KR100748082B1 - Novel iminecalixarene derivatives method of preparation thereof and self-assembled monolayer prepared by the method fixing method of oligo-dna by using the self-assembled monolayer and oligo-dna chip prepared by the method - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2의 신규한 이민캘릭스아렌 유도체 및 이의 제조방법, 그리고 상기 제조방법에 의해 제조된 자기조립 단분자층, 상기 자기조립 단분자층을 이용하는 올리고DNA 고정화 방법 및 이에 의해 제조된 올리고DNA 칩에 관한 것이다. The present invention is a novel imine callix arene derivative of the formula (1) and (2) and a method for preparing the same, and the self-assembled monomolecular layer prepared by the method, the oligo DNA immobilization method using the self-assembled monomolecular layer and the oligo prepared by It relates to a DNA chip.
[화학식 1][Formula 1]
(상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다.)Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently of the other -H, -CH 3 , -C 2 H 5 , -C 3 H 7 , -OCH 3 , -Cl, -C 6 H 5 and -COOR, in which -R represents -CH 3 or -C 2 H 5. )
[화학식 2][Formula 2]
(상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z= -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 로 정의됨).) Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently of the other -H, -CH 3 , -C 2 H 5 , -C 3 H 7 , -OCH 3 , -Cl, -C 6 H 5 and -COOR, and in -COOR, R represents -CH 3 or -C 2 H 5. In addition, Y 1 , Y 2 , Y 3 and Y 4 are independently of each other -H, -(CH 2 ) n -CH = O,-(CH 2 ) n -SH,-(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -CH = O,-(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -SH,-(CH 2 ) m -C 6 H 4- (CH 2 ) c -Z and -CO- (CH 2 ) m-1 -C 6 H 4- (CH 2 ) c -Z is selected from the group consisting of (n = being 2 ~ 15, m = 1 ~ 10, c = 0 ~ 10, Z = -SH, -CHO, -COOH or defined as -NH 2).)
이민캘릭스아렌 유도체, 자기조립 단분자층 고체기질, 올리고DNA 칩 Imine callix arene derivative, self-assembled monolayer solid substrate, oligo DNA chip
Description
도 1은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체의 유리 기질 (아민 슬라이드 글라스) 위에서의 자기조립 단분자층의 제조과정의 개략도이다.1 is a schematic diagram of a process for preparing a self-assembled monolayer on a glass substrate (amine slide glass) of an iminecalixarene derivative of the present invention.
도 2는 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체의 금 기질 위에서의 자기조립 단분자층의 제조과정의 개략도이다.2 is a schematic diagram of a process for preparing a self-assembled monolayer on a gold substrate of an iminecalixarene derivative of the present invention.
도 3은 본 발명의 연속된 구아닌 기를 가진 올리고DNA 고정화 방법에 대한 개략도이다.Figure 3 is a schematic diagram of an oligoDNA immobilization method having a continuous guanine group of the present invention.
도 4 및 도 5는 연속된 구아닌기를 가진 올리고DNA만 선택적으로 고정화되는 과정을 나타낸 것으로, 형광이 부착된 c-DNA를 이용하여 고정화된 올리고DNA의 밀도를 분석한 결과를 보여준다.4 and 5 show a process of selectively immobilizing only oligo DNA having a continuous guanine group, and shows the result of analyzing the density of the immobilized oligo DNA using c-DNA with fluorescence.
도 6는 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층에 올리고DNA 고정화시 7 개 이상의 연속된 구아닌 작용기가 필요하다는 것을 보여준다.Figure 6 shows that at least seven consecutive guanine functional groups are required for immobilization of oligoDNA in the self-assembled monolayer of iminecalixarene derivatives of the present invention.
도 7은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층에 올리고DNA 고정화시 구아닌 기가 분자 인식에 의해 선택적으로 인식된다는 것을 증명하기 위해, 이와 유사한 구조를 가진 이미다졸 작용기를 이용한 경쟁반응 결과를 보여준다. Figure 7 shows the results of competition reactions using imidazole functional groups with similar structures to demonstrate that the guanine groups are selectively recognized by oligo DNA immobilization in the self-assembled monolayer of iminecalixarene derivatives of the present invention.
본 발명은 신규한 이민캘릭스아렌 (iminecalixarene) 유도체 및 이의 제조방법, 그리고 상기 제조방법에 의해 제조된 자기조립 단분자층, 상기 자기조립 단분자층을 이용하는 올리고DNA 고정화 방법 및 이에 의해 제조된 올리고DNA 칩에 관한 것이다. The present invention relates to a novel iminecalixarene derivative and a method for preparing the same, and a self-assembled monolayer prepared by the above method, an oligo DNA immobilization method using the self-assembled monolayer, and an oligo DNA chip prepared thereby. will be.
보다 구체적으로, 본 발명은 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 분자인식에 의해 고체기질의 표면에 고정화가 가능한 이민캘릭스아렌 화합물을 유리 기질 또는 금 기질에 단분자층으로 제조하는 방법 및 그의 자기조립 단분자층을 이용한 올리고DNA 단분자층, 즉 올리고DNA 칩 (OligoDNA chip)을 제조하는 방법에 관한 것이다. More specifically, the present invention provides a method for preparing an iminecalixarene compound capable of immobilizing oligo DNA having a continuous guanine base on a surface of a solid substrate by molecular recognition, and a self-assembled monolayer on a glass substrate or a gold substrate. The present invention relates to a method for producing an oligo DNA monolayer, that is, an oligo DNA chip.
인간게놈 연구팀과 셀레라사에 의해 경쟁적으로 진행되던 인간 게놈 프로젝트 (Human Genome Project)가 2000년에 그 유전자 정보지도가 완성되면서, 유전자의 기능연구와 변이 유전자 검색 및 이 정보를 이용한 진단용 올리고DNA 칩 개발이 전세계적으로 진행되고 있다. 특히, 단일염기 변이 (SNP; single nucleotide polymorphism) 검색용 올리고DNA 칩은 유전자 결함 등에 의한 유전병이나 암 조기 진단 등에 사용될 것으로 예측되고 있어, 올리고DNA 칩 제조기술에 대한 연구가 전세계적으로 진행되고 있다. 실제로 자궁경부암 진단용 올리고DNA 칩은 한국 식품의약품안정청 허가가 내려졌으며 이미 진단에 사용되고 있다. The Human Genome Project, a competitive genome run by the Human Genome Research Team and Celerasa, completed the genetic information map in 2000, which led to the study of gene function, mutational gene search, and diagnostic oligoDNA chip development using this information. This is happening worldwide. In particular, the oligo DNA chip for detecting single nucleotide polymorphism (SNP) is expected to be used for genetic diseases or early diagnosis of cancer due to genetic defects, and researches on oligo DNA chip manufacturing technology are being conducted worldwide. In fact, the oligo DNA chip for cervical cancer diagnosis has been approved by the Korea Food and Drug Administration and is already being used for diagnosis.
올리고DNA 칩은 15-50 단위 (mer) 수준의 짧은 길이의 유전자를 고정화해야 한다. 따라서, 변이 유전자 분석용으로 사용되어 온 c-DNA 칩이 종래 단순히 물리흡착 방식을 이용했던 것과 달리, 현재 알데히드와 아민간의 화학적 결합에 의한 이민결합 방식을 이용한 고정화 방식 또는 알데히드와 아민작용기 간의 화학적 결합 후 결합의 강도를 높이기 위한 환원반응을 거쳐 아민결합 방식을 이용한 고정화 방식 등이 널리 이용되고 있다. OligoDNA chips must immobilize short length genes on the order of 15-50 units. Therefore, the c-DNA chip, which has been used for mutated gene analysis, has conventionally used a physisorption method, but the immobilization method using an imine bond method by chemical bonding between aldehyde and amine or the chemical between aldehyde and amine functional group. The immobilization method using the amine bond method through a reduction reaction to increase the strength of the bond after bonding is widely used.
이 외에 스트렙토에버딘-비오틴 (streptavidin-biotin)의 결합방식을 응용한 기술도 널리 사용되고 있는데, 상기 기술은 고체기질 표면에 스트렙토에버딘을 물리흡착, 화학결합 방식 등을 이용하여 고정화한 후, 비오틴이 부착된 올리고DNA의 비오틴 작용기를 스트렙토에버딘에 분자인식시켜 올리고DNA를 제조하는 방식이다 (Science, 1993년 Vol. 262, pp 1706-1708). In addition, a technique using a binding method of streptoberdin-biotin is widely used. The technique is a biotin immobilized on the surface of a solid substrate by physisorption and chemical bonding. The biotin functional group of the attached oligo DNA is molecularly recognized in streptoberdine to prepare oligo DNA (Science, 1993 Vol. 262, pp 1706-1708).
그러나, 상기 화학결합 방식 및 스트렙토에버딘-비오틴 방식 등의 올리고DNA 고정화 방법은 하기와 같은 문제점을 가지고 있다. However, the oligo DNA immobilization method such as the chemical bonding method and the streptoberdine-biotin method has the following problems.
1. 고정화 밀도의 균일성 : 화학결합 방식은 가장 널리 사용되는 방식으로서, 올리고DNA들이 고정화될 때 알데히드 작용기 (-CHO)와 아민 작용기 (-NH2) 사이에 화학반응이 진행되어 화학적으로 고정화되는 것으로 알려져 있다. 이 때, 물분자(H2O) 하나가 빠지면서 이민 결합 (-C=N-)형태로 고정화된다. 그러나, 상기 반응이 수용액 상에서 진행되기 때문에, 고정화 밀도가 균일하게, 즉 재현성 있게 진행되지 않는다. 또한, 이민결합은 수용액 상에서 원래의 작용기로 되돌아 가는 역반응이 쉽게 진행되기 때문에, 올리고DNA의 밀도가 균일하게 진행되기 어렵다는 문제가 있다. 또한, 이러한 역반응을 최소화하기 위해 이민 결합을 NaBH4 등의 환원제를 이용하여 환원반응을 수행하면, 올리고DNA의 결합에 영향을 주어 고정화된 올리고DNA의 길이가 일정하게 유지되지 않는다. 이에 따라, 제조할 때마다 다른 수준의 결과를 보여주게 되어 새로운 올리고DNA 칩 개발이 장기화되는 경향이 있으며, 올리고DNA 칩 제품화에 커다란 장애물로 인식되고 있다. 동시에 고정화된 올리고DNA는 그 밀도에 비례하여 형광 (Cy-3 등) 부착된 c-DNA와 결합하여 c-DNA 의 존재여부 및 농도를 알려주어 진단목적 등에 사용되는데, 올리고DNA의 밀도가 동일하게 유지되지 않으면 제품화가 불가능해지는 경우가 나타나 현재 많은 기업들이 올리고DNA 칩 제품화에 막대한 비용을 지불하고도 결과를 얻지 못하고 있는 실정이다. 1. Uniformity of Immobilization Density: Chemical bonding method is the most widely used method. When oligo DNAs are immobilized, chemical reaction is performed between aldehyde functional group (-CHO) and amine functional group (-NH 2 ) It is known. At this time, one of the water molecules (H 2 O) is missing and immobilized in the imine bond (-C = N-) form. However, since the reaction proceeds in an aqueous solution, the immobilization density does not proceed uniformly, ie reproducibly. In addition, since the reverse reaction of the imine bond back to the original functional group in the aqueous solution proceeds easily, there is a problem that the density of the oligo DNA does not proceed uniformly. In addition, when the reduction reaction is performed using a reducing agent such as NaBH 4 in order to minimize such reverse reaction, the length of the immobilized oligo DNA is not kept constant due to the binding of the oligo DNA. As a result, new levels of oligo DNA chips tend to be prolonged due to different levels of production, and are recognized as a major obstacle to the commercialization of oligo DNA chips. At the same time, immobilized oligo DNA is combined with fluorescence (Cy-3, etc.) attached c-DNA in proportion to its density to indicate the presence and concentration of c-DNA and used for diagnostic purposes. If it is not maintained, it will be impossible to commercialize, and many companies are currently paying huge costs for the production of oligo DNA chips, but have not been able to obtain results.
2. c-DNA 접근을 위한 올리고DNA 간 공간 확보의 필요성 : 올리고DNA 칩은 궁극적으로 병원균의 주형 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)을 통해 증폭된 c-DNA 가 부착되어야 한다. 그러나, 도 7에서 보여지는 것처럼 고정화된 유전자가 대단히 좁은 간격으로 존재하게 되면, c-DNA 가 올리고DNA의 아랫 부분에 접근하기가 어려워진다. 따라서, 적절한 수준의 올리고DNA 간의 공간확보 기술 의 필요성이 대두되고 있으나 현재까지는 해결책이 제시되지 못하고 있다. 2. Necessity of securing the space between oligo DNA for c-DNA access: Oligo DNA chip should ultimately attach c-DNA amplified by PCR (polymerase chain reaction) of the pathogen's template gene. However, when the immobilized genes are present at very narrow intervals, as shown in Figure 7, c-DNA becomes difficult to access the lower part of the oligo DNA. Therefore, there is a need for a technique for securing a space between oligo DNAs at an appropriate level, but a solution has not been proposed until now.
3. 작용기 부착 : 화학결합 또는 스트렙토에버딘-비오틴 결합을 이용하는 올리고DNA 고정화 기술은 결합이 이루어질 올리고DNA에 비오틴 또는 아민 작용기를 부착해야 고정화가 가능하다. 그런데, 올리고DNA 합성 후 이러한 작용기 부착에 있어서, 현재까지 작용기 부착이 거의 없는 올리고DNA에 비해 3 배에서 10 배 이상의 높은 올리고DNA 합성비용이 필요하다. 또한, 올리고DNA 칩 제품화를 위해 최소 수 십개의 올리고DNA를 고정화 하더라도 수 백 내지 수 천개의 올리고DNA를 테스트해야 하며, 이 때 필요한 기술개발 비용이 수 억 내지 수 십억 수준이어서 제품화에 어려움을 겪고 있다. 또한, 완성된 제품의 제조에도 많은 비용이 필요하다. 이러한 문제를 최소화하기 위하여 작용기 부착이 없는 올리고DNA를 이용한 올리고DNA 칩 제조기술의 개발이 필요하다.3. Functional Group Attachment: OligoDNA immobilization technology using chemical bonds or streptoeberdine-biotin bonds requires biotin or amine functional groups to be attached to the oligoDNA to be bound to allow immobilization. However, in the functional group attachment after the oligo DNA synthesis, oligo DNA synthesis cost 3 to 10 times higher than that of the oligo DNA with little functional group attachment until now. In addition, even if at least tens of oligo DNAs are immobilized for commercialization of oligo DNA chips, hundreds to thousands of oligo DNAs must be tested. . In addition, the manufacture of the finished product is expensive. In order to minimize this problem, it is necessary to develop an oligo DNA chip manufacturing technology using oligo DNA without functional group attachment.
본 발명의 목적은 전술한 종래의 올리고DNA 고정화 방법에서 발생하는 고정화밀도의 균일성문제, 올리고DNA 간 공간확보 문제 및 작용기 부착문제 등을 해결하기 위해, 연속된 구아닌 기를 가진 올리고DNA에 대한 분자인식이 가능한 이민캘릭스아렌 유도체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다. An object of the present invention is to solve the problem of the uniformity of the immobilization density, the problem of securing the space between oligo DNA and the attachment of functional groups in the above-described conventional oligo DNA immobilization method, molecular recognition for oligo DNA having a continuous guanine group It is possible to provide a possible iminecalixarene derivative and a preparation method thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이민캘릭스아렌 유도체 화합물을 아민작용기를 가진 유리 기질 (아민 슬라이드 글라스) 또는 금 기질 (금 박막 또는 금)에 부착함으로써, 모든 종류의 올리고DNA가 아무런 가공과정 없이 적절한 수준의 공간을 유지한 채 고밀도로 들어찬 올리고DNA 단분자층, 즉 올리고DNA 칩을 생성할 수 있 는 이민캘릭스아렌 유도체의 단분자층을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to attach the iminecalixarene derivative compound to a glass substrate (amine slide glass) or gold substrate (gold thin film or gold) having an amine functional group, so that all kinds of oligo DNA are suitable without any processing. It is to provide a monolayer of oligoDNA monolayers, ie, iminecalixarene derivatives capable of producing oligoDNA chips, while maintaining a high level of space.
보다 상세하게, 본 발명은 7 개 이상의 연속된 구아닌을 보유한 올리고DNA가 아무런 가공과정 없이 적절한 수준의 공간을 유지한 채 고밀도로 들어찬 올리고DNA 단분자층, 즉 올리고DNA 칩을 생성할 수 있는 이민캘릭스아렌 유도체의 단분자층 을 제공하는 것을 목적으로 한다. More specifically, the present invention provides an iminecalix in which an oligoDNA having 7 or more consecutive guanines can generate a high density oligoDNA monolayer, i.e., an oligoDNA chip, while maintaining an appropriate level of space without any processing. It is an object to provide a monolayer of an arene derivative.
본 발명의 신규한 이민캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1 또는 2의 구조를 갖는다. 상기 이민캘릭스아렌 유도체는 7 개 이상의 연속된 구아닌 기를 가진 올리고DNA 고정화 방법에서 사용하는 자기조립 단분자층에 필수적인 화합물이다.The novel iminecalixarene derivatives of the present invention have the structure of formula (1) or (2). The iminecalixarene derivative is an essential compound for the self-assembled monolayer used in the oligo DNA immobilization method having 7 or more consecutive guanine groups.
(상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다.)Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently of the other -H, -CH 3 , -C 2 H 5 , -C 3 H 7 , -OCH 3 , -Cl, -C 6 H 5 and -COOR, in which -R represents -CH 3 or -C 2 H 5. )
(상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다. 또한, 상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z= -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 로 정의됨).) Wherein R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently of the other -H, -CH 3 , -C 2 H 5 , -C 3 H 7 , -OCH 3 , -Cl, -C 6 H 5 and -COOR, and in -COOR, R represents -CH 3 or -C 2 H 5. In addition, Y 1 , Y 2 , Y 3 and Y 4 are independently of each other -H, -(CH 2 ) n -CH = O,-(CH 2 ) n -SH,-(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -CH = O,-(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -SH,-(CH 2 ) m -C 6 H 4- (CH 2 ) c -Z and -CO- (CH 2 ) m-1 -C 6 H 4- (CH 2 ) c -Z is selected from the group consisting of (n = being 2 ~ 15, m = 1 ~ 10, c = 0 ~ 10, Z = -SH, -CHO, -COOH or defined as -NH 2).)
본 발명은 또한 상기 화학식 1 및 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for preparing the iminecalixarene derivative compounds of Formula 1 and Formula 2.
하기 화학식 3의 5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌 화합물은 캘릭스[4]아렌을 하기 참고문헌 1의 방법에 따라 5,11,17,23-테트라니트로캘릭스[4]아렌으로 변환한 뒤, 환원반응에 의해서 합성한다 [참고문헌 1: Journal of Organic Chemistry, 1990년 Vol 55, pp 5639-5643; Journal of Organic Chemistry, 1979년 Vol 44, pp 1233-1238]. The 5,11,17,23-tetraaminocalix [4] arene compound of the following
본 발명의 상기 화학식 1의 이민캘릭스아렌 유도체 화합물은, 상기 화학식 3의 5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌 화합물을 출발물질로 하여 화학식 3의 아민 작용기를 하기 화학식 4의 방향족 알데히드와 반응시켜 합성한다 (하기 실시예의 반응식 2 참조). The imine callix arene derivative compound of the formula (1) of the present invention, the 5,11,17,23-tetraamino callix [4] arene compound of
(상기 화학식 4 에서, R 은 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 및 COOR' 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 COOR' 에서 R' 는 -CH3 또는 -C2H5 를 나타낸다.)(In Formula 4, R is selected from the group consisting of -H, -CH 3 , -C 2 H 5 , -C 3 H 7 , -OCH 3 , -Cl, -C 6 H 5 and COOR ', R 'in COOR' represents -CH 3 or -C 2 H 5. )
또한, 본 발명의 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체 화합물은, 화학식 1의 화합물과 말단기에 할로겐이 부착된 알데히드 화합물을 반응시켜, 화학식 1의 화합물의 첫번째 및 세번째 -OH 기 자리에 알데히드 또는 티올이 부착된 말단기를 갖도록 합성한다 (하기 실시예의 반응식 3 내지 반응식 5 참조). In addition, the iminecalixarene derivative compound of the formula (2) of the present invention, by reacting the compound of formula (1) with an aldehyde compound having a halogen attached to a terminal group, the aldehyde or thiol in place of the first and third -OH group of the compound of formula (1) It synthesize | combined to have this attached end group (refer Scheme 3-Scheme 5 of the following Example).
상기 할로겐화 알데히드는 X-(CH2)n-CH=O, X-(CH2)n-SH, X-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, X-(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, X-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z 및 X-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되며, 여기에서 n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, X= -Cl, -Br, -I 또는 -OSO2C6H4CH3, Z= -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH2 로 정의된다. The halogenated aldehyde is X- (CH 2 ) n -CH = O, X- (CH 2 ) n -SH, X- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -CH = O, X- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -SH, X- (CH 2 ) m -C 6 H 4- (CH 2 ) cZ and X-CO- (CH 2 ) m-1 -C 6 H 4- (CH 2 ) c -Z selected from the group consisting of n = 2-15, m = 1-10, c = 0-10, X = -Cl, -Br, -I or -OSO 2 C 6 H 4 CH 3 , Z = -SH, -CHO, -COOH or -NH 2 .
또한, 본 발명은 티올기가 부착된 이민캘릭스아렌 유도체를 금 기질에 부착하여 제조한 자기조립 단분자층 고체기질을 제공한다. The present invention also provides a self-assembled monolayer solid substrate prepared by attaching a thiol group-attached iminecalixarene derivative to a gold substrate.
또한, 본 발명은 유리, 실리콘웨이퍼 또는 수정결정 등의 고체기질에 이민캘릭스아렌 유도체를 이민결합을 통해 부착하여 제조한 자기조립 단분자층 고체기질, 그리고 유리, 실리콘웨이퍼 또는 수정결정 등에서 선택되는 고체기질에 이민캘릭스아렌 유도체를 에스테르, 에테르 또는 아미드결합 등의 화학결합을 통해 부착하여 제조한 자기조립 단분자층 고체기질을 제공한다. In addition, the present invention is a self-assembled monomolecular layer solid substrate prepared by attaching the imine callix arene derivatives to a solid substrate such as glass, silicon wafer or quartz crystal through the imine bond, and a solid substrate selected from glass, silicon wafer or quartz crystal It provides a self-assembled monolayer solid substrate prepared by attaching the imine callix arene derivative through a chemical bond such as ester, ether or amide bond.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체 화합물을 금 기질 또는 아민 작용기가 부착된 유리 기질에 부착함으로써, 모든 종류의 올리고DNA가 고밀도로 고정화된 올리고DNA 단분자층, 즉 올리고DNA 칩 및 그의 제조방법을 제공한다. In addition, the present invention by attaching the iminecalixarene derivative compound of the formula (2) to a gold substrate or a glass substrate attached with an amine functional group, oligoDNA monomolecular layer in which all kinds of oligoDNA are immobilized at high density, that is, oligoDNA chip and It provides a manufacturing method.
도 1은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체의 유리 기질 위에서의 자기조립 단분자층 제조과정을 개략적으로 나타내고 있다.FIG. 1 schematically shows a process for preparing a self-assembled monolayer on a glass substrate of an iminecalixarene derivative of the present invention.
아민 작용기가 부착된 유리 기질에 이민캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다. A specific method for preparing a self-assembled monolayer of imine callix arene derivatives on a glass substrate having an amine functional group is as follows.
우선, 상기 아민 작용기가 부착된 유리 기질 (유리 슬라이드 글라스)은, 하기 참고문헌 2의 방법에 따라 실라놀 (-Si-OH) 작용기가 풍부한 유리 기질의 표면에 화학반응을 통하여 아민 말단기를 가진 유리 기질 (아민 슬라이드 글라스 또는 아민 칩) 형태로 제조하였다 [참고문헌 2: Langmuir, 1997 년, Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir, 1996년, Vol 12, pp 5338-5342]. 이렇게 제조된 아민 작용기가 부착된 유리 기질과 화학식 2의 화합물을 0.1-5 mM 농도로 녹인 클로로포름과 THF의 혼합용액 (CHCl3 : THF = 9 : 1)에 넣어둔다. 1-5 시간 뒤 클로로포름, 아세톤 및 에탄올 순으로 세척한 뒤 건조시키면, 도 1과 같은 이민캘릭스아렌 자기조립 단분자층이 완성된다. 상기 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다. 상기 유리 기질로서 시판되는 모든 종류의 슬라이드 글라스 또는 유리를 사용할 수 있다. 결합에 사용되는 이민 결합은 물 속에서 장기간 보존하는 경우 결합이 깨어지는 경우가 있다. 그러나, 올리고DNA와 같은 생 체물질은 대부분 pH 가 7-8 사이의 완충용액에서 녹여서 제조하기 때문에, 이러한 용도로 사용할 때에는 이민 결합된 형태로 곧바로 사용하여도 문제가 없음을 확인하였다. First, the glass substrate (glass slide glass) to which the amine functional group is attached has an amine end group through a chemical reaction on the surface of the glass substrate rich in silanol (-Si-OH) functional groups according to the method of Ref. Prepared in the form of a glass substrate (amine slide glass or amine chip) [Ref. 2: Langmuir, 1997, Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir, 1996, Vol 12, pp 5338-5342. Thus prepared glass substrate to which the amine functional group is attached and the compound of Formula 2 are dissolved in a mixed solution of chloroform and THF (CHCl 3 : THF = 9: 1) dissolved at a concentration of 0.1-5 mM. After 1-5 hours, washed with chloroform, acetone and ethanol in order and dried, the iminecalixarene self-assembled monolayer as shown in Figure 1 is completed. The production of the monolayer is confirmed using surface reflection infrared spectroscopy. Any kind of commercially available slide glass or glass can be used as the glass substrate. The imine bonds used for bonding are sometimes broken when stored for a long time in water. However, since most of biological materials such as oligo DNA are prepared by dissolving in pH 7-8 buffer solution, it is confirmed that there is no problem even when used immediately in imine-bound form when used for this purpose.
도 2는 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체의 금 기질 위에서의 자기조립 단분자층이 제조되는 과정을 개략적으로 나타낸다.Figure 2 schematically shows a process for preparing a self-assembled monolayer on the gold substrate of the imine callix arene derivative of the present invention.
금 기질에 이민캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다. A specific method for preparing a self-assembled monolayer of imine callix arene derivatives on a gold substrate is as follows.
클로로포름 (CHCl3) 등의 유기용매에 화학식 2의 화합물 중 티올이 부착된 화합물을 0.1-5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 금 기질을 상기 제조된 용액에 넣어 1-5 시간 동안 담근 후 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면, 도 2와 같은 이민 캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층이 완성된다. 상기 금 기질은 어떤 종류의 금 박막이라도 가능하나, 일반적으로 유리, 용융 석영 (fused silica), 실리콘 웨이퍼, 플라스틱 기질 등에 크롬 (Cr)이나 티타늄 (Ti) 등을 2-10 nm로 진공증착 시킨 후 금을 50-200 nm 두께로 진공증착시킨 기질이 바람직하다. 이렇게 제조된 금 기질은 사용 직전에 피라니아 용액 (Piranha solution; 진한황산 : 30% 과산화수소수 = 3 : 1)에 1 분 정도 담근 후, 정제수로 씻고 질소를 불어주며 건조시켜 사용하는 것이 일반적이다. 상기 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다. A solution obtained by dissolving a compound having a thiol in a compound of Formula 2 at 0.1-5 mM concentration in an organic solvent such as chloroform (CHCl 3 ) is prepared. Gold substrate was immersed in the prepared solution for 1-5 hours, then taken out, washed with chloroform, acetone and water, and then dried, and the self-assembled monolayer of imine calixarene derivative as shown in FIG. 2 was completed. The gold substrate may be any kind of gold thin film, but generally, after vacuum deposition of 2-10 nm of chromium (Cr) or titanium (Ti) on glass, fused silica, silicon wafer, plastic substrate, etc. Preferred is a substrate in which gold is vacuum deposited to a thickness of 50-200 nm. The gold substrate thus prepared is generally used after soaking for 1 minute in Piranha solution (concentrated sulfuric acid: 30% hydrogen peroxide = 3: 1) immediately before use, washing with purified water, blowing with nitrogen, and drying. The production of the monolayer is confirmed using surface reflection infrared spectroscopy.
또한, 본 발명은 상기 고체기질에 연속된 구아닌 염기가 부착된 올리고DNA를 다중분자인식에 의해 고정화하여 올리고DNA 칩을 제조하는 방법 및 제조된 올리고DNA 칩을 제공한다. The present invention also provides a method for preparing an oligo DNA chip by immobilizing an oligo DNA attached to a continuous guanine base on the solid substrate by multi-molecule recognition and an oligo DNA chip prepared.
더욱 상세하게, 본 발명은 상기 이민캘릭스아렌 유도체의 4 개의 질소원자를 통해 연속된 구아닌 작용기를 분자 인식하여 다중 분자인식에 의한 올리고DNA 고정화 방법을 제공한다. More specifically, the present invention provides a method for immobilizing oligo DNA by multi-molecule recognition by molecular recognition of a continuous guanine functional group through four nitrogen atoms of the iminecalixarene derivative.
본 발명의 올리고DNA 고정화 방법은 올리고DNA를 이용한 모든 종류의 분석방법의 기반이 되는 것으로, 현재까지 전세계적으로 이와 유사한 연구결과도 발표된 적이 없는 신규한 것이다.The oligo DNA immobilization method of the present invention is the basis of all kinds of analysis methods using oligo DNA, and thus, a novel research result has not been published worldwide.
도 3은 본 발명의 연속된 구아닌 기를 가진 올리고DNA 고정화 방법에 대한 개략도이다. Figure 3 is a schematic diagram of an oligoDNA immobilization method having a continuous guanine group of the present invention.
고정화에 사용된 연속된 구아닌기를 가진 올리고DNA는, 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 1)이다. 여기에 결합될 형광 부착된 c-DNA 는 5'-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 2)으로서 고정화된 올리고DNA와 상보적인 DNA 서열을 가지고 있으며, 말단기에 형광물질 Cy-3 (텔레켐, 미국)을 부착하여 부착된 위치에서만 형광이 나타나게 함으로써, 고정화된 올리고DNA의 밀도를 측정하였다. 올리고DNA를 54 ㎍/㎖ (6.75 pmol/㎖) 농도로 15%의 글리세롤이 포함된 500 mM KCl 수용액에 녹인 후, 프로테오젠사 (한국)에서 구입한 마이크로어레이를 사용하여 제조된 이민캘릭스아렌 단분자층위에 직경 약 150 um 수준으로 도포함으로써, 올리고DNA를 고정한다. 1-4 시간 정도 후 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate)가 포함된 2x SSC (1x SSC = sodium sitrate 15 mM + NaCl 150 mM) 수용액으로 세척하고, 0.1x SSC 수용액으로 3 분간 세척한 후 건조하여 제조한다. 제조된 올리고DNA 단분자층은 최소 6 개월 이상 측정할 만한 변화가 없음을 확인하였다.OligoDNA with a continuous guanine group used for immobilization is 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3 '(SEQ ID NO: 1). The fluorescently attached c-DNA to be bound thereto has a DNA sequence complementary to the oligoDNA immobilized as 5'-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3 '(SEQ ID NO: 2), and the fluorescent material at the terminal The density of the immobilized oligo DNA was measured by attaching Cy-3 (Telechem, USA) so that fluorescence appeared only at the attached position. OligoDNA was dissolved in a 500 mM KCl solution containing 15% glycerol at a concentration of 54 μg / ml (6.75 pmol / ml), and then iminecalixarene monolayer prepared using a microarray purchased from Proteogen (Korea). The oligo DNA is fixed by applying on the level of about 150 um in diameter. After 1-4 hours washed with 2x SSC (1x SSC = sodium sitrate 15 mM + NaCl 150 mM) aqueous solution containing 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), washed for 3 minutes with 0.1x SSC aqueous solution and dried do. It was confirmed that the prepared oligo DNA monolayer has no measurable change for at least 6 months.
도 4 및 도 5는 본 발명의 올리고DNA 단분자층에서의 올리고DNA 밀도를 형광분석하는 개략도이다.4 and 5 are schematic diagrams of fluorescence of the oligo DNA density in the oligo DNA monolayer of the present invention.
도 3에서 제조된 올리고DNA 단분자층에 고정화에 사용된 연속된 구아닌기를 가진 올리고DNA는 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 1)이다. 여기에 결합될 형광 부착된 c-DNA 는 5'-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 2)로서 고정화된 올리고DNA와 상보적인 DNA 서열을 가지고 있으며, 말단기에 형광을 나타낼 형광물질 Cy-3 (텔레켐, 미국)을 부착하여 부착된 위치에서만 형광이 나타나게 함으로써, 고정화된 올리고DNA의 밀도를 측정하였다. 고정화된 올리고DNA에 형광부착된 c-DNA 가 0.17 nmol/㎖ 농도로 녹아 있는 4x SSC + 0.002% SDS + 50% 글리세롤의 혼합용액 60 ㎕ 를 도포하고, 50℃에서 30 분간 교잡반응시켰다. 그 후, 상온에서 0.1% SDS 가 포함된 4x SSC 용액으로 1 차 세척하고 4x SSC 용액으로 2 차 세척한 뒤, 건조하고 스캐너 (GSI lite, 미국)를 이용하여 결과를 확인하였다. OligoDNA having a continuous guanine group used for immobilization on the oligoDNA monolayer prepared in FIG. 3 is 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3 '(SEQ ID NO: 1). The fluorescently attached c-DNA to be bound thereto has a DNA sequence complementary to the oligoDNA immobilized as 5′-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3 ′ (SEQ ID NO: 2), The density of the immobilized oligo DNA was measured by attaching the fluorescent substance Cy-3 (Telechem, USA) to be shown and causing fluorescence only at the attached position. 60 μl of a mixed solution of 4 × SSC + 0.002% SDS + 50% glycerol, in which c-DNA fluoresced to immobilized oligoDNA was dissolved at a concentration of 0.17 nmol / ml, was applied and hybridized at 50 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the mixture was first washed with a 4x SSC solution containing 0.1% SDS at room temperature, washed twice with a 4x SSC solution, dried, and confirmed by a scanner (GSI lite, USA).
고정화에 사용된 올리고DNA로서 각각 9 개의 연속된 A, T, C, G 염기서열을 가진 하기 DNA 서열을 가지고 있는 올리고DNA, 구아닌과 유사한 작용기인 비오틴이 부착된 올리고DNA 및 연속된 염기서열이 없는 올리고DNA를 이용하여, 연속된 구아닌염기만 선택적으로 고정화되는 것을 실험을 통하여 확인하였다. 고정화 비교에 사용된 DNA 서열은 다음과 같다.OligoDNA used for immobilization, oligoDNA having the following DNA sequences with 9 consecutive A, T, C, and G sequences, respectively, biotinylated oligoDNA, which is a functional group similar to guanine, and without consecutive sequences Using oligo DNA, it was confirmed through experiment that only the continuous guanine base was selectively immobilized. The DNA sequence used for the immobilization comparison is as follows.
9G 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 1)
9T 5'-TTT TTT TTT TAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 3)
9A 5'-AAA AAA AAA TAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 4)
9C 5'-CCC CCC CCC CAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 5)
비오틴 5'-비오틴-T ATA TAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 6)
no 5'-AA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 7)no 5'-AA TCA ACC CAC AGC TGC A-3 '(SEQ ID NO: 7)
이들과 교잡반응하여 결합된 c-DNA 는 상보적인 염기서열을 가지도록 합성하였다.The c-DNA bound by hybridization with them was synthesized to have complementary nucleotide sequences.
5'-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 2)5'-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3 '(SEQ ID NO: 2)
동시에 형광물질 (Cy3)을 부착하여 형광 스캐너로 부착된 c-DNA의 밀도, 즉 c-DNA 가 부착된 고정화된 올리고DNA의 밀도를 상대적으로 분석할 수 있게 하였다. 실제 실험결과에 따르면 각각의 올리고DNA를 상기한 조건에서 동일하게 도포하고 고정화한 뒤, c-DNA를 표면에 최대로 고정화 될 수 있는 올리고DNA 양의 3 배를 도포하여 고정화된 올리고DNA 모두에 충분히 형광부착된 c-DNA 가 결합되게 한 후, 씻고 건조하여 형광 스캐너로 분석하였다. At the same time, the fluorescent material (Cy3) was attached so that the density of the c-DNA attached to the fluorescent scanner, that is, the density of the immobilized oligoDNA to which the c-DNA was attached, could be analyzed relatively. According to the experimental results, each oligo DNA was applied and immobilized in the same condition as described above, and then 3 times the amount of oligo DNA capable of immobilizing c-DNA on the surface was sufficiently applied to all immobilized oligo DNAs. Fluorescent c-DNA was allowed to bind, washed, dried and analyzed with a fluorescence scanner.
실제 실험결과는 6x6 으로 결과가 보이는 도 5의 중간그림이며, 이 형광을 수치로 분석하여 막대 그래프로 보인 결과가 도 5의 우측 도표이다. 실제 실험 결과는 구아닌 기가 9 개 연속된 9G 올리고DNA의 경우가 다른 염기가 연속된 올리고DNA, 비오틴이 부착된 것 또는 연속된 염기가 부착되지 않은 경우에 비해 10 배에서 약 40 배 수준의 높은 형광세기를 나타내고 있다. 상기 결과는 올리고DNA 고정화시 연속된 구아닌 염기가 있는 경우에만 분석이 가능할 수준의 올리고DNA가 이민캘릭스아렌 표면에 고정화된다는 것을 보여주고 있다. The actual experimental result is the middle figure of FIG. 5 showing the result at 6 × 6, and the result shown in the bar graph by analyzing the fluorescence numerically is the right diagram of FIG. 5. Actual experimental results show that 9G oligo DNA with 9 guanine groups is 10 to about 40 times higher in fluorescence than other base oligo DNA, with biotin or with no consecutive base attached. It represents the intensity. The results show that oligoDNA is immobilized on the surface of iminecalixarene which can be analyzed only when there is a continuous guanine base upon oligoDNA immobilization.
도 6는 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층에 올리고DNA고정화시 7 개 이상의 연속된 구아닌 작용기가 필수적임을 보여주고 있다. FIG. 6 shows that seven or more consecutive guanine functional groups are essential when oligo DNA is immobilized on the self-assembled monolayer of iminecalixarene derivatives of the present invention.
올리고DNA 고정화 조건은 도 3에서 제시된 조건으로 진행하였으며, c-DNA도 도 4에서 사용된 형광부착된 올리고DNA를 이용하여 상기 제시된 조건에 따라 교잡반응을 수행하였다. OligoDNA immobilization conditions were carried out under the conditions shown in FIG. 3, and c-DNA was also subjected to hybridization according to the conditions shown above using the fluorinated oligoDNA used in FIG. 4.
1G 5'-GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 8)
4G 5'-GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 9)
7G 5'-GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 10)
9G 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 1)
12G 5'-GGG GGG GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 11)
15G 5'-GGG GGG GGG GGG GGG GAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 12)
c-DNA 5'-Cy3-GT GCA GCT GTG GGT TGA TT-3' (서열번호 2) (Cy-3 ; 형광물 질)c-
상기 제시된 조건과 동일하게 올리고DNA를 도포하고 씻은 후 건조하였다. 실제 실험결과에 따르면, 각각의 올리고DNA를 상기한 조건에서 동일하게 도포하고 고정화한 뒤, c-DNA를 표면에 최대로 고정화될 수 있는 올리고DNA 양의 3 배를 도포하여 고정화된 올리고DNA 모두에 충분히 형광부착된 c-DNA 가 결합될 수 있도록 한 후, 씻고 건조하여 형광 스캐너로 분석하였다. Oligo DNA was applied, washed and dried under the same conditions as given above. According to the actual experimental results, each oligo DNA was applied and immobilized in the same condition as described above, and then c-DNA was applied to all immobilized oligo DNAs by applying three times the amount of oligo DNA that can be immobilized to the surface. After allowing sufficient fluorescent c-DNA to bind, it was washed, dried and analyzed with a fluorescence scanner.
실제 실험결과는 6x6으로 결과가 보이는 도 6의 중간그림이며, 이 형광을 수치로 분석하여 막대 그래프로 보인 결과가 도 6의 우측 도표이다. 연속된 구아닌 염기서열이 1 또는 4 개 정도일때는 거의 표면 고정화가 이루어지지 않는 결과를 보여주고 있으며, 7 개의 연속된 구아닌 (7G)을 가질 때부터 형광이 강하게 나타나기 시작하고, 9 개 (9G)에서 최대치의 형광을 나타내는 결과를 보여주고 있다. 이 때 9 개보다 길이가 더욱 긴 12 개 (12G) 및 15 개 (15G)의 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 사용하여 고정화한 경우에는 9G의 경우 보다 조금씩 형광감도가 감소하기 시작한다. 이는 9 개의 구아닌 염기가 분자인식에 의한 고정화에 충분한 수준이며, 길이가 더 긴 구아닌 염기를 이용하게 되면 이론적으로 12G인 경우 9G인 올리고DNA 고정화에 필요한 공간보다 약 1/3 수준을 더 필요로 하여 결과적으로 형광감도가 1/3 수준 감소하는 결과를 나타내고 있다. 15G 인 경우에는 고정화에 필요한 공간이 9G 보다 2/3 수준을 더 필요로 하여 이론적으로 고정화 될 양이 3/5 수준으로, 즉 60% 수준으로 감소하게 되며, 실제로는 형광감도가 9G에 비 해 약 55% 감소한 결과로 나타나고 있다. 상기 결과를 종합하면 고정화에 필요한 연속된 구아닌은 7 개 이상임을 알 수 있다. 바람직하게는, 상기 연속된 구아닌은 7 내지 15 개이며, 더욱 바람직하게는 9 내지 12개이고, 가장 바람직하게는 9 개이다. The actual experimental result is the middle figure of FIG. 6 showing the result at 6 × 6, and the result shown in the bar graph by analyzing the fluorescence numerically is the right diagram of FIG. 6. In the case of 1 or 4 consecutive guanine sequences, surface immobilization was hardly achieved. Fluorescence began to appear strongly after having 7 consecutive guanines (7G) and at 9 (9G). Results show maximum fluorescence. At this time, when immobilized using oligoDNA having 12 (12G) and 15 (15G) consecutive guanine bases longer than 9, the fluorescence sensitivity begins to decrease slightly than that of 9G. This is enough for guanine bases to be immobilized by molecular recognition, and using longer guanine bases requires about one third more than the space required for oligoDNA immobilization, which is theoretically 9G for 12G. As a result, the fluorescence sensitivity is reduced by 1/3. In the case of 15G, the space required for immobilization requires 2/3 more than 9G, and theoretically, the amount to be immobilized is reduced to 3/5, that is, to 60%. The result is a decrease of about 55%. Taken together, it can be seen that there are seven or more consecutive guanines required for immobilization. Preferably, the continuous guanine is 7 to 15, more preferably 9 to 12, most preferably 9.
도 7은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층에 올리고DNA 고정화시, 구아닌기가 분자 인식에 의해 선택적으로 인식된다는 것을 증명하기 위해 유사한 구조를 가진 이미다졸 작용기를 이용한 경쟁반응 결과이다. 7 is a result of a competition reaction using an imidazole functional group having a similar structure to prove that the guanine group is selectively recognized by molecular recognition when oligoDNA immobilization is performed on the self-assembled monolayer of iminecalixarene derivative of the present invention.
도 7에서는 연속된 구아닌 염기가 고정화시에 분자인식에 의해 고정화된다는 것을 구아닌염기와 유사한 분자인식이 가능한 이미다졸을 포함시켜 고정화를 진행하여 실제로 얻어낸 연구결과이다. 이미다졸은 구아닌 염기에 비해 이민캘릭스아렌 내에 분자인식이 상대적으로 약하기 때문에, 고정화되는 올리고DNA보다 높은 농도를 사용하여 분자인식을 경쟁반응시켰다. 고정화는 도 3에서의 고정화 조건과 동일하며 형광감도 측정방식도 c-DNA를 이용하여 도 4에서 사용된 방식과 동일하게 진행하였다. 도 7의 좌측 그림은 실제 실험결과를 보여주고 있으며,우측 도표는 형광감도를 경쟁반응시킨 이미다졸의 농도에 따른 형광감도의 감소를 보여주고 있다. 실제로 약 20 mM 수준에서 감소가 시작되어 30 mM 수준에서 절반 수준으로 감소하고 있으며, 100 mM 이상에서는 올리고DNA의 고정화가 거의 진행되지 않은 결과를 보여주고 있다. 이러한 결과는 올리고DNA의 고정화가 9 개의 연속된 구아닌 염기가 이민캘릭스아렌 유도체 내에 다중 분자인식되어 진행된다는 것을 보여주는 것이다. In FIG. 7, the continuous guanine base is immobilized by molecular recognition at the time of immobilization, and the immunization is carried out by including imidazole capable of molecular recognition similar to guanine base. Since imidazole has a relatively weak molecular recognition in iminecalixarene compared to guanine base, the molecular recognition was used at a higher concentration than the immobilized oligoDNA. Immobilization was the same as immobilization conditions in FIG. 3, and the fluorescence sensitivity measurement method was performed in the same manner as in FIG. 4 using c-DNA. The left figure of FIG. 7 shows the actual experimental results, and the right plot shows the decrease in the fluorescence sensitivity according to the concentration of imidazole which competed the fluorescence sensitivity. Indeed, the reduction began at about 20 mM level and decreased to half level at 30 mM level, showing that the immobilization of oligo DNA was hardly progressed above 100 mM. These results show that immobilization of oligo DNA proceeds with 9 consecutive guanine bases multi-molecularly recognized in the iminecalixarene derivative.
이와 같은 결과들은 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층이 9 개의 염속된 구아닌 염기를 다중 분자인식하여 비가역적으로 고정화하며, 특히 형광분석에 의해 나타난 고정화된 올리고DNA의 양이 기존에 알려진 방식에 비해 5-30 배 수준의 높은 고정화 밀도를 나타내고 있다. These results indicate that the immobilized monolayer of iminecalixarene derivatives immobilized irreversibly by multi-molecule recognition of 9 salted guanine bases, and the amount of immobilized oligo DNA shown by fluorescence analysis was 5 compared with the known method. A high immobilization density of -30 times is shown.
이와 같이, 본 발명은 연속된 구아닌 염기가 단분자층의 표면에 고정화되면서, 그 길이만큼의 공간 (2.5-3.5 nm)이 진단이나 연구목적 등으로 특정염기서열을 가진 유전자 분석시 수 백개 이상의 염기서열을 가진 c-DNA가 고정화된 올리고DNA와의 강한 결합을 위해 올리고DNA의 아래 부분까지 내려오는데 필요한 공간을 제공해 줌으로써, 기존에 12 시간 이상 걸려야 했던 c-DNA 결합에 필요한 교잡반응 시간을 1-2 시간 이내로 획기적으로 단축시켜 주어 공간확보가 가능한 신규의 올리고DNA 고정화 방법을 제공한다. As described above, in the present invention, a series of guanine bases are immobilized on the surface of a monomolecular layer, and spaces of the same length (2.5-3.5 nm) are used for analyzing hundreds of base sequences when analyzing a gene having a specific base sequence for diagnosis or research purposes. By providing the space required for the c-DNA to be bound to the lower part of the oligo DNA for strong binding with the immobilized oligo DNA, the hybridization time required for c-DNA binding, which had previously been required for more than 12 hours, within 1-2 hours It provides a novel oligoDNA immobilization method that can significantly shorten the space by dramatically shortening it.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited thereto.
실시예 1 Example 1
5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌의 제조Preparation of 5,11,17,23-tetraaminocalix [4] aren
5,11,17,23-테트라니트로캘릭스[4]아렌 (TNCA; tetranitrocalix[4]arene)을 출발물질로 하고 하기 참고문헌 3에 제시된 합성방법으로 합성하여, 연한황색의 고체 생성물 5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌 (TACA; tetraaminocalix[4]-arene)을 75% 수율로 얻었다 [참고문헌 3: Van Wagenigen, A. M. A.; Snip, E.; Verboom. W.; Reinhoudt, D. N.; Boerrigter, H.; Liebigs Ann/Recueil 1997년. pp 2235-2245]. 상기 반응을 반응식 1에 나타내었다. 5,11,17,23-Tetranitrocalix [4] arene (TNCA; tetranitrocalix [4] arene) as a starting material and synthesized by the synthesis method shown in Ref. , 17,23-tetraaminocalix [4] arene (TACA; tetraaminocalix [4] -arene) was obtained in 75% yield [Reference 3: Van Wagenigen, AMA; Snip, E .; Verboom. W .; Reinhoudt, D. N .; Boerrigter, H .; Liebigs Ann / Recueil 1997. pp 2235-2245]. The reaction is shown in Scheme 1.
실시예 2Example 2
5,11,17,23-테트라벤질이민캘릭스[4]아렌의 제조 Preparation of 5,11,17,23-tetrabenzyliminecalix [4] aren
건조된 둥근바닥 플라스크에 TACA 500 mg (1.03 mmol)과 무수 MgSO4를 200 mg 넣어주고, 150 ㎖ 아세토니트릴과 벤즈알데히드 0.84 ㎖ (8.24 mmol)를 동시에 넣어준 후, 상온에서 질소 교류 하에 2 시간 동안 교반시켰다. 반응 후 여과하여 고체생성물을 제거한 뒤, 용액을 감압하여 여분의 용매를 제거하고, 5 ㎖ 의 CH2Cl2 에 완전히 녹인 후, 30 ㎖ 의 n-헥산을 가하면 5,11,17,23-테트라벤질이민캘릭스[4]아렌 (TBICA;tetrabenzylimine-calix[4]arene)이 연분홍색 고체로 결정화된다. 감압필터하고 여분의 용매를 감압 하에서 제거하여, TBICA (822 mg, 수율 95.7 %)을 얻었다. 상기 반응을 반응식 2에 나타내었다. In a dried round bottom flask, 500 mg (1.03 mmol) of TACA and 200 mg of anhydrous MgSO 4 were added, 150 ml of acetonitrile and 0.84 ml (8.24 mmol) of benzaldehyde were added simultaneously, followed by stirring at room temperature under nitrogen exchange for 2 hours. I was. After the reaction was filtered to remove the solid product, the solution was depressurized to remove the excess solvent, completely dissolved in 5 ml of CH 2 Cl 2 , 30 ml of n-hexane was added to 5,11,17,23-tetra Benzylimine caliber [4] arene (TBICA; tetrabenzylimine-calix [4] arene) is crystallized into a pale pink solid. Filter under reduced pressure and excess solvent was removed under reduced pressure to give TBICA (822 mg, yield 95.7%). The reaction is shown in Scheme 2.
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 10.15(s, 4H, OH), 8.34(s, 4H, N=CH), 7.82-7.78(m, 8H, Ar), 7.40-7.38(m, 12H, Ar), 7.01(s, 8H, Ar), 4.31(d, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz), 3.63(d, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ 10.15 (s, 4H, OH), 8.34 (s, 4H, N = CH), 7.82-7.78 (m, 8H, Ar), 7.40-7.38 (m, 12H, Ar), 7.01 (s, 8H, Ar), 4.31 (d, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz), 3.63 (d, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz)
13C NMR (300MHz, CDCl3): δ 159.26, 146.28, 136.40, 131.32, t128.86, 121.90, 32.47 13 C NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ 159.26, 146.28, 136.40, 131.32, t128.86, 121.90, 32.47
실시예 3Example 3
5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4]아렌의 제조Preparation of 5,11,17,23-tetrabenzyliminalkoxyalkalix [4] arene
건조된 둥근바닥 플라스크에 TBICA 500 mg (0.6 mmol), 무수 K2CO3 (830 mg, 6 mmol) 및 요오드화 나트륨 (810 mg, 5.4 mmol)를 넣고 아세토니트릴 150 ㎖ 를 넣어준 뒤 질소 교류 하에 교반시켰다. 10 분 뒤 6-브로모헥산알 (bromohexanal) (644 mg, 3.6 mmol)을 넣어주고, 반응용기 온도를 80℃로 올려준 후 24 시간 동안 교반시켰다. 반응 후 아세토니트릴을 감압하여 제거시키고 CH2Cl2 150 ㎖ 를 사용하여 반응물을 녹였다. 반응 시 생성되는 KBr, KI, K2CO3 등은 녹지 않으므로 감압 여과하여 제거하고, 여과액은 감압하여 용매를 제거한 뒤 5 ㎖ 의 에틸 아세테이트에 완전히 녹인 후, 40 ㎖ 의 n-헥산을 가하면 5,11,17,23-테트라벤질이민알콕시캘릭스[4]아렌 (TBICOCA; tetrabenzyliminealkoxy -calix[4]arene)가 노란색의 고체로 석출된다. 이를 CHCl3/n-헥산으로 재결정하여 엷은 노란색의 고체 생성물 TBICOCA (570 mg, 수율 90%)를 얻었다. 상기 반응을 반응식 3에 나타내었다. TBICA 500 mg (0.6 mmol), anhydrous K 2 CO 3 (830 mg, 6 mmol) and sodium iodide (810 mg, 5.4 mmol) were added to the dried round bottomed flask, and 150 ml of acetonitrile was added thereto. I was. After 10 minutes, 6-bromohexanal (644 mg, 3.6 mmol) was added thereto, and the reaction vessel was heated to 80 ° C. and stirred for 24 hours. After the reaction, acetonitrile was removed under reduced pressure and the reaction was dissolved using 150 ml of CH 2 Cl 2 . KBr, KI, and K 2 CO 3 produced during the reaction are not dissolved, so they are removed by filtration under reduced pressure. The filtrate is removed under reduced pressure, completely dissolved in 5 ml of ethyl acetate, and then 40 ml of n-hexane is added. , 11,17,23-tetrabenzyliminalkoxyalkalix [4] arene (TBICOCA; tetrabenzyliminealkoxy -calix [4] arene) precipitates as a yellow solid. It was recrystallized from CHCl 3 / n-hexane to give the pale yellow solid product TBICOCA (570 mg, 90% yield). The reaction is shown in
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 9.81(t, 2H, CHO), 8.46(s, 2H, N=CH), 8.24(s, 2H, N=CH), 7.86-7.82(m, 4H, Ar), 7.73-7.70(m, 4H, Ar), 7.43-7.31(m, 12H, Ar), 7.07(s, 4H, Ar), 6.83(s, 4H, Ar), 4.33(d, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz), 4.04(t, 4H, OCH2), 3.46(d, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz), 2.57(t, 4H, CH2CHO), 2.10(t, 4H, OCH2CH2), 1.88-1.70(m, 8H, CH2CH2) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ 9.81 (t, 2H, CHO), 8.46 (s, 2H, N = CH), 8.24 (s, 2H, N = CH), 7.86-7.82 (m, 4H, Ar), 7.73-7.70 (m, 4H, Ar), 7.43-7.31 (m, 12H, Ar), 7.07 (s, 4H, Ar), 6.83 (s, 4H, Ar), 4.33 (d, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz, 4.04 (t, 4H, OCH 2 ), 3.46 (d, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz), 2.57 (t, 4H, CH 2 CHO), 2.10 (t, 4H, OCH 2 CH 2 ), 1.88-1.70 (m, 8H, CH 2 CH 2 )
13C NMR (300MHz, CDCl3): δ 202.07, 197.11, 159.61, 158.90, 148.21, 147.19, 145.93, 143.10, t136.07, 130.59-129.57, 128.83-128.08, 122.10, 121.54, 43.84, 31.73, 25.57 13 C NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ 202.07, 197.11, 159.61, 158.90, 148.21, 147.19, 145.93, 143.10, t136.07, 130.59-129.57, 128.83-128.08, 122.10, 121.54, 43.84, 31.73, 25.57
실시예 4Example 4
5,11,17,23-테트라벤질이민브로모부톡시캘릭스[4]아렌의 제조Preparation of 5,11,17,23-tetrabenzylimbromobutoxycalix [4] arene
건조된 둥근바닥 플라스크에서 TBICA (500 mg, 0.6 mmol), 무수 K2CO3 (830 mg, 6 mmol) 및 요오드화 나트륨 (1.08 g, 7.2 mmol)를 넣고 아세토니트릴 150 ㎖를 넣어준 후 상온에서 10 분간 교반시켰다. 반응용기에 1,4-디브로모부탄 (1.3 g, 0.72 ml, 6 mmol)을 넣어주고 반응용기 온도를 80 ℃로 올려준 후 24 시간동안 반응시켰다. 반응용기를 상온으로 식힌 뒤 용매는 감압하여 제거시키고 CH2Cl2 150 ㎖ 로 잔여물을 녹였다. 반응 시 생성된 KBr, KI, K2CO3 등은 녹지 않으므로 감압 여과하여 제거하고 여과액은 감압하여 용매를 제거하였다. 에틸 아세테이트/n-헥산으로 석출시킨뒤, 감압 여과하여 황토색의 고체생성물 5,11,17,23-테트라벤질이민브로모부톡시캘릭스[4]아렌 (TBBCA; tetrabenzylimine -bromobutoxy-calix[4]arene) 을 얻었다. 이 고체를 CHCl3/n-헥산으로 재결정하여 엷은 노란색의 TBBCA (480 mg, 72%)를 얻었다. 상기 반응을 반응식 4에 나타내었다. In a dried round bottom flask, TBICA (500 mg, 0.6 mmol), anhydrous K 2 CO 3 (830 mg, 6 mmol) and sodium iodide (1.08 g, 7.2 mmol) were added and 150 ml of acetonitrile was added thereto at room temperature. Stirred for a minute. 1,4-dibromobutane (1.3 g, 0.72 ml, 6 mmol) was added to the reaction vessel, the reaction vessel temperature was raised to 80 ° C., and reacted for 24 hours. After the reaction vessel was cooled to room temperature, the solvent was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved in 150 ml of CH 2 Cl 2 . KBr, KI, K 2 CO 3 and the like produced during the reaction are not dissolved, so it was removed by filtration under reduced pressure and the filtrate was removed under reduced pressure to remove the solvent. Precipitated with ethyl acetate / n-hexane and filtered under reduced pressure to yield an ocher colored solid product 5,11,17,23-tetrabenzyliminebromobutoxycalix [4] arene (TBBCA; tetrabenzylimine -bromobutoxy-calix [4] arene ) This solid was recrystallized from CHCl 3 / n-hexane to give a pale yellow TBBCA (480 mg, 72%). The reaction is shown in Scheme 4.
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 8.47(s, 2H, N=CH), 8.24(s, 2H, N=CH), 7.98(s, 2H, ArOH), 7.86-7.83(dd, 4H, ArH), 7.73-7.70(dd, 4H, ArH), 7.41-7.31(m, 12H, ArH), 7.08(s, 4H, Ar), 6.83(s, 4H, Ar), 4.33(d, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz), 4.06(t, 4H, OCH2), 3.49(s, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz), 3.45(t, 4H, CH2Br), 2.37-2.29(m, OCH2CH2) 2.24-2.18(m, CH2CH2Br) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ 8.47 (s, 2H, N = CH), 8.24 (s, 2H, N = CH), 7.98 (s, 2H, ArOH), 7.86-7.83 (dd, 4H, ArH), 7.73-7.70 (dd, 4H, ArH), 7.41-7.31 (m, 12H, ArH), 7.08 (s, 4H, Ar), 6.83 (s, 4H, Ar), 4.33 (d, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz), 4.06 (t, 4H, OCH 2 ), 3.49 (s, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz), 3.45 (t, 4H, CH 2 Br), 2.37-2.29 (m, OCH 2 CH 2 ) 2.24-2.18 (m, CH 2 CH 2 Br)
실시예 5Example 5
5,11,17,23-테트라벤질이민머캅토부톡시캘릭스[4]아렌의 제조Preparation of 5,11,17,23-tetrabenzylimmercaptobutoxycalix [4] arene
건조된 둥근바닥 플라스크에 TBBCA (500 mg, 0.45 mmol) 및 칼륨 티오아세테이트 (114.21 mg, 1 mmol)을 넣고 아세톤 60 ㎖ 에 녹인 후 질소 교류 하에서 실온에서 90 분 동안 소닉반응시켰다. 반응 후 용매를 감압 하에 제거하고 30 ㎖ 의 CH2Cl2 로 녹여주어 녹지 않는 침전물은 감압 여과하여 거른 뒤 여과액을 물로 두 번 닦아주고 유기층을 분리하여 MgSO4 로 건조시켰다. 유기층을 감압 여과하고 여과액을 감압 건조시킨 뒤 얻어진 고체를 에틸 아세테이트/n-헥산을 이용하여 재결정하고 감압 여과하여 연한 노란색의 고체 결정을 얻었다. 얻어낸 고체결정을 둥근바닥 플라스크에 넣고 CH2Cl2 : 메탄올 = 5 : 1 비율의 혼합용액에 녹이고 상온에서 질소 교류 하에서 소닉반응하였다. 1 분 뒤 1.0 M KOH (1 ㎖, 1 mmol)을 넣고 30 분 동안 소닉반응시켰다. 반응 후 용매를 감압하에 제거한 뒤 5 ㎖ 의 CH2Cl2 에 녹여서 0.1 M HCl 수용액으로 한 번 닦아주었다. 유기층을 분리하고 MgSO4 로 건조시킨 뒤 감압 여과하고 여과액의 용매를 감압 하에 제거하여 연한 노란색의 5,11,17,23-테트라벤질이민머캅토부톡시캘릭스[4]아렌 (TBIMBCA; tetrabenzyliminemercaptobutoxycalix[4]arene)을 얻었다. 얻어진 TBIMBCA 를 에틸 아세테이트/n-헥산으로 재결정하여 TBIMBCA (450 mg, 수율 73%)을 흰색의 고체 결정으로 얻었다. 상기 반응을 반응식 5에 나타내었다. TBBCA (500 mg, 0.45 mmol) and potassium thioacetate (114.21 mg, 1 mmol) were added to the dried round bottom flask and dissolved in 60 ml of acetone, followed by sonication at room temperature for 90 minutes under nitrogen flow. After the reaction, the solvent was removed under reduced pressure, dissolved in 30 ml of CH 2 Cl 2, and the insoluble precipitate was filtered off under reduced pressure. The filtrate was washed twice with water, and the organic layer was separated and dried over MgSO 4 . The organic layer was filtered under reduced pressure, the filtrate was dried under reduced pressure, and the obtained solid was recrystallized with ethyl acetate / n-hexane and filtered under reduced pressure to give a pale yellow solid crystal. The obtained solid crystals were placed in a round bottom flask and dissolved in a mixed solution of CH 2 Cl 2 : methanol = 5: 1 ratio and sonicated under nitrogen flow at room temperature. After 1 minute, 1.0 M KOH (1 mL, 1 mmol) was added and sonicated for 30 minutes. After the reaction, the solvent was removed under reduced pressure, and then dissolved in 5 ml of CH 2 Cl 2 and wiped once with 0.1 M HCl aqueous solution. The organic layer was separated, dried over MgSO 4 , filtered under reduced pressure, and the solvent in the filtrate was removed under reduced pressure. 4] arene). The obtained TBIMBCA was recrystallized from ethyl acetate / n-hexane to give TBIMBCA. (450 mg, yield 73%) was obtained as white solid crystals. The reaction is shown in Scheme 5.
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 8.48(s, 2H, N=CH), 8.17(s, 2H, N=CH), 7.84(m, 4H, ArOH), 7.68(m, 4H, ArOR), 7.38(m, 6H, ArH), 7.28(m, 6H, ArOR), 7.10(s, 4H, ArH), 6.81(s, 4H, ArH), 4.34(d, 4H, ArCHA2r), 4.04(t, 4H, ArOCH2), 3.47(d, 4H, ArCH2Ar, J=13Hz), 3.03(t, 4H, SHCH2), 2.38(m, 4H, ArOCH2CH2), 2.11(m, 4H, CH2CH2) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ 8.48 (s, 2H, N = CH), 8.17 (s, 2H, N = CH), 7.84 (m, 4H, ArOH), 7.68 (m, 4H, ArOR) , 7.38 (m, 6H, ArH), 7.28 (m, 6H, ArOR), 7.10 (s, 4H, ArH), 6.81 (s, 4H, ArH), 4.34 (d, 4H, ArCHA 2 r), 4.04 ( t, 4H, ArOCH 2 ), 3.47 (d, 4H, ArCH 2 Ar, J = 13 Hz), 3.03 (t, 4H, SHCH 2 ), 2.38 (m, 4H, ArOCH 2 CH 2 ), 2.11 (m, 4H , CH 2 CH 2 )
실시예 6Example 6
이민캘릭스아렌 유도체 단분자층의 제조Preparation of imine callix arene derivative monolayer
CHCl3 등의 유기용매에 실시예 3에서 합성된 TBICOCA 를 0.1-5 mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 1에서와 같이 아민작용기가 부착된 슬라이드글라스 (아민칩)을 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시켜 본 발명의 이민캘릭스아렌 단분자층을 제조하였다. 동일한 방법에 따라 다른 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하였다. TBICOCA synthesized in Example 3 in an organic solvent such as CHCl 3 A solution dissolved at a concentration of 0.1-5 mM was prepared. As shown in FIG. 1, the slide glass (amine chip) to which the amine functional group is attached is immersed in the prepared solution for 1-24 hours and then taken out and washed with chloroform, acetone, and water, respectively, and dried to prepare the imine callis arene monolayer of the present invention. Prepared. According to the same method, another iminecalixarene derivative monolayer was prepared.
실시예 7Example 7
금 기질에서의 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조Preparation of Imine Calixarene Derivative Monolayer on Gold Substrate
CHCl3 등의 유기용매에 실시예 5에서 합성된 TBIMBCA 를 0.1-5 mM 농도로 녹인 용액을 제조하였다. 도 2에서와 같이 금 기질을 제조된 용액에 1-24 시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면 본 발명의 이민캘릭스아렌 단분자층을 제조하였다. 동일한 방법에 따라 다른 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제조하였다. 상기 금 기질은 여러 가지 형태로 사용될 수 있으나, 일반적으로 유리, 용융석영, 실리콘웨이퍼, 플라스틱 등에 크롬 (Cr)이나 티타늄 (Ti)등을 5-20 nm 로 진공증착 시킨 후 금을 100-300 nm 두께로 진공증착시킨 기질이 바람직하다. 이렇게 제조된 금 기질은 사용 직전에 피라나 (piranha) 용액 (진한황산 : 30% 과산화수소수 = 3 : 1로 섞은 혼합용액)에 10 초 내지 1 분 정도 담근 후, 물로 세척하고 질소 교류 하에 건조시켜 곧바로 사용하였다. 단분자층의 생성은 표면반사적외선분광분석법 (FTIR-ERS)을 이용하여 분석하였다. A solution in which TBIMBCA synthesized in Example 5 was dissolved in an organic solvent such as CHCl 3 at a concentration of 0.1-5 mM was prepared. As shown in FIG. 2, the gold substrate was immersed in the prepared solution for 1-24 hours and then taken out, washed with chloroform, acetone, and water, respectively, and dried to prepare the iminecalixarene monolayer of the present invention. According to the same method, another iminecalixarene derivative monolayer was prepared. The gold substrate may be used in various forms. Generally, gold is deposited on glass, molten quartz, silicon wafer, plastic, etc. by vacuum deposition of 5-20 nm of chromium (Cr) or titanium (Ti) to 5-20 nm. Substrates vacuum deposited to thickness are preferred. The gold substrate thus prepared is immersed in a piranha solution (concentrated sulfuric acid: 30% hydrogen peroxide = 3: 1 mixed solution) for 10 seconds to 1 minute immediately before use, washed with water and dried under nitrogen flow. It was used immediately. The production of monolayers was analyzed using surface reflection infrared spectroscopy (FTIR-ERS).
실시예 8Example 8
다중 분자인식에 의한 올리고DNA 고정화 방법OligoDNA Immobilization Method by Multiple Molecular Recognition
도 3에 나타난 올리고DNA 고정화에는 제네틱스 (Genetics) 마이크로어레이 장치 (영국)와 프로테오젠 마이크로어레이 장치 (한국)를 사용하였다. 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA를 6.75 pmol/㎕ 로 BMT 스폿팅 (spotting) 용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 어레이핀을 이용하여, 실시예 6과 같은 방식으로 제조된 도 1에 제시된 형태의 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 유리 기질 (유리 슬라이드)에 1-5 nL 씩을 도포하여, 올리고DNA를 직경이 150-180 ㎛ 인 스폿 내에 고정화시켰다. 1-4 시간 뒤에 유리 슬라이드를 500 ㎖ 의 BMT Wa-A-1 용액에서 1 분 동안 1회 세척하고, BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척한 후 건조하여 제조하였다. 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹 (blocking)하기 위하여, 세척된 유리 슬라이드를 250 ㎖ 의 BMT 블록킹 용액에 넣고 30 분 동안 처리하였다. 그 후, 다시 500 ml의 BMT Wa-A-1 용액에서 3 분 동안 1 회 세척하고 BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척한 뒤, 물기를 제거하여 건조한 후 제조하였다. The oligo DNA immobilization shown in FIG. 3 was used in the Genetics microarray device (UK) and the Proteogen microarray device (Korea). An immobilized solution was prepared by dissolving oligo DNA having 9 consecutive guanine bases in a BMT spotting solution at 6.75 pmol / μl. The immobilization solution was applied to the iminecalixarene derivative monolayer glass substrate (glass slide) of the type shown in FIG. 1 prepared in the same manner as in Example 6 by using an array pin, and the oligo DNA was diameterd. It is immobilized in this 150-180 micrometers spot. After 1-4 hours, the glass slides were washed once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 1 minute, washed twice with BMT Wa-A-2 solution and dried. To block the rest of the sites where the oligo DNA was immobilized, the washed glass slides were placed in 250 ml BMT blocking solution and treated for 30 minutes. Thereafter, the mixture was washed once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 3 minutes, washed twice with BMT Wa-A-2 solution, and dried to prepare water.
실시예 9Example 9
다중 분자인식에 의해 9 개의 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고DNA만 비가역적으로 고정화되는 방법Method of reversibly immobilizing only oligo DNA with 9 consecutive guanine bases by multi-molecular recognition
도 4에 나타난 올리고DNA 고정화에는 제네틱스 마이크로어레이 장치(영국)를 사용하였다. 하기 표 1의 9A, 9G, 9C, 9T, no, 비오틴 등의 6 종의 각각 다른 고정화용 작용기의 고정화 효율을 확인하기 위해, 각각의 올리고DNA가 6.75 pmol/㎕ 로 BMT 스폿팅 용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 어레이핀을 이용하여, 실시예 6과 같은 방식으로 제조된 도 1에서 제시된 형태의 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 유리 기질 (유리 슬라이드)에 1-5 nL 씩을 도포하여 올리고DNA를 직경이 150-180 ㎛ 인 스폿 내에 고정화시켰다. 1-4 시간 뒤에 유리 슬라이드를 500 ㎖ 의 BMT Wa-A-1 용액에서 1 분 동안 1 회 세척하고, BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척한 뒤 건조하여 제조하였다. 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹하기 위하여, 세척된 유리 슬라이드를 250 ㎖ 의 BMT 블록킹 용액에 넣고 30 분 동안 처리한 후, 다시 500 ㎖ 의 BMT Wa-A-1 용액에서 3 분 동안 1 회 세척하고 BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척하였다. 물기를 제거하여 건조 후 도 4에 나타난 올리고DNA 칩을 제조한 다음, 직경이 0.8 cm 인 교잡반응용 챔버를 단단히 부착하였다. The oligo DNA immobilization shown in FIG. 4 was used with a Genetics microarray device (UK). In order to confirm the immobilization efficiency of six different immobilization functional groups, such as 9A, 9G, 9C, 9T, no, and biotin in Table 1, each oligo DNA was dissolved in a BMT spotting solution at 6.75 pmol / μl and immobilized. The solution was prepared. The immobilization solution was applied to the iminecalixarene derivative monomolecular layer glass substrate (glass slide) of the type shown in Figure 1 prepared in the same manner as in Example 6, using an array pin, to increase the oligo DNA by diameter. Immobilized in a spot that is 150-180 μm. After 1-4 hours, the glass slides were prepared by washing once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 1 minute, washing twice with BMT Wa-A-2 solution and then drying. To block the rest of the oligoDNA immobilization sites, the washed glass slides were placed in 250 ml of BMT blocking solution and treated for 30 minutes, then washed once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 3 minutes. And washed twice with BMT Wa-A-2 solution. After drying to prepare the oligo DNA chip shown in FIG. 4 after drying, the hybridization chamber having a diameter of 0.8 cm was firmly attached.
다음 형광부착된 표적 유전자와 교잡반응을 위하여 1.5 ㎖ 튜브에 2 pmol/㎕ 농도의 형광이 부착된 표적 유전자 2 ㎕와 BMT hyb-mixA 58 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고, 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕의 혼합용액을 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 습도가 유지되는 항온 오븐에서 50℃에서 30 분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 30℃ 항온조에서 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS) 용액으로 2 분간, 상온에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도 5에 나타난 결과와 같다. 상기 결과는 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA는 고밀도로 고정화가 진행되었고 다른 염기는 고정화에 영향을 주지 않음을 보여준다.Next, a mixed solution was prepared at a ratio of 2 μl of the target gene with 2 pmol / μl of fluorescence attached to a 1.5 mL tube and 58 μl of BMT hyb-mixA for hybridization with the fluorescence-targeted target gene. It was heated in 100 ° C. water for 3 minutes, cooled for 3 minutes on ice, and then 60 μl of the mixed solution was injected into a glass slide equipped with a hybridization chamber. The glass slides were hybridized for 30 minutes at 50 ° C. in a constant temperature oven maintained with humidity. The hybridized glass slides were washed twice with BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS) solution for 2 minutes in a 30 ℃ thermostatic bath and for 2 minutes with BMT Wa-B-2 (4xSSC) solution at room temperature. It was. After drying, the fluorescence sensitivity was quantitatively analyzed using a microarray scanner (GSI Lumonics, USA). The actual result is the same as the result shown in FIG. The results show that the oligo DNA having 9 guanine bases was immobilized at a high density and other bases did not affect the immobilization.
실시예 10Example 10
1-15 개의 연속된 구아닌 염기를 가진 올리고DNA가 다중 분자인식에 의해 비가역적으로 고정화될 때의 효율 비교방법Efficiency comparison method when oligo DNA having 1-15 consecutive guanine bases is irreversibly immobilized by multiple molecular recognition
도 6에 나타난 올리고DNA 고정화에는 제네틱스 마이크로어레이 장치(영국)를 사용하였다. 하기 표 2의 1G, 4G, 7G, 9G, 12G, 15G 등의 6 종의 각각 다른 고정화용 작용기의 고정화 효율을 확인하기 위하여, 각각의 올리고DNA가 6.75 pmol/㎕ 로 BMT 스폿팅 용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 어레이핀을 이용하여 실시예 6과 같은 방식으로 제조된 도 1에서 제시된 형태의 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 유리 기질 (유리 슬라이드)에 1-5 nL씩을 도포하여, 올리고DNA를 직경이 150-180 ㎛인 스폿 내에 고정화시켰다. 4 시간 뒤에 유리 슬라이드를 500 ㎖의 BMT Wa-A-1 용액에서 1 분 동안 1 회 세척하고 BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척하고 건조하여 제조하였다. 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹하기 위하여, 세척된 유리 슬라이드를 250 ㎖의 BMT 블록킹 용액에 넣고 30 분 동안 처리하였다. 다시 500 ㎖의 BMT Wa-A-1 용액에서 3 분 동안 1 회 세척하고 BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척한 후 물기를 제거하였다. 건조 후 도 4에서 보여지는 올리고DNA 칩을 제조한 다음 직경이 0.8 cm 인 교잡반응용 챔버를 단단히 부착하였다. The oligo DNA immobilization shown in FIG. 6 was used with a Genetics microarray device (UK). In order to confirm the immobilization efficiency of six different immobilization functional groups such as 1G, 4G, 7G, 9G, 12G, and 15G in Table 2, each oligo DNA was dissolved in a BMT spotting solution at 6.75 pmol / μl and immobilized. The solution was prepared. The immobilization solution was applied to the iminecalixarene derivative monolayer glass substrate (glass slide) of the type shown in FIG. 1 prepared in the same manner as in Example 6 using array pins, thereby increasing the oligo DNA by diameter. Immobilized in spots 150-180 μm. After 4 hours the glass slides were prepared by washing once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 1 minute, washing twice with BMT Wa-A-2 solution and drying. To block the rest of the sites where the oligo DNA was immobilized, the washed glass slides were placed in 250 ml BMT blocking solution and treated for 30 minutes. Again washed once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 3 minutes, washed twice with BMT Wa-A-2 solution and then drained. After drying, the oligo DNA chip shown in FIG. 4 was prepared, and then a hybridization chamber having a diameter of 0.8 cm was firmly attached.
다음 실시예 9에서 사용된 것과 동일한 형광부착된 표적 유전자와 교잡반응을 위하여, 1.5 ㎖ 튜브에 2 pmol/㎕ 농도의 형광이 부착된 표적 유전자 2 ㎕와 BMT hyb-mixA 58 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕의 혼합용액을 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 습도가 유지되는 항온 오븐에서 50℃에서 30 분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 30℃ 항온조에서 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)용액으로 2 분간, 상온에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분 간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도 6에 제시된 바와 같다. 상기 결과는 고정화를 위하여 7 개의 연속된 구아닌 염기 이상의 연속된 구아닌 염기가 필요하다는 것을 보여주고 있다. 추가로 9 개의 연속된 구아닌 염기의 경우 가장 높은 고정화 밀도를 보여줌을 알 수 있다. For hybridization with the same fluorescently-targeted target gene as used in Example 9 below, the mixed solution was mixed at a ratio of 2 μl of target gene with 2 pmol / μl of fluorescence attached to a 1.5 mL tube and 58 μl of BMT hyb-mixA. made. It was heated in 100 ° C. water for 3 minutes, cooled for 3 minutes on ice, and then 60 μl of the mixed solution was injected into a glass slide with a hybridization chamber. The glass slides were hybridized for 30 minutes at 50 ° C. in a constant temperature oven maintained with humidity. After completion of the hybridization reaction, the glass slide was washed twice with BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS) solution for 30 minutes in a 30 ℃ thermostatic chamber, and for 2 minutes with BMT Wa-B-2 (4xSSC) solution at room temperature. It was. After drying, the fluorescence sensitivity was quantitatively analyzed using a microarray scanner (GSI Lumonics, USA). The actual result is as shown in FIG. 6. The results show that more than seven consecutive guanine bases are required for immobilization. In addition, 9 consecutive guanine bases showed the highest immobilization density.
실시예 11Example 11
이미다졸과의 경쟁반응을 통한 다중 분자인식에 의한 올리고DNA 고정화의 증명Demonstration of OligoDNA Immobilization by Multiple Molecular Recognition through Competitive Reaction with Imidazole
도 7에서 보여진 올리고DNA 고정화에는 제네틱스 마이크로어레이 장치(영국)를 사용하였다. 5'-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3' (서열번호 1)의 염기서열을 가진 올리고DNA를 6.75 pmol/㎕ 로 BMT 스폿팅 용액에 녹여서 고정화 용액을 제조하였다. 상기 고정화 용액을 어레이핀을 이용하여 실시예 6과 같은 방식으로 제조된 도 1에 나타난 형태의 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 유리 기질 (유리 슬라이드)에 1-5 nL 씩을 도포하여 올리고DNA를 직경이 150-180 ㎛ 인 스폿 내에 고정화시켰다. 단, 각각 다른 농도의 이미다졸을 도 7에 나타난 농도로 포함되게 하여 고정화 용액을 도포하였다. 3 시간 후 유리 슬라이드를 500 ㎖ 의 BMT Wa-A-1 용액에서 1 분 동안 1 회 세척하고, BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척하고 건조하여 제조하였다. 올리고DNA가 고정화된 나머지 위치를 블록킹하기 위하여, 세척된 유리 슬라이드를 250 ㎖ 의 BMT 블록킹 용액에 넣고 30 분 동안 처리하였다. 다시 500 ㎖ 의 BMT Wa-A-1 용액에서 3 분 동안 1 회 세척하고, BMT Wa-A-2 용액으로 2 회 세척한 후, 물기를 제거하여 건조 후 도 4에 나타난 올리고DNA 칩을 제조한 다음 직경이 0.8 cm 인 교잡반응용 챔버를 단단히 부착하였다. The oligo DNA immobilization shown in FIG. 7 was used with a Genetics microarray device (UK). Immobilization solution was prepared by dissolving oligo DNA having a nucleotide sequence of 5′-GGG GGG GGG AAA TCA ACC CAC AGC TGC A-3 ′ (SEQ ID NO: 1) at 6.75 pmol / μl in BMT spotting solution. The immobilized solution was coated with 1-5 nL of the iminecalixarene derivative monomolecular layer glass substrate (glass slide) of the type shown in FIG. 1 prepared in the same manner as in Example 6 by using an array pin. It is immobilized in the spot which is -180 micrometers. However, immobilization solution was applied by including imidazole having different concentrations in the concentrations shown in FIG. 7. After 3 hours the glass slides were prepared by washing once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 1 minute, washing twice with BMT Wa-A-2 solution and drying. To block the rest of the sites where the oligo DNA was immobilized, the washed glass slides were placed in 250 ml BMT blocking solution and treated for 30 minutes. Again washed once in 500 ml of BMT Wa-A-1 solution for 3 minutes, washed twice with BMT Wa-A-2 solution, and then dried to prepare the oligo DNA chip shown in FIG. The hybridization chamber with a diameter of 0.8 cm was then attached firmly.
다음 실시예 9에서 사용된 것과 동일한 형광부착된 표적 유전자와 교잡반응을 위하여, 1.5 ㎖ 튜브에 2 pmol/㎕ 농도의 형광이 부착된 표적 유전자 2 ㎕ 와 BMT hyb-mixA 58 ㎕ 비율로 혼합용액을 만들었다. 이를 100℃ 물에서 3 분 동안 가열하고 얼음 위에서 3 분간 방치하여 냉각시킨 후, 60 ㎕ 의 혼합용액을 교잡반응용 챔버가 부착된 유리 슬라이드에 주입하였다. 유리 슬라이드를 습도가 유지되는 항온 오븐에서 50℃에서 30 분 동안 교잡반응시켰다. 교잡반응이 끝난 유리 슬라이드를 30℃ 항온조에서 BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)용액으로 2 분간, 상온에서 BMT Wa-B-2 (4xSSC)용액으로 2 분간씩 2 회 반복하여 세척하였다. 건조시킨 뒤 마이크로 어레이어 스캐너 (GSI Lumonics, 미국)를 이용하여 형광감도를 정량적으로 분석하였다. 실제 결과는 도 7에 제시된 바와 같다. 상기 결과는 이미다졸이 연속된 구아닌의 다중 분자인식에 의한 고정화를 방해하여 100 mM 이상의 이미다졸이 포함되면 올리고DNA의 고정화가 거의 진행되지 않는 것으로 나타났다. 즉, 분자인식으로 이미다졸이 경쟁하면서 연속된 9 개의 구아닌 염기를 가진 올리고DNA의 고정화 속도를 떨어뜨린다는 것을 보여주고 있다. For hybridization with the same fluorescently-targeted target gene as used in Example 9 below, the mixed solution was mixed at a ratio of 2 μl of target gene with 2 pmol / μl of fluorescence attached to a 1.5 mL tube and 58 μl of BMT hyb-mixA. made. It was heated in 100 ° C. water for 3 minutes, cooled for 3 minutes on ice, and then 60 μl of the mixed solution was injected into a glass slide equipped with a hybridization chamber. The glass slides were hybridized for 30 minutes at 50 ° C. in a constant temperature oven maintained with humidity. The hybridized glass slides were washed twice with BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS) solution for 30 minutes in a 30 ℃ thermostatic bath, and for 2 minutes with BMT Wa-B-2 (4xSSC) solution at room temperature. It was. After drying, the fluorescence sensitivity was quantitatively analyzed using a microarray scanner (GSI Lumonics, USA). The actual result is as shown in FIG. The results show that imidazole prevents immobilization of oligoDNA when imidazole is contained in 100 mM or more by preventing the immobilization by continuous molecular recognition of guanine. In other words, molecular recognition shows that imidazole competes and slows the immobilization rate of oligoDNA with 9 consecutive guanine bases.
실시예 8-11에서 사용된 고정화, 세척 등에 사용된 용액들의 조성은 다음과 같다.The compositions of the solutions used in the immobilization, washing and the like used in Example 8-11 are as follows.
BMT 스폿팅 용액 (4xSSC, 15% 글리세롤, 1x PBS)BMT Spotting Solution (4xSSC, 15% Glycerol, 1x PBS)
BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)BMT Wa-A-1 (2xSSC, 0.1% SDS)
BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)BMT Wa-A-2 (0.1x SSC)
BMT 블록킹 용액 (밀크카제인 5% 수용액)BMT blocking solution (5% aqueous solution of milk casein)
BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.1% SDS, 50% 글리세롤, 1x PBS)BMT hyb-mixA (4xSSC, 0.1% SDS, 50% Glycerol, 1x PBS)
BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)BMT Wa-B-1 (4xSSC, 0.1% SDS)
BMT Wa-B-2 (4xSSC)BMT Wa-B-2 (4xSSC)
본 발명은 전세계적으로 일반화되어 사용되고 있는 화학결합 또는 물리흡착방식에 의해 올리고DNA를 고정화하는 기존의 방식과는 완전히 차별화된 것으로, 연속된 구아닌염기를 다중분자인식이라는 분자인식 개념을 적용하여 비가역적으로 올 리고DNA를 고체기질 상에 고정화시키는 신규한 방법이다. The present invention is completely different from the conventional method of immobilizing oligo DNA by chemical bonding or physisorption method which is widely used worldwide, and it is irreversible by applying the molecular recognition concept of multi-molecule recognition to the continuous guanine base. And immobilize DNA on a solid substrate.
본 발명은 올리고DNA 칩 제조 시 올리고DNA를 고체기질에 고정화하기 위하여 기존의 화학결합방식에서 주로 사용되던 아민작용기가 부착된 고가의 올리고DNA와 알데히드 슬라이드 글라스 (알데히드 칩 기판)간의 화학반응을 통해 올리고DNA를 알데히드 칩 기판에 고정화시킬 때 나타나는 많은 문제점들을 해결함으로써, 누구나 손쉽게 올리고DNA 칩을 제조할 수 있는 신규한 방법이다. 고가의 작용기가 부착된 올리고DNA를 이용하여 제조하는 올리고DNA 칩들은 고정화 단계에서 재현성을 확보하기가 매우 어렵기 때문에, 연구개발 기간이 장기화되고 많은 바이오기업들이 연구개발단계에서 제품화 단계로 나아가지 못하는 원인이 되고 있다. 또한, 수 백 내지 수 천개의 올리고DNA 염기서열을 검증해서 최상의 교잡반응 결과를 가져오는 올리고DNA를 선택할 때 연구개발비의 부담으로 인해 제품개발을 포기하는 경우가 나타나고 있다.The present invention provides an oligonucleotide through the chemical reaction between an expensive oligo DNA attached to an amine functional group and an aldehyde slide glass (aldehyde chip substrate), which is mainly used in the conventional chemical bonding method, in order to immobilize the oligo DNA to a solid substrate when preparing the oligo DNA chip. By addressing many of the problems encountered when immobilizing DNA onto an aldehyde chip substrate, it is a novel method for anyone to easily manufacture oligo DNA chips. Oligo DNA chips manufactured using oligo DNAs with expensive functional groups are very difficult to secure reproducibility in the immobilization stage, which leads to a prolonged period of research and development, and many bio companies are unable to move from the R & D stage to the commercialization stage. It is the cause. In addition, when selecting oligo DNA that results in the best hybridization result by verifying the oligo DNA sequence of hundreds to thousands of cases, the product development is abandoned due to the burden of research and development cost.
본 발명은 도 3에서 설명된 것처럼 연속된 구아닌 염기가 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 (BMT 이민칩)에 다중 분자인식에 의해 고정화되기 때문에, 동일한 조건에서 고정화되는 올리고DNA의 밀도가 항상 균일하여 수 천 내지 수 만개의 올리고DNA 칩을 제조하더라도 매우 높은 재현성을 나타낸다. 또한, 도 3에서 연속된 구아닌 염기가 기질의 표면에 고정화 되어 생성되는 공간은 도 4에서 보여지는 교잡반응 시 기질의 표면까지 결합되어야 할 c-DNA가 고정화된 올리고DNA 사이를 쉽게 들어와서 교잡반응을 수행한다. 따라서, 밀집되게 올리고DNA가 고정화 되어있는 기존의 올리고DNA 칩에 비해 수 배 내지 수 십 배 속성으로 교잡반응을 진행할 수 있어서 속성 진단이 가능하다는 장점이 있다. 분자인식에 의해 고정화되는 올리고DNA는 용액상에서 BMT 이민칩에 다중분자인식으로 고정화 되기 때문에, 사용되는 올리고DNA의 농도를 기존의 1/3-1/10 수준으로 사용하여도 고밀도로 올리고DNA가 고정화된 올리고DNA 칩 제조가 가능하다. In the present invention, since the continuous guanine base is immobilized on the iminecalixarene derivative monolayer (BMT imine chip) by multiple molecular recognition as described in FIG. 3, the density of the oligo DNA immobilized under the same conditions is always uniform and thousands of times. Even the production of tens of thousands of oligo DNA chips shows very high reproducibility. In addition, the space generated by immobilizing the continuous guanine base on the surface of the substrate in FIG. 3 easily crosses the oligo-DNA immobilized c-DNA to be bound to the surface of the substrate during the hybridization reaction shown in FIG. Do this. Therefore, compared to the existing oligo DNA chip in which the oligo DNA is densely packed, the hybridization reaction can be performed several times to several tens of times, so that there is an advantage in that property diagnosis is possible. Since the oligo DNA immobilized by molecular recognition is immobilized by multi-molecule recognition on the BMT imine chip in solution, the oligo DNA is immobilized at a high density even when the concentration of oligo DNA used is 1 / 3-1 / 10. Oligo DNA chips can be prepared.
또한, 본 발명은 올리고DNA 고정화에 약 2-4 시간, 그리고 세척 및 건조하여 제조하므로 올리고DNA 칩 제조를 위한 제조공정의 단순화 및 신속화를 가능하게 한다. In addition, the present invention is prepared by washing and drying the oligo DNA immobilization for about 2-4 hours, and thus simplifying and speeding up the manufacturing process for preparing the oligo DNA chip.
특히, 도 4 및 도 6는 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층이 9 개의 염속된 구아닌 염기를 다중 분자인식하여 비가역적으로 고정화하며, 교잡반응을 통해 얻어진 형광분석 결과는 고정화된 올리고DNA의 양이 기존에 알려진 방식에 비해 최소 5 배에서 30 배 정도의 높은 올리고DNA 고정화 밀도를 나타내고 있음을 보여주고 있다. In particular, FIGS. 4 and 6 show that iminecalixarene derivative self-assembled monolayer irreversibly immobilizes 9 salts of guanine bases by multi-molecule recognition. It shows that the oligo DNA immobilization density is at least 5 to 30 times higher than the known method.
이와 같이, 본 발명은 기존의 올리고DNA 고정화에 의한 올리고DNA 칩 제조기술에 비해 신속하게 제조가 가능하며 높은 수준의 재현성을 바탕으로 한 연구개발비용의 절감, 그리고 제품제조 시에 기존의 1/3-1/5 수준으로 제품생산이 가능하도록 한 획기적인 신기술이다. 따라서, 추후 본 발명에 기초하여 다양한 DNA 칩 제조 등의 응용이 가능할 것이다. As described above, the present invention can be manufactured faster than the conventional oligo DNA chip manufacturing technology by immobilizing oligo DNA, and it is possible to reduce research and development costs based on high reproducibility and 1/3 of existing ones during product manufacturing. It is a breakthrough new technology that enables the production of products at -1/5 level. Therefore, in the future, it will be possible to apply various DNA chips and the like based on the present invention.
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