0과 pH 2.0 로서 pH 3.5~9.0에서 60% 이상의 상대 활성값을 유지하는, 효소 파이타아제(Phytase)에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 균주에 의하여 생산되는 파이타아제를 사료첨가제로 사용하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자는 우수한 파이타아제 활성, 열 안정성 및 pH 안정성의 장점을 동시에 지닌 파이타아제를 생산하는 미생물을 찾고자, 돈분, 사료, 퇴비, 왕겨, 부토, 옥수수 속대, 나무껍질, 물풀, 여귀, 마른 호박잎, 고구마잎, 호박꽃, 인삼잎, 찰흙, 마른 풀, 소나무 마른 껍질, 솔방울, 황토 흙 등에서 유래된 파이타아제 생산 균주를 탐색하여 선발, 분리 및 동정하였다.

그 결과, 본 발명의 효모 균주인 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)를 얻었으며, 그 분리 및 동정 과정은 다음과 같다.

본 발명에서 파이타아제 생산 균주의 분리 및 동정은, (1) 파이타아제 효소 활성이 있는 미생물의 1차 분리, (2) 1차 분리된 미생물의 효소 역가 측정, (3) 효소의 열 안정성 및 pH 안정성 측정, (4) 선발된 균주의 동정에 의하여 이루어진다.

(1) 파이타아제 효소 활성이 있는 미생물의 1차 분리

파이타아제 생산 균주를 탐색하기 위하여 돈분, 사료, 퇴비 등의 자연물에서 파이타아제 효소 활성이 있는 미생물의 1차 분리를 하였으며 그 분리법은 다음과 같다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 먼저, 돈분, 사료, 퇴비, 왕겨, 부토, 옥수수 속대, 나무껍질, 물풀, 여귀, 마른 호박잎, 고구마잎, 호박꽃, 인삼잎, 찰흙, 마른 풀, 소나무 마른 껍질, 솔방울, 황토 흙 등 총 89가지 시료를 준비하고, 시료를 각각 멸균 생리식염수에 희석하여 희석 용액을 준비한다. 또한, 0.1~0.3%의 파이테이트, 0.10~0.20%의 타르타르산(tartaric acid), 소량의 CaCl₂가 함유된 PDA(potato dextrose agar) 평판배지를 준비한다. 그 다음, 상기 시료 희석용액을 PDA 평판 배지 위에 떨어뜨리고 유리막대로 잘 문질러서 배지 표면에 흡수시킨 후, 25~37℃의 항온배양기 내에서 2-3일 배양한다. 이를 매일 관찰하며 형성된 미생물의 집락 위에 다음과 같은 발색시약 용액을 부어 파이타아제 활성이 있는지를 조사한다. 발색시약 용액은 10% 아스코르브산(Ascorbic acid) : 2.5% 암모늄 몰리브데이트 (Ammonium molybdate) : 2N H₂SO₄: 5% TCA = 1:1:3:0.5 비율로 혼합한 것을 사용한다. 37 ℃에서 1-2시간 발색시킨 후, 집락 주변이 처음의 노란색에서 푸른색 으로 변하면 파이타아제 활성이 있는 것으로 판단, 선발하여 미생물을 1차 분리한다.

(2) 1차 분리된 미생물의 효소 역가 측정

상기에서 1차 분리된 미생물을 액체배지배양 또는 고체배지배양하고, 이로부터 수득한 배양액, 균체 등에서 파이타아제 효소 활성을 측정하여 효소활성이 높은 균주를 선발한다.

먼저, 상기에서 1차 분리된 미생물을 밀기울 침출액 배지와 같은 파이타아제 생산 배지에 접종하고, 30~40 ℃에서 2~4일 배양한 후 배양액을 수득하고, 이를 원심분리 하여 얻은 상징액을 파이타아제 활성을 측정하는 조효소액으로 사용할 수 있다.

또는 상기에서 1차 분리된 미생물을 PDA 평판배지에서 배양하고, 배지에서 자란 균체를 긁어모아 0.1M 초산나트륨 완충용액(pH 5.5)과 같은 완충용액에 현탁시키고 자이몰리에이즈(zymolyase) 효소 처리로 세포벽을 분해, 파쇄한 후 원심분리하여 얻은 상징액을 파이타아제 활성을 측정하는 세포내 분획 효소액으로 사용할 수 있다.

그 다음, 조효소액 또는 세포내 분획 효소액으로 파이타아제 효소활성(효소역가)을 측정하여 높은 파이타아제 활성을 갖는 균주들을 선발한다. 이 때 파이타아제 효소활성은 당업계에 공지된 방법을 사용한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 원심분리용 튜브에 0.5ml의 소듐 파이테이트 용액(1.0mM의 CaCl₂가 함유되고 소듐 파이테이트 농도가 0.0051M이 되도록 초산 완충액에 녹여 pH 5.5로 조정)을 넣어 37 ℃로 조정된 수욕조에 5분간 둔 다음, 상기 조효소액 50 μl를 첨가하고 잘 섞어 준 다음 37 ℃에서 30-60 분간 반응시킨다. 반응 후, 0.45 ml의 반응 정지액 (25 ml의 AM 용액과 25 ml의 AV 용액을 섞고 16.5 ml의 질산을 합하여 100 ml로 맞추었음)을 넣고 10분간 방치하고, 그 다음 5,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상징액을 수득하고, 415 nm에서 상징액의 흡광도를 측정하고, NaH₂PO₄를 이용하여 작성한 표준곡선과 비교하여 생성된 PO₄의 함량을 구한다. 효소단위 FTU (Natuphos의 효소활성 실험법, BASF, Germany)는 37℃에서 5.10 mM의 소듐 파이테이트 용액으로부터 1 분간에 1 μmole의 인산염을 유리시키는 효소의 양으로 정의되고, 이를 기준으로 조효소액 또는 세포내 분획 효소액의 파이테이트 효소 활성을 계산한다.

(3) 효소의 열 안정성 및 pH 안정성 측정

상기 (2)에서 선발된 높은 파이타아제 활성을 갖는 균주의 조효소액 또는 세포내 분획 효소액을 가지고 열 안정성(내열성) 및 pH 안정성(내산성)을 조사한다.

먼저, 다양한 온도에서의 효소활성을 측정하는데, 특히 고온에서 효소활성이 유지되는 열 안정성을 나타내는지 조사하고, 또한, 다양한 pH에서의 효소활성을 조사하는데, 특히 낮은 pH에서도 효소활성이 유지되는 pH 안정성을 나타내는지 조사하여, 열안정성 및 pH 안정성이 우수한 균주를 선발한다.

(4) 선발된 균주의 동정

상기 선발된 균주의 동정을 위하여, 형태학적인 관찰 후 당류(탄소원) 이용성 실험과 각종 효소 생산 유무를 API 키트 등을 사용해 조사한다.

또한 분자생물학적인 방법으로 동정하기 위하여 균체로부터 DNA를 추출하여 계통분류를 위한 특정 유전자, 예를 들면 리보솜의 ITS(internal transcribed spacer) rDNA 부분을 PCR로 증폭시키고, 생성된 DNA의 염기서열을 분석하여 문헌상에 기 보고된 DNA와 상동성을 비교하고 계통 분류도를 작성한다.

상기와 같은 과정을 통해 본 발명에서는 우수한 파이타아제 활성, 우수한 열 안정성 및 pH 안정성을 나타내는 균주 CM602를 선발하였다.

선발된 CM602 균주를 PDA 배지에 배양한 결과, 콜로니의 색은 연노랑이고 전형적인 효모의 형태로서 크림과 같은 양상으로 관찰되고, 광학현미경으로 관찰시, 땅콩 깍지 모양으로 내부에 2개씩의 내생포자가 있는 형태학적 특징을 나타낸다(도1 참조).

상기 선발된 균주는 탄소원으로서 L-아라비노스, D-리보오스, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-만니톨, D-말토오스 등을 이용하고(표 1 참조), 염기성 포스파타아제, 산성 포스파타아제, 에스터라제, 에스터라제 리파아제, 류신 아릴아미다제, 베타-글루코시다제 등의 효소활성을 나타내는 특징을 보인다(표 2 참조).

또한, 상기 CM602 균주의 유전자 수준에서의 동정을 위하여 리보솜의 rDNA ITS(internal transcribed spacer) 유전자 염기서열을 분석하고(도 2), 근린결합법 으로 미생물의 계통분류도를 작성하는 방법을 사용하여 동정한다(도 3).

상기 특징들을 종합한 결과, 본 발명의 CM602 균주는 효모류인 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata)로 동정되었다.

본 발명자는 상기 균주를 에바리스트라 리니아타 CM602로 명명하고, 미생물기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 2006년 5월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10945BP를 부여받았다.

이러한 본 발명의 에바리스트라 리니아타 CM602 균주는 기존의 파이타아제 생산 효모 균주로 알려진 쉬바니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castelli) KCTC 7196에 비해 약 2배의 높은 파이타아제 활성을 나타낸다(도 4).

또한, 에바리스트라 리니아타 CM602 균주의 파이타아제 효소는 50~60℃의 범위에서 높은 파이타아제 효소 활성을 나타내고, 최적온도는 55℃로서 이 최적온도에서 최고의 활성을 나타낸다(도 5). 그리고, 동물 체내 온도인 39℃ 부근에서 약 50% 의 상대활성값을 나타낸다.

또한, 에바리스트라 리니아타 CM602 균주의 파이타아제 효소는, 30~70℃ 범위에서 온도별 처리 후 37℃에서 효소 활성 측정시, 70℃에서도 90%의 잔존효소 활성 값을 보여 온도가 70℃까지 높아지더라도 효소 활성이 저하되지 않는 우수한 열 안정성을 나타낸다(도 6).

또한, 에바리스트라 리니아타 CM602 균주의 파이타아제 효소는 산성과 중성 의 두 산도, 즉 pH 2.0 과, pH 7.0에서 높은 파이타아제 효소 활성을 나타내고, 최적 pH 7.0에서 최고의 활성을 나타낸다(도 7).

또한, 에바리스트라 리니아타 CM602 균주의 파이타아제 효소는, pH 2.0~10.0범위에서 pH별 처리 후 55℃에서 효소 활성 측정시, pH 3.5~4.0에서 80% 이상의 높은 잔존효소 활성값을 보이고, pH 3.5~9.0 에서 60% 이상의 활성값을 나타내므로 pH 안정성이 우수하다. 즉, 산성 및 중성의 영역에서 효소 활성이 저하되지 않고 안정하게 유지되는 pH 안정성을 나타낸다(도 8).

따라서, 본원발명의 파이타아제는 동물의 체온과 더 가까운 온도에서 비교적 높은 활성을 나타내고 또한 열 안정성도 우수하므로, 사료의 가공 과정에 투입되어도 가공과정에서 가해질 수 있는 고온에 대하여 열 안정성을 가지며, 또한 사료첨가제로서 투여 전 사료와 혼합되어 가축 동물(예를 들면, 닭, 돼지 등)에게 섭취될 경우 위산의 분비로 인한 pH의 저하에도 잘 적응하는 우수한 파이타아제 활성을 나타낼 수 있고, 이로써 유기태 인의 이용성을 더욱 효과적으로 증가시킬 수 있다.

이러한 파이타아제를 생산하는 에바리스트라 리니아타 CM602 균주는 배양하여 균체 또는 배양물로부터 당업계의 통상적인 방법으로 파이타아제 효소를 분리 정제할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 균주인 에바리스트라 리니아타 CM602 (KCTC 10945BP)는 국내에서는 보고된 바가 없는 최초의 균종이고, 또한 최초의 파 이타아제 생산 균종이며, 이 균이 생산하는 파이타아제는 종래의 파이타아제와는 다른 것이다.

본 발명의 에바리스트라 리니아타 CM602 (KCTC 10945BP) 균주가 생산하는 파이타아제는 우수한 파이타아제 효소활성, 열 안정성 및 pH 안정성 등의 사료첨가 용도로 사용하기에 적합한 특성을 가지므로 산업화 가능성이 높다.

또한, 에바리스트라 리니아타 CM602 (KCTC 10945BP) 균주는 유전자 재조합 기술 및 발효 최적화를 통해 파이타아제 효소의 생합성이 증대됨으로써 효소 대량생산하기 위해 사용될 수 있다.

특히, 에바리스트라 리니아타 CM602 균주에서 파이타아제 유전자를 찾아서 그 유전자의 특성을 밝히고, 이 파이타아제 효소 유전자를 벡터(예, 효모 유래 벡터 등)에 삽입하여 발현·생산하며, 또한 벡터의 발현기작의 개선 등을 통해 효소생산량을 증대할 수 있다. 이 때, 효모용 벡타를 사용해 연구할 경우 곰팡이나 세균의 유전자를 사용하는 것 보다 효모를 사용하는 것이 목표를 달성하는데 유리할 것으로 예측되며, 따라서 에바리스트라 리니아타의 유전자의 활용이 유리할 것이다.

또한, 본 발명은 에바리스트라 리니아타 CM602 (KCTC 10945BP) 균주에서 특유의 유전자를 찾아서 그 유전자의 특성을 밝히는데 활용하여 파이타아제를 분자생물학적인 방법으로 대량생산하는데 사용하기 위한 것으로, 신규 유전자원으로서 그 가치가 큰 균주를 제공하는데도 본 발명의 기술적 의의가 있다.

따라서 본 발명의 에바리스트라 리니아타 CM602 (KCTC 10945BP)균주는 파이타아제를 생산 및 사료 첨가제로 이용하게 되는 가능성을 높일 수 있다.

또한, 본 발명의 에바리스트라 리니아타 CM602로부터 생산된 파이타아제는 가축이 섭취시 우수한 파이타아제 활성을 나타내어 파이테이트로 존재하는 유기태인을 이용가능하게 함으로써 영양분을 보충하는 효과가 있으며 가축의 인 배출량을 감소시켜 수질오염을 줄일 수 있고, 호수의 녹조현상을 감소시켜, 이를 방지하기 위하여 소요되는 막대한 비용을 절감시킬 수 있는 경제적인 효과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하고자 하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어 자명할 것이다.

또한, 본원 명세서에서 참조하고 있는 선행 특허공보를 포함하는 문헌은 그 전체로서 본원 명세서에 편입되어 있는 것으로 한다.

실시예 1. 본 발명의 파이타아제 효소를 생산하는 미생물의 분리, 동정, 효소활성 확인

1) 파이타아제 효소 활성이 있는 미생물의 1차 분리

하기와 같이 다양한 시료에서 파이타아제 효소를 생산하는 미생물을 분리하였다.

0.2%의 파이테이트와 0.16%의 타르타르산(tartaric acid) 그리고 소량의 CaCl₂가 함유된 PDA(potato dextrose agar) 평판 배지를 준비하고, 돈분, 사료, 퇴비, 왕겨, 부토, 옥수수 속대, 나무껍질, 물풀, 여귀, 마른 호박잎, 고구마잎, 호박꽃, 인삼잎, 찰흙, 마른 풀, 소나무 마른 껍질, 솔방울, 황토 흙 등 총 89가지 시료를 준비하였다.

시료를 각각 멸균 생리식염수에 희석 (10³까지 희석)하고, 희석 용액 한 방울을 PDA 평판 배지 위에 떨어뜨리고 유리막대로 잘 문질러서 배지 표면에 흡수시킨 후, 거꾸로 하여 30℃의 항온배양기 내에서 2~3일 배양하였다. 이를 매일 관찰하였고, 3일째에 형성된 미생물의 집락 위에 다음과 같은 발색시약 용액을 부어 파이타아제 활성이 있는 미생물을 조사하였다. 발색시약 용액은 10% 아스코르브산(Ascorbic acid) : 2.5% 암모늄 몰리브데이트 (Ammonium molybdate) : 2N H₂SO₄: 5% TCA = 1:1:3:0.5 비율로 혼합한 것을 사용하였다. 37℃에서 1~2 시간 발색시킨 후 집락 주변이 처음의 노란색에서 푸른색으로 변하면 간접적인 파이타아제 활성이 있는 것으로 판단하였고, 파이타아제 활성이 있는 것으로 판단된 82 균주를 1차 분리하여 보관하였다.

2) 효소 역가 측정에 의한 우수 균주 선정

상기에서 1차 분리된 82 균주를 밀기울 침출액 배지 (밀기울 200g과 탈지 대두박 분말 20g에 수돗물 150ml을 섞어서 상온에서 6시간 침출 후 거즈로 여과하고 당밀 5%를 첨가한 후 멸균)에 접종하여 30℃에서 3 일간 진탕 배양하였다. 배양 후, 5,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상징액(上澄液)을 분리하였고, 그 상징액을 조효소액으로 하여 아래와 같은 효소역가 측정방법으로 실험하고 생산된 효소 량의 단위를 계산하였다.

[효소 활성 측정]

위와 같이 배양한 미생물 배양액의 상징액 혹은 세포벽을 분해, 파쇄한 후 원심분리 하여 얻은 상징액(조효소액)을 가지고 정량적인 방법으로 파이타아제 활성을 분석하여 수치화하였다.

즉, 원심분리용 튜브에 기질인 0.5ml의 소듐 파이테이트 용액(1.0mM의 CaCl₂가 함유되고 소듐 파이테이트 농도가 0.0051M이 되도록 초산 완충액에 녹여 pH 5.5로 조정)을 넣어 37℃로 조정된 수욕조에 5분간 둔 다음, 상기 조효소액 50 μl를 첨가하고 잘 섞어 준 다음 37 ℃에서 30-60분간 반응시켰다. 반응 후, 0.45ml의 반응 정지액 (25ml의 AM 용액과 25 ml의 AV 용액을 섞고 16.5 ml의 질산을 합하여 100 ml로 맞추었음)을 넣고 10분간 방치하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 5,000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 이 때 얻은 상징액을 가지고 415 nm에서 흡광도를 측정한 후, NaH₂PO₄를 이용하여 작성한 표준곡선과 비교하여 생성된 PO₄의 함량을 구하였다. 효소단위 FTU (Natuphos의 효소활성 실험법, BASF, Germany)는 37℃로 5.10 mM의 소듐 파이테이트 용액으로부터 1 분간에 1 μmole의 인산염을 유리시키는 효소의 양으로 정의하였다. [참고; AM 용액,10%의 암모늄 몰리브데이트 용액에 1.0%가 되도록 암모니아수를 첨가한 용액, 갈색 병에 보관; AV 용액, 0.235g의 암모늄 바나데이트를 물에 용해시키고 2.0 ml의 35% 질산용액을 합하여 100 ml로 맞춘 용액, 갈색 병에 보관.]

이어서, 열안정성을 갖는 효소를 선별하기 위하여 조효소액을 70℃에서 15분간 둔 다음, 상기의 효소활성 측정법으로 시험하여 열안정성이 우수한 효소를 생산하는 균주를 선별하였다.

실험 결과, 그 중 활성이 가장 우수한 균주, CM602균주가 선발되었다.

조효소액 수준에서 파이타아제 활성을 조사한 결과 CM602 균주는 0.1단위/ml의 활성을 나타내었다.

또한, 균주의 세포 내 효소활성 실험을 위하여, 감자즙 한천(PDA) 평판배지에 자란 균체를 긁어모아 0.1M 초산나트륨 완충용액 (pH 5.5)에 현탁시키고 자이몰라아제(zymolyase) 효소처리로 세포벽을 분해하여 파쇄한 후, 5,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 이 때 원심분리하여 얻은 상징액을 세포 내 분획으로 사용하였고, 상기와 같이 정량적인 방법으로 파이타아제 활성을 분석하여 수치화하였다.

그 결과, CM602균주의 균체 습 중량 1 g당 세포 내 효소활성은 0.42 단위로 나타났다.

3) 선발된 CM602 균주의 동정

3-1) 형태학적 특성

선발된 CM602 균주의 형태학적 특성을 파악하기 위하여 PDA 배지에 배양한 결과 콜로니의 색은 연노랑이고 전형적인 효모의 형태로서 크림과 같은 물성을 갖는 것으로 관찰되었다. 또한, 광학현미경을 통하여 균체세포의 형태학적 특성을 조사하였다. 도 1을 보면, 선발균주 CM602의 형태는 땅콩 깍지 모양으로 내부에 2개씩의 내생포자가 관찰되었다.

3-2) 생화학적 특성

선발된 CM602 균주의 생화학적 특성을 확인하기 위하여, API 키트 (BioMerieux 사 제품)를 사용하여 발효성 검정을 실시하였다. 발효성 검정 결과는 하기의 표 1과 같다.

API 시험결과, 본 발명의 CM602 균주는 L-아라비노스, D-리보오스, 포도당(글루코오스), 과당(프룩토오스), 만노오스, 만니톨, 맥아당(말토오스), 설탕(수크로스), 트레할로스, 라피노오스, L-아라비톨 등을 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다 (표 1).

또한 API ZYM 키트(BioMerieux 사 제품)에 의한 시험결과, 본 발명의 CM602 균주에서 염기성 및 산성 인산화 효소(alkaline and acid phosphate), 지방분해효소 (리파아제, lipase), 섬유소 분해효소 베타-글루코시다제 (β-glucosidase) 등의 효소활성이 양성으로 나타나, 이러한 효소를 생산, 분비하고 있음을 확인할 수 있다(표 2).

탄소원	본 발명의 균주 (CM602)
글리세롤 (Glycerol)	-
에리쓰리톨 (Erythritol)	-
D-아라비노스 (D-Arabinose)	-
L-아라비노스 (L-Arabinose)	+
D-리보오스 (D-Ribose)	+
D-자일로오스 (D-Xylose)	-
L-자일로오스 (L-Xylose)	-
D-아도니톨 (D-Adonitol)	-
메틸-베타-D-자일로오스 (Methyl-β-D-Xylose)	-
D-갈락토오스 (D-Galactose)	-
D-글루코오스 (D-Glucose)	+
D-프룩토오스 (D-Fructose)	+
D-만노오스 (D-Mannose)	+
L-소르보스 (L-Sorbose)	-
L-람노오스 (L-Rhamnose)	-
둘시톨 (Dulcitol)	-
이노시톨 (Inositol)	-
D-만니톨 (D-Mannitol)	+
D-소르비톨 (D-Sorbitol)	-
메틸-알파-D-만노피라노사이드 (Methyl-α-D-Mannopyranoside)	-
메틸-알파-D-글루코피라노사이드(Mehtyl-α-D-Glucopyranoside)	-
N-아세틸-글루코사민 (N-Acetyl-Glucosamine)	-
아미그달린 (Amygdalin)	-
알부틴 (Arbutin)	-
에스큘린 구연산철 (Esculin ferric citrate)	-
살리신 (Salicin)	-
D-셀로비오스 (D-Cellobiose)	-
D-말토오스 (D-Maltose)	+
D-락토오스 (D-Lactose)	-
D-멜로비오스 (D-Melobiose)	-
D-사카로스(수크로스) (D-Saccharose (Sucrose))	+
D-트레할로스 (D-Trehalose)	+
이눌린 (Inulin)	-
D-멜레치토오스 (D-Melezitose)	-
D-라피노오스 (D-Raffinose)	+
아미돈 (Amidon)	-
글리코겐 (Glycogen)	-
자일리톨 (Xylitol)	-
겐티오비오스 (Gentiobiose)	-
D-투라노스 (D-Turanose)	-
D-리조스 (D-Lyxose)	-
D-타가토스 (D-Tagatose)	-
D-푸코스 (D-Fucose)	-
L-푸코스 (L-Fucose)	-
D-아라비톨 (D-Arabitol)	-
L-아라비톨 (L-Arabitol)	+
글루코네이트(칼륨) (gluconate (potassium))	-
2-케토글루코네이트(칼륨) (2-Ketogluconate (potassium))	+
5-케토글루코네이트 (5-Ketogluconate (potassium))	-

효소	본 발명의 균주 (CM602)
염기성 포스파타아제 (Alkaline phosphatase)	+
에스터라제 (Esterase (C4))	+
에스터라제 리파아제 (Esterase Lipase (C8))	+
리파아제 (Lipase (C14))	-
류신 아릴아미다제 (Leucine arylamidase)	+
발린 아릴아미다제 (Valine arylamidase)	-
크리스틴아릴아미다제 (Crystine arylamidase)	-
트립신 (Trypsin)	-
알파-키모트립신 (α-chymotrypsin)	-
산성 포스파타아제 (Acid phosphatase)	+
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라제 (Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase)	-
알파-갈락토시다제 (α-galactosidase)	-
베타-갈락토시다제 (β-galactosidase)	-
베타-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase)	-
알파-글루코시다제 (α-glucosidase)	-
베타-글루코시다제 (β-glucosidase)	+
N-아세틸-베타-글루코사미니다제 (N-acetyl-β-glucosaminidase)	-
알파-만노시다제 (α-mannosidase)	-
알파-푸코시다제 (α-fucosidase)	-

3-3) 선발된 CM602 균주의 rDNA 분석

본 발명의 CM602 균주에 대한 유전자 수준에서의 동정을 위하여, rDNA 염기 서열 분석을 실시하였다.

균체로부터 DNA를 분리하기 위하여 상업적 키트 (솔젠트, 한국)를 사용하였고, ITS rDNA 유전자의 증폭을 위해서 두 종류의 프라이머 (pITS-F 5'-GTCGTAACAAGGTTAACCTGCGG-3'(서열번호 2), pITS-R 5'-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3'(서열번호 3))를 사용하였고, PCR을 통해 증폭된 유전자의 염기서열을 분석하였다(참조: Im et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol 54, 851-855, 2004).

또한, CM602 균주의 리보솜 DNA의 ITS 유전자 염기서열을 분석하고, 그 결과를 도 2 및 서열번호 1에 나타내었다.

상기 분석된 염기 서열은 Clustal X 프로그램(참조: Thompson et al. Nucleic acids Res., 24, 4876-4882, 1997)으로 정렬하고 근린결합법(참조: Saitou와 Nei, Mol. Bio. Evol. 4, 406-425, 1987)에 의해 작성된 미생물 계통분류도는 도 3과 같았으며, CM602 균주는 에바리스트라 리니아타 (Eballistra lineata) 또는 그 근연주로 분류, 동정 되었다(도 3). 근연주와의 상동성은 99.5%였다.

상기와 같은 형태학적, 생화학적 및 리보솜 DNA의 ITS 유전자 분석 수준에서 검토한 결과를 토대로 본 발명에서 선발한 균주 CM602를 최종적으로 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata)로 동정하였다.

상기한 바와 같이, 상기 선발된 균주가 파이타아제를 생산하는 것에 관하여 아직 국내·외에서 보고된 적이 없음을 확인하였고, 이를 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602로 명명하였으며, 미생물기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 2006년 5월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 10945BP를 부여받았다.

4) 본 발명의 CM602 균주의 파이타아제 효소역가 확인

본 발명의 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 균주와 이미 외국에서 발표된 효모 균주인 쉬바니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castellii) KCTC 7196 (Segueilha, L. et al., J. Fermen. Bioeng. 74, 7-11, 1992)으로부터 생산되는 파이타아제의 활성도 비교 실험을 하기와 같이 수행하였다.

상기 실시예 2)와 같이, 밀기울 침출액 배지를 사용하여 두 균주를 30℃로 3일간 진탕 배양하여 원심분리 후 상징액을 조효소액으로 사용하였다. 37℃에서 파이타아제 효소역가를 측정하고 비교한 결과는 도 4에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 에바리스트라 리니아타 CM602 균주가 KCTC 7196 균주보다 약 두 배의 높은 파이타아제 효소활성을 보였다.

5) 본 발명의 파이타아제의 특성 확인

① 온도에 따른 파이타아제 활성 확인

반응온도에 따른 본 발명의 파이타아제의 활성 정도를 알아보기 위하여, 30 내지 70℃의 온도 범위에서 기질과 상기 4)의 조효소액을 0.1M 초산 완충용액(pH 5.5)에서 각각 60분간 반응시키고 파이타아제 활성을 측정하여 최적온도를 조사하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었고, 본 발명의 CM602균주의 파이타아제는 온도 50 내지 60℃에 걸쳐서 활성이 높게 나타났고, 55℃에서 최고의 활성을 보였다.

또한, 동물 체내 온도인 39℃ 부근에서 약 50% 의 상대 활성 값을 나타내어 동물이 섭취시에 우수한 효소작용을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

② 온도에 따른 파이타아제 열 안정성 확인

또한, 본 발명의 파이타아제의 열 안정성을 알아보기 위하여, 상기 4)의 조효소액 50 μl를 30, 40, 50, 60, 70℃에서 15분간 방치시킨 후 위와 같은 방법으로 37℃에서 기질과 조효소액을 60분간 반응시키고 파이타아제 활성을 측정하여 잔류효소의 활성을 조사하였다. 대조군으로서 온도 처리를 거치지 않은 조효소액을 37 ℃에서 기질과 60분간 반응시켜 파이타아제 활성을 측정하였다. 이 때 측정한 효소활성값을 100%로 하고, 상기 열처리한 효소들의 상대 활성 값(%)을 계산하였다

도 6의 실험결과를 보면, 본 발명의 CM602균주의 파이타아제 열 안정성은 온도가 높아질수록 다소 낮아졌으나, 70℃에서도 90%의 상대 활성 값을 보여 우수한 열 안정성을 나타냄을 확인하였다.

상기한 열 안정성은 파이타아제를 산업적으로 이용할 경우, 사료의 펠렛 제조공정(feed-pelleting) 또는 팽창(expansion) 공정 동안 열에 의한 효소의 활성저하를 극복하는데 매우 유효하기 때문에, 산업적으로 이용가치가 매우 높을 것으로 생각된다.

기타의 파이타아제 효소의 열 안정성 및 작용최적 온도를 비교한 바, 참고균주(참조: Segueilha, L. et al., J. Ferment. Bioeng., 74, 7-11, 1992)인 쉬바니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castelli)KCTC 7196의 열안정성은 77℃로 우수하였으나 가축 동물의 체온인 39℃에서의 효소활성은 최적 활성의 약 20% 로, 본 발명의 CM602 균주의 약 50% 보다 낮았다.

③ pH에 따른 파이타아제의 활성 확인

pH 변화에 따른 본 발명의 파이타아제의 활성 정도를 조사하기 위하여, 55℃에서 상기 4)의 조효소액 50μl과 각각의 pH 2.0 내지 10.0의 초산 완충액 중의 기질용액을 잘 섞어서 60 분간 반응시키고 파이타아제 활성을 측정하여 최적 pH를 조사하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 두 개의 피크를 보였는데, 즉, pH 2.0 부근의 아주 낮은 부근과 중성 부근에서 높았으며 pH 7.0에서 최대의 활성을 나타내었다.

④ pH에 따른 파이타아제의 pH 안정성 확인

또한, 본 발명의 파이타아제 pH 안정성을 알아보기 위하여, 상기 4)의 조효소액 0.5 ml를 취해 pH를 2.0에서 10.0까지 각각 조정하여 8℃ 냉장고에서 20시간 넣어둔 다음, 50 μl씩 취하여 pH 7.0의 기질용액과 55℃에서 60분간 반응시켜 잔존효소활성을 조사하였고, 이를 상대 활성으로 표시하였다.

대조군으로서 산처리 안한 조효소액을 55℃, pH 7.0에서 기질과 60분간 반응시켜 파이타아제 활성을 측정하였다. 이 때 측정한 효소활성값을 100% 로 하고, 상기 산처리한 효소들의 상대활성값(%)을 계산하였다.

그 결과, 약 pH 3.5와 4.0에서 pH 안정성이 인정되었고 약 pH 3.5에서 9.0까지 60% 이상의 잔존활성을 보였다(도 8).

또한, 본 발명의 CM602 균주는 참고균주인 쉬바니오마이세스 카스텔리(Schwanniomyces castelli) KCTC 7196에 비해 상기와 같이 pH 안정성을 가짐을 확인하였다.

또한, 파이타아제 발현 효모에 관해서는 일본 학술지에 프랑스인 연구자에 의해 발표된 Schwanniomyces castellii (참조: Segueilha et al. J. Ferm. Bioeng. 74, 7-11, 1992)가 있는데, Sch. castellii가 생산하는 파이타아제는 최적 pH가 4.4, 최적 온도는 77℃이고 74℃이하에서는 열안정성이 있다고 보고된 바 있다. 단위 동물 가축의 효소제로 사용하려면 가축의 소화기관 내에서 효소의 활성이 좋아야 하고, 따라서 39 ℃ 부근에서 효소활성이 높아야 하는데 Sch. castellii의 파이타아제는 39 ℃에서 77℃의 최적 활성의 약 20% 의 값을 보여서 단점으로 지적할 수 있다.

반면, 본원발명의 균주가 생산하는 파이타아제는 39 ℃에서도 최적 활성의 약 50% 을 나타내고, 70 ℃에서도 우수한 열 안정성을 갖고 있으며, pH 3.5~9.0에서 최적활성의 60% 이상을 나타내는 우수한 pH 안정성을 갖고 있으므로 사료첨가제인 동물가축의 효소제로 사용하는데 적합함을 알 수 있다.

6) 본 발명의 파이타아제의 정제

10 ml의 CM602 균액을 2리터의 YM 배지 (Difco)에 접종하고 30℃에서 48시간 진탕배양 후 원심분리 (10,000 × g, 15분)하여 균체를 회수하고 Bead Beater (Biospec Products, Barlesville. OK)로 균체를 파괴하였다. 균체 파쇄액을 원심분리 (10,000 ×g, 15분)하여 상징액을 조효소액으로 사용하였다. 정제단계로는 황산 암모늄 침전법과 이온교환 컬럼크로마토 그라피법을 사용하였다. 황산암모늄으로 조효소액을 85% 포화시켜 원심분리 (10,000 × g, 15분)한 후 침전물을 모아 투석막으로 하룻밤 투석시켰다.

그 다음 파이타아제를 정제하기 위해서, 상기 투석한 효소액 부분을 완충액으로 평형화시킨 DEAE-세파로즈 이온교환 컬럼에 흡착시킨 후, 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 세척하여 흡착되지 않는 단백질을 제거하였다. 효소단백질이 흡착된 컬럼에 0.1M, 0.3M, 0.7M NaCl로 각각 농도별로 용출시키고 분획한 시료를 280 nm에서 흡광도를 측정하고 그래프를 그렸다. 그래프 및 상기영동 결과는 도 9 및 10에 나타난 바와 같다.

도 10의 상기영동 사진의 1번은 조효소액, 2번은 0.1M, 3번은 0.3M, 4번은 0.7M NaCl의 용출부분을 나타내며, 0.7 M 부분이 높은 파이타아제 활성을 나타내었다.

이 부분 단백질을 모아서 동결 건조시키고 소량의 완충액에 녹여, 액체 크로마토그라피용 모노-Q 75S/S 컬럼이 장착된 AKTA FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용하여 더욱 정제하였다. 정제는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 다음, 동일한 완충액에 0.1M, 0.3M, 0.5M, 0.7M NaCl이 포함된 용출 완충액으로 각각 농도별로 시간당 80 ml의 유속의 조건으로 용출하였다. 액체 크로마토그라피 그래프는 도 11에 나타난 바와 같다. 4번 피크인 0.5M에서 용출된 부분이 효소활성을 보였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 마른 호박잎으로부터 분리한 파이타아제 생산 균주 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP) 및 그로부터 생산되며 종래 보고된 파이타아제와 구별되는 특징을 지니고 있는 파이타아제를 제공한다.

본 발명의 균주인 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)에 의해 파이타아제가 생산되는 것은 국내·외에서 아직 보고된 바가 없으며 이 균이 생산하는 파이타아제는 종래의 파이타아제와는 다른 것으로, 본 발명의 파이타아제는 동물의 체온과 더 가까운 온도에서 비교적 강한 활성을 나타내고 또한 열 안정성 및 pH 안정성도 우수하므로, 사료첨가제로서 가축 동물(예를 들면, 닭, 돼지 등)에게 섭취될 경우 우수한 파이타아제 활성을 나타낼 수 있고, 이로써 유기태인의 이용성을 더욱 효과적으로 증가시킬 수 있다.

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Claims

열 안정성, pH 안정성이 우수하고, 단위동물 체내 온도인 39℃ 부근에서 활성이 우수한 파이타아제를 생산하는 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP).
제 1항의 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)가 생산하는 효소로, 최적 온도는 55℃이고 70℃에서도 우수한 열안정성을 보이며, 단위동물 체내 온도인 39℃ 부근에서 충분한 활성을 나타내며, 최적 pH는 pH 7.0과 pH 2.0 로서 pH 3.5~9.0에서 60% 이상의 상대 활성값을 유지하는 효소 파이타아제(Phytase).
제 1항의 에바리스트라 리니아타(Eballistra lineata) CM602 (KCTC 10945BP)가 생산하는 파이타아제를 사료 첨가제로 사용하는 방법.