KR100752757B1

KR100752757B1 - 2-페닐이미노-1,3-티아졸린을 포함하는 미백 조성물

Info

Publication number: KR100752757B1
Application number: KR1020060031130A
Authority: KR
Inventors: 한호규; 신동윤; 남기달; 김동석; 박경찬
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2006-04-05
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2007-08-29

Abstract

본 발명은 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 또는 그 유도체를 포함하는 미백 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성을 억제할 뿐만 아니라, 동시에 ERK 활성을 촉진함으로써 티로시나제 및 티로시나제 관련 단백질-1(TRP-1)과 티로시나제 관련 단백질-2(TRP-2)의 생성을 억제하여 멜라닌 형성을 현저히 감소시킬 수 있는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 및 그 유도체를 포함하는 미백 조성물에 관한 것이다.

2-페닐이미노-1,3-티아졸린, 미백 조성물, 멜라닌 생성, ERK 활성, 티로시나제.

Description

2-페닐이미노-1,3-티아졸린을 포함하는 미백 조성물{WHITENING COMPOSITION CONTAINING 2-PHENYLIMINO-1,3-THIAZOLINE}

도 1은 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린의 B16 세포에 대한 독성 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2A는 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린의 투여 농도에 따른 B16 세포에서의 멜라닌 합성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 2B는 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린의 투여 농도에 따른 B16 세포에서의 티로시나제 활성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 2C는 세포-프리 시스템에서의 표준미백원료인 코직산 및 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린의 투여 농도에 따른 티로시나제 활성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 3A는 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린의 B16 세포에서의 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase, 이하 ERK) 경로 활성 효과를 관찰한 웨스턴-블랏 분석이다.

도 3B는 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 2-페닐이미노-1-3-티아졸린이 B16 세포에서 멜라닌 합성관련 전사인사와 효소들의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 또는 그 유도체를 포함하는 미백 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성을 억제할 뿐만 아니라, 동시에 ERK 활성을 촉진함으로써 티로시나제 및 티로시나제 관련 단백질-1(TRP-1)과 티로시나제 관련 단백질-2(TRP-2)의 생성을 억제하여 멜라닌 형성을 현저히 감소시킬 수 있는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 및 그 유도체를 포함하는 미백 조성물에 관한 것이다.

[종래기술]

피부색을 결정하는 색소로는 멜라닌, 헤모글로빈, 카로티노이드가 있으며, 인간의 피부, 모발, 눈 등의 다양한 색깔은 이들 색소에 의하여 결정된다. 그 중 피부에 있어 색깔을 결정하는 가장 중요한 색소는 멜라닌이며, 멜라닌의 성질 및 분포 정도에 따라 피부색이 결정된다.

인간에게 있어 피부나 모발의 색소는 햇빛, 특히 자외선이 유해한 영향으로부터 보호해주는 역할을 한다. 예를 들어, 색소가 부족한 사람(ANBINOS; 백색증)은 햇빛에 매우 민감하여 화상을 입기 쉬우며, 어린 나이에도 피부암 발생 확률이 높다.

단파장의 자외선(290 내지 320 nm) 및 발암 물질은 피부에서 산소 라디칼을 형성시키는데, 이 산소 라디칼이 피부 세포를 공격하여 피부를 노화시키는 것으로 알려져 있다.

멜라닌은 상기와 같은 산소 라디칼을 제거하여 이에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 기능을 한다. 그러므로, 멜라닌이 많다는 것은 물리적, 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호하기 위한 효과적인 대응체계를 가지고 있다는 것을 의미한다. 그러나 인간의 심미적 관점에서 볼 때 멜라닌의 침착으로 인한 주근깨, 기미 등은 네거티브적인 요인이 된다.

이러한 멜라닌의 생성을 촉진하는 요인들로는 햇빛(자외선) 뿐만 아니라, 에스트로겐(estrogen), 프로스타글란딘(prostaglandin) 등의 인자들이 있다.

또한, 멜라닌 생성과 소멸 사이클은 다음과 같다. 멜라닌 세포(melanocytes)가 자극을 받으면, 세포내 함유되어 있는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산으로부터 자극에 의해 활성화되는 티로시나제(tyrosinase)가 멜라노좀(melanosome)에서 멜라닌을 생성한다. 이때, 티로신은 산소와 결합하여 산화되고 티로시나제는 구리와 결합되는데, 만일 피부에 구리가 결핍되면 정상적인 멜라닌 생성에 장애를 주게 된다. 자외선 등의 자극은 멜라닌 생성 세포에 직접적인 영향을 미칠 뿐 아니라, 자극호르몬계에도 영향을 미쳐 뇌하수체중엽에서 멜라닌 세포 자극호르몬 (melanocyte stimulating hormone, MSH)분비가 많아지면 멜라닌의 생성을 촉진시킨다. 멜라닌 세포 내에 포함되어 있는 티로신이라는 아미노산은 티로시나제의 작용으로 도파(dopa)로 변하고, 이어 도파옥시다제(dopaoxidase)의 작용으 로 도파키논(dopa-quinone)으로 변한 후, 티로시나제 관련단백질-1(tyrosinase-related protein-1, 이하 TRP-1이라고 함)과 티로시나제 관련단백질-2(TRP-2)의 작용에 의하여 멜라닌을 생성한다. 이와 같이 생성된 멜라닌은 각질형성세포로 전달되고 표피박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸되는 순환 작용을 보인다.

미백 화장품에 있어 멜라닌 생성을 억제하는 방법은 크게 다음과 같이 나눌 수 있다. 첫째로, 자외선을 차단하여 멜라닌 생성의 주원인을 제거하는 방법으로, 이 방법은 화장품 조성물로서 광산란제 또는 광차단제를 함유케 하여 좋은 결과를 기대할 수 있다. 둘째로, 티로시나제가 활성을 나타내기 위해 필요한 글루코사민(glucosamine)과 같은 코어 탄수화물의 합성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시키는 방법이다. 셋째로, 코직산(kojic acid) 또는 알부틴 등을 이용하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나제의 기능을 방해하는 방법이다. 넷째로, 하이드로퀴논과 같이 멜라닌을 생성하는 세포인 멜라닌 세포에 대하여 특이적인 독성을 가지고 있는 물질을 이용하여 멜라닌 세포의 분열을 방해하는 방법이다. 다섯째로, 생성된 멜라닌을 환원시켜 탈색하는 방법이 있다.

종래에는 멜라닌의 생성과정을 억제하기 위하여 아스코르빈산(ascorbic acid), 코직산, 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 및 천연식물의 추출물 등이 미백원료로 사용되어 왔다. 그러나 대표적인 미백원료인 코직산 또는 알부틴은 강한 미백효과에도 불구하고 제품 안정성이 낮다는 문제가 있다.

페닐이미노티아졸린 유도체는 하기 화학식 1과 같은 구조를 포함하며, 이러한 페닐이미노티아졸린 유도체는 대한민국 특허출원공개번호 제1994-0014366호에서 2-페닐이미노티아졸린 유도체의 제조방법 및 이의 중간체의 제조방법에 대하여 개시하고 있고, 특허출원공개번호 제1999-0062051호에서는 상기 2-페닐이미노티아졸린 유도체의 제조방법 및 상기 유도체의 일반 살균효과에 대하여 개시하고 있으나, 미백 효과에 대하여는 알려진 바 없다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 인체에 무해하며 우수한 미백효과를 가지는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 및 그 유도체를 포함하는 미백 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 화합물 또는 그 유도체를 포함하는 미백 조성물을 제공한다.

(화학식 1)

R₁은 수소 또는 할로겐 원자이고,

R₂는 수소, 할로겐 원자, 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기 또는 니트로기이고,

R₃는 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 탄소수 1 내지 5의 알킬 또는 할로겐 원자이고,

R₄, R₅, R₇, R₈, R₁₀ 및 R₁₁은 동시에 또는 각각 수소 또는 할로겐 원자이고,

R₆는 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 탄소수 1 내지 5의 알콕시기, 또는 아미노기이고, 및

R₉는 트리플루오로메틸, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, 니트로기 또는 할로겐 원자이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 멜라닌 세포에서의 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 유도체의 작용에 대하여 연구하던 중, 상기 유도체 중 상기 화학식 1로 표시되는 물질이 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성을 억제하며, 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase, 이하 ERK) 활성을 촉진함으로써 티로시나제의 생성을 억제하여 멜라닌 형성을 현저히 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 사람의 피부에 안전하게 사용할 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

인간에게 멜라닌 색소는 기미 및 흑색점과 같은 과다색소침착에 존재하며, 여러 종류의 내인성 시스템이 멜라닌 생합성을 조절하기 위하여 작용하는 것으로 밝혀졌다. 상기 내인성 시스템 중 하나인 α-멜라노사이트-자극 호르몬(α-Melanocyte-stimulating hormone, 이하 α-MSH)는 포유동물의 색소에 있어서 중요한 호르몬이며, 이는 특이적 수용체인(MC1R)과 결합하여 cAMP를 증가시키며, 마이 크로프탈미아-연관 전사인자(microphthalmia-associated transcription factor, 이하 Mitf)의 활성을 통하여 멜라닌 색소의 형성을 활성화시킨다. 상기 Mitf는 티로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 멜라닌 형성 효소의 발현을 현저하게 증가시킨다. 더욱이, MITF 유전자 돌연변이는 피부 및 머리카락의 비정상적인 색소의 발현인 바덴부르그 신드롬 타입 ⅡA (Waardenburg Syndrome type ⅡA)를 일으킨다.

티로시나제는 멜라닌 색소 형성 과정의 속도-제한 반응을 활성화시키므로, 멜라닌 형성은 티로시나제의 활성 및 발현에 의하여 중점적으로 억제된다. 또한, DOPA크롬상호변이효소로 알려진 TRP-2는 DOPA 크롬의 5,6-디하이드록시인돌-2-카르복실산(DHICA)로의 반응을 활성화시키고, TRP-1는 DHICA를 카르복실 인돌-퀴논으로 산화시킨다. 결과적으로, TRP-1 및 TRP-2는 고분자의 멜라닌 생폴리머의 형성에 중요한 역할을 한다.

세포외 신호조절 키나아제(ERK) 경로는 중요한 신경전달 경로에 해당하며, 세포 성장을 억제함에 있어서 중요한 역할을 한다. 최근에는, ERK 경로의 억제가 B16 흑색종 세포의 분화를 야기하고, 과다색소침착증을 야기하는 티로시나제의 활성을 증가시킨다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명의 미백 조성물은 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 및 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 사용되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

(화학식 1)

R₁은 수소 또는 할로겐 원자이고,

R₂는 수소, 할로겐원자, 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시 또는 니트로기이고,

R₃는 탄소수 1 내지 5의 알콕시, 탄소수 1 내지 5의 알킬 또는 할로겐원자이고,

R₄, R₅, R₇, R₈, R₁₀ 및 R₁₁은 동시에 또는 각각 수소 또는 할로겐원자이고,

R₆는 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, 또는 아미노기이고, 및

R₉는 트리플루오로메틸, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, 니트로기 또는 할로겐원자이다.

본 발명에서 사용되는 상기 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 유도체의 구조는 하기 표 1과 같다 (특허공개 제1999-0062051호 및 특허공개 제2002-0010028호 참조).

상기 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 및 그 유도체는 미백 조성물에 0.0001 내지 10 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 미백 효과가 미미하다는 문제점이 있으며, 10 중량%를 초과할 경우에는 사용량에 따른 효과가 미미하다는 문제점이 있다.

또한, 본 발명의 미백 조성물은 필요에 따라 벤조페논계 화합물과 같은 자외선 차단제 또는 광산란제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 자외선 차단제 또는 광산란제는 멜라닌 형성의 주원인이 자외선일 경우 멜라닌의 환원 탈색 기능 이외에 자외선을 차단하는 역할을 하며, 본 발명의 미백 조성물 내에 포함되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 화합물과 함께 작용하여 더욱 하얗고 깨끗한 미백 효과를 나타낼 수 있다. 상기 자외선 차단제 또는 광산란제는 미백 조성물에 대하여 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 0.01 중량% 미만일 경우에는 효과가 미미한 문제점이 있으며, 5 중량%를 초과하는 경우에는 사용량에 따른 효과가 미미한 문제점이 있다.

본 발명의 미백 조성물은 투여 경로에 제한이 없으나, 미백 목적상, 경피 투여, 피하 투여 등의 국부 투여가 바람직하다.

상기와 같은 성분을 포함하는 본 발명의 미백 조성물은 일반 피부화장료에 배합되는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등의 성분을 필요한 만큼 적용 배합할 수 있다. 또한, 상기 미백 조성물은 피부에 사용하는 것으로서 유연화장수(스킨), 수렴화장수, 영양화장수(로션), 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 파우더, 연고, 서스펜션, 에멀젼, 스프레이, 미용액, 비누, 샴푸, 피부접착용 패취, 또는 피부접착용 겔 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 담체와 첨가제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 미백 조성물은 화장품, 세제 및 섬유 등의 피부에 접촉하는 피부접촉물질로 제조할 수도 있다.

또한, 본 발명의 미백 조성물은 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 화합물 또는 그 유도체 이외에 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 희석제 또는 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 말토덱스트린, 물, 글리세롤 또는 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 미백 조성물은 약제로 사용될 경우 국소제로 사용할 수 있으며, 약제의 제형은 연고제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 미백 조성물을 약제로 제조할 경우 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remington’s Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 사용량 및 방법은 특정 환자에게 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 투여 경로, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물(예를 들어, 화학요법제)을 비롯한 다양한 인자에 따라 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 미백 조성물은 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성을 억제하며, 직접적으로 티로시나제의 활성을 억제하지는 못하나, ERK 활성을 촉진함으로써 간적접으로 티로시나제의 생성을 억제하여 멜라닌 형성을 현저히 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 사람의 피부에 안전하게 사용할 수 있는 장점이 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 세포 독성 시험

(사용된 화합물)

상기 화학식 1의 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 유도체는 대한민국 서울 키스트(KIST) 연구소에서 합성하여 사용하였으며, 그 제조는 한국특허출원 공개공보 제2002-0010028호 (발명의 명칭: 2. 2-페닐이미노티아졸린 유도체, 그의 염 및 제조방법; 2002년 2월 2일 공개)에 기재된 방법을 따랐다. 본 발명에서 사용한 화학식 1의 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 유도체의 구조를 상기 표 1에 나타내고, 물질번호를 기재하였으며, 하기 실시예에서는 명명된 물질번호를 사용하였다. 상기 표 1에 나타낸 화합물의 물성은 다음과 같다:

1. KHG 21544: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(4-메틸페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 브롬산염

수율: 88%

녹는점: 206-207 ℃

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2.25 (s, 3H, CH₃), 3.62 (s, 3H, 3-CH₃), 3.93 (s, 2H, 4-CH₂), 6.84 (s, 1H, 5-vinyl H), 7.11∼7.58 (m, 7H, ArH), 10.27 (s, 1H, NH); IR(KBr) 3435 (NH), 1670 (C=O)

2. KHG 22085: 2-(2.4-디플로로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(3-메톡시페닐)카바모일메틸]-4-티아졸린 염산염

수율: 65.0%

녹는점: 220.5∼227.7 ℃

¹H NMR(DMSO-d₆) δ 3.67 (s, 3H, 3-CH₃), 3.80 (s, 2H, 4-CH₂), 3.95 (s, 3H, OCH₃), 6.86 (s, 1H, Vinyl-H), 7.09∼7.80 (m, 7H, ArH), 10.73 (s, 1H, NH); IR(KBr), 3425.5(br), 3076.6, 1676, 1584.

3. KHG 22394: 2-(2.5-디플로로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(4-메톡시페닐)카바모일메틸]-4-티아졸린 염산염

수율: 43.7 %

녹는점: 183-186 ^oC

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃), δ3.71(s, 3H, N-CH₃), 3.76(2, 3H, OCH₃), 3.86(s, 2H, CH₂), 6.69(s, 1H, Vinyl CH), 6.83(d, 2H, J=9.0, Ar-H), 6.97-7.35 (m, 3H, ArH), 7.52(d, 2H, J=9.0, Ar-H), 10.20(s, 1H, amide NH).

FT-IR(KBr): 3425.5(NH), 2752.0, 1668.0, 1570.0, 1508.0(st), 1250.0, 1034.0, 826.0, 746.0, 524.0 cm^-1.

4. KHG 22397: 2-(4-트리플로로메톡시페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(4-메톡시페닐)카바모일메틸]-4-티아졸린 염산염

수율 : 78.15 %

녹는점 : 237-239 ^oC

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃ ), δ2.58(s, 3H, N-CH₃), 3.77(s, 2H, CH₂), 3.99 (s, 3H, O-CH₃), 6.83(d, 2H, J=9.0, Ar-H), 7.03(s, 1H, Vinyl CH), 7.37(d, 2H, J=9.0, Ar-H), 10.42(s, 1H, amide NH).

FT-IR(KBr): 3425.5(NH), 3120.0, 3056.0, 2952.0, 2750.0(br), 1658.0(st), 1584.0, 1512.0(st), 1430.0, 1358.0, 1294.0, 1238.0, 1160.0, 1038.0, 926.0, 830.0, 756.0, 678.0, 520.0 cm^-1.

5. KHG23038: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(4-메틸페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 77%,

녹는점: 211~212℃

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 2.25 (s, 3H, CH₃), 3.74 (s, 3H, 4-CH₃), 3.99 (s, 2H, 4-CH₂), 6.92 (s, 1H, vinyl-H), 7.11-7.62 (m, 7H, ArH), 10.62 (s, 1H, NH)

6. KHG23077: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(2-플루오로,4-클로로페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 79%,

녹는점: 188-190 ℃

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 3.63 (s, 3H, N-CH₃), 4.19 (s, 2H, 4-CH2), 6.76 (s, 1H, vinyl-H), 7.23-7.96 (m, 6H, Ar-H), 10.34 (s, 1H, NH)

7. KHG23089: 2-(4-트리플루오로메톡시페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(2-플루오로,5-클로로페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 29%,

녹는점: 228-229 ℃

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 3.77 (s, 3H, N-CH₃), 4.12 (s, 2H, 4-CH2), 7.01 (s, 1H, vinyl-H), 7.25-8.09 (m, 7H, Ar-H), 10.52 (s, 1H, NH)

8. KHG23096: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(2-플루오로,5-클로로페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 80%,

녹는점: 132-133 ℃

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 3.68 (s, 3H, N-CH₃), 4.08 (s, 2H, 4-CH2), 6.84 (s, 1H, vinyl-H), 7.24-8.10 (m, 6H, Ar-H), 10.47 (s, 1H, NH)

9. KHG 23243: 2-(4-나이트로페닐이미노)-3-아미노-4-[N-(4-메톡시페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 88 %

녹는점 : 188.1 ℃

¹H NMR (300MH_z, DMSO-d₆) δ 3.7 (s, 3H, OCH₃), 3.96 (s, 2H, 4-CH₂), 7.01 (s. 1H, vinyl-H), 6.87-8.35 (m, 7H, Ar-H), 10.45 (s, 1H, N-H).

10. KHG 23253: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(4-플루오로페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율 : 85%,

녹는점 : 210.4 ℃

¹H NMR (300MH_z, DMSO-d₆) δ 3.73 (s, 3H, N-CH₃), 3.96 (s, 2H, 4-CH₂), 6.93 (s. 1H, vinyl-H), 7.14-7,69 (m, 7H, Ar-H), 10.84 (s, 1H, N-H).

11. KHG 23254: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(4-플루오로페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율 : 79 %

녹는점 : 212.0 ℃

¹H NMR (300MH_z, DMSO-d₆) δ 3.34 (s, 3H, N-CH₃), 3.72 (s, 2H, 4-CH2), 6.14 (s. 1H, vinyl-H), 6.97-7.63 (m, 7H, Ar-H), 10.31 (s, 1H, N-H).

12. KHG 23303: 2-(2,4-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(2-플루오로-4-메틸페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 97%

녹는점: 187.4 ℃

¹H NMR (300MH_z, DMSO-d₆) δ 2.08 (s, 3H, CH₃), 3.64 (s, 3H, N-CH₃), 4.00 (s, 2H, 4-CH₂), 6.85 (s. 1H, vinyl-H), 6.97-7.68 (m, 6H, Ar-H), 10.18 (s, 1H, N-H).

13. KHG 23304: 2-(2,5-디플루오로페닐이미노)-3-메틸-4-[N-(2-플루오로-4-메틸페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율: 94%

녹는점: 140.9 ℃

¹H NMR (300MH_z, DMSO-d₆) δ 2.07 (s, 3H, CH₃), 3.62 (s, 3H, N-CH₃), 3.97 (s, 2H, 4-CH₂), 6.73 (s. 1H, vinyl-H), 6.97-7.63 (m, 6H, Ar-H), 10.17 (s, 1H, N-H).

14. KHG 23417: 2-(4-트리플루오로메틸페닐이미노)-3-아미노-4-[N-(3-메톡시페닐)카바모일메틸]-1,3-티아졸-4-린 염산염

수율 : 40%

녹는점 : 223-225℃

¹H NMR (300MH_z, DMSO-d₆) δ 3.70 (s, 3H, Ar-OCH₃), 3.99 (s, 2H, 4-CH₂), 6.64-7.90 (m, 8H, Ar-H), 7.01 (s. 1H, vinyl-H), 10.56 (s, 1H, N-H).

(재료 준비)

합성 멜라닌, L-DOPA, 및 버섯 티로시나제는 시그마사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 인산-특이적 ERK1/2(Thr202/Tyr204, #9101S), 인산-특이적 RSK-1(Thr359/Ser363, #9344S), 및 ERK1/2(#9102)를 인지하는 항체는 모두 셀 시그날링 테크놀러지사(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 마이크로프탈미아 Ab-1(C5, MS-771-P0)는 네오마커사(Fremont, CA, USA)로부터 구입하였으며, RSK-1(C-21, sc-231), 티로시나제(C-19), TRP-1(G-17), TRP-2(G-15), 및 액틴(I-19)항체는 모두 산타 크루즈 바이오테크놀러지사(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

(세포 배양)

한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 얻은 마우스의 B16 흑색종 세포는 5%의 CO2, 37℃하에서 10%의 태아소 혈청(FBS, 하이클론사, Logan, UT, USA), 1%의 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/㎖ 및 10,000 ㎍/㎖)를 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다.

(B16 흑색종 세포에서의 독성 시험)

상기와 같이 배양된 B16 흑색종 세포에 각각의 화합물을 0, 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 25, 50 μM의 농도로 각각 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 그 다음 배양배지를 제거하고, 실온에서 5분동안 10%의 에탄올 하에서 0.1% 크리스탈 바이올렛(crytal violet)으로 염색하였다. 이때, 염색되지 않은 크리스탈 바이올렛은 증류수로 네 차례 세척하여 제거하고, 세포에 잔존하는 크리스탈 바이올렛은 95% 에탄올을 이용하여 추출하였다.

상기의 방법으로 추출된 크리스탈 바이올렛의 흡광도는 엘라이자(ELISA) 리더를 사용하여 590 nm에서 측정하여 세포의 생존력 정도를 측정하여(Dooley et al., 1994) 세포독성여부를 표 2에 나타냈다.

그 중 KHG22394 화합물을 처리한 B16 흑색종 세포의 독성을 엘라이자(ELISA) 리더를 사용하여 도 1에 나타냈다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미백 조성물에 포함되는 KHG22394는 0.01 내지 50 μM의 농도에서 B16 흑색종 세포에 독성을 보이지 않았으며, 이를 통하여 사람의 피부에 안전하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2. B16 흑색종 세포의 멜라닌 합성 억제 시험

상기 실시예 1에서 배양된 B16 흑색종 세포를 하룻밤동안 6-well 플레이트에 1 X 10⁵ 개의 밀도로 배양하였다.

그 후, 1μM의 α-MSH의 존재하에서 상기 세포에 각각 0.1, 1, 10, 25 μM의 상기 표 1의 화합물을 첨가하여 페놀 레드가 포함되지 않은 DMEM 배지에서 3일동안 처리하였다. 그 후, 200μM를 취하여 96-well 플레이트로 옮겨, 흡광도를 측정하였다. 합성 멜라닌(0 내지 300 ㎍/㎖)을 위한 기준 곡선은 각각 세 번의 실험에 의하여 얻어 결정하였다.

흡광도(OD)는 엘라이자(ELISA) 리더를 이용하여 400nm에서 측정하였으며, 세포수는 헤모사이토미터(haemocytometer)를 이용하여 측정하였다. 대조군으로는 α-MSH로 자극하지 아니한 B16 흑색종 세포를 이용하였다. 이 실험의 결과값은 세포당 세포외 멜라닌 형성을 대조군에 대한 %로 표시하여 하기 표 3에 나타냈으며, 실시예 1에서 세포독성이 있다고 판단된 화합물에 대하여는 측정하지 아니하였다.

한편, 현저한 멜라닌 생성 억제 효과를 보이는 KHG22394 화합물을 처리한 경우의 세포당 세포외 멜라닌 형성을 대조군에 대한 %로 표시하여 도 2A에 나타냈다.

도 2A에 나타낸 바와 같이, α-MSH의 첨가는 배지에서의 멜라닌 생성을 증가시켰으나, KHG22394의 처리는 투여량에 비례하여 α-MSH로 야기되는 세포외 멜라닌 형성을 감소시키는 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.

실시예 3. 티로시나제 활성 억제 시험

B16 흑색종 세포는 6-well 플레이트에서 3일동안 KHG22394과 함께 배양하였다. 3일동안 페놀 레드를 포함하지 않는 DMEM 배지에서 시료와 함께 배양한 후에, 상기 배양된 멜라닌 세포를 냉동된 PBS로 세척하고 1% Triton-X/인산완충액(pH 6.8)에서 용해한 후, 냉동-해동법으로 분쇄시킨 후, 용해질을 10,000 X g로 5분동안 원심분리하여 결정화하였다. 그 후, 단백질의 양을 정량하고 용해버퍼와 함께 농도를 조절한 후, 각각의 용해질 90μM을 96-웰에 넣고 10㎕의 10mM L-도파를 각 웰에 첨가하여 혼합한 뒤, 37℃에서 1시간 동안 더욱 배양하였다. 1시간 동안 배양하는 동안 10분 간격으로 엘라이자(ELISA) 리더를 사용하여 흡광도를 475nm에서 측정하여 그 결과를 도 2B에 나타냈다.

도 2B에 나타낸 바와 같이 α-MSH를 처리하는 경우 티로시나제의 활성을 증가하였으며, KHG22394의 처리 농도에 비례하여 티로시나제의 활성이 감소하는 것으로 나타나는 바, 본 발명의 KHG22394가 티로시나제의 활성을 억제하는 것을 알 수 있었다.

또한, 티로시나제 활성에의 직접적인 효과가 있는지 알아보기 위하여 무세포 시스템을 이용하였다. KHG22394를 포함하는 인산버퍼 70㎕를 20㎕의 10㎍/㎖ 버섯 티로시나제와 혼합하고, 10㎕의 10mM의 L-도파를 첨가하여 이를 상기와 같은 방법으로 37℃에서 배양하고, 475nm에서 흡광도를 측정하여 도 2C에 나타냈다. 음성대조군으로는 티로시나제 자체의 활성을 측정하였으며, 양성대조군으로는 티로시나제의 활성을 직접적으로 억제한다고 알려진 코직산(kojic acid)을 버섯 티로시나제에 처리한 경우의 흡광도를 측정하였다.

도 2C에 나타낸 바와 같이, 코직산을 처리한 경우는 티로시나제의 활성이 직접적으로 억제되는 것을 알 수 있었으나, KHG22394를 처리하는 경우 무세포 시스템에서 티로시나제의 활성이 거의 억제되지 않는 것으로 나타났다.

따라서, 상기 KHG22394는 티로시나제의 활성을 세포내에서 간접적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 실시예 3에서의 실험결과는 3회 실험한 평균값±SD를 나타낸다. **P<0.01, *P<0.05 는 α-MSH-처리된 대조군(A 및 B), 및 처리되지 아니한 대조군(C)과 비교하였다.

실시예 4. B16 흑색종 세포의 ERK 활성 및 멜라닌 생성 억제 실험

상기 실시예 1에서 배양된 B16 흑색종 세포를 24시간 동안 혈청없이 배양한 후, 25μM의 KHG22394를 0, 2, 10, 30, 60, 180, 360 분동안 처리하고 p-ERK, ERK, p-RSK-1 및 RSK-1에 대응하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 하여 도 3A에 나타냈다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, KHG22394는 ERK 및 RSK-1 등의 ERK 경로를 활성화시킨다는 것을 알 수 있었다.

또한, 1μM의 α-MSH의 존재하에서 25 μM의 KHG22394를 처리하여 3일동안 배양하였다. 이 때, 하루에 한번씩 Mitf, 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 액틴의 양을 웨스턴 블랏 분석을 하여 도 3B에 나타냈다.

도 3B에 나타낸 바와 같이, KHG22394를 처리하는 경우 Mitf 단백질의 양이 현저히 감소하였으며, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 양 또한 연달아 감소한다는 사실을 알 수 있었는 바, KHG22394는 Mitf, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2를 하향-조절함으로써 멜라닌 색소의 형성을 억제하여 미백효과를 가져온다는 사실을 알 수 있었다.

실시예 5. 유연화장수 제조

KHG22394 0.1 중량%, 글리세롤 3 중량%, 에탄올 5 중량%, 프로필렌글리콜 2 중량% 적량의 향 및 잔량의 정제수를 혼합하여 유연화장수를 제조하였다.

실시예 6. 수렴화장수 제조

KHG22394 0.1 중량%, 밀랍 4 중량%, 유동파라핀 54 중량%, 스쿠알렌 4 중량%, 글리세롤 3 중량%, 적량의 방부제와 향 및 잔량의 정제수를 혼합하여 수렴화장수를 제조하였다.

실시예 7. 영양크림 제조

KHG22394 0.2 중량%, 프로필렌글리콜 6 중량%, 글리세린 4 중량%, 유동파라핀 5 중량%, 스쿠알렌 3 중량%, 폴리솔베이트60 1.5 중량% 및 잔량의 정제수를 혼합하여 영양크림을 제조하였다.

실시예 8. 마사지크림 제조

KHG22394 0.2 중량%, 바셀린 7 중량%, 유동파라핀 10 중량%, 밀랍 2 중량%, 폴리솔베이트 2.5 중량%, 스쿠알렌 3 중량%, 글리세린 4 중량%, 프로필렌글리콜 6 중량%, 적량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 마사지크림을 제조하였다.

실시예 9. 에센스 제조

KHG22394 0.2 중량%, 프로필렌글리콜 3 중량%, 글리세린 4 중량%, 에탄올 7 중량%, 적량의 방부제와 향 및 잔량의 정제수를 혼합하여 에센스를 제조하였다.

실시예 10. 팩 제조

KHG22394 0.1 중량%, 프로필렌글리콜 6 중량%, 글리세린 4 중량%, 밀랍 2 중량%, 유동파라핀 30 중량%, 적량의 방부제와 향 및 잔량의 정제수를 혼합하여 팩을 제조하였다.

본 발명의 미백 조성물은 화학식 1로 표시되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 화합물을 포함하므로써, 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성을 억제하고, ERK 활성을 촉진하여 티로시나제의 생성을 억제하여 미백효과를 갖는다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 2-페닐이미노-1,3-티아졸린 화합물을 포함하는 미백 조성물:

(화학식 1)

상기 식 중,

R₁은 수소 또는 할로겐 원자이고,

R₂는 수소, 할로겐원자, 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시 또는 니트로기이고,

R₃는 탄소수 1 내지 5의 알콕시, 탄소수 1 내지 5의 알킬 또는 할로겐원자이고,

R₄, R₅, R₇, R₈, R₁₀ 및 R₁₁은 동시에 또는 각각 수소 또는 할로겐원자이고,

R₆는 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 1 내지 5의 알콕시 또는 아미노기이고,

R₉는 트리플루오로메틸, 탄소수 1 내지 5의 알콕시, 니트로기 또는 할로겐원자이다.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 함량이 미백 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%인 미백 조성물.
제 1항에 있어서, 자외선 차단제 또는 광산란제를 추가로 포함하는 미백 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화장수, 유액, 크림, 팩, 미용액, 및 피부외용 연고로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형태로 제형화 된 것인 미백 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 활성을 촉진하는 것인 미백 조성물.