KR100732564B1 - 진피 추출물을 주요 활성 성분으로 함유하는 피부외용제조성물 - Google Patents

Abstract

진피 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물로서, 조성물 총 중량에 대하여, 진피 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 진피 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물이 제공된다.

진피 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성을 막아주는 티로시나제 활성 억제효과, 멜라닌 합성 억제효과 등의 미백효과와 자유라디칼 소거효과, 콜라게나제 (MMP-1)의 활성 및 발현억제 등의 주름개선효과가 우수하며 항산화 효과, 주름방지효과, 자극완화 효과가 우수하다.

진피 추출물, 미백, 항노화, 자극완화, Fraxinus chinensis

Description

진피 추출물을 주요 활성 성분으로 함유하는 피부외용제 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OF FRAXINUS CHINENSIS}

본 발명은 진피 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 진피 추출물 0.001~30.0 중량%를 함유하는 미백효과와 주름개선효과, 자극완화효과가 우수한 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부색을 결정하는 인자는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분적, 또는 전체적인 색소침착과, 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다.

이상의 인자들 가운데에서도 피부색을 결정하는 가장 중요한 인자는 색소침착이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 이러한 멜라닌 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비정도이다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계 속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다.

그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남, 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.

종래에는, 기미, 주근깨, 색소침착 등과 같은 피부색소 이상침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소침착을 치료 또는 경감시켜주기 위해서, 이전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 티로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합 사용하여 왔다. 그러나 이들은 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

한편, 현재 이들 기존 미백 효능 물질들 이외에 천연물 중에서 미백활성성분 을 찾기 위한 연구가 계속 이루어지고 있는데, 그 중 상백피(일본공개특허 소55-44375, 소64-26507, 소64-83009, 평1-25687, 평5-139950, 한국공개특허 제1992-002109호, 제1997-021273호), 감초(일본공개특허 소60-214721, 소63-23809, 소64-63506, 평1-149706, 한국공개특허 제1992-002109호, 제1997-025601호) 등 다수의 식물추출물이 티로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 안정성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.

다음으로, 피부에 영향을 미치는 인자로는 피부의 노화로 인한 주름의 생성과 탄력의 저하이다. 사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부노화와 색소침착에 의해 끊임없이 변한다. 피부노화는 크게 자연 노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며(EB Doris, Cosmetics & Toiletories, 111: 31-37, 1996), 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적인 노화현상이 바로 주름 형성이다(HW Daniel, Ann Intern Med, 75(6): 873-880, 1971; GL Grove, et al., J Am Acad Dermatol, 21: 631-637, 1989; CE Griffiths, et al., Arch Dermatol, 128: 347-351, 1992).

자외선에 의해 야기되는 광노화 메카니즘 중의 하나는 자유 라디칼 경로를 경유하는 것이다(D Harman, J Gerontol, 11(3): 298-301, 1956). 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직형성 파괴, 세포막 기능저해, DNA 변이촉진, 단백질 작용 변형, 세포간 에너지 전이, 신진대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(AF Kligman and RM Lavker, J Cutan Aging Cosmet Dermatol, 1: 5-12, 1988). 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화 시키는 항산화제 또는 여러 가지 화학적 소거제들을 사용하여 노화과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 'MMP'라 칭함), 특히 콜라게나제(collagenase, 이하 'MMP-1'이라 칭함)와 젤라티나제(gelatinase, 이하 'MMP-2'라 칭함)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사와 자유라디칼에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.

MMP는 그 기질특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류되는데, MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐 타입 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(gelatinase)의 작용이 용이하게 한다. MMP-2는 72 KD의 젤라티네이즈(A)가 속하며 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ, 엘라스틴 및 파이브로넥틴과 같은 기질을 분해한다. 호중구 및 다형핵성 백혈구의 MMP는 산화과정에 의하여 일차적으로 활성화되는데 그 과정은 먼저 세포 내에서 과산화수소가 발생되면 염소이온의 존재 하에서 미엘로페록시다제(myeloperoxidase)에 의하여 차아염소 산으로 전환되고 이것이 MMP를 활성화시킨다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 피부 거칠음 및 잔주름의 완화에 효과가 있다고 보고 되었고(KS Weiss, et al., JAMA, 259: 527-532, 1988), 전 세계적으로 피부노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C, E, 비타민류의 유도체 및 AHA(alpha-hydroxy acid)는 현재까지 알려진 피부노화 개선의 대표적인 물질이다(Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107: 63-67, 1992; DR Rosenthal, et al., J Invest Dermatol, 95: 510-515, 1990; TD Ditre, et al., J Invest Dermatol, 34: 187-195, 1996). 하지만, 이들은 자연환경에서 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 혹은 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는데 문제가 있다.

따라서 본 발명자는 천연물에서 피부미백 및 피부노화 억제에 관한 물질을 찾고자 노력하였고, 진피에 주목하게 되었다. 진피(Fraxini Cortex)는 물푸레나무과(Oleaceae)의 물푸레나무 Fraxinus chinensis Roxb.의 수피를 건조한 것을 말한다. 물푸레나무는 낙엽 활엽 교목으로 높이 30m에 달하고, 잎은 우상(羽狀)이며 복생(複生)한다. 작은 잎은 장란형이며 꼭대기 잎은 항상 폭이 넓고 거의 성기게 나며 길이 6~15cm로서 가장자리에 톱니가 있거나 없고 뒷면 중륵(中肋)에 갈색 털이 난다. 꽃은 5얼에 피며 자웅이주 또는 자웅잡가이고 원추화서(圓錐花序)로서 새로 나온 가지 끝에 액생하며 꽃이 잘다. 꽃잎은 도피침형이며 꽃받침은 4조각으로 갈라지거나 또는 밋밋하다. 과실은 시과(翅果)로서 도피침형이며 날개는 폭이 좁고 9월에 성숙한다. 한방에서 신경통, 안충혈, 부종 등에 약재로 사용하며, 수피에 esculin, mannitol, fraxin, esculetin, fraxetin 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(육창수, 생약도감, 도서출판 경원, p421, 1997). 그러나 미백 및 노화억제 효과 등의 효능은 알려져 있지 않고, 진피(Fraxinus chinensis)를 화장품 등의 피부외용제에 적용한 예는 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 피부외용제에 적용 가능하고 피부외용제에 함유시 멜라닌의 생성 및 이와 관련된 효소의 활성을 억제하여 우수한 미백효과를 나타내는 천연 진피 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 항산화효과, 콜라겐 합성효과, 기질 금속단백질 분해효소에 작용하여 피부 잔주름 방지효과 등 우수한 주름개선 효과를 나타내는 천연 진피 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 피부외용제에 적용 가능하고 외용제에 함유시 외용제 기재로 일어날 수 있는 피부 자극을 감소시키는 자극완화 효과를 나타내는 천연 진피 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 여러 가지 생약들 중 진피를 선택하여, 이의 피부외용제 원료로서의 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발 함으로써, 다양한 화장품 원료의 선택범위를 높이고, 피부자극이 없으면서 기능성 효과를 나타내는 피부외용제를 제공한다.

본 발명은 진피 추출물을 주요 활성 성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 사용된 진피 추출물은 진피로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액, 또는 그 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

또한 상기 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여, 진피 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다. 상기 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주효과를 손상시키지 않는 범위내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

상기 진피 추출물은 추출용매를 사용하여 70∼85℃에서 추출하여 냉침하고, 상기 결과 현탁액을 여과하여 얻어진 액상물을 추가로 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 얻는다. 상기 추출용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 단독으로 사용하거나 2종 또는 3종의 용매를 혼합하여 사용한다.

또한 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크 림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립글로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류의 색조화장료 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 조성물은 다소 유체일수 있으며, 백색 또는 유색크림, 연고, 밀크로션, 유액(serum), 에센스, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 화장 분야에서 통상적인 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.01~20 중량 %이다. 이러한 보조제는 지방상, 수성상, 지질 소포체 및/또는 나노입자에 도입될 수 있다. 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 피부외용제 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한 본 발명의 주제는 피부 미백제, 노화방지제, 피부 자극 완화제로 사용되는 진피 추출물의 피부외용제 조성물의 용도이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 진피 추출물 제조

진피를 세절하여 70% 에탄올 수용액으로 3시간 동안 환류추출하고 냉침한 후 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 조성물 총 중량의 0.001∼30.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 진피 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 머쉬룸 티로시나제를 이용한 티로시나제 활성 억제효과 측정

실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 보고 판단하였다.

티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실시예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(SH Pomerantz, J Biol chem, 241: 161-168, 1966)을 응용해 미백효과를 판정하였다.

코지산, 알부틴, 상백피 추출물, 유용성 감초추출물 및 실시예 1에서 제조한 진피 추출물을 시료로 사용하여 티로시나제 활성 억제효과를 조사하였다. 각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96공 평판 배양기(96-well plate)에 넣고, 50mM 인산 완충액(pH 6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500 units/㎖, Sigma) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 흡광광도계(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 활성 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 활성 저해율(%)은 수학식 1에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(D-C)-(B-A)/(D-C)]×100

A : 시료를 넣은 웰의 반응전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응후 흡광도

티로시나제 활성 억제효과를 시험한 결과, 진피 추출물의 IC₅₀ 값은 0.01%로 나타나 티로시나제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 상백피 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 1).

시료명	티로시나제 활성저해 효과 (IC50)
코지산	0.02%
알부틴	0.39%
진피 추출물	0.01%
상백피 추출물	0.8%
유용성 감초 추출물	0.03%

실시예 3: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 세포내 티로시나제 효소 활성 억제효과 측정

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트내 티로시나제 효소 활성 억제정도를 세포 내 티로시나제 효소 활성을 측정하여 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며 티로시나제라는 효소를 합성하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하고 세포에서 티로시나제를 분리하여 효소의 활성을 측정함으로써 티로시나제 효소활성 억제정도를 비교평가 하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 활성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6공 평판배양기에 각 웰 당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 세포 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하고, 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 상등액을 회수하였다. 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 1.5mM L-티로신, 0.06mM L-도파, 세포 상등액을 각각 넣고, 37℃에서 30분간 배양한 후 흡광 광도계로 490㎚에서 흡광도를 측정하여 티로시나제 효소 활성 억제효과를 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 활성 억제율(%)은 수학식 2에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 세포내 티로시나제 효소의 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 흡광도

B: 시료를 첨가한 웰의 흡광도

B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 활성 억제효과를 측정한 결과, 진피 추출물의 IC₅₀ 값은 0.01%로 나타나 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 낮은 농도에서도 티로시나제의 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다(표 2). 따라서, 본 발명의 진피 추출물은 세포내 티로시나제 효소의 활성을 저해하여 미백효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

시료명	티로시나제 활성 저해 효과 (IC50)
코지산	0.03%
알부틴	0.2%
진피 추출물	0.01%
상백피 추출물	0.7%
유용성 감초 추출물	0.02%

실시예 4: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도에 따라 미백효과를 판단하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6공 평판배양기에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(R Lotan and D Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 세포 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 흡광광도계로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 진피 추출물의 IC₅₀ 값은 0.005%로 나타나 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 3).

시료명	멜라닌 합성 저해 효과 (IC50)
하이트로퀴논	0.02%
알부틴	0.4%
진피 추출물	0.004%
상백피 추출물	4.5%
유용성 감초 추출물	0.03%

실시예 5: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 항산화효과를 확인하기 위해 활성산소 라디칼 소거효과를 측정하였다.

활성산소 라디칼 소거작용은 Furuno 등(K Furuno, et al., Biol Pharm Bull, 25(1): 19-23, 2002)의 방법에 따라 각 시료의 크산틴-크산틴옥시다제 시스템에 의해 생성된 활성산소를 소거하는 효과를 측정하였다. 0.05M Na₂CO₃ 완충액에 3mM 크산틴, 3mM EDTA, 0.72mM 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium; NBT), 0.15% bovine serum albumin(BSA) 용액과 시료를 각각 첨가하여 혼합한 다음, 25℃에서 10분간 반응하였다. 그 후 각 시험관에 크산틴옥시다제(0.25U/㎖)용액을 첨가하여 25℃에서 30분간 반응한 후, 565㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 활성산소 소거효과의 결과는 수학식 4에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 4와 같다.

활성산소 소거효과(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560㎚에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560㎚에서의 흡광도

So : 효소 무첨가 시료용액의 효소 반응 전의 560㎚에서의 흡광도

Bo : 효소 무첨가 공시험용액의 효소 반응 전의 560㎚에서의 흡광도

시료명		항산화효과(%)
진피 추출물	0.001%	30
	0.005%	75
	0.01%	97
녹차 추출물		95
비타민 E		90

표 4에 나타난 바와 같이 진피 추출물은 투여농도 의존적으로 활성산소 라디칼 소거작용을 나타내 0.001, 0.005, 0.01%의 농도로 처리한 경우, 각각의 활성산소 라디칼 소거능은 30%, 75%, 97%로 나타났다. 양성 대조군으로 사용된 녹차 추출물과 비타민 E는 0.01%에서 각각 활성산소 라디칼을 95%, 90% 정도 소거하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과에 의해 진피 추출물은 우수한 항산화효과를 갖고 있음이 확인되었다.

실시예 6: 콜라겐 합성 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 콜라겐 합성효과를 관찰하기 위해 인간으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 처리하여 실험을 실시하였다.

96공 평판 배양기에 2.5% 우 태아 혈청이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)와 인간 섬유아세포(5,000세포/well)를 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음 진피 추출물을 각각 0.01% 및 0.001%의 농도로 1일 처리 후 세포배양액을 채취하여 콜라겐 단백질 측정기구(Catalog No.:MK 101, Takara Shuzo Co. Ltd, 일본)를 이용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.

측정방법은 우선 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 96공 평판 배양기에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간동안 항원-항체 반응을 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96공 평판 배양기에 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색 유발 물질을 넣어 실온에서 발색시키고, 1M 황산을 넣어 발색을 중지시켰다. 반응색의 색깔은 노란색을 띠며, 반응의 정도에 따라 진한 정도가 달라진다.

노란색을 띤 96공 평판 배양기를 흡광광도계를 이용하여 450㎚에서 측정하였다. 이때 상기 추출물을 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. 콜라겐 합성 효과는 수학식 5에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 5와 같다.

콜라겐 합성효과(%) = (진피 추출물을 처리한 세포 배양액의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)×100

시료명		콜라겐 합성효과(%)
진피 추출물	0.01%	85
	0.001%	55
대조군		0

표 5에 나타난 바와 같이 진피 추출물은 우수한 콜라겐 생성 촉진효과를 가짐을 알 수 있다.

실시예 7: 기질 금속단백질 분해효소(MMP-1)의 활성 억제효과 측정

실시예 1에서 제조된 진피 추출물의 기질 금속단백질 분해효소(MMP-1) 활성 억제효과 측정은 Wang 등(Y Wang, et al., J Biol Chem, 274: 33043-33049, 1999)이 사용한 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 즉, 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ-콜라겐 20㎕와 시료 40㎕를 첨가하고 0.5 unit로 희석된 콜라게나제 40㎕를 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(LS55, PERKIN ELMER, 미국)를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚로 형광값을 측정하였고, 대조그룹으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였다. 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다. 양성 대조군으로 MMP-1 활성 저해 작용이 있는 것으로 알려진 1,10-페난트롤린(phenanthroline)을 사용하였다.

결과는 표 6에 나타난 바와 같이 본 발명에 따르는 진피 추출물은 농도 의존적으로 콜라게나제 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 양성 대조군으로 사용된 1,10-페난트롤린의 경우는 2mM에서 70% 활성 저해효과를 나타내었다. 이와 같은 결과로 볼 때 진피 추출물의 경우 우수한 콜라게나제 활성 저해효과가 있음을 알 수 있다.

시료명		MMP-1 활성 억제 효과(%)
진피 추출물	0.002%	45
	0.005%	65
	0.01%	85
대조군(2mM 1, 10-페난트롤린)		70

실시예 8: 자외선 조사 후 진피 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1의 발현량을 측정하기 위해서 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)를 실시하였다(SE Dunsmore, et al., J Biol Chem, 271: 24576-24582, 1996).

UV 챔버를 이용하여 인간 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96공 평판 배양기에 코팅하였다. 일차항체(단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 90분간 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 이뮤노를로불린 지(alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgG)를 다시 90분 정도 반응시킨 후, 완충용액으로 세척한 다음 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ p-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 흡광광도계를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 상기 추출물을 처리하지 않은 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. MMP-1 발현 억제효과는 수학식 6에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 7과 같다.

MMP-1 발현 억제율(%) = [(A-B)/A]×100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 흡광도

B: 시료를 첨가한 웰의 흡광도

시료명		MMP-1 발현 억제율(%)
진피 추출물	0.001%	25
	0.005%	55
	0.01%	85
레티놀		45

표 7에 나타난 바와 같이 본 발명의 진피 추출물은 농도 의존적으로 MMP-1 발현 저해효과를 나타내었다. 양성 대조군으로 사용된 레티노인산의 경우는 3.5uM에서 45% 발현 저해효과를 나타내었다. 이와 같은 결과로 볼 때 진피 추출물의 경우 우수한 MMP-1 발현 저해효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 9: 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과 측정

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증유발관련 효소인 히아루로니디아제의 효소활성을 측정하여 판단한 것이다.

히아루로니디아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발하는 기능을 가지고 있다. 본 실시예에서는 이 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법(Y Kakegawa, et al., Japanese J of Inflammation, 4: 437-438, 1984)을 응용해 항염증 효과를 판정하였다.

컴프리, 시소, 삼백초, 유용성 감초 추출물, 진피 추출물을 시료로 사용하여 히아루로니디아제 활성 억제효과를 조사하였다. 각 시료들의 히아루로니디아제에 대한 저해활성은 다음과 같이 행하였다.

시료 100㎕와 히아루로니디아제 용액(type Ⅳ-S, Sigma, 400U/㎖) 50㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl2ㆍ2H2O, Sigma, 0.1㎎/㎖)을 100㎕를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시켰다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4㎎/㎖)을 250㎕ 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100㎕ 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3㎖ 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시킨 후 발색시켰다. 565㎚에서 흡광도를 측정하여 히아루로니디아제에 대한 저해율을 측정하였다. 히아루로니디아제에 대한 저해율(%)은 수학식 7에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소활성

B : 시료를 첨가한 웰의 효소 활성

시료	히아루로니디아제 활성 억제효과 (IC50)
컴프리 추출물	0.3%
시소 추출물	0.4%
유용성 감초 추출물	0.06%
삼백초 추출물	0.3%
진피 추출물	0.03%

히아루로니디아제 효소 활성 억제효과를 시험한 결과 진피 추출물의 IC₅₀값은 0.03%로 나타나 히아루로니디아제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 항염증제인 유용성 감초 추출물, 컴프리 추출물, 삼백초 추출물, 시소 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 8).

실시예 10: 세포 배양기술을 이용한 자극완화 효과 평가

본 실시예는 실시에 1에서 수득한 진피 추출물의 자극완화 효과를 평가하기 위하여 세포배양 기술을 이용하여 피부자극을 유발하는 물질인 소듐라우릴설페이트(Sodium Lauryl Sulfate; SLS)에 의한 세포사멸을 저해시키는 정도로 자극완화 효과를 평가하였다.

SLS는 화장품 기재의 피부자극 평가의 기준이 되는 물질로 세포막에 결합되어 세포대사 억제와 세포막을 파괴하여 피부자극을 유발하는 물질이다.

본 실시예는 사람 섬유아세포에 SLS와 진피 추출물을 동시에 첨가하였을때 SLS에 의한 세포사멸을 감소시키는 효과를 평가한 것이다.

본 실시예에 사용된 Hs68 섬유아세포는 사람의 피부 진피세포로 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 : 1635)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양기술을 이용한 자극완화 평가실험은 다음과 같이 행하였다.

사람 유래의 섬유아세포를 96공 평판 배양기에 각 웰당 1×10⁵농도로 분주하고, 24시간동안 배양한 후 0.01% SLS 단독, 0.01% SLS와 진피 추출물(0.01%)을 동시에 처리하고 24시간동안 추가 배양하였다. 배양 후 MTT(Sigma) 시약을 첨가하고 4시간동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 1N NaOH/이소프로판올용액을 첨가하여 20분간 교반한 후 흡광광도계로 565㎚에서 흡광도를 측정하여 진피 추출물이 SLS에 의한 세포사멸을 저해하는 효과를 측정하였다.

실험결과 진피 추출물은 SLS에 의해서 유발되는 세포사멸을 억제시킴으로써 화장료 기재와 함께 처방하였을 때 화장료 기재로 일어날 수 있는 피부 자극을 감소시키는 자극완화 물질임이 밝혀졌다(표 9).

시료명	섬유아세포 생존율(%)
0.01% SLS	25
0.01% SLS + 0.01% 진피 추출물	70

실험예 1

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 11 내지 13, 비교예 1)을 제조한다.

원료		실시예 비교예			비교예1
		11	12	13
가	스테아릴알콜	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2
	스테아린산콜레스테롤	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가) 알콜에스테르	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산에스테르	2	2	2	2
나	진피 추출물	10	1	0.1	-
	프로필렌글리콜	5	5	5	5
	정제수	적량	적량	적량	적량

주) 단위 : 중량%

실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 11 내지 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다. 표 11은 실시예 13에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색을 비교예 1로 만든 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색과 비교한 것이다.

사용제품	실시예 13	비교예 1
실험 인원 번호	오른쪽 피부색	왼쪽 피부색
1	1.5	2.5
2	2.0	3.0
3	1.5	3.0
4	2.0	3.0
5	2.5	3.0
6	1.5	2.5
7	2.5	3.5
8	2.0	3.5
9	2.0	3.0
10	1.5	2.0
11	2.0	3.0
12	1.5	2.5
13	1.5	2.0
14	2.0	2.0
15	2.0	3.0
16	1.5	2.5
17	2.0	3.0
18	2.5	3.0
19	1.0	2.5
20	1.5	3.5

실험 결과 진피 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 2

본 실험예에서는 상기 실시예 11 내지 13, 비교예 1에서 제조된 크림형태 화장료를 사람을 대상으로 적용하여 피부 잔주름 개선효과를 평가하였다.

실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽부위에는 실시예 11 내지 13에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 잔주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하였다.

표 12는 실시예 12에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소율을 비교예 1의 크림을 사용한 실험자와 비교한 것이다. 표 12에서 나타난 바와 같이 진피 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 눈주위 피부에서 피부 잔주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

	실시예 12		비교예 1
	사용전	2개월 후	사용전	2개월 후
평균 잔주름 깊이(AU)	0.201	0.160	0.199	0.195
사용전 대비 주름 감소율(%)	20.4%		2.0%

n=20, p<0.01

실험예 3

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 진피 추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포실험으로 평가하였다. 본 평가는 실시예 10에서 얻어진 결과를 인체에 직접 적용하여 얻어진 평가의 결과이다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS와 상기 실시예 11 내지 13에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가하였다.

20~50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박부위에 FINN CHAMBER (FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.2mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 진피 추출물을 함유하는 제품을 첩포하고 24시간, 48시간, 72 시간 경과 후에도 아무런 피부 발적을 일으키지 않았다.

이 평가의 결과는 진피 추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 의미한다.

이하에서는 그 외의 실시예를 나타내었다.

실시예 14: 진피 추출물을 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올리엘알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 진피 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선 효과가 있는 화장수를 제조하였다.

실시예 15: 진피 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸 알콜(setyl alcohol) 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아리에드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합 용해하고, 실시예 2에서 수득한 진피 추출물 0.05g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열하여 가열용해 시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수/유중계형의 피부개선효과가 있는 유액을 제조하였다.

실시예 16: 진피 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에스텔에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 진피 추출물 각 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선 효과가 있는 미용액을 얻었다.

즉, 진피 추출물을 주요 활성 성분으로 함유하는 화장료 조성물은 미백효과, 자극완화효과, 주름개선효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 진피 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성을 막아주는 티로시나제 활성 억제효과, 멜라닌 합성 억제효과 등의 미백효과와 자유라디칼 소거효과, 콜라게나제(MMP-1)의 활성 및 발현억제 등의 주름개선효과가 우수하고, 화장품 기재에 의해 야기되는 피부자극을 감소시키는 피부세포 사멸 억제효과, 염증 유발관련 효소 활성억제 효과 등의 피부자극 완화효과가 우수하다.

따라서, 이러한 진피 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 피부외용제 조성물은 항산화 효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절 효과, 피부 잔 주름 개선 효과, 미백, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부외용제로서의 효능을 가진다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원 발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원 발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 진피 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하고 항염증 또는 피부자극완화용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 진피 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하고 콜라겐 생성 촉진용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
6. 삭제