KR100738496B1 - Antibody protein separation method using magnetic micro beads and oriented immobilizing ligand - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 리간드 항체(anti-IgG)가 비배향성으로 고정화된 자성 미세입자를 이용한 IgG의 분리 공정도.1 is a separation process of IgG using magnetic microparticles in which a ligand antibody (anti-IgG) is immobilized in a non-oriented manner.
도 2는 리간드 항체의 산화과정 및 산화된 항체 리간드를 자성미세입자 표면의 아민기와 반응시켜 배향성 고정화 시키는 모식도.Figure 2 is a schematic diagram of the orientation of the ligand antibody and the oxidized antibody ligand reacts with the amine groups on the surface of the magnetic microparticles to fix the orientation.
도 3은 anti-IgG가 고정화된 자성입자와 이상 혼합물(IgG 및 인슐린)을 반응시키고, 원심분리 후, 상층액을 SDS-PAGE(20% 아크릴아마이드 겔)한 분석사진[레인1: 이상 혼합물(0.6mg/mL IgG 및 0.6mg/mL 인슐린), 레인2: anti-IgG를 비배향성 고정화(아민 커플링), 레인3: anti-IgG를 배향성 고정화(산화된 탄수화물), 레인4: 비오틴-스트렙타비딘 고정화]. FIG. 3 is an analytical photograph of a magnetic mixture immobilized with anti-IgG and an abnormal mixture (IgG and insulin), and centrifuged, followed by SDS-PAGE (20% acrylamide gel). 0.6 mg / mL IgG and 0.6 mg / mL insulin), lane 2: non-oriented immobilization of anti-IgG (amine coupling), lane 3: orientation-immobilized immobilization (oxidized carbohydrate) of anti-IgG, lane 4: biotin-strep Tabidine immobilization].
도 4는 고정화된 리간드 항체(anti-IgG)와 반응하는 단백질(IgG)의 양을 나타낸 그래프(●: 비배향성 고정화된 리간드 항체 이용, ○: 배향성 고정화된 리간드 항체 이용).4 is a graph showing the amount of protein (IgG) reacting with immobilized ligand antibody (anti-IgG) (●: using non-oriented immobilized ligand antibody, ○: using oriented immobilized ligand antibody).
본 발명은 항체 단백질 분리방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 자성 미세입자 및 배향성 고정화 리간드를 이용한 항체 단백질 분리방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating antibody proteins, and more particularly, to a method for separating antibody proteins using magnetic microparticles and an orientationally immobilized ligand.
생물분리공정을 단순화시키기 위한 자기분리 기술은 고체 입자를 포함한 여러 가지 생물 물질들이 섞인 현탁액 또는 점성용액에서, 온화한 조건으로 목적 물질을 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 스케일 업 가능성(scalability), 효율성, 단순성, 자동화의 용이성, 비용의 저렴함 등의 장점이 있어, 단백질, 펩타이드, 효소의 고정화, 생물분리기술, 면역분석(immunoassay), 약물 표적 전달, 바이오 센서 등에 폭넓게 사용되고 있다. Magnetic separation techniques to simplify the bioseparation process not only allow the separation of target substances under mild conditions, but also in suspensions or viscous solutions containing various biological substances, including solid particles, as well as scalability, efficiency and simplicity. It has advantages such as ease of automation, low cost, and is widely used for immobilizing proteins, peptides, enzymes, bioseparation technology, immunoassays, drug target delivery, and biosensors.
통상적인 자성입자를 이용한 생물 소재의 선택적 분리공정은 다음과 같다. (1)목적 물질과의 결합력이 강한 리간드 물질을 자성입자 표면에 고정화 시킨다. (2)혼합 용액 상에서 리간드 물질이 목적 물질만을 인식하여 결합할 수 있도록 반응시킨다. (3)자력을 이용하여 혼합용액 상에서 자성입자만을 분리한다. (4)분리된 자성입자의 표면에 고정화된 리간드로부터 목적 물질을 탈착시킨다. 여기서, 리간드는 목적 물질만을 특이적(specific)으로 분리하기 위한 것으로서, 목적 물질과 특이적으로 반응할 수 있는 물질을 사용한다. The selective separation of biological materials using conventional magnetic particles is as follows. (1) Immobilize the ligand material with strong binding force to the target material on the magnetic particle surface. (2) The ligand substance reacts on the mixed solution so that only the target substance can be recognized and bound. (3) Only magnetic particles are separated on the mixed solution using magnetic force. (4) The target substance is desorbed from the ligand immobilized on the surface of the separated magnetic particles. Herein, the ligand is used to isolate only a target substance in a specific manner, and a substance that can specifically react with the target substance is used.
도 1은 리간드 항체가 비배향성으로 고정화된 자성 미세입자(magnetic particles)를 이용한 IgG의 분리 공정도로서, 목적 물질인 IgG를 분리하기 위하여, IgG와 특이적으로 결합하는 anti-IgG를 리간드로 사용하며, 아민을 이용한 통상적인 고정화 방법을 이용한다. 리간드 물질인 anti-IgG가 자성입자표면에 방향성없이 고정화되는 경우, 항원결합부위와 IgG의 결합력이 감소되는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 항체를 배향성 고정화 시키는 방법이 개발되었다. 배향성 고정화는 항체의 활성 부위와 인접하지 않은 부위를 고정화에 이용하는 방법이다. 예를 들면, 고정영역(Fc)에 위치한 당 단백질의 탄수화물 부분을 이용하여 고정화시킬 수 있다. 항체의 경우, 항체의 H-사슬(Heavy chain)에는 적어도 하나 이상의 N-linked 탄수화물을 가지고 있으며, 예를 들면, IgG의 경우, CH2 도메인(domain)의 Asn 297 지역에 하나의 N-글리코실레이션(glycosylation) 부분을 가지고 있다. 통상적인 배향성 고정화 방법에서는 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 이용한다. 스트렙타비딘(streptavidin)은 세균인 스트렙토마이세스 아비디니(streptomyces avidinii)의 배양액에서 추출된 물질로서, 아비딘(avidin)과 유사한 특성을 갖는 물질이다. 아비딘은 계란 흰자위에 존재하는 당단백질로서, 저분자 비타민인 비오틴(biotin) 4개와 결합할 수 있는 입체구조를 갖고 있다. 비오틴(vitamin-H)의 아민기는 항체의 고정영역(Fc)에 위치한 탄수화물 부분을 산화시켜 부착시킬 수 있으므로, 미세 자성입자에 흡착된 스트렙타비딘과 항체에 부착된 비오틴이 결합되어, 결과적으로 자성 미세입자에 항체를 배향성 고정화시킬 수 있다. 하지만, 스트렙타비딘 및 비오틴은 비교적 고가의 시료 이기 때문에, 이들을 사용하지 않으면서, 리간드를 미세 자성입자에 배향성 고정화 시킬 수 있는 방법이 요구된다.1 is a flow chart of IgG separation using magnetic particles in which a ligand antibody is immobilized in a non-orientated manner. In order to separate IgG as a target substance, anti-IgG that specifically binds to IgG is used as a ligand. The conventional immobilization method using amine is used. When the anti-IgG ligand is immobilized on the surface of the magnetic particle without any orientation, there is a problem in that the binding force between the antigen-binding site and IgG is reduced. To overcome this problem, a method of orientationally immobilizing antibodies has been developed. Orientational immobilization is a method of using an immobilization site that is not adjacent to an active site of an antibody. For example, it may be immobilized using a carbohydrate portion of the sugar protein located in the fixed region (Fc). For antibodies, the antibody has at least one N-linked carbohydrate in its heavy chain, for example IgG, one N-glycosyl in the Asn 297 region of the CH 2 domain. It has a glycosylation part. Conventional orientational immobilization methods employ streptavidin-biotin binding. Streptavidin is a substance extracted from a culture solution of the bacterium streptomyces avidinii , and has similar properties to avidin. Avidin is a glycoprotein found in egg whites and has a conformation that can bind to four low-molecular vitamins, biotin. Since the amine group of biotin (H) can oxidize and attach a carbohydrate moiety located in the fixed region (Fc) of the antibody, streptavidin adsorbed on the fine magnetic particles and biotin attached to the antibody are consequently magnetic. Orientational immobilization of antibodies to the microparticles can be achieved. However, since streptavidin and biotin are relatively expensive samples, there is a need for a method of orientationally immobilizing ligands on fine magnetic particles without using them.
따라서, 본 발명의 목적은 간단하고 효율적으로 항체 단백질을 정제할 수 있는 단백질 분리방법을 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a protein separation method capable of purifying antibody proteins simply and efficiently.
본 발명의 다른 목적은 경제적으로 항체 단백질을 정제할 수 있는 단백질 분리방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a protein separation method which can economically purify antibody proteins.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자성 미세입자 표면의 아민기와 리간드 항체의 탄수화물 부분을 산화시켜 얻은 알데히드를 반응시켜, 상기 자성 미세입자의 표면에 리간드 항체를 공유결합으로 배향성 고정화 시키는 공정; 상기 리간드 항체가 표면에 배향성 고정화된 자성 미세입자와 목적 단백질 및 불순물을 포함하는 현탁용액을 반응시켜, 상기 리간드 항체와 목적 단백질을 선택적으로 결합시키는 공정; 상기 자성 미세입자 표면에 고정화된 리간드 항체와 특이적으로 결합한 목적 단백질을 자력을 이용하여 분리하는 공정; 및 상기 리간드 항체와 특이적으로 결합한 목적 단백질에 리간드 항체의 활성감소를 최소화시키는 탈착버퍼를 처리하여, 목적 단백질을 탈착시키는 공정을 포함하는 항체 단백질 분리방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is a step of reacting the amine obtained by oxidizing the carbohydrate moiety of the ligand antibody and the amine group on the surface of the magnetic microparticles, the alignment of the ligand antibody on the surface of the magnetic microparticles by covalent bond; Selectively binding the ligand antibody to the target protein by reacting the ligand antibody with a magnetically-immobilized magnetic microparticle on a surface thereof and a suspension solution containing the target protein and impurities; Separating the target protein specifically bound to the ligand antibody immobilized on the magnetic microparticle surface by using magnetic force; And it provides an antibody protein separation method comprising the step of desorbing the target protein by processing a desorption buffer to minimize the activity of the ligand antibody to the target protein specifically bound to the ligand antibody.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명에 따라 단백질을 분리하기 위하여, 자성 미세입자 표면의 아민기와 리간드 항체의 탄수화물 부분을 산화시켜 얻은 알데히드기를 반응시켜, 상기 자성 미세입자의 표면에 리간드 항체를 배향성 고정화 시킨다. 여기에서 상기 리간드 항체를 상기 자성 미세입자에 배향성 고정화시키는 공정은, 표면에 카르복실기를 도입한 자성 미세입자를 아디픽산 디하이드라지드와 반응시켜 아민기로 개질시키는 단계; 상기 리간드 항체의 고정영역(Fc) C-말단부위에 인접한 탄수화물 부위를 산화시켜 알데히드기로 변화시키는 단계; 및 상기 탄수화물 부위가 산화된 리간드 항체 및 표면이 아민기로 개질된 자성입자를 공유결합 시키는 단계를 포함한다.In order to separate the protein according to the present invention, the amine group obtained by oxidizing the amine group on the surface of the magnetic microparticle and the carbohydrate portion of the ligand antibody is reacted to orientally immobilize the ligand antibody on the surface of the magnetic microparticle. The process of orientationally immobilizing the ligand antibody on the magnetic microparticles may include: reacting the magnetic microparticles having a carboxyl group introduced thereon with adipic acid dihydrazide to modify the amine group; Oxidizing the carbohydrate moiety adjacent to the C-terminal part of the immobilized region (Fc) of the ligand antibody to convert it to an aldehyde group; And covalently binding a ligand antibody oxidized with the carbohydrate moiety and a magnetic particle whose surface is modified with an amine group.
상기 리간드 항체는 고정영역(Fc)에 올리고사카라이드기를 함유한 것으로, Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM 등을 예시할 수 있고, 상기 목적 단백질은 IgG, IgA, IgM 등을 예시할 수 있으며, 상기 자성 미세입자는 지름이 100nm 내지 20㎛, 바람직하게는 2.8㎛인 것을 사용할 수 있다.The ligand antibody contains an oligosaccharide group in the immobilized region (Fc), and may exemplify Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM, etc., and the target protein may exemplify IgG, IgA, IgM, and the like. The magnetic fine particles may have a diameter of 100 nm to 20 μm, preferably 2.8 μm.
상기 리간드 항체의 고정영역(Fc)의 C-말단(terminus)에 인접한 탄수화물 부위의 산화는 리간드 항체에 산화제를 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 산화제로는 소듐 m-페리오데이트(sodium m-periodate)를 사용하는 것이 바람직하다. Oxidation of the carbohydrate moiety adjacent to the C-terminus of the immobilized region (Fc) of the ligand antibody can be carried out by reacting an oxidant with the ligand antibody. As the oxidizing agent, it is preferable to use sodium m-periodate.
상기 탄수화물 부위가 산화된 리간드 항체 및 표면이 아민기로 개질된 자성입자를 공유결합 시키는 단계는 상기 탄수화물 부위가 산화된 리간드 항체 및 표면이 아민기로 개질된 자성입자를 상온에서 교반시키거나, 소듐시아노보로하이드라이 드(NaBH3CN) 등의 환원제를 더욱 첨가한 후, 교반시킬 수 있다. 상기 환원제는 쉬프 염기(Schiff base)를 안정화시켜, 반응시간을 단축시킬 수 있다. The step of covalently binding the ligand antibody oxidized carbohydrate moiety and the magnetic particles whose surface is modified with an amine group is stirred at room temperature or the magnetic particles modified the carbohydrate moiety ligand and the surface modified amine groups, or sodium cyanobo After further adding a reducing agent such as low hydride (NaBH 3 CN), the mixture may be stirred. The reducing agent stabilizes the Schiff base, thereby reducing the reaction time.
또한, 상기 배향성 고정화 공정은 pH 7.0 내지 9.0에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 리간드 항체의 배향성 고정화 공정이 상기 pH를 벗어날 경우, 고정화 반응이 발생하지 않거나, 리간드 항체가 변성될 우려가 있다.In addition, the orientation fixing process is preferably performed at pH 7.0 to 9.0. If the alignment immobilization process of the ligand antibody is out of the pH, the immobilization reaction may not occur or the ligand antibody may be denatured.
상기 자성 미세입자의 표면에 리간드 항체가 배향성 고정화되면, 이를 목적 단백질 및 불순물을 포함하는 현탁용액과 반응시켜, 상기 리간드 항체와 목적 단백질을 결합시키는 공정을 수행한다. 상기 리간드 항체와 목적 단백질을 결합시키는 공정은 pH 7.5 내지 9.5 에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 공정이 pH 7.5 이하에서 수행될 경우, 리간드 항체가 아닌 자성 미세입자의 표면에 비특이적으로 타 단백질들이 결합되는 문제점이 있고, pH 9.5 이상에서 수행될 경우, 목적 단백질 또는 리간드 항체가 변성될 우려가 있다. When the ligand antibody is oriented immobilized on the surface of the magnetic microparticles, the ligand antibody is reacted with a suspension solution containing the target protein and impurities, thereby binding the ligand antibody and the target protein. The process of binding the ligand antibody and the target protein is preferably performed at pH 7.5 to 9.5. When the process is carried out at pH 7.5 or less, there is a problem that other proteins are non-specifically bound to the surface of the magnetic microparticles other than the ligand antibody, when the pH or more than 9.5, there is a concern that the target protein or ligand antibody is denatured have.
본 발명에 따른 리간드 항체의 탄수화물 부분을 산화시켜서 자성 미세입자의 표면에 고정화시키는 방법은, 리간드 항체의 아민 부위를 이용한 통상적인 비배향성고정화 방법과 비교해 볼 때, 리간드 항체가 비교적 방향성 있게 고정화되기 때문에, 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 활성부위인 항원결합영역(Fab)을 외부 방향으로 노출시킬 수 있다. 또한, 상기 리간드 항체의 고정영역(Fc) 부분에 위치한 탄수화물 부위는 일종의 스페이서 암(spacer arm)으로 작용하여, 자성 미세입자의 표면으로부터 일정한 거리를 만들어 주기 때문에, 목적 단백질의 접근을 보다 용이하게 할 수 있으며, 단백질의 안정화에도 효과적이다. 따라서 본 발명에 따른 상기 배향성 고정화 방법은 리간드 항체와 목적 단백질의 결합력을 약 1.6배 향상 시킬 수 있을 뿐만 아니라, 여러 종류의 불순물이 존재하는 용액으로부터 목적 단백질만을 선택적으로 분리하는데 효과적이다. Since the carbohydrate moiety of the ligand antibody according to the present invention is oxidized and immobilized on the surface of the magnetic microparticles, the ligand antibody is immobilized relatively directionally as compared with the conventional non-oriented immobilization method using the amine moiety of the ligand antibody. In addition, the antigen-binding region (Fab), which is an active site that specifically binds to a target protein, may be exposed to the outside direction. In addition, the carbohydrate moiety located in the fixed region (Fc) of the ligand antibody acts as a kind of spacer arm to make a constant distance from the surface of the magnetic microparticles, thereby making it easier to access the target protein. It is also effective in stabilizing proteins. Therefore, the alignment immobilization method according to the present invention can not only improve the binding force between the ligand antibody and the target protein by about 1.6 times, but also is effective for selectively separating only the target protein from the solution in which various kinds of impurities are present.
본 발명에서는 목적 단백질인 IgG를 선택적으로 분리하기 위하여 자성입자에 리간드 항체(anti-IgG)를 고정화시키고, 고정화 과정에서 일반적으로 사용되는 아민을 이용한 비배향성 고정화 방법과 탄수화물 부분을 이용한 배향성 고정화 방법을 이용하여, 각각의 경우 IgG와의 결합능력을 비교하였다. 또한, 표면 플라즈몬 공명 바이오센서(Surface plasmon resonance; SPR biosensor)를 이용하여, 고정화 방법에 따른 결합력 차이를 확인하였으며, 리간드 항체(anti-IgG)를 고정화시킨 자성입자를 사용하여 IgG만을 선택적으로 분리할 수 있는 조건을 찾았으며, 자성입자를 이용하여 분리공정의 단계를 줄일 수 있는 가능성에 대하여 확인하였다.In the present invention, a ligand antibody (anti-IgG) is immobilized on a magnetic particle in order to selectively separate IgG, a target protein, and a non-oriented immobilization method using an amine generally used in the immobilization process and an orientation immobilization method using a carbohydrate moiety. In each case, the binding ability with IgG was compared. In addition, the surface plasmon resonance (SPR biosensor) was used to confirm the difference in binding strength according to the immobilization method, and only IgG could be selectively separated using magnetic particles immobilized with a ligand antibody (anti-IgG). The conditions were found and the possibility of using magnetic particles to reduce the steps of the separation process was identified.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 하기 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited by the following Examples.
하기의 실시예에 사용된 자성 미세입자는 CM-MP(carboxyl modified magnetic particle)로서, Seradyn, Inc.(Indianapolis, USA)에서 구입하였고, 모델물질로 사용한 mouse IgG 폴리크로날(polyclonal) 항체, 마우스(mouse) IgG 및 BSA(Bovine serum albumin)는 Sigma-Aldrich(St. Lois, USA)사에서 구입하였으며, 단백정량을 위한 브래드포드 염색약(Bradford dye) 및 SDS-PAGE 시약은 Bio-Rad(Hercules, USA)사에서 구입하였다. 그리고 스트렙타비딘(streptavidin) 및 비오틴(biotin)은 Pierce(Rockford, USA)사에서 구입하였으며, 이 두 가지 모두 하이드라지드(hydrazide)기를 가지고 있다. 끝으로, 인간 인슐린은 종근당 바이오(주)에서 공급 받았다.The magnetic microparticles used in the following examples were CM-MP (carboxyl modified magnetic particles), purchased from Seradyn, Inc. (Indianapolis, USA), and used as a model mouse mouse polyclonal antibody, mouse. (mouse) IgG and Bovine serum albumin (BSA) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Lois, USA), and Bradford dye and SDS-PAGE reagents for protein quantification were Bio-Rad (Hercules, USA). Streptavidin and biotin were purchased from Pierce (Rockford, USA), both of which have hydrazide groups. Finally, human insulin was supplied by Chong Kun Dang Bio Co., Ltd.
[실시예 1] anti-IgG의 고정화 Example 1 Immobilization of anti-IgG
가. anti-IgG의 아민 부위를 이용한 비배향성 고정화(아민 커플링 반응) end. Non-oriented immobilization using amine moiety of anti-IgG (amine coupling reaction)
표면에 카르복실기를 갖는 자성입자 1mg을 50mM MES(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 6.1) 버퍼로 3번 세척한 후, 50mg/mL의 NHS(N-hydroxysuccinimide) 230mL 및 10mg/mL EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylamino -propyl) carbodiimide) 230mL의 혼합액과 30분간 반응시켜, 표면기를 NHS로 활성화시켰다. 다음으로, 1mg/mL의 anti-IgG를 10mM 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 4.5) 버퍼를 이용하여 농도가 100㎍/mL이 되도록 희석한 후, 1mL을 취하여, 자성입자가 들어있는 마이크로 튜브에 넣고, 교반시키면서 상온에서 반응시켰다. After washing 1 mg of magnetic particles having carboxyl groups on the surface three times with 50 mM MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 6.1) buffer, 230 mg of 50 mg / mL NHS (N-hydroxysuccinimide) and 10 mg / mL EDC ( After reacting for 30 minutes with a mixed solution of 230 mL of 1-ethyl-3- (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide), the surface group was activated with NHS. Next, dilute 1 mg / mL anti-IgG to a concentration of 100 μg / mL using 10 mM sodium acetate (pH 4.5) buffer, take 1 mL, and place it in a microtube containing magnetic particles. It was made to react at normal temperature, stirring.
나. anti-IgG의 탄수화물 부위를 이용한 배향성 고정화 I. Orientation Immobilization Using Carbohydrate Sites of anti-IgG
표면에 카르복실기를 갖는 자성입자 1mg을 0.1M MES(pH 4.8) 버퍼로 3번 세척하고, 마이크로 튜브에 넣은 후, 0.1M MES(pH 4.8)에 0.5M 아디픽산 디하이드라 지드(adipic acid dihydrazide)를 교반하여 얻은 반응액 1mL을 첨가하였다. 다음으로 마이크로 튜브에 EDC 3mg을 첨가하고, 3시간 동안 교반으로 반응시킨 후, 3차 증류수, 1M NaCl, 3차 증류수 순으로 세척하였다. 또한, anti-IgG의 탄수화물 부분을 산화시키기 위하여, 0.1M sodium phosphate(pH 7.0) 버퍼 1mL에 anti-IgG 1mg을 용해시킨 후, 소듐 메타-페리오데이트(sodium m-periodate) 10mg을 첨가하여, 30분간 상온에서 반응시켰다. 도 2는 리간드 항체의 산화과정 및 산화된 항체 리간드를 자성미세입자 표면의 아민기와 반응시켜 배향성 고정화 시키는 모식도이다. 반응이 완료된 후, 탈염 컬럼(desalting column, Sephadex G-25)을 이용하여 남아있는 소듐 메타-페리오데이트와 산화된 anti-IgG를 분리하였다. 최종적으로 0.1M 소듐 포스페이트(sodium phosphate, pH 7.0) 버퍼를 이용하여 자성입자를 세척한 후, 세척된 자성입자 1mg 및 산화된 anti-IgG 50㎍을 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응물을 0.1M 소듐 포스페이트(pH 7.0) 버퍼, 3차 증류수, 1M NaCl, 3차 증류수 순으로 세척하였다.1 mg of magnetic particles having a carboxyl group on the surface was washed three times with 0.1 M MES (pH 4.8) buffer, placed in a micro tube, and then 0.5 M adipic acid dihydrazide in 0.1 M MES (pH 4.8). 1 mL of the reaction solution obtained by stirring was added. Next, 3 mg of EDC was added to the microtube, and the reaction was stirred for 3 hours, followed by washing with tertiary distilled water, 1M NaCl, and tertiary distilled water. In addition, in order to oxidize the carbohydrate portion of anti-IgG, 1 mg of anti-IgG was dissolved in 1 mL of 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0) buffer, and then 10 mg of sodium m-periodate was added, The reaction was carried out at room temperature for minutes. Figure 2 is a schematic diagram of the orientation of the ligand antibody oxidized and the oxidized antibody ligand reacts with the amine groups on the surface of the magnetic microparticles. After the reaction was completed, the remaining sodium meta-periodate and oxidized anti-IgG were separated using a desalting column (Sephadex G-25). Finally, the magnetic particles were washed with 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0) buffer, and then 1 mg of washed magnetic particles and 50 µg of oxidized anti-IgG were stirred at room temperature for 24 hours. After the reaction was completed, the reaction was washed with 0.1M sodium phosphate (pH 7.0) buffer, tertiary distilled water, 1M NaCl, tertiary distilled water.
다. 비오틴-스트렙타디딘을 이용한 anti-IgG의 고정화 All. Immobilization of anti-IgG with Biotin-Streptadine
표면에 카르복실기를 갖는 자성입자 1mg을 50mM MES(pH 6.1) 버퍼로 3번 세척한 후, 2mg/mL의 스트렙타비딘 하이드라지드(streptavidin hydrazide) 용액 200㎕ 및 EDC 10mg과 하루 동안 반응시켰다. 또한, anti-IgG의 탄수화물 부분을 산화시키기 위하여, 0.1M 소듐 포스페이트(pH 7.0) 버퍼 1mL에 anti-IgG 1mg을 용해시킨 후, 소듐 메타-페리오데이트(sodium m-periodate) 10mg을 첨가하여, 30분간 상 온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 탈염 컬럼(desalting column, Sephadex G-25)을 이용하여 남아있는 소듐 메타-페리오데이트와 산화된 anti-IgG를 분리하였다. 다음으로, 1mg/mL의 산화된 anti-IgG 및 1mg/mL의 비오틴 하이드라지드(biotin hydrazide) 용액을 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응을 멈추기 위하여 0.01M 소듐 포스페이트(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 4℃에서 하루 동안 투석시켰다. 최종적으로 스트렙타비딘이 결합된 자성입자 1mg 및 비오틴이 결합된 100mg/mL anti-IgG 1mL을 상온에서 하루 동안 교반하였다. 1 mg of magnetic particles having a carboxyl group on the surface was washed three times with 50 mM MES (pH 6.1) buffer, and then reacted with 200 µl of 2 mg / mL of streptavidin hydrazide solution and 10 mg of EDC for 1 day. In addition, in order to oxidize the carbohydrate portion of anti-IgG, 1 mg of anti-IgG was dissolved in 1 mL of 0.1 M sodium phosphate (pH 7.0) buffer, and then 10 mg of sodium m-periodate was added, The reaction was performed at room temperature for a minute. After the reaction was completed, the remaining sodium meta-periodate and oxidized anti-IgG were separated using a desalting column (Sephadex G-25). Next, 1 mg / mL oxidized anti-IgG and 1 mg / mL biotin hydrazide solution were reacted at room temperature for 1 hour. Dialysis was performed at 4 ° C. for one day using 0.01 M sodium phosphate (pH 7.4) buffer to stop the reaction. Finally, 1 mg of streptavidin-bound magnetic particles and 1 mg of biotin-bound 100 mg / mL anti-IgG were stirred at room temperature for one day.
[실시예 2] 고정화된 anti-IgG 및 IgG의 결합반응 Example 2 Binding Reaction of Immobilized Anti-IgG and IgG
가. 고정화된 anti-IgG 및 IgG의 결합 친화도 측정 end. Binding affinity measurement of immobilized anti-IgG and IgG
(1)anti-IgG의 아민 부위가 비배향성 고정화된 자성입자(실시예 1의 가), (2)anti-IgG의 산화된 탄수화물 부위가 배향성 고정화된 자성입자(실시예 1의 나) 및 (3)비오틴-스트렙타비딘을 이용하여 anti-IgG이 고정화된 자성입자(실시예 1의 다) 1mg 각각에 최종농도가 100㎍/mL이 되도록 IgG을 용해시킨 50mM 소듐 바이카보네이트(pH 9.5) 버퍼 1mL을 1시간동안 교반하며 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 원심분리를 실시하고, 상등액에 잔존하는 IgG의 양을 분석함으로써, 흡착된 IgG의 양 및 고정화된 anti-IgG과 IgG의 결합 친화도를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다(하기 표 1의 데이터는 3회 반복실험의 결과이다.).(1) the magnetic particles in which the amine moiety of anti-IgG is non-oriented immobilized (A of Example 1), (2) the magnetic particles in which the oxidized carbohydrate moiety of the anti-IgG is orientated immobilized (B of Example 1) and ( 3) 50 mM sodium bicarbonate (pH 9.5) buffer in which IgG was dissolved in 1 mg of anti-IgG-immobilized magnetic particles (C in Example 1) using biotin-streptavidin to give a final concentration of 100 µg / mL. 1 mL was reacted with stirring for 1 hour. After the reaction was completed, centrifugation was performed and the amount of IgG remaining in the supernatant was analyzed, and the amount of adsorbed IgG and binding affinity between immobilized anti-IgG and IgG were measured and shown in Table 1 below. The data in Table 1 is the result of three replicates.).
이론적으로 하나의 항체(anti-IgG)에 반응할 수 있는 항원(IgG)의 수는 2개인데, 상기 표 2로부터 알 수 있듯이 비배향성 고정화 방법을 이용하는 경우, 항체 하나에 대하여 반응할 수 있는 항원의 수는 약 0.9개이고, 항체의 탄수화물 부분을 이용하여 배향성 고정화를 시킨 경우에는 약 1.5개로 항원과의 결합력이 약 1.6배 향상되는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 비배향성 고정화 방법의 경우, 항체 내에 존재하는 라이신의 ε-아민이 고정화에 이용되는데, 라이신기는 항체에 다량으로 존재하기 때문에 자성 미세입자에 다중 결합으로 고정화되는 것은 피할 수 없고, 또한 고정화 후 항체의 비배향성에 의해 리간드 항체 항체의 결합력이 감소하게 된다는 연구 결과와 일치하였다(Wimalasena, R. L. and Wilson G. S., "Factor Affecting the Specific Activity of Immobilized Antibodies and Their Biological Active Fragments," J. Chromatogra., 572, 85-102(1991)). Theoretically, the number of antigens (IgGs) that can respond to one antibody (anti-IgG) is two. As can be seen from Table 2 above, when the non-oriented immobilization method is used, the antigens that can react to one antibody The number of is about 0.9, and when the orientation immobilization using the carbohydrate portion of the antibody is performed, it can be seen that the binding force to the antigen is about 1.6 times improved to about 1.5. The results indicate that in the non-oriented immobilization method, the ε-amine of lysine present in the antibody is used for immobilization, and since lysine groups are present in the antibody in a large amount, immobilization by multiple bonds to magnetic microparticles is inevitable, and Consistent with the findings that the non-orientation of antibodies after immobilization resulted in decreased binding of the ligand antibody antibody (Wimalasena, RL and Wilson GS, "Factor Affecting the Specific Activity of Immobilized Antibodies and Their Biological Active Fragments," J. Chromatogra. , 572, 85-102 (1991).
또한, 비오틴-스트렙타비딘을 이용하여 배향성 고정화시키는 방법은 항체 하나에 대하여 반응할 수 있는 항원의 수가 1.4개로써, 항체의 탄수화물 부분을 이용하여 배향성 고정화를 시킨 경우와 유사한 결과를 나타내었다.In addition, the method of orientation immobilization using biotin-streptavidin showed a result similar to that of orientation immobilization using a carbohydrate portion of the antibody, with 1.4 antigens that can react to one antibody.
나. 이상 혼합물(binary mixture)에서의 선택적 결합 I. Selective binding in binary mixture
(1)anti-IgG의 아민 부위가 비배향성 고정화된 자성입자(실시예 1의 가), (2)anti-IgG의 산화된 탄수화물 부위가 배향성 고정화된 자성입자(실시예 1의 나) 및 (3)비오틴-스트렙타비딘을 이용하여 anti-IgG이 고정화된 자성입자(실시예 1의 다) 1mg을 IgG와 인슐린이 각각 60㎍이 용해되어 있는 50mM 소듐 바이카보네이트(pH 9.5) 버퍼 1ml에 넣고, 1시간동안 교반하며 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 원심분리를 실시하고, 상등액에 잔존하는 IgG 및 인슐린을 비변성(non-denaturing) SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 이때, 20％ 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)을 사용하였으며, 겔은 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie brilliant blue) 염색하였다. SDS-PAGE 이미지 정량분석을 위하여 덴시토미터(densitometer, Total Lab, Durham, USA)를 이용하였다. 또한, 자성입자를 동일한 버퍼로 세척한 후, 자성입자의 표면에 고정화된 anti-IgG의 양과 이와 반응한 IgG의 양 및 결합친화도를 하기 표 2에 나타내었다(하기 표 2의 데이터는 3회 반복실험의 결과이다.).(1) the magnetic particles in which the amine moiety of anti-IgG is non-oriented immobilized (A of Example 1), (2) the magnetic particles in which the oxidized carbohydrate moiety of the anti-IgG is orientated immobilized (B of Example 1) and ( 3) Using biotin-streptavidin, 1 mg of anti-IgG-immobilized magnetic particles (C in Example 1) was added to 1 ml of 50 mM sodium bicarbonate (pH 9.5) buffer containing 60 µg of IgG and insulin. The reaction was stirred for 1 hour. After the reaction was completed, centrifugation was performed, and IgG and insulin remaining in the supernatant were analyzed using non-denaturing SDS-PAGE. At this time, 20% acrylamide gel was used, and the gel was stained with Coomassie brilliant blue. A densitometer (Densitometer, Total Lab, Durham, USA) was used for quantitative analysis of SDS-PAGE images. In addition, after washing the magnetic particles with the same buffer, the amount of anti-IgG immobilized on the surface of the magnetic particles, the amount of IgG reacted with them and the binding affinity are shown in Table 2 below (the data in Table 2 is three times) Results of replicates).
상기 표 2로부터, (1)anti-IgG가 비배향성 고정화된 자성입자는 전체 IgG 의 약 29.6％만이 IgG가 결합하였고, (2)배향성 고정화된 자성입자 및 (3)비오틴-스트렙타비딘을 이용하여 고정화된 자성입자의 경우에는 각각 94.2％, 96.8％의 IgG가 결합한 것을 알 수 있다. 또한, 고정화된 anti-IgG에 흡착된 IgG의 비율을 확인해 보면, (2)배향성 고정화된 자성입자 및 (3)비오틴-스트렙타비딘을 이용하여 고정화된 자성입자의 경우 하나의 항체(anti-IgG)에 약 1.7개의 항원(IgG)이 결합되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 상기 표 1의 결과와 유사함을 알 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 단백질 분리방법은 불순물인 인슐린이 존재함에도 불구하고, 특이적인 결합력이 유지되는 것으로 미루어 볼 때, 여러 불순물이 존재하는 용액에서 목적 단백질을 선택적으로 결합 분리해내는데 유용할 것으로 기대된다. 또한, 상기의 결과는 단백질의 배향성 고정화가 비배향성 고정화보다 항원결합영역(Fab)의 접근성이 향상됨으로 인하여 높은 활성을 보여준다는 기존의 연구결과와 일치하는 것을 알 수 있다(Turkova, J., "Orient Immobilization of Biologically Active Proteins as a Tool for Revealing Protein Interactions and Function," J.Chromatogra. B, 722, 11-31(1999)).From Table 2, (1) the anti-IgG non-orientated immobilized magnetic particles, only about 29.6% of the total IgG is bound to IgG, (2) the orientation-immobilized magnetic particles and (3) biotin- streptavidin using In the case of the immobilized magnetic particles, it can be seen that 94.2% and 96.8% of IgG bound, respectively. In addition, the ratio of IgG adsorbed to the immobilized anti-IgG, (2) the orientation-immobilized magnetic particles and (3) one antibody (anti-IgG in the case of the magnetic particles immobilized using biotin-streptavidin It can be seen that about 1.7 antigens (IgG) are bound to). These results can be seen that the results are similar to the results of Table 1, and accordingly, the protein separation method according to the present invention, despite the presence of insulin, an impurity, in view of the specific binding force is maintained, several impurities are present It is expected to be useful for selectively binding and separating target proteins from solution. In addition, the above results are consistent with previous studies showing that the orientational immobilization of proteins shows higher activity due to the improved accessibility of the antigen-binding region (Fab) than the non-oriented immobilization (Turkova, J., " Orient Immobilization of Biologically Active Proteins as a Tool for Revealing Protein Interactions and Function, "J. Chromatogra. B, 722, 11-31 (1999)).
도 3은 anti-IgG가 고정화된 자성입자(1, 2, 3)와 이상 혼합물(IgG 및 인슐린)을 반응시키고, 원심분리 후, 상층액을 SDS-PAGE(20% 아크릴아마이드 겔)한 분석사진[레인1: 이상 혼합물(0.6mg/mL IgG 및 0.6mg/mL 인슐린), 레인2: anti-IgG를 비배향성 고정화(아민 커플링), 레인3: anti-IgG를 배향성 고정화(산화된 탄수화물), 레인4: 비오틴-스트렙타비딘 고정화]이다. 불순물로 넣어 준 인슐린의 양은 반응 전후에 거의 차이가 없는 것으로 보아, 고정화된 anti-IgG는 IgG와 선택적으로 결합한다는 것을 확인하였다. 특히 레인 3과 4를 레인 2와 비교시 배향성 고정화된 anti-IgG에 의해 IgG가 훨씬 효율적으로 결합됨을 알 수 있다. 레인 3(산화된 탄수화물)과 레인 4(비오틴-스트렙타비딘 고정화)는 거의 비슷한 결합력을 보였다. 따라서 탄수화물 부위를 산화시킨 배향성 고정화 방법이 고가의 비오틴-스트렙타비딘 고정화 방법보다 더욱 간편하고 경제적임을 알 수 있다. Figure 3 is an analysis of the reaction mixture (IgG and insulin) and the magnetic particles (1, 2, 3) immobilized anti-IgG, centrifuged, supernatant SDS-PAGE (20% acrylamide gel) [Lane 1: abnormal mixture (0.6 mg / mL IgG and 0.6 mg / mL insulin), lane 2: non-oriented immobilization of anti-IgG (amine coupling), lane 3: orientation-immobilization of anti-IgG (oxidized carbohydrate) Lane 4: biotin-streptavidin immobilization]. The amount of insulin added as an impurity showed little difference before and after the reaction, indicating that the immobilized anti-IgG selectively binds to IgG. In particular, when comparing
[실시예 3] 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용한 anti-IgG 및 IgG의 결합력 분석 Example 3 Analysis of Avidity of Anti-IgG and IgG Using Surface Plasmon Resonance (SPR)
가. 표면 플라즈몬 공명(SPR)를 이용한 anti-IgG의 비배향성 고정화 end. Non-Oriented Immobilization of anti-IgG Using Surface Plasmon Resonance (SPR)
카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 층으로 도포되어 있으며, 4개의 플로우 셀(flow cell)이 있는 CM5 칩을 표면 플라즈몬 공명 바이오센서(SPR biosensor)(Biacore 3000 시스템, Biacore AB사, Uppsala, Sweden)에 장착한 후, 음전하를 띄고 있는 덱스트란 층에 anti-IgG를 효율적으로 고정시키기 위하여, 양전하를 지닌 10mM 소듐 아세테이트 커플링 버퍼(sodium acetate coupling buffer)를 흘려주어 정전기력을 유도하였다. CM5 칩의 카르복실기와 anti-IgG 표면의 아민기의 공유결합을 촉진시키기 위하여, 0.2M EDC(N-ethyl-N'-dimethylaminopropyl carbodiimide) 및 0.05M NHS(N-hydroxysuccinimide)를 7분 동안 CM5 칩에 흘려주어, 반응성이 좋은 NHS 에스테르(ester)기로 활성화시켰다. 10mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 anti-IgG를 첨가하여 최종농도 20㎍/mL를 맞춘 후, 활성화된 플로우 셀 2(fc 2) 위로 5㎕/min의 유속으로 흘려주어 anti-IgG를 칩에 고정화시켰다. anti-IgG가 결합하지 않은 칩의 NHS 에스테르를 1M 에탄올아민을 7분 동안 흘려주어 블로킹(blocking) 시켰다. A CM5 chip with four flow cells, coated with a layer of carboxymethyl dextran, was placed on a surface plasmon resonance biosensor (Biacore 3000 system, Biacore AB, Uppsala, Sweden). After mounting, in order to efficiently fix the anti-IgG to the negatively charged dextran layer, 10mM sodium acetate coupling buffer with a positive charge was flowed to induce electrostatic force. To promote covalent bonding of the carboxyl group of the CM5 chip with the amine group on the anti-IgG surface, 0.2M N-ethyl-N'-dimethylaminopropyl carbodiimide (EDC) and 0.05M NHS (N-hydroxysuccinimide) were added to the CM5 chip for 7 minutes. Spilling was activated to activate the reactive NHS ester group. Anti-IgG was added to 10 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) to adjust the final concentration to 20 μg / mL, followed by flowing anti-IgG onto the chip at a flow rate of 5 μl / min over activated flow cell 2 (fc 2). Immobilized. The NHS ester of the chip to which anti-IgG was not bound was blocked by flowing 1M ethanolamine for 7 minutes.
CM5 칩에 anti-IgG가 1,076 RU(Resonance Unit)(약 428nM)으로 비배향성 고정화되었음을 확인하였다.It was confirmed that anti-IgG immobilized in CM5 chip at 1,076 RU (Resonance Unit) (about 428 nM).
나. 표면 플라즈몬 공명(SPR)를 이용한 anti-IgG의 배향성 고정화 I. Orientation Immobilization of anti-IgG Using Surface Plasmon Resonance (SPR)
CM5 칩의 카르복실기를 0.2M EDC 및 0.05M NHS를 5㎕/min의 유속으로 3분 동안 흘려주어 NHS 에스테르기로 활성화시킨 후, 아민기로 수식하기 위하여 5mM 아디픽산 디하이드라지드(adipic acid hydrizide)를 5㎕/min으로 7분간 흘려주었다. 다음으로, 아민기로 바뀌지 않은 NHS 에스테르기를 1M 에탄올아민으로 5㎕/min의 유속으로 7분간 흘려주어 블로킹(blocking)시켰다. 다음으로 "실시예 1의 나"와 동일한 방법으로 anti-IgG의 탄수화물 부분을 알데히드기로 산화시킨 후, 10mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 3.5)에 첨가하여 최종농도 20㎍/mL를 맞춘 후, 활성화된 플로우셀 4(fc 4)에 5㎕/min의 유속으로 흘려주어 anti-IgG를 칩에 고정화시켰다. Anti-IgG를 칩에 고정화시킨 후, 결합물(Schiff base)을 안정화시키기 위하여 0.1M 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)를 2㎕/min의 유속으로 20분간 흘려주었다.The carboxyl group of the CM5 chip was flowed at 0.2 M EDC and 0.05 M NHS at a flow rate of 5 μl / min for 3 minutes to activate the NHS ester group, and then 5 mM adipic acid hydrizide was modified to modify the amine group. It was flowed at 5 μl / min for 7 minutes. Next, the NHS ester group, which was not changed to an amine group, was blocked with 1M ethanolamine for 7 minutes at a flow rate of 5 µl / min for blocking. Next, the carbohydrate portion of anti-IgG was oxidized with an aldehyde group in the same manner as in "b of Example 1", and then added to 10 mM sodium acetate buffer (pH 3.5) to adjust the final concentration to 20 µg / mL, followed by an activated flow. Anti-IgG was immobilized on the chip by flowing the cell 4 (fc 4) at a flow rate of 5 μl / min. After immobilizing the Anti-IgG on the chip, 0.1M sodium cyanoborohydride was flowed for 20 minutes at a flow rate of 2 μl / min to stabilize the conjugate base.
CM5 칩에 anti-IgG가 1,047 RU(Resonance Unit)(약 418nM)으로 배향성 고정화되었음을 확인하였다.It was confirmed that anti-IgG was orientally immobilized to 1,047 RU (Resonance Unit) (about 418 nM) on the CM5 chip.
다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)를 이용한 anti-IgG의 고정화 농도에 따른 결합력 비교 All. Comparison of Adhesion According to Immobilization Concentration of Anti-IgG Using Surface Plasmon Resonance (SPR)
10.8mg/mL IgG를 최종농도가 321.3, 160.7, 80.3, 40.2, 20.1, 10.0, 5.0, 2.5㎍/mL이 되도록 0.01M PBS(pH 7.2)에 녹인 후, 30㎕/min의 유속으로 anti-IgG가 고정된 동일한 CM5 칩의 플로우 셀(fc) 1에서부터 4까지 흘려주었다. 각 실험은 2분 결합구간(association time), 3분 해리구간(dissociation time)을 주어 5번 반복 실험하였다. 시료마다 다음 시료를 주입하기 위해 250mM NaCl+12.5mM NaOH를 2분간 30㎕/min으로 흘려주어 재생(regeneration)하였다.10.8 mg / mL IgG was dissolved in 0.01 M PBS pH 7.2 to a final concentration of 321.3, 160.7, 80.3, 40.2, 20.1, 10.0, 5.0, 2.5 μg / mL, and then anti-IgG at a flow rate of 30 μl / min. Was flowed from flow cells (fc) 1 to 4 of the same CM5 chip. Each experiment was repeated 5 times with 2 minutes association time and 3 minutes dissociation time. Each sample was regenerated by flowing 250 mM NaCl + 12.5 mM NaOH at 30 μl / min for 2 minutes to inject the next sample.
도 4는 고정화된 리간드 항체(anti-IgG)와 반응하는 단백질(IgG)의 양을 나타낸 그래프이다. 도 4로부터, 배향성 고정화(산화된 탄수화물)된 anti-IgG의 경우 비배향성 고정화된 anti-IgG보다 약 6배 정도 높게 반응할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과는 항체(anti-IgG)의 탄수화물 부위가 산화되어 칩에 배향성 있게 결합됨으로써, 항원(IgG) 반응 부위가 바깥으로 많이 노출되기 때문인 것으로 사료된다. 또한, 고정화된 anti-IgG와 반응한 IgG의 몰비를 구해 보면, 비배향성의 경우 anti-IgG 한 분자 당 0.04분자의 IgG와 반응하는 반면, 배향성의 경우 0.27분자의 IgG와 반응하는 것을 알 수 있다. 따라서, 배향성 고정화된 anti-IgG의 경우 비배향성 고정화된 anti-IgG보다 더 높은 결합 친화력을 갖는다는 사실을 알 수 있다.4 is a graph showing the amount of protein (IgG) that reacts with immobilized ligand antibody (anti-IgG). From Figure 4, it can be seen that the orientation-immobilized (oxidized carbohydrate) anti-IgG can react about 6 times higher than the non-oriented immobilized anti-IgG. This result is thought to be because the carbohydrate moiety of the antibody (anti-IgG) is oxidized and oriented in the chip, thereby exposing much of the antigen (IgG) reaction site to the outside. In addition, the molar ratio of IgG reacted with immobilized anti-IgG shows that it reacts with 0.04 molecules of IgG per molecule of anti-IgG in the case of non-orientation, and 0.27 molecules of IgG in orientation. . Thus, it can be seen that oriented immobilized anti-IgG has a higher binding affinity than non-oriented immobilized anti-IgG.
[실시예 4] IgG 탈착을 위한 버퍼 선정 Example 4 Buffer Selection for IgG Desorption
상기 표 1의 (2)와 같이 배향성 고정화된 anti-IgG에 의해 결합된 IgG를 함유한 1mg의 자성미세입자에 하기 표 3의 탈착 버퍼를 각각 1mL 넣은 후, 2분 동안 반응시키고 원심분리 하였다. 원심분리된 용액의 상층액을 취하여 탈착된 IgG 양을 확인하고, 측정하였다.To 1 mg of magnetic microparticles containing IgG bound by the orientation-immobilized anti-IgG as shown in Table 1 (2), 1 mL of the desorption buffer shown in Table 3 below, respectively, was reacted for 2 minutes and centrifuged. The supernatant of the centrifuged solution was taken to confirm the amount of desorbed IgG and measured.
상기 표 3으로부터, 100mM 글리신(glycine, pH 2.0) 및 100mM 글리신(glycine, pH 2.3) + 1％ DMSO 버퍼는 각각 77.1% 및 86％의 높은 탈착율을 나타냄을 알 수 있다. 글리신(glycine)만을 사용하는 경우보다 DMSO를 혼합하여 사용할 경우 탈착율이 증가하는데, 이는 아세토니트릴 또는 DMSO와 같은 유기물질들이 탈착효율을 높여준다는 보고와 일치하였다(Kandimalla, V. B., Neeta, N. S., Karanth, N. G., Thakur, M. S., Roshini, K. R., Rani, B. E. A., Pasha, A. and Karanth, N. G. K., "Regeneration of Ethyl Parathion Antibodies for Repeated use in Immunosensor: a Study on Dissociation of Antigens from Antibodies,"Biosens. Bioelectron., 20, 903-906(2004)).From Table 3, it can be seen that 100 mM glycine (glycine, pH 2.0) and 100 mM glycine (plycine, pH 2.3) + 1% DMSO buffer showed high desorption rates of 77.1% and 86%, respectively. Desorption rate is increased when DMSO is mixed rather than glycine alone, which is consistent with reports that organic materials such as acetonitrile or DMSO increase desorption efficiency (Kandimalla, VB, Neeta, NS, Karanth). , NG, Thakur, MS, Roshini, KR, Rani, BEA, Pasha, A. and Karanth, NGK, "Regeneration of Ethyl Parathion Antibodies for Repeated use in Immunosensor: a Study on Dissociation of Antigens from Antibodies," Biosens. Bioelectron. , 20, 903-906 (2004).
[실시예 5] 자성미세입자 표면에 고정된 리간드 항체(anti-IgG)의 재사용 Example 5 Reuse of Ligand Antibody (anti-IgG) Immobilized on Magnetic Microparticle Surface
상기 실시예 4와 같이 자성입자에 고정화된 anti-IgG와 결합된 IgG를 탈착시켜 회수한 후, 100㎍/mL 농도의 IgG 1mL를 첨가하고, 가볍게 교반시키며 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 원심분리를 실시하여, 상등액에 잔존하는 IgG의 양을 측정함으로써, 반응한 IgG의 양을 결정하였다. IgG의 탈착과정과 결합과정을 반복하여 진행하면서, 재사용된 자성입자 표면의 anti-IgG와 반응하는 IgG의 양의 변화를 관찰 하였다.After detaching and recovering the IgG bound to the anti-IgG immobilized on the magnetic particles as in Example 4, 1mL of IgG at a concentration of 100 µg / mL was added and reacted with gentle stirring. After the reaction was completed, centrifugation was performed, and the amount of IgG reacted was determined by measuring the amount of IgG remaining in the supernatant. As the IgG desorption and binding process was repeated, the amount of IgG reacted with anti-IgG on the surface of the reused magnetic particles was observed.
관찰결과, 100mM glycine(pH 2.3) + 1％ DMSO 버퍼를 이용하였을 때, 8회 반복 사용까지는 초기 결합력의 70％ 이상을 유지함을 확인하였다.As a result, it was confirmed that when 100 mM glycine (pH 2.3) + 1% DMSO buffer was used, 70% or more of the initial binding force was maintained until 8 times repeated use.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 자성 미세입자 및 배향성 고정화 리간드를 이용한 항체 단백질 분리방법은 간단하고 효율적으로 목적 단백질을 정제할 수 있을 뿐만 아니라 경제적인 장점이 있다. As described above, the antibody protein separation method using the magnetic microparticles and the alignment-immobilized ligand according to the present invention can be purified simply and efficiently as well as economical advantages.
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