KR100737861B1

KR100737861B1 - 식물병원균에 대해 항진균 활성을 갖는 바실러스서브틸리스 ｋｍｕ-13 ｋｃｃｍ 80020

Info

Publication number: KR100737861B1
Application number: KR1020050065925A
Authority: KR
Inventors: 유대식; 김현수; 박성민; 정혁준; 이정훈
Original assignee: 박성민; 정혁준; 이정훈; 유대식; 김현수
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2007-07-12
Also published as: KR20070010930A

Abstract

본 발명은 식물 병원균에 대해 항진균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 균주는 노르웨이의 릴레함메르에서 분리된 균주로서 LB 배양액을 기본배지로 하여 탄소원으로는 0.1-1%의 말토스를, 질소원으로는 0.1-1%의 박토펩톤(bactopeptone)을 첨가하여, 배양조건으로는 25-35℃에서, 100-250rpm, 배지의 pH는 5-7을 유지할 때 가장 탁월한 항진균 활성물질을 생산해내며, 이는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum), 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum), 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대하여 항진균 활성을 나타내므로, 본원 발명의 균주 및 이로부터 생산된 항진균 활성 물질을 포함한 생물학적 방제제를 제공하여 유기합성농약이 아닌 길항균주를 이용하여 식물병원균을 방제하므로 환경친화적인 농작물의 생산에 유용하다.

클라도스포리움 쿠쿠메리눔, 푸사리움 그래미니아룸, 항진균 활성

Description

식물병원균에 대해 항진균 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스 ＫＭＵ-13 ＫＣＣＭ 80020{Baciullus subtilis KMU-13 KCCM 80020 having antifungal activity to plant disease-causing pathogens}

도 1은 바실러스 서브틸리스 KMU-13 KCCM 80020가 생산하는 항진균 활성물질의 항진균 활성을 나타내는 도이며,

도 2는 바실러스 서브틸리스 KMU-13 KCCM 80020가 생산하는 항진균 활성물질의 부탄올 추출물의 TLC 분석을 나타낸 도이다.

본 발명은 식물병원균에 대해 항진균활성을 갖는 길항균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)KMU-13 KCCM 80020에 관한 것이다.

식물병원성 진균의 피해 중 검은별무늬병은 우리나라 오이재배지역에서 국부적으로 발생하여 큰 피해를 주는 병으로 1994년 충북 괴산, 경기 안성 등의 시설오이재배단지에서 발생하여 큰 피해를 나타내었고 지금도 계속하여 발생이 되고 있다. 오이 검은별무늬병을 일으키는 병원균은 클라도스포리움 쿠쿠메리눔( Cladosporium cucumerinum)으로 알려져 있으며, 이 균에 감염된 오이에서는 잎, 줄 기, 신초, 과실에 검은별무늬의 병반이 형성되며, 어린 잎이나 줄기에 감염되면 고사되고 과실에 감염되면 흑색 병반위에 회흑색 곰팡이가 자라면서 곡과가 되어 상품성을 크게 떨어뜨리는 주요한 요인으로 작용한다.

클라도스포리움 쿠쿠메리눔( Cladosporium cucumerinum)은 불완전균에 속하는 곰팡이의 일종으로 분생자경과 분생포자를 형성한다. 연갈색의 방추형 또는 란형의 포자를 형성하며, 1개의 격막을 가진 포자들이 많다. 포자의 크기는 4-25×2-6㎛이며, 생육 온도는 2-35℃ 이며 최적 온도는 20℃ 내외이다. 생육 pH 범위는 4-8pH로 pH의 생육에 대한 영향은 적은 것으로 알려져 있다. 분생포자의 형성은 10-30℃ 이며 최적 온도는 20℃ 내외이다.

클라도스포리움 쿠쿠메리눔( Cladosporium cucumerinum)은 병든 잎이나 줄기에서 균사나 분생포자 형태로 월동하여 1차 전염원이 되며 2차 전염원은 병반상에 형성된 분생포자가 바람에 비산되어 이루어지고 저온다습한 환경에서 발생이 심하기 때문에 시설재배시 피해가 크며 노지재배 오이에서도 드물게 발생하기도 하며 특히 이 시기에 강우가 잦은 날씨가 계속되면 피해가 더욱 증가한다.

이들의 방제를 위해서 주로 화학농약이 사용되어지고 있으나 화학농약을 처리하여도 완전한 방제가 어려운 실증이다. 또한 화학농약은 그 독성과 저항성 병원균의 출현, 생태계의 부정적 영향, 유기농산물에 대한 소비자의 요구증가 등 심각한 폐해로 인해 그 사용량이 점차 감소되고 있다.

화학농약의 대체방안으로 생물농약이 대두되고 있는 바, 생물농약이란 미생물 자체를 직접이용하거나 미생물이 함유된 제제를 이용하여 농작물에 해를 주는 곤충, 응애, 선충 등과 각종 식물병 원균 또는 잡초를 방제하는데 사용되는 농약이다. 이러한 미생물 농약은 유기합성 농약과 비교하였을 때 생태계에 영향이 적으며 약제 내성이나 저항성 유발을 보이지 않는 특성이 있다.

생물농약 중 미생물의 길항작용(Davison, J., Plant beneficial bacteria., Biotechnology 6, pp282-286, 1998; Lee, E. J. et al., The mechamism of biologycal control of Pseudomonas spp. against Fusarium solani causing plant root-rot disease., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, pp91-97, 1995)을 이용하여 생태학적으로 병원균의 활동을 억제하며 근권토양 중 식물병원균에 대한 길항미생물 분포나 밀도를 증가시키는 미생물농약이 출현하였다. 농업용 항진균성 항생물질의 개발은 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 대사산물에서 벼도열병 예방과 치료에 카수가마이신(kasugamycin, Oh, Y. J. Studies on the optimization of media composition and cultural conditions for kasugamycin production by Streptomyces kasugansis., Kor. J. Appl. Mircrobiol. Biotechnol., 20 , pp583-587, 1992)과 블래스티딘 S(blastidin S)를 분리하여 실용화하였다(Bae, M.,. Present status and future of antibiotics for agiculture. Kor. J. Appl . Microbiol . Biotechnol ., 6 , pp141-148, 1978). 이외에 폴리신(polyxin, Reveni, M., H. et al., Polar a potant polyxin B compound for controlling powdery mild in apple and nectarine trees, and grapevins. Crop protection., 19, pp393-399, 2000)과 밸리다마이신(validamycin, Edward, J. K. et al., Trehalase actibity in plant tissue culture. Phytochemistry., 29, pp2525-2528, 1990), 사이클헥사마이드(cyclohexamide), 그리세오풀빈(griseofulvin, Ko, B. S., T. Oritani, and K. Yamashita., Synthesis and biological activity of 6-phenylgriseofulvin as analogs of antibiotic griseofulvin. J. Kor. Agric. Chem. Soc., 35 ., pp395-398, 1992)등이 실용화되어 독성이 강한 일부 유기합성계 농약을 대체하고 식량증산에 이바지해 왔다(Kim, S. U. et al., Identification of bacteria having antifungal activity isolated from solid and its actibity. Kor. J. Microbiol. Biotechnol., 19 , pp337-342, 1991). 또한 특정세균을 이용한 생물학적 해충방제 개발도 많이 진전되어 미생물 농약으로 작물보호 분야에 도입되어 사용되었으며 농작물, 산림 및 인간건강 보호를 위해 성공한 미생물 살충제로 여러 시험지역에서는 기존의 화학 합성 농약을 미생물 살충제로 대치하고 있는 중이며, 이에 관한 연구도 세계적으로 매우 활발히 진행되어지고 있다. 항진균성 항생물질은 진균성 질병을 치료하기 위한 의약용 개발뿐만 아니라 식물병원균을 방제며 분해성 물질로 잔류 독성의 염려가 상대적으로 적은 농약용 항생물질로도 많이 개발되어지고 있다(Shin, Y. J. et al., Isolation and identification a bacterium producing antifungal antibiotic., Kor. J. Food. Sci. Nutr., 29, pp832-836, 2000).

이에 따라, 본 발명자들은 항진균 항생물질을 생산하는 길항균주에 의한 식물병원균의 방제를 목적으로 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)을 강하게 억제하는 길항균주를 동정하고, 상기 길항균주에 의해 오이 검은별무늬병의 방제력을 확인 및 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum), 콜 레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 에 대한 방제력을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물병원균에 대해 항진균활성을 갖는 길항균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)KMU-13 KCCM 80020를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 병원균에 대하여 항진균활성을 갖는 길항균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020를 제공한다.

상기 균주를 포함하는 생물학적 방제제를 제공한다.

상기 생물학적 방제제는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020를 탄소원으로는 0.1-1%의 말토스를, 질소원으로는 0.1-1%의 박토펩톤(bactopeptone)을 첨가한 LB 배양액(1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 1.0% 염화나트륨)에서 25-40℃에서, 100-250rpm, pH 5-7을 유지하면서 배양시킴을 특징으로 한다.

또한, 상기의 조건으로 배양한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020의 배양액의 부탄올 추출물을 클로로포름:메탄올:부탄올이 7:2.5:0.5의 비율로 혼합된 용매를 전개용매로 한 TLC(Rf value=0.64)로 분리된 항진균 활성 물질을 포함한 식물병원균에 대한 생물학적 방제제를 제공한다.

상기에서 식물병원균은 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum), 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum), 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) 또는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 포함된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 식물 병원균에 대하여 항진균활성을 갖는 길항균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020를 제공한다.

본 발명의 균주는 노르웨이 릴레함메르 근교 토양시료를 멸균수에 넣고 교반 배양기(shaking incubator)로 1-30분간 진탕배양 한 후, 길항균주의 선발을 위해서 50-90℃ 물 전해조(water bath)에서 10-60분간 열처리하고 LB 아가배지(1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 1.0% 염화나트륨, 1.5% 아가)에 접종하여 일차적으로 콜로니를 분리한다. 분리된 균주들을 대상으로 오이 검은별무늬병원균인 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)를 방제할 수 있는 길항균주를 분리, 선발하기 위하여 PDA(감자 덱스트로즈 아가, 0.4% 감자전분, 2.0% 덱스트로즈, 1.5% 아가)에서 대치배양(paring culture)을 실시하여 억제거리를 형성하는 콜로니를 최종적으로 분리한 후, 현미경을 통한 형태관찰, 그람염색, 카탈라아제 활성측정과 API 시스템 검사를 통해 분리된 균주가 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)임을 확인하고, 이 균주의 DNA 추출 및 16s rDNA의 PCR 증폭을 통해 최종적으로 동정할 수 있다.

따라서, 본원발명은 상기의 방법으로 동정된 바실러스 서브틸리스 KMU-13 KCCM 80020를 포함한 생물학적 방제제를 제공한다.

또한, 바실러스 서브틸리스 KMU-13 KCCM 80020의 항진균 물질 생산을 위한 최적의 배지조건 및 pH, 배양온도, 배양시간을 실험한 결과, 항진균 활성 물질을 생산하기위한 최적의 조건은 LB 배양액을 기본배지로 하여 탄소원으로는 0.1-1%, 바람직하게는 0.5%의 말토스를, 질소원으로는 0.1-1%, 바람직하게는 0.5%의 박토펩톤(bactopeptone)을 첨가하였을 때 가장 탁월한 생산성을 보이며, 배양조건으로는 25-35℃, 바람직하게는 30℃에서, 100-250rpm, 바람직하게는 180rpm, 배지의 pH는 5-7, 바람직하게는 pH 6을 유지할 때 가장 탁월한 항진균 활성물질을 생산해낼 수 있다.

상기 항진균 물질의 분리하여 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 전개용매로, 바람직하게는 클로로포름, 메탄올, 부탄올 혼합용매로 하여 TLC를 분석함으로서 상기 항진균 물질을 정제할 수 있다. 정제된 항진균 물질의 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum) 이외의 식물병원균에 대하여 항진균 활성 검사를 실시한 결과, 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum), 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) 또는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대하여도 항진균 활성을 나타낸다.

따라서, 본원발명은 상기 항진균 물질을 포함한 식물병원균에 대한 생물학적 방제제를 제공하며, 상기 식물병원균에는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum), 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum), 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum) 또는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 포함된다.

상기 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)은 오이 검은별무늬병원균이며, 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum)은 감자시드름병원균이며, 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)은 강남통 탄저병원균이며, 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum)은 모마름병원균이며 또한 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)는 잿빛곰팡이병원균을 의미한다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되지 않는다.

실시예 1. 길항균주의 분리 및 선발

노르웨이 릴레함메르 근교 토양시료 30g을 270㎖의 멸균수에 넣고 교반 배양기(shaking incubator)로 10분간 진탕배양 한 후, 길항균주의 선발을 위해서 80℃ 물 전해조(water bath)에서 30분간 열처리하고 LB 아가배지(1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 1.0% 염화나트륨, 1.5% 아가)에 접종하여 58개의 콜로니를 분리하였다.

분리된 균주들을 대상으로 오이 검은별무늬병원균인 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum)를 방제할 수 있는 길항균주를 분리, 선발하기 위 하여 PDA(감자 덱스트로즈 아가, 0.4% 감자전분, 2.0% 덱스트로즈, 1.5% 아가)에서 대치배양(paring culture)을 실시하여 억제거리를 형성하는 6개의 콜로니를 최종적으로 분리하였다. 공시균주로 사용한 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum) KACC 40576은 농업진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물보존센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양을 받아 사용하였다.

분리한 균주 중에서 가장 큰 저지대를 형성하는 균주를 선별하기 위하여 클라도스포리움 쿠쿠메리눔을 직경 6㎜ 크기의 배양접시로 접종하고 24℃에서 24시간 배양한 후, 3㎝ 떨어진 곳에 선별한 상기 6개의 콜리니를 획선접종 한 후, 24℃에서 계속 배양하면서 클라도스포리움 쿠쿠메리눔에 대한 성장 억제를 확인하여, 클라도스포리움 쿠쿠메리눔에 대해 가장 우수한 길항능을 가지는 콜로니를 선별하고 KMU-13이라 명명하였다.

실시예 2. 길항균주의 일차동정

상기 실시예 1에서 최종 선발된 균주 KMU-13의 분류학적 동정을 위해 현미경을 통한 형태관찰, 그람염색, 카탈라아제 활성측정과 API CHB 50 키트(bioMerieux, France)과 API 20E 키트(bioMerieux, France)를 이용하였고 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(Holt, J. G. et al., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology., 9th, Williams&Wilkins., U.S.A., 1994)를 참조한 결과, 상기 실시예 1에서 최종선발된 균주인 KMU-13 균주는 바실러스 종(Bacillus sp.)으로 판별이 되었고, API CHB 50 키트(bioMerieux, France)과 20E 키트(bioMerieux, France) 를 함께 사용한 경우에 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 99%의 상동성을 나타내었다.

실시예 3. 길항균주의 DNA 추출 및 16s rDNA의 PCR 증폭

위자드 게노믹 DNA 정제 키트(Wizard genomic DNA purification kit, Promega, USA)를 이용하여 분리균주의 크로모좀얼 DNA를 분리하여 시퀀싱에 사용하였다. PCR을 위하여 AccuPower PCR PreMix tube(Bioneer사)에 DNA 1㎕(약 40㎍), 각각 1㎕의 프라이머, 17㎕의 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 혼합하였다. PCR은 초기 변성 94℃, 3분; 변성 94℃, 1분; 어닐링 55℃, 1분; 익스텐션 72℃, 3분의 조건으로 32 사이클을 실시한 후, 최종 익스텐션을 72℃에서 5분간 유지하여 증폭을 종결하였다. 16S rDNA의 증폭을 위하여 E. coli 16S rDNA 부분의 보존된 시퀀스를 기초로 하여 합성된 일반적인 프라이머인 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 프라이머로 사용하였다.

16S rDNA의 PCR 산물은 위자드 SV 겔 및 PCR 클린업 시스템(Wizard SV Gel and PCR clean-up system, Promega, USA)를 이용하여 정제하였고 정제된 PCR 산물은 ABI PRISM 3700 DNA 분석기를 이용하여 염기서열을 분석한 후, 그 결과를 이용하여 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK의 ribosomal DNA 시퀀스와 비교하여 동정하였다(Thompson, J. D. et al., CLUSTAL W; improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalies and weight matrix choice. Nucleic Acids Res., 22, pp4673-4680, 1994).

그 결과, 1400bp 정도의 증폭된 DNA 단편을 확인할 수 있었으며, 이 DNA의 부분 염기서열을 분석할 결과는 서열목록 1에서 보는 바와 같다. 16S rDNA 부분 염기서열을 NCBI GeneBank에 등록된 유사 균주와 비교, 분석하여 본 결과, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 99%의 상동성을 나타내었으며, 이러한 결과를 바탕으로 하여 본 연구에 선별된 KMU-13을 최종적으로 B. subtilis로 동정하고, 이를 2005년 6월 10일에 한국미생물보존센터에 기탁하였으며, 그 기탁번호는 KCCM 80020이다.

실험예 1. 항진균 물질의 생산을 위한 최적배지조건

상기 실시예 3에서 동정된 바실러스 서브틸리스 KMU-13균주의 항진균 물질의 생산을 위한 최적배지조건을 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

1-1. 항진균 물질의 생산에 배지가 미치는 영향

항진균 물질의 생산을 위하여 기본배지로 LB 배양액(broth)을 사용하였으며, 배지에 따른 항진균 물질의 생산력을 검토하기 위하여 LB 배양액, YM 배양액(0.3% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 0.5% 펩톤, 1.0% 덱스트로즈), PDB(0.4% 감자 전분, 2.0% 덱스트로즈), TSB(1.7% 카제인 소화물, 0.3% soytone, 0.5% 염화나트륨, 0.25% 덱스트로즈)배지를 제조하여 pH 7.0으로 조정하여 121℃, 10분간 멸균하여 사용하였다. 전 배양액은 24시간 전에 LB 배양액에 단일 콜로니를 접종하여 30℃에서 배양하여 사용하였다. 각각의 삼각플라스크에 전 배양액 100㎕ 접종한 후, 이들을 30℃, 180rpm에서 24시간 배양하였다. 아가 확산법(Agar diffusion method)를 실시한 후, 24℃에서 72시간동안 항진균 활성을 조사하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 LB 배양액에서의 항진균 활성은 클리어 존의 직경이 17mm로 가장 높게 나타났으며, TSB 배지에서 서장은 1.589로 가장 높은 생육도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

배지가 미치는 영향

배지	성장(OD 660nm)	클리어 존(Φmm)
LB	1.371	17
YM	1.533	12
PDB	0.040	-
TSB	1.589	8

1-2. 항진균 물질의 생산에 대한 탄소원의 영향

항진균 물질의 생산에 미치는 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 탄소원으로 용해성 전분, 포도당, 프락토오즈, 글리세롤, 수크로스, 만니톨, 락토오즈, 솔비톨, 말토오즈, 아라비노오스을 각 0.5%씩 첨가하여 30℃에서 24시간 배양한 후, 배양액을 이용하여 아가 확산법을 실시하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 말토오즈를 첨가한 배지의 경우 클리어 존의 직경이 19mm로 가장 탁월한 항진균 활성을 나타내고 있으며, 솔비톨을 첨가한 배지에서 1.725로 가장 탁월한 생육도를 나타내었으며, 글리세롤을 첨가한 경우 증식은 하였으나 항진균 활성은 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

탄소원이 미치는 영향

탄소원	성장(OD 660nm)	클리어 존(Φmm)
대조군	1.544	16
용해성 전분	1.474	17
포도당	1.656	12
프락토오즈	1.575	12
글리세롤	1.290	-
수크로스	1.553	10
만니톨	1.596	14
락토오즈	1.667	16
솔비톨	1.725	13
말토오즈	1.462	19
아라비노오스	1.654	16

1-3. 항진균 물질의 생산에 대한 질소원의 영향

또한, 질소원의 영향을 조사하기 위하여 앞서 조사된 탄소원 0.5%를 기본배지에 첨가한 후, 질소원으로 우레아, 맥아 추출물, 쇠고기 추출물, 효모 추출물, 트립톤, 폴리펩톤, 박토펩톤을 각 0.5%씩 첨가하여 배지를 제조한 후 사용하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이 질소원에 대한 바실러스 서브틸리스 KMU-13의 항생물질 생산성과 생육도를 조사하여 본 결과 사용한 7종의 질소원에 대하여 양호한 증식을 나타내었으며, 항진균성 항생물질 생산성은 박토펩톤, 트립톤, 폴리펩톤과 같은 펩톤류를 첨가하였을 때 다른 질소원에 비하여 높은 항진균성 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

질소원이 미치는 영향

질소원	성장(OD 660nm)	클리어 존(Φmm)
대조군	1.631	19
우레아	1.501	15
맥아 추출물	1.576	12
쇠고기 추출물	1.706	12
효소 추출물	1.784	15
트립톤	1.315	20
박토펩톤	1.367	21
폴리펩톤	1.787	20

실험예 2. pH, 배양온도, 배양시간에 따른 항진균 물질의 생산성

본 발명의 바실러스 서브틸리스 KMU-13 의 항진균 물질의 생산에 pH, 배양온도, 배양시간이 미치는 영향을 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

2-1. pH의 영향

배지의 pH가 항진균 물질의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1N NaOH, 1N HCl을 이용하여 배지의 pH를 3.0-10.0로 조정한 후, 전 배양액 100㎕를 각각의 삼각 플라스크에 접종하여 24시간 배양한 후 항진균 활성을 관찰하였다.

상기 실험수행의 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 pH에 따른 바실러스 서브틸리스 KMU-13의 생육 및 항진균 물질의 생산은 pH 3.0, 4.0, 10.0에서는 균이 증식하지 못하였으며, pH7.0인 경우에 균의 생육도가 가장 탈월하였으며, pH 6.0에서 가장 높은 항진균력을 나타내었다. 하지만, 배양액의 pH가 7.0-9.0 인 경우에 비하여 5.0-6.0인 경우에 보다 높은 항진균력을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

pH의 영향

pH	성장(OD 660nm)	클리어 존(Φmm)
3.0	-	-
4.0	-	-
5.0	1.656	18
6.0	1.693	20
7.0	2.772	15
8.0	1.572	10
9.0	1.570	10
10.0	-	-

2-2. 배양온도의 영향

배양온도에 따른 항진균 활성의 검토는 동일한 배지를 20, 30, 37, 45, 50, 55℃에서 180rpm, 24시간 배양한 후 항진균 활성을 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 5에서 보는 바와 같이 바실러스 서브틸리스 KMU-13의 성장과 항진균성 항생물질의 생산은 30℃에서 가장 우수하게 나타났으며 50, 55℃에서는 증식을 하지 못하였다. 30-45℃까지 항진균 물질의 생산성이 유지되며 균주의 생육 또한 양호한 것으로 보아 본 균주를 미생물제제로 사용할 경우에 겨울 하우스나 여름철 노지의 온도에서도 항진균 물질의 생산 및 균의 생육을 충분히 유지 할 것으로 판단된었다.

배양온도의 영향

온도(℃)	성장(OD 660nm)	클리어 존(Φmm)
20	0.175	8
30	1.591	21
37	1.438	18
45	0.979	12
50	-	-
55	-	-

2-3. 배양시간의 영향

배양시간에 따른 길항균주의 항생물질 생산능은 항생물질 생산 최적배지에 100㎕ 전 배양액을 접종 후 1-3일간 배양하였고, 24시간마다 배양액을 회수하여 항진균 활성을 관찰하였다.

배양시간에 따른 길항세균 바실러스 서브틸리스 KMU-13의 생육과 항진균 물질의 생산은 배양 후 48시간에 이르러 최고의 생산능을 나타내었다. 하지만, 24시간과 비교하였을 때 큰 차이를 나타내지는 않았다.

실험예 3. 항진균 물질의 분리, 정제

바실러스 서브틸리스 KMU-13으로부터 생산된 항진균성 물질을 분리, 정제하기 위하여 조사된 항진균성 물질 최대생산배지에 바실러스 서브틸리스 KMU-13을 300㎖ 배양한 후, 배양액을 8,000rpm, 30분, 4℃에서 원심분리하여 상등액 280㎖를 회수한 후, 동량의 부탄올을 첨가하여 활성물질을 부탄올층으로 이행시킨 후 이행된 항진균 활성물질을 50℃ 이하에서 감압농축하여 감압농축된 추출물을 1/40 부피의 메탄올에 녹인 후 아가 확산법을 사용하여 항진균력을 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 매우 크고 선명한 클리어 존을 형성하였고 그 효과는 4주이상 지속되었다.

전개용매로 클로로포름 : 메탄올 : 부탄올 = 7 : 2.5 : 0.5 을 사용하여 TLC(silica gel 60F254, Merck)로 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 UV 365nm에서 여러개의 밴드를 확인할 수 있었다. TLC 플레이트 상에서 전개한 각각의 밴드를 회수하여 메탄올에 녹인 후, 다시 감압농축하여 항진균활성을 검토한 결과, Rf 값이 0.64를 나타낸 밴드에서만 항진균 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 다른 식물 병원균에 대한 항진균 활성 검사

상기 실험예 3에서 분리된 항진균 활성을 갖는 물질을 이용하여 식물병원성 진균인 잿빛곰방이병원균 B. cinerea KACC 40573, 수박탄저병원균 C. orbiculare KACC 40808, 강남콩탄저병원균 C. gloeosporioides KACC 40804, 수박덩굴마름병원균 D. bryoniae KACC 40669, 모마름병원균 F. graminearum KACC 41040, 감자시드름병원균 F. oxysporum KACC 40052, 잎마름병원균 R. solani AG-1 KACC 40101, 줄기썩음병원균 R. solani AG-4 KACC 40142를 대상으로 아가 확산법을 이용하여 그 항균활성을 조사하였다.

상기 실험 수행의 결과, 감자시드름병원균인 F. oxysporum KACC 40052에 대하여 약하지만 항진균효과를 나타내었으며(10.9㎜) 강남콩탄저병원균인 C. gloeosporioides KACC 40804에 대하여서는 15㎜ 크기의 클리어 존을 형성하였으며, 모마름병원균인 F. graminearum KACC 41040에 대하여서는 18㎜의 클리어 존을 형성하였고, 잿빛곰방이병원균인 B. cinerea KACC 40573에 대하여서도 18㎜의 클리어 존을 형성함을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 식물병원균에 대해 항진균활성을 갖는 길항균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)KMU-13 KCCM 80020에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 균주는 노르웨이의 릴레함메르에서 분리된 균주로서 LB 배양액을 기본배지로 하여 탄소원으로는 0.1-1%의 말토스를, 질소원으로는 0.1-1%의 박토펩톤(bactopeptone)을 첨가하여, 배양조건으로는 25-35℃에서, 100-250rpm, 배지의 pH는 5-7을 유지할 때 가장 탁월한 항진균 활성물질을 생산해내며, 이는 오이 검은별무늬병원균인 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum), 시드름병원균인 푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporum), 강남콩탄저병원균인 콜레토트리쿰 글로에스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 모마름병원균인 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum), 잿빛 곰팡이 병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대하여 항진균 활성을 나타내므로, 본원발명의 균주 및 이로 부터 생산된 항진균 활성 물질을 포함한 생물학적 방제제를 제공하여 유기합성농약이 아닌 길항균주를 이용하여 식물병원균을 방제하므로 환경친화적인 농작물의 생산에 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)에 대하여 항진균 활성을 갖는 길항균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020.
삭제
제1항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020 균주 배양액을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 오이의 검은별무늬병에 대한 생물학적 방제제.
삭제
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020 균주를 0.1-1%의 말토스, 0.1-1%의 박토펩톤(bactopeptone), 1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출액 및 1.0% 염화나트륨으로 구성된 LB 배양액에서 25-40℃, 100-250rpm, pH 5-7을 유지하면서 배양하고,

상기로부터 얻은 균주 배양여액의 부탄올 추출물을 클로로포름:메탄올:부탄올이 7:2.5:0.5의 비율로 혼합된 용매를 전개용매로 한 TLC에서 전개하여 Rf 값이 0.64이고, 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)에 대하여 항진균 활성을 갖는 항생물질을 얻음을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KMU-13 KCCM 80020 유래의 항생물질의 제조방법.
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