KR100745833B1 - Complex composition of cationic gold nanoparticles and dna for effective transfection - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물을 조성물 형성 시 복합체의 유전자가 양이온성 골드 나노입자와 결합하여 전기영동이 지연된 결과를 나타낸 결과이고, 1 is a result showing the result of the electrophoresis delayed by combining the gene of the complex with the cationic gold nanoparticles when the composition of the complex composition of the cationic gold nanoparticles and genes,
도 2는 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물의 결합 비율을 달리한 경우 형성된 복합체의 크기를 측정한 결과로 복합체 형성 시 양이온성 골드 나노입자의 양이 증가할수록 형성된 복합체의 크기가 증가한다는 것을 나타내는 결과이고,FIG. 2 shows that the size of the formed complex increases as the amount of the cationic gold nanoparticles increases when forming the complex as a result of measuring the size of the formed complex when the ratio of the combination of the cationic gold nanoparticle and the complex composition of the gene is different. It is a result that represents
도 3은 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물의 결합 비율을 달리한 경우 형성된 복합체가 근육세포주인 C2C12 세포내 유전자 전달 효율이 변화하는 것을 정량적으로 나타내는 결과이고,3 is a result quantitatively indicating that the complexes formed when the binding ratio of the complex composition of the cationic gold nanoparticles and the gene is changed in C2C12 intracellular gene transfer efficiency of the muscle cell line,
도 4는 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물이 근육세포주인 C2C12 세포에서 분자량 25,000 이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민)와 유전자의 복합체 조성물에 비하여 세포 내 유전자 전달 효율이 높다는 것을 정량적으로 나타내는 결과이고,4 is a result quantitatively showing that the complex composition of cationic gold nanoparticles and genes is higher in intracellular gene transfer efficiency compared to the complex composition of cationic polymers (polyethylenimine) and genes having a molecular weight of 25,000 or more in C2C12 cells which are muscle cell lines. ,
도 5는 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물을 전자현미경 (TEM)을 이용하여 관찰한 결과로서 A는 양이온성 골드 나노입자 (입자경 0.5 - 10 nm, 검은색 입자)를 나타내며, B는 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물 (붉은색은 유전자의 탄소를 나타내며, 검은색 입자들은 양이온성 골드 나노입자를 나타냄)을 촬영한 결과이고,5 is a result of observing the composite composition of the cationic gold nanoparticles and the gene using an electron microscope (TEM), where A represents cationic gold nanoparticles (particle diameter of 0.5-10 nm, black particles), and B represents a cation. Is the result of photographing a complex composition of sex gold nanoparticles and genes (red represents the carbon of the gene and black particles represent the cationic gold nanoparticles),
도 6은 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물이 분자량 2,000 이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민) 또는 분자량 25,000 이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민)와 유전자 복합체에 비하여 유전자의 발현을 증가시킨다는 것을 근육세포주인 C2C12 세포에서 유전자가 암호하고 있는 단백질의 발현량을 정량적으로 나타내는 결과이고,FIG. 6 shows that the complex composition of the cationic gold nanoparticles and the gene increases the expression of the gene compared to the cationic polymer (polyethyleneimine) having a molecular weight of 2,000 or more or the cationic polymer (polyethyleneimine) having a molecular weight of 25,000 or more. It is a result quantitatively expressing the amount of expression of the protein encoded by the gene in C2C12 cells,
도 7은 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물이 분자량 2000 이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민) 또는 분자량 25000 이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민)와의 유전자 복합체에 비하여 세포 독성이 작다는 것을 C2C12 세포에서 세포독성 실험을 수행한 결과이다.FIG. 7 shows that in C2C12 cells, the complex composition of the cationic gold nanoparticles and the gene is less cytotoxic compared to the gene complex with the cationic polymer (polyethyleneimine) having a molecular weight of 2000 or higher or the cationic polymer (polyethyleneimine) with a molecular weight of 25000 or higher. This is the result of toxicity experiment.
본 발명은 외래 유전자의 세포 내 발현 증강을 위한 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 평균 크기 0.5-10 nm의 양이온성 골드 나노입자와 목적하는 외래 유전자의 복합체를 다양한 세포에 처리하여 이로부터 목적하는 외래 유전자의 발현을 증진시키는 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a complex composition of cationic gold nanoparticles and genes for enhancing intracellular expression of foreign genes, and in detail, complexes of cationic gold nanoparticles having an average size of 0.5-10 nm and desired foreign genes are various. The present invention relates to a composition for treating cells to thereby enhance expression of a desired foreign gene.
양이온성 나노입자나 양이온성 고분자들은 구조적인 특징에 의한 양하전으로 유전자의 음이온성 하전과 결합하여 복합체를 형성하는 특징이 있어 유전자 전달체로서 연구되어 왔다. 이러한 합성 물질을 이용한 유전자 전달 방법은 렌티바이러스나 아데노 바이러스 등을 사용한 바이러스성 유전자 수송체에 비하여 제조방법이 간편하고, 전달하려는 유전자의 크기가 제한을 받지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질에 의한 반복투여시의 면역부작용이 적으며, 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되지 않으며, 제조 비용 및 시간에 있어서도 상업적으로 유리한 장점이 있다. 한편 양이온성 물질을 이용한 유전자 전달방법 중 양이온성 인지질 수송체의 경우 인지질 조성에 양하전의 지질을 일정 비율로 혼합하여 양이온성 리포솜 (cationic liposome)과 같은 나노 크기의 입자를 제조하고 이 입자를 유전자와 혼합하여 양하전 인지질 입자와 유전자의 복합체를 세포주들에 처리하여 유전자의 발현을 증강시키는 방법이 사용되어 왔다(미국특허 제5,858,784호). 양이온성 고분자의 경우 DEAE dextran, 라이신 아미노산이 반복되는 구조의 폴리라이신, 에틸렌이민이 반복되는 구조의 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (polyamidoamine) (미국특허 제6,020,457호) 등이 유전자의 수송체로 연구되어 왔다. 그러나 이들 양이온성 고분자를 이용한 수송체 경우에는 세포 표면의 수용체를 통하여 효과적으로 수송되는 바이러스성 수송체에 비하여 체내 세포 내로의 수송 효율이 낮다는 문제점이 지적되어 왔다. Cationic nanoparticles or cationic polymers have been studied as gene carriers because they have a characteristic of forming a complex by combining with the anionic charge of a gene by positive charges due to structural characteristics. Gene delivery methods using such synthetic materials are simpler to manufacture than viral gene transporters using lentiviruses or adenoviruses, and are not limited in size to the genes to be delivered, and are repeatedly administered by viral capsid proteins. Less immune side effects, no safety problems caused by genes owned by the virus itself, there is a commercially advantageous advantage in terms of manufacturing cost and time. In cationic phospholipid transport, cationic phospholipid transporter prepares nano-sized particles such as cationic liposomes by mixing positively charged lipids with phospholipid composition in a ratio. A method has been used to enhance expression of genes by mixing cell lines with complexes of positively charged phospholipid particles and genes (US Pat. No. 5,858,784). For cationic polymers, DEAE dextran, polylysine with repeating lysine amino acid, polyethyleneimine with repeating ethyleneimine, polyamidoamine (US Pat. No. 6,020,457) and the like have been studied as transporters of genes. . However, it has been pointed out that in the case of transporters using these cationic polymers, transport efficiency into cells in the body is lower than that in viral transporters that are effectively transported through receptors on the cell surface.
지금까지 당 분야에서 사용된 대부분의 양이온성 고분자들은 분자량이 20,000이상의 고분자들이 대부분으로서 양이온성 골드 나노입자를 대상으로 하여 유전자 발현 효율의 증가를 연구한 예는 다양한 세포주들을 대상으로 아직 보고된 바 없었다.Up to now, most cationic polymers used in the art have mostly molecular weights of 20,000 or more, and cationic gold nanoparticles have been studied to increase gene expression efficiency in various cell lines. .
이에 본 발명자들은 양이온성 고분자를 이용한 유전자 수송체들의 문제점들을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 입자경 0.5-10 나노미터 정도의 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체가 분자량 2,000 또는 25,000 이상의 양이온성 고분자들보다 근육세포주에서 유전자 전달 효율 및 유전자 발현량을 현저히 증가시킬 뿐만 아니라 세포 독성도 현저하게 감소시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to solve the problems of gene transporters using cationic polymers. As a result, the complex of cationic gold nanoparticles and genes having a particle diameter of about 0.5-10 nanometers is larger than those of cationic polymers having a molecular weight of 2,000 or 25,000 or more. The present invention has been completed by confirming that not only the gene transfer efficiency and gene expression amount in muscle cell lines are significantly increased, but also the cytotoxicity is significantly reduced.
본 발명의 목적은 세포들에서 독성을 감소시키고 세포 내로 목적하는 유전자의 수송 및 발현을 증강시킬 수 있는 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a complex composition of cationic gold nanoparticles and genes capable of reducing toxicity in cells and enhancing the transport and expression of the desired genes into cells.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양이온성 나노 골드입자(Positively charged nanogold)와 유전자의 복합체를 함유하는 동물세포 내 외래 유전자 전달용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for foreign gene delivery in animal cells containing a complex of positively charged nanogold (Positively charged nanogold) and the gene.
본 발명의 조성물은 상기 양이온성 나노 골드입자를 유전자의 전달체로 사용하여 다양한 동물 세포내에 목적하는 외래 유전자의 수송 및 발현 효율을 현저히 증강시킬 수 있다. 본 발명의 조성물에서 상기 복합체는 양이온성 나노 골드입자의 양하전과 유전자의 음이온성 하전에 의해 단순한 혼합(mix)에 의해 정전기 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다.The composition of the present invention can significantly enhance the transport and expression efficiency of the desired foreign genes in various animal cells by using the cationic nano gold particles as a gene carrier. In the composition of the present invention, the complex may form a complex through electrostatic bonding by a simple mix by positive charge of the cationic nano gold particles and anionic charge of the gene.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 양이온성 나노 골드입자는 종래 나노 골드입자의 표면을 양이온성 잔기로 처리된 어떤 양이온성 나노 골드입자도 사용될 수 있다. 예컨대, 나노골드 입자는 기본적으로 음전하 상태로 존재하나, 본 발명에 사용된 나노 골드 입자는 입자 표면에 라이신(lysine) 잔기를 부착하여 표면전하를 양이온성으로 변화시킨 형태를 사용하였습니다. 나노 골드 입자 당 평균 5-7개의 라이신 잔기가 존재합니다.In the composition of the present invention, the cationic nano gold particles may be used any cationic nano gold particles treated with a cationic residue on the surface of the conventional nano gold particles. For example, nano gold particles are basically in a negatively charged state, but the nano gold particles used in the present invention used lysine residues on the surface of the particles to change their surface charges to cationic. There are an average of 5-7 lysine residues per nano gold particle.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 양이온성 나노 골드 입자는 유전자의 결합과 동물세포로의 전달을 방해하지 않는 어떤 입자경도 가질 수 있으나, 바람직하게는 0.5-10 나노미터 크기의 입자경을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 사용된 나노 골드 입자와 유전자 결합 조성물이 동물세포의 세포막을 통과할 때 조성물의 체적이 증가하는 경우 세포막을 파괴하여 세포에 영향을 초래할 수 있으므로, 상기 수치범위의 나노 골드 입자를 사용하여 세포막의 파괴에 대한 영향을 최소화하였다.In the composition of the present invention, the cationic nano gold particles may have any particle size that does not interfere with gene binding and delivery to animal cells, but preferably has a particle size of 0.5-10 nanometers do. When the nano gold particles and the gene-binding composition used in the present invention pass through the cell membrane of an animal cell, when the volume of the composition increases, the cell membrane may be destroyed and the cells may be affected. The effect on the destruction of the cell membrane was minimized.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 양이온성 나노 골드입자의 몰수와 유전자(DNA) 몰수의 비율은 유전자가 나노골드입자와 충분한 복합체를 형성할 수 있는 어떤 비율로도 혼합될 수 있으나, 바람직하게는 300:1 ~ 5000:1로, 더욱 바람직하게는 1600:1 ~ 3200:1로 혼합되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 수치범위에서 유전자 전달효율을 현저히 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 세포 독성을 최소한으로 할 수 있다.In the composition of the present invention, the ratio of the number of moles of the cationic nano gold particles and the number of moles of the gene (DNA) may be mixed in any ratio that allows the gene to form a sufficient complex with the nano gold particles, but preferably 300 1: 1 to 5000: 1, and more preferably 1600: 1 to 3200: 1. In the above numerical range, not only can the gene transfer efficiency be significantly improved, but also the cytotoxicity can be minimized.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 유전자는 외래 유전자만으로 될 수도 있으나, 바람직하게는 상기 유전자가 재조합 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다. 이 경우 목적하는 외래 유전자를 동물세포내로 전달할 뿐만 아니라, 이를 발현시킬 수도 있다. 상기 재조합 발현벡터로는 동물세포에서 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 CMV 프로모터와 같은 프로모터를 갖는 어떤 시판중인 발현벡터도 사용할 수 있다. In the composition of the present invention, the gene may be only a foreign gene, but preferably, the gene is inserted into a recombinant expression vector. In this case, not only the desired foreign genes can be delivered into the animal cells, but also they can be expressed. As the recombinant expression vector, any commercial expression vector having a promoter such as a CMV promoter capable of expressing a foreign gene in an animal cell may be used.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 동물세포는 외래 유전자의 도입과 발현을 바라는 어떤 동물세포도 가능하나, 바람직하게는 근육세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 근육세포주인 C2C12 세포주를 사용하였다. In the composition of the present invention, the animal cells may be any animal cells that wish to introduce and express foreign genes, but are preferably muscle cells. In the embodiment of the present invention, a C2C12 cell line, which is a muscle cell line, was used.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 동물세포에 처리하는 것을 포함하는 동물세포내 외래 유전자의 전달방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for delivering a foreign gene in an animal cell, comprising treating the composition of the present invention with an animal cell.
본 발명의 전달방법은 구체적으로, 양이온성 골드 나노입자와 외래 유전자와 복합체를 제조하는 제 1단계; 상기에서 제조된 복합체를 적당한 세포에 처리하여 세포 내 유전자 발현을 증강시키는 2단계로 구성됨을 특징으로 한다.Specifically, the delivery method of the present invention includes a first step of preparing a complex with a cationic gold nanoparticle and a foreign gene; The complex prepared in the above is characterized in that it consists of two steps to enhance gene expression in cells by treating the cells.
상기 제 1단계의 양이온성 입자는 양이온성 골드 나노입자인 것을 특징으로 하며, 복합체 제조 시 양이온성 골드 나노입자의 몰수와 DNA의 몰수의 비율을 2400:1 이상으로 혼합하여 복합체 형성을 위해 실온에서 30분간 방치하는 것을 특징으로 하며, 상기 혼합비로 인해 본 발명의 복합체 조성물을 세포 내로 전달시 유전자 전달 효율을 극대화 시킬 수 있는 장점을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 제 2단계의 적절한 세포는 근육 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 사용된 조 성물은 양전하를 띄고 있으므로 세포막의 음전하와 인력이 작용하여 세포막에 부착되어 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포 내부로 유입될 수 있다.The cationic particles of the first step is characterized in that the cationic gold nanoparticles, when the composite is prepared by mixing the ratio of the number of moles of cationic gold nanoparticles and the number of DNA to more than 2400: 1 at room temperature to form a complex Characterized in that it is left for 30 minutes, and due to the mixing ratio has the advantage of maximizing the gene transfer efficiency when delivering the complex composition of the present invention into the cell, the appropriate cell of the second step is a muscle cell It is characterized by. Since the composition used in the present invention has a positive charge, the negative charge and the attraction force of the cell membrane may be attached to the cell membrane and introduced into the cell by endocytosis.
본 발명에서는 세포 내로 전달된 유전자의 양을 구체적으로 정량화하여 측정하기 위하여 외래 유전자를 특이적으로 인식하도록 고안된 프라이머 및 외래 유전자의 내부 표준폼 유전자를 사용하여 세포 내로 전달된 유전자를 경쟁적으로 증폭하는 정량성 중합효소 연쇄반응을 사용하였다. 또한 유전자의 발현을 정량적으로 평가하기 위하여 유전자의 단백질로의 발현량을 정량적으로 측정할 수 있는 효소결합면역흡수법(ELISA)을 사용하였다.In the present invention, to quantitatively competitively amplify genes delivered into cells using primers designed to specifically recognize foreign genes and internal standard form genes of foreign genes to specifically quantify and measure the amount of genes delivered into cells. Sex polymerase chain reaction was used. In addition, in order to quantitatively evaluate the expression of genes, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to quantitatively measure the expression level of genes into proteins.
본 발명에서 기술된 조성물, 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체는 다양한 세포들에서 유전자 전달 효율 및 유전자 발현량을 분자량 2,000 또는 25,000 (고분자량) 이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민)들보다 증가시킬 뿐만 아니라 세포 독성도 현저하게 감소시키는 바, 유전자 치료요법 등에 효과적으로 사용 가능할 것이다.The composition described in the present invention, a complex of cationic gold nanoparticles and genes, not only increases gene transfer efficiency and gene expression in various cells than cationic polymers (polyethyleneimines) with molecular weights of 2,000 or 25,000 (high molecular weight) or more. In addition, the cytotoxicity is also significantly reduced, and thus may be effectively used for gene therapy.
예를 들어, 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체를 함유하는 조성물을 제조하여 세포 내 발현을 증강시키는 방법은 하기와 같은 공정을 통하여 수행된다.For example, a method of preparing a composition containing a complex of a cationic gold nanoparticle and a gene to enhance intracellular expression is performed through the following process.
입자경 0.5-10 nm인 양이온성 골드 나노입자를 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 바람직하게는 사이토메갈로바이러스 (cytome-galovirus CMV) 프로모터 및 제한 효소 부위를 가지는 플라스미드 벡터와 400:1 이상 3200:1 이하로 혼합하여 실온에서 1 내지 120분, 바람직하게는 20 내지 30분간 방치하여 복합체를 형성시키며 이를 적절한 세포, 바람직하게는 근육 세포에 처리하여 0.5 내지 24시간, 바람직하게는 12내지 24시간 동안 배양한 후 정량성 중합효소 연쇄반응 및 효소결합면역흡수법(ELISA)을 통하여 각 세포에서의 유전자 전달 효율 및 발현량을 비교함으로써 본 발명의 복합체 조성물을 이용한 세포 내 외래 유전자 발현 증강정도를 평가하였다.Cationic gold nanoparticles having a particle diameter of 0.5-10 nm are recombinant expression vectors containing foreign genes, preferably plasmid vectors having a cytomegalovirus (CMV) promoter and restriction enzyme sites and at least 400: 1 and 3200: 1. The mixture is mixed at a temperature of 1 to 120 minutes, preferably 20 to 30 minutes, to form a complex, which is treated with appropriate cells, preferably muscle cells, and cultured for 0.5 to 24 hours, preferably 12 to 24 hours. Afterwards, the gene transfer efficiency and expression level of each cell were compared by quantitative polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예Example 1. One. 양이온성Cationic 골드 나노입자 및 Gold nanoparticles and 양이온성Cationic 고분자와 유전자의 복합체 제조 Manufacture of complexes of polymers and genes
1-1. 1-1. 입자경Particle diameter 0.5-10 0.5-10 nmnm 의 of 양이온성Cationic 골드 나노입자 용액 및 Gold nanoparticle solution and 양이온성Cationic 고분자 용액 제조 Polymer Solution Preparation
입자경 0.5-10 nm인 양이온성 골드 나노입자(Positively charged nanogold, PGN)을 (Nanoprobes, 미국)에서 구입하여 사용하였으며, 분자량 2,000 및 25,000인 양이온성 고분자 폴리에틴렌이민(PEI)을 (Sigma Aldrich, 미국)에서 구입하여 10-100 mM 용액을 제조하여 사용하였다. Cationic gold nanoparticles (PGN) having a particle size of 0.5-10 nm were purchased from (Nanoprobes, USA) and cationic polymer polyethyleneimine (PEI) having molecular weights of 2,000 and 25,000 was used (Sigma Aldrich, 10-100 mM solution was prepared and used.
1-2.외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 제조1-2.Recombinant Expression Vector Preparation Including a Foreign Gene
목적하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하기 위해 사이토메갈로바이러스 (cytome-galovirus CMV) 프로모터 및 제한 효소를 사용하여 제조하였다. 목적하는 외래 유전자의 예로서 쥐(Mus Musculus)의 인터류킨-2 유전자(mouse 유래, NCBI accession number NM_008366) 의 단편을 중합효소 연쇄반응으로 긴 단편 말단에 제한 효소 작용부위가 있도록 증폭하거나 클로닝 벡터에서 직접 제한효소를 처리하여 1차적으로 수득하였다. 상기 유전자 단편을 CMV 프로모터가 존재하는 발현용 벡터 pVAX-1 (Invitrogen사, USA)의 멀티클로닝 사이트 (multicloning site) 중의 동일한 제한 효소 부위(Nhe1 과 BamH1) 내로 삽입하여 재조합 발현 벡터의 제작을 완성하였다. 본 벡터의 제작 확인은 중합효소 연쇄반응시의 중합반응 산물의 크기 또는 제한 효소 처리시의 단편의 숫자 및 단편의 크기를 아가로즈 젤에 전기영동 하여 평가하였다. A cytomegalovirus CMV promoter and restriction enzymes were used to prepare a recombinant expression vector containing the desired foreign gene. As examples of foreign genes of interest, fragments of the murine interleukin-2 gene (mouse-derived, NCBI accession number NM_008366) can be amplified by polymerase chain reaction so as to have restriction enzyme sites at the ends of long fragments or directly in a cloning vector. Treatment with restriction enzymes yielded primarily. The gene fragment was inserted into the same restriction enzyme site (Nhe1 and BamH1) in the multicloning site of the expression vector pVAX-1 (Invitrogen, USA) in which the CMV promoter is present to complete the construction of the recombinant expression vector. . The production confirmation of the vector was evaluated by electrophoresis on the size of the polymerization product in the polymerase chain reaction or the number of fragments and the size of the fragments in the restriction enzyme treatment on the agarose gel.
1-3.외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 1-3.Recombinant expression vectors containing foreign genes 양이온성Cationic 고분자의 복합체 조성물 제조 Preparation of the composite composition of the polymer
외래 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터와 양이온성 골드 나노입자의 복합체 및 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민의 복합체 조성물을 제조하기 위해 양이온성 골드 나노입자 용액 및 폴리에틸렌이민 용액에 외래 유전자, 즉 상기 실시예 1-1에서 제조된 양이온성 골드 나노입자, 분자량 2,000 폴리에틸렌이민, 또는 분자량 25,000의 폴리에틸렌이민 용액에 각각 외래 유전자, 즉 상기 실시예 1-2에서 제조된 인터류킨-2 유전자를 일정 비율 (2:1~80:1)로 가하고 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치시켰다.In order to prepare a complex composition of a recombinant expression vector containing a foreign gene, a cationic gold nanoparticle and a cationic polymer polyethylenimine, a foreign gene, i.e., Example 1-1, was added to a cationic gold nanoparticle solution and a polyethyleneimine solution. The cationic gold nanoparticles prepared in the above, the molecular weight 2,000 polyethyleneimine, or polyethyleneimine solution of 25,000 molecular weight, respectively, the foreign gene, that is, the interleukin-2 gene prepared in Example 1-2, a certain ratio (2: 1 to 80: 1) was added, mixed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
1-4.외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 1-4.Recombinant Expression Vectors Containing Foreign Genes 양이온성Cationic 골드 나노입자의 복합체 조성물 측정 Complex composition measurement of gold nanoparticles
외래 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터와 양이온성 골드 나노입자의 복합체 조성물을 제조하기 위해 실시예 1-3에서 제조된 양이온성 골드 나노입자와 인터 류킨-2 유전자를 일정 비율(양이온성 골드 나노입자 몰수 대 인터류킨-2 유전자 몰수, 100 - 3200:1)로 가하고 혼합한 다음 37℃에서 30분간 방치시킨 후 아가로즈 젤에 전기영동하여 확인하였다. In order to prepare a complex composition of a recombinant expression vector containing a foreign gene and a cationic gold nanoparticle, the cationic gold nanoparticle and the interleukin-2 gene prepared in Examples 1-3 were used at a predetermined ratio (cation of cationic gold nanoparticles). Vs. interleukin-2 mole number, 100-3200: 1), mixed and left for 30 minutes at 37 ° C, followed by electrophoresis on agarose gel.
본 실험 수행결과, 도 1에서 보는 바와 같이 양이온성 골드 나노입자의 양이 증가할수록 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자 플라스미드의 복합체의 양이 증가하여 결합체를 형성하지 않은 인터류킨-2 유전자 플라스미드의 양이 감소하는 결과를 확인할 수 있었다. 도 1에서, lane 1부터 9까지의 골드 나노입자 대 유전자의 몰 비율은 각각 100:1, 200:1, 400:1, 800:1, 1200:1, 1600:1, 2000:1, 2400:1, 3200:1이다.As shown in FIG. 1, as the amount of the cationic gold nanoparticles increased, the amount of the complex of the cationic gold nanoparticles and the interleukin-2 gene plasmid increased, resulting in the formation of the conjugated interleukin-2 gene plasmid. The result was a decrease in the amount was confirmed. In FIG. 1, the molar ratios of gold nanoparticles to genes from
1-5.외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 1-5.Recombinant Expression Vectors Containing Foreign Genes 양이온성Cationic 골드 나노입자의 복합체 조성물 크기 측정 Complex composition size measurement of gold nanoparticles
외래 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터와 양이온성 골드 나노입자의 복합체 조성물을 제조하기 위해 실시예 1-3에서 제조된 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자를 일정 비율(양이온성 골드 나노입자 몰수 대 인터류킨-2 유전자 몰수, 400 - 3200:1)로 가하고 혼합한 다음 37℃에서 30분간 방치시킨 후 ELS-8000 제타 포텐시오미터를 사용하여 입자의 직경을 측정하였다.In order to prepare a composite composition of a recombinant expression vector containing a foreign gene and a cationic gold nanoparticle, the cationic gold nanoparticle and the interleukin-2 gene prepared in Examples 1-3 were used in a ratio (cationic gold nanoparticle mole ratio vs. cationic gold nanoparticle). Molecular weight of Interleukin-2, 400-3200: 1), mixed and left for 30 minutes at 37 ° C. was used to measure the diameter of the particles using an ELS-8000 Zeta Potentiometer.
본 실험 수행결과, 도 2에서 보는 바와 같이 양이온성 골드 나노입자의 양이 증가할수록 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자 플라스미드의 복합체의 크기가 증가하는 것으로 확인되었으며, 양이온성 골드 나노입자와 외래 유전자의 결합 비율이 2400:1인 경우에는 평균 직경이 350 나노미터에 해당되었다.As shown in FIG. 2, as the amount of the cationic gold nanoparticles increased, the size of the complex of the cationic gold nanoparticles and the interleukin-2 gene plasmid was increased. When the gene binding ratio was 2400: 1, the average diameter was 350 nanometers.
실시예Example 2. 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 2. a recombinant expression vector containing a foreign gene and 양이온성Cationic 골드 나노입자 복합체 및 Gold nanoparticle composites and 양이온성Cationic 고분자 복합체의 세포 내 유전자 전달 및 발현 Intracellular Gene Transfer and Expression of Polymer Complexes
외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 양이온성 골드 나노입자 복합체 및 양이온성 고분자 복합체의 세포 내 유전자 발현 및 전달 효율성을 보기 위하여 근육 세포주인 C2C12 세포를 사용하였다. C2C12 cells, which are muscle cell lines, were used to examine the expression and delivery efficiency of intracellular genes between recombinant expression vectors containing foreign genes, cationic gold nanoparticle complexes and cationic polymer complexes.
2-1. 2-1. 근육세포주에서의In muscle cell lines 유전자 전달 효율 Gene transfer efficiency
외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 양이온성 골드 나노입자 및 양이온성 고분자로 이루어진 복합체를 사용하여 세포 내로 전달된 외래 유전자의 세포 내 전달 효율성을 평가하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.In order to evaluate the intracellular delivery efficiency of the foreign gene transferred into the cell using a recombinant expression vector containing a foreign gene, a complex consisting of cationic gold nanoparticles and a cationic polymer, the experiment was performed as follows.
근육 세포주인 C2C12 세포는 DMEM (Dulbecco's modified eagles medium)에 우혈청이 10 % 첨가된 배지를 제조하여 배양하였다. C2C12 cells, a muscle cell line, were cultured by preparing a medium containing 10% of bovine serum in DMEM (Dulbecco's modified eagles medium).
C2C12 세포주에 입자경 0.5-10 nm인 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 2,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 25,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 그리고 유전자 자체를 각각 1 ㎍의 농도로 각각 가하고 4시간동안 배양한 다음 세포를 수세하고 DNA 졸 (DNAzol (인비트로젠 (Invitrogen), 미국))과 DNA 클린 엎 키트 (DNA clean up kit (프로메가 (Promega), 미국)를 사용하여 세포에서 유전자를 분리 정제한 다음 세포내로 전달된 유전자의 양을 인터류킨-2 유전자의 내부 표준폼을 첨가한 후 주합효소 연쇄반응으로 정량적으로 측정하였다. Complex composition of cationic gold nanoparticles with particle diameter of 0.5-10 nm and interleukin-2 gene in C2C12 cell line, complex composition of polyethyleneimine and interleukin-2 gene with molecular weight of 2,000, complex composition of polyethyleneimine and interleukin-2 gene with molecular weight of 25,000 And the genes themselves were added at a concentration of 1 μg each, incubated for 4 hours, and the cells were washed with DNA sol (DNAzol (Invitrogen, USA)) and DNA clean up kit (Pro). Genes were isolated and purified from cells using Promega, USA) and the amount of genes delivered into cells was quantitatively determined by adding the internal standard form of interleukin-2 gene followed by synthase chain reaction.
중합효소 연쇄반응은 먼저 10 pmol의 센스 (sense) 및 안티센스 프라이머 (antisense primer)를 각각 0.48 ㎕씩, 탭 폴리머라아제 (Taq polymerase) (5 U/㎕, 바이오니아 (Bioneer)) 0.072 ㎕, dNTP (각 dNTP 2.5 mM, 바이오니아 (Bioneer)), 10× 반응 완충액 (reaction buffer)로 전체 반응 용량 약 6.24 ㎕로 한 혼합액과 유전자가 일부 소실된 인터류킨 유사체 표준품 플라스미드 (mIL-2 mimic), 목적 (target)이 되는 DNA를 넣어서 수행하였다. 센스 프라이머 (5'→3')는 ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-GAG-ACC-C, 안티센스 프라이머 (3'→5')는CAA-CTA-GAA-GGC-ACA-GTC-GAG-G이며, 중합효소 연쇄반응 조건은 95 ℃에서 40초, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초의 반응을 33 회 (cycle) 반복 시행함으로써 증폭을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응 생성물은 1.5 %의 아가로스 겔 (agarose gel)에서 전기영동 하였으며 겔 분석 기기 (Gel Doc Video Gel Documentation System)를 사용하여 이미지를 저장하고 바이오 아이디 소프트웨어 (Bio ID software)로 겔 밀도의 측정 및 정량화 분석을 수행하였다.Polymerase chain reaction First, 0.48 μl of 10 pmol sense and antisense primer, respectively, 0.072 μl of Taq polymerase (5 U / μl, Bioneer), dNTP (2.5 dNTP each, Bioneer), a mixture containing 10.6 μl of reaction buffer with a total reaction volume of about 6.24 μl, and an interleukin analog standard plasmid (mIL-2 mimic) that has partially lost genes, and a target DNA. Was performed. Sense primer (5 '→ 3') is ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-GAG-ACC-C, antisense primer (3 '→ 5') is CAA-CTA-GAA-GGC-ACA-GTC-GAG- G, the polymerase chain reaction conditions were amplified by repeating 33 cycles of 40 seconds at 95 ℃, 30 seconds at 56 ℃, 30 seconds at 72 ℃ (cycle). The polymerase chain reaction product was electrophoresed on 1.5% agarose gel, and images were stored using the Gel Doc Video Gel Documentation System and the gel density was determined using Bio ID software. Measurement and quantification analysis was performed.
본 실험 수행 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체는 복합체의 조성 비율 (양이온성 골드 나노입자 몰수 대 인터류킨-2 유전자 몰수)이 2400:1 인 경우에 가장 증가된 양의 유전자를 C2C12 세포로 수송하는 것을 확인할 수 있었으며, 복합체 조성 비율이 3200:1 인 경우에는 2400:1에 비해 유전자 수송 능력이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 3, the complexes of the cationic gold nanoparticles and the genes were most increased when the composition ratio of the complexes (moles of cationic gold nanoparticles to moles of interleukin-2 gene) was 2400: 1. It was confirmed that the transport of the positive gene to the C2C12 cells, when the complex composition ratio of 3200: 1 was confirmed that the gene transport capacity is reduced compared to 2400: 1.
또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 양이온성 골드 나노입자와 유전자의 복합체는 복합체의 조성 비율이 2400:1인 경우에 분자량 25,000의 양이온성 고분자 (폴리 에틸린이민)와 유전자의 복합체의 조성에 비해 10배 정도 증가된 유전자 전달 효율을 보여주었다.In addition, as shown in Figure 4, the complex of the cationic gold nanoparticles and the gene is compared to the composition of the complex of the cationic polymer (polyethylenimine) and the gene having a molecular weight of 25,000 when the composition ratio of the complex is 2400: 1 It showed a 10-fold increase in gene delivery efficiency.
2-2. 2-2. 근육세포주에서의In muscle cell lines 유전자 발현 효율 Gene expression efficiency
외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터와 양이온성 골드 나노입자 및 양이온성 고분자로 이루어진 복합체를 사용하여 세포 내로 전달된 외래 유전자의 세포 내 전달 효율성을 평가하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.In order to evaluate the intracellular delivery efficiency of the foreign gene transferred into the cell using a recombinant expression vector containing a foreign gene, a complex consisting of cationic gold nanoparticles and a cationic polymer, the experiment was performed as follows.
실시예 2-1에서 기재된 바와 같이, C2C12 세포를 배양하였으며, C2C12 세포주에 입자경 0.5-10 nm인 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 2,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 25,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 그리고 유전자 자체를 각각 1 ㎍의 농도로 각각 가하고 4시간동안 배양한 다음 세포를 수세하고 새로운 우혈청 첨가 DMEM 배지에서 20시간 동안 추가로 배양한 후 각각의 복합체 조성이 도입된 세포주의 배양 상등액을 회수하여 효소결합면역흡수법(ELISA) 쥐 인터류킨-2 키트 (mIL-2 ELISA kit, Pierce Endigen, 미국)를 이용해 C2C12 세포주에 삽입된 인터류킨-2 유전자의 단백질 발현량을 확인하였다.As described in Example 2-1, C2C12 cells were cultured, and the complex composition of the cationic gold nanoparticles having a particle diameter of 0.5-10 nm and the interleukin-2 gene in the C2C12 cell line, and the polyethyleneimine and interleukin-2 genes having a molecular weight of 2,000 The complex composition, the complex composition of the polyethylenimine and interleukin-2 genes having a molecular weight of 25,000, and the genes themselves were each added at a concentration of 1 μg, incubated for 4 hours, washed with cells and added for 20 hours in fresh bovine serum-added DMEM medium. Culture supernatants of the cell lines to which the respective complex compositions were introduced were collected and inserted into C2C12 cell lines using the enzyme-linked immunosorbent (ELISA) mouse interleukin-2 kit (mIL-2 ELISA kit, Pierce Endigen, USA). The protein expression level of the interleukin-2 gene was confirmed.
도 6에서 보는 바와 같이, 양이온성 골드 나노입자와 유전자 복합체 조성물을 사용한 세포주에서의 인터류킨-2의 발현량이 유전자 자체 조성 및 분자량 2,000인 폴리에틸렌이민과 유전자의 복합체 조성, 분자량 25,000인 폴리에틸렌이민과 유전자의 복합체 조성에 비해 각각 40배 이상, 3배 이상, 2배 이상 높은 인터류킨-2의 발현량을 보여주었다.As shown in Figure 6, the expression level of interleukin-2 in the cell line using the cationic gold nanoparticles and gene complex composition of the polyimide and gene complex composition of polyethylenimine and the molecular weight of 25,000, polyethyleneimine and gene of 25,000 The expression level of interleukin-2 was 40 times higher, 3 times higher, and 2 times higher than the complex composition, respectively.
실시예Example 3. 3. 근육세포주에서의In muscle cell lines 세포 독성 평가 Cytotoxicity Assessment
외래 유전자의 세포 내 발현 및 전달 효율성을 향상시키기 위하여 사용된 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 양이온성 골드 나노입자로 이루어진 복합체의 세포 독성에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.In order to evaluate the cytotoxicity of the complex consisting of a cationic gold nanoparticles and a recombinant expression vector containing a foreign gene used to improve the intracellular expression and delivery efficiency of the foreign gene experiment was carried out as follows. .
C2C12 근육세포주에 입자경 0.5-10 nm인 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 2,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 25,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 그리고 유전자 자체 조성을 제조하고 세포 독성을 평가하였다.Complex composition of cationic gold nanoparticles with particle diameter of 0.5-10 nm and interleukin-2 gene in C2C12 muscle cell line, complex composition of polyethyleneimine and interleukin-2 gene with molecular weight of 2,000, complex of polyethyleneimine and interleukin-2 gene with molecular weight of 25,000 The composition, and the gene itself composition, were prepared and cytotoxicity was evaluated.
독성 평가 방법으로는 MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-di -phenyl tetrazolium bromide) 방법을 사용하였다. 세포를 1× 104 cells/well이 되도록 분주 (seeding)하고 12시간 배양한 후 양이온성 골드 나노입자와 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 2,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 분자량 25,000인 폴리에틸렌이민과 인터류킨-2 유전자의 복합체 조성, 그리고 유전자 자체 조성을 제조하고첨가하였다. 복합체를 처리하고 24시간 경과 후 각각 MTT 용액을 배지의 10 %가 되도록 가하고, 4시간 더 배양 한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader)를 이용하여 590 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 양이온성 고분자와 유 전자의 복합체를 처리하지 않은 세포가 사용되었으며 세포의 생존률 (Cell viability)은 하기와 같은 식으로 계산되었다.MTT (3- (4,5-dimethylthiazole-2-yl) -2,5-di-phenyl tetrazolium bromide) was used for the toxicity evaluation. Cells were seeded to 1 × 10 4 cells / well and cultured for 12 hours, followed by complex composition of cationic gold nanoparticles and interleukin-2 gene, complex composition of polyethyleneimine and interleukin-2 gene with molecular weight of 2,000, and molecular weight The complex composition of 25,000 polyethylenimine and interleukin-2 gene and the gene itself were prepared and added. After 24 hours of treatment, each MTT solution was added to 10% of the medium, incubated for 4 hours more, the supernatant was removed, and 0.04 N isopropanol solution was added, followed by using an ELISA reader. The absorbance was measured at 590 nm. As a control group, cells which were not treated with a cationic polymer and a gene complex were used, and cell viability was calculated as follows.
[수학식][Equation]
세포의 생존률 (%) = (실험군의 OD /대조군의 OD)× 100Cell survival rate (%) = (OD of control group / OD of control group) × 100
본 실험 수행 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 양이온성 나노 골드입자와 유전자 복합체 조성물은 분자량 2,000 및 25,000인 폴리에틸렌이민을 사용한 복합체 조성물에 비해 세포 독성이 상당히 감소하는 것으로 나타남을 확인할 수 있었다. As a result of the experiment, as shown in Figure 7, the cationic nano gold particles and the gene complex composition was confirmed that the cytotoxicity was significantly reduced compared to the composite composition using polyethyleneimine having a molecular weight of 2,000 and 25,000.
상술한 바와 같이, 본 발명의 양이온성 나노 골드입자(입자경 0.5-10 nm)와 유전자 복합체 조성물은 근육세포주에서 유전자 전달 효율 및 유전자 발현량을 분자량 2,000 및 25,000이상의 양이온성 고분자(폴리에틸렌이민)들 보다 탁월하게 증가 시킬 뿐만 아니라 세포 독성도 현저히 감소시킴으로써 다양한 세포들을 대상으로 목적하는 유전자를 효과적으로 세포 내로 수송하고 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the cationic nano gold particles (particle diameter 0.5-10 nm) of the present invention and the gene complex composition have higher gene transfer efficiency and gene expression in muscle cell lines than those of cationic polymers (polyethyleneimines) having molecular weights of 2,000 and 25,000 or more. Not only does it increase remarkably, but also significantly reduces cytotoxicity, it can be usefully used to efficiently transport and express genes of interest to various cells.
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US5858784A (en) | 1991-12-17 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery |
| US6020457A (en) | 1996-09-30 | 2000-02-01 | Dendritech Inc. | Disulfide-containing dendritic polymers |
| JP2005287507A (en) | 2004-03-10 | 2005-10-20 | Japan Science & Technology Agency | Cationic gold nanoparticle, polyethylene glycol-modified cationic gold nanoparticle and complex thereof with nucleic acid |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5858784A (en) | 1991-12-17 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery |
| US6020457A (en) | 1996-09-30 | 2000-02-01 | Dendritech Inc. | Disulfide-containing dendritic polymers |
| JP2005287507A (en) | 2004-03-10 | 2005-10-20 | Japan Science & Technology Agency | Cationic gold nanoparticle, polyethylene glycol-modified cationic gold nanoparticle and complex thereof with nucleic acid |
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