KR100729938B1 - Novel multi-glycosyl hydrolase gene cel44c from paenibacillus polymyxa gs01 strain - Google Patents
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Abstract
Description
도 1A는 23 내지 49kb DNA 사이즈 확인을 위하여 1㎖의 주사기를 이용하여 DNA를 부분적으로 마쇄한 후 전기 영동한 결과이며 도 1B는 5 내지 40%의 슈크로오즈 밀도 구배 초원심분리법을 이용하여 원심분리한 후 정액펌프를 이용하여 500㎕씩 1.5㎖ 마이크로 듀브에 분취하고 전기 영동한 결과이다.Figure 1A is a result of electrophoresis after partially crushed DNA using a 1ml syringe to confirm the 23 to 49kb DNA size and Figure 1B centrifuged using a 5 to 40% sucrose density gradient ultracentrifugation method After separation, the semen pump was used to collect 500 µl each in 1.5 ml micro-duve and subjected to electrophoresis.
도 2는 균주 GS01 게놈 라이브러리로부터 클론을 무작위로 선택하고 플라스미드 정제 후 제한효소 BamHI으로 자른 후 전기 영동한 결과이다.FIG. 2 shows the results of randomly selecting clones from the strain GS01 genome library, plasmid purification, cutting with restriction enzyme BamHI and electrophoresis.
도 3A는 균주 GS01 게놈 라이로부터 셀루라아제(cellulase) 활성 클론을 스크리닝한 결과이며 도 3B는 자이란아제(xylanase) 활성 클론을 스크리닝한 결과이다.FIG. 3A shows the results of screening cellulase active clones from strain GS01 genomic lys and FIG. 3B shows the results of screening xylanase active clones.
도 4A는 셀루로즈 배지에 서브클로닝한 클론을 배양하여 셀루라아제 활성 클론을 스크리닝한 결과이며 도 4B는 활성 클론의 플라스미드를 분리한 후 여러 제한효소로 처리하여 전기 영동한 결과이다.4A is a result of screening cellulase active clones by culturing subcloned clones in cellulose medium, and FIG. 4B is a result of electrophoresis by separating plasmids of active clones and treating them with various restriction enzymes.
도 5는 다기능 단일효소인 cel44C 유전자의 DNA 염기서열, 프로모터 지역, 개방 해독 판톡틀(open reading frame, ORF)의 아미노산 서열을 나타낸 결과이다.Figure 5 is a result showing the amino acid sequence of the DNA sequence, promoter region, open reading frame (ORF) of the cel 44C gene is a multifunctional homoenzyme.
도 6은 다기능 단일효소인 cel44C 유전자의 구조와 셀루라아제, 자이란아제, 린첸안아제 및 만난아제 활성을 나타낸 결과이다.Figure 6 shows the structure of the cel 44C gene, which is a multifunctional single enzyme, and cellulase, jalanase , lincianase and mannanase activity.
도 7은 다기능 단일효소인 cel44C 유전자의 구조 분석을 통하여 서브클로닝한 클론의 한천확산법을 통하여 효소 활성을 나타낸 것으로 A는 셀루라아제(cellulase), B는 자이란아제(xylanase), C는 리첸아제(lichenase) D는 만난아제(mannanase) 효소 활성 결과이다.Figure 7 shows the enzyme activity through the agar diffusion method of the subcloned clone through the structural analysis of the multifunctional monoclonal cel 44C gene A is cellulase, B is xylanase, C is Richen Lichenase D is the result of mannanase enzyme activity.
도 8은 다기능 단일효소인 cel44C 유전자산물을 단백질 전기영동 후 활성염색법으로 단백질 분자량을 측정한 것으로 A는 셀루라아제(cellulase), B는 자이란아제(xylanase), C는 리첸아제(lichenase) 및 D는 만난아제(mannanase) 유전자산물을 확인한 결과이다.Figure 8 shows the molecular weight of the cel 44C gene product, which is a multifunctional single enzyme, by protein electrophoresis, followed by active staining. A is cellulase, B is xylanase, and C is lichenase. And D is the result of identifying the mannanase gene product.
도 9A는 다기능 단일효소인 cel44C 유전자산물의 pH 변화에 따른 결과이며 도 9B는 다기능 단일효소인 cel44C 유전자산물의 온도의 변화에 따른 결과이다.9A is a result of the pH change of the multi-function cel 44C gene products of a single enzyme 9B is a result of the change in the temperature of the multi-function cel 44C gene products of a single enzyme.
도 10은 부위 직접돌연변이법(site direct mutagenesis)를 위해 다기능 단일효소인 cel44C의 아미노산 서열과 기존에 알려진 8 가지의 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44)의 효소의 아미노산 서열의 결과이다.Figure 10 shows the amino acid sequence of the multifunctional monoclonal cel 44C for site direct mutagenesis and the amino acid sequence of the enzymes of the eight known glucosyl hydrolase family 44 (GH44). Is the result.
본 발명은 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주가 생성하는 단일효소로서 셀루로즈(cellulose), 자이란(xylan), 린첸안(lichenan) 및 만난(mannan)을 동시에 분해하는 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 5년근 인삼뿌리 내부로부터 내생균을 분리하고 식물 세포벽 분해력이 우수한 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주를 선발하여 상기 균주로부터 생성되는 cel44c 다기능성 단일효소 유전자 및 부위 직접 돌연변이법(site direct mutagenesis)을 이용하여 셀루로즈(cellulose), 자이란(xylan), 린첸안(lichenan), 및 만난(mannan)을 동시에 분해하는 본 발명 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기에 관한 것이다.The present invention is a penicillus polymix yarn ( Paenibacillus polymyxa ) is a single enzyme produced by the GS01 strain and relates to a gene that simultaneously degrades cellulose, xylan, lichenan and mannan. More particularly, 5 year-old ginseng root remove the bacteria from within the plant cell wall and internal bunhaeryeok excellent penny Bacillus miksa poly (Paenibacillus polymyxa ) GS01 strain was selected by using the cel 44c multifunctional single enzyme gene and site direct mutagenesis generated from the strain, such as cellulose, xylan, lichenan, And essential active amino acid residues of the genes of the invention which simultaneously degrade mannan.
식물의 세포벽은 많은 다른 다당류, 단백질, 방향족 화합물로 구성이 되어있다. 셀루로즈(cellulose)는 일차 식물 세포벽 건조중량의 약 15-30%와 이차 식물 세포벽 대부분을 차지하고 있으며, 글루코우스(glucose)가 베타 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다. 자이란(xylan)은 헤미셀루로즈의 일종으로 식물 세포벽의 주요 성분이며, 자일로즈(xylose)가 베타 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다. Plant cell walls are made up of many different polysaccharides, proteins, and aromatic compounds. Cellulose (cellulose) accounts for about 15-30% of the dry weight of primary plant cell walls and most of the secondary plant cell walls. Glucose is a polysaccharide with
만난(mannan) 역시 헤미셀루로즈이며, 만노오즈(mannose)가 베타 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다. 린첸안(lichenan)은 식물의 내배유 조직과 곡류에 존재하는 식물 다당류로 글루코스(glucose)가 베타 1→3과 1→4 결합을 하고 있는 다당류이다.Mannan is also hemicellulose, a polysaccharide in which mannose has a
많은 세균, 곰팡이, 및 동물에서 식물 세포벽을 분해하는 효소들을 암호화하 는 유전자들이 보고 되어있다. 셀루로즈(cellulose)를 분해하는 셀루라아제(cellulase)는 글루코실 하이도라제 패밀리(glycosyl hydrolase family) 5, 8, 9, 44, 45, 48, 및 61 등이 해당되며, 자이란(xylan)을 분해하는 자이란아제(xylanase)는 글루코실 하이도라제 패밀리 10, 11, 및 43 등이 해당되며, 만난의 분해효소인 만난아제는 글루코실 하이도라제 패밀리(glycosyl hydrolase family) 5 및 26 등이 있었으며, 린첸안(lichenan)의 분해효소인 린첸안아제(lichenanase)는 글루코실 하이도라제 패밀리(glycosyl hydrolase family) 16이 대표적이다. Genes encoding enzymes that degrade plant cell walls have been reported in many bacteria, fungi, and animals. Cellulase that degrades cellulose includes the glucosyl hydrolase family 5, 8, 9, 44, 45, 48, and 61, and xylan The xylanase that degrades the
식물 세포벽을 분해하는 효소를 암호화하는 유전자에는 탄수화물 분해를 촉매하는 도메인(catalytic domain, CD), 탄수화물에 결합하는 도메인(carboxylhydrolate binding domain, CBD), 섬유소 기질에 결합하는 도메인(fibronectin, Fn) 등으로 구성되어 있다. Genes encoding enzymes that degrade plant cell walls include catalytic domains (CDAs), carbohydrate-binding domains (CBD), and fibrinogen-binding domains (fibronectin, Fn). Consists of.
이들 중에서 글루코실 하이도라제 패밀리 44는 지금까지 많이 보고가 되지 않은 식물 세포벽 분해효소이다. Of these, glucosyl hyorase family 44 is a plant cell wall degrading enzyme that has not been reported much until now.
본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 본 발명의 목적은 식물 뿌리 내부에 존재하는 균주를 분리, 그 균주의 게놈 라이브러리 제작을 통하여 셀루로즈, 자이란, 린첸안, 및 만난을 동시에 분해하는 단일 유전자를 제공하는데 있다.The present invention has been made in view of the above points, and an object of the present invention is to isolate the strains present inside the plant roots and simultaneously meet cellulose, jalan, lincian, and met through the production of the genome library of the strains. To provide a single gene that degrades.
본 발명의 다른 목적은 셀루로즈, 자이란, 린첸안, 및 만난을 동시에 분해하는 단일 유전자의 필수 아미노산 잔기를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide essential amino acid residues of a single gene that simultaneously degrade cellulose, xylan, lincian, and mannan.
인삼 뿌리 내부로부터 식물 세포벽 분해력이 뛰어난 균주을 선발한 후 단일효소로서 여러 가지 식물 세포벽을 분해하는 신규한 유전자를 분리하고 상기 유전자를 대장균에 이종 발현시킨 후 유전자의 염기 서열과 아미노산 서열을 결정하고 유전자 산물의 확인 및 효소적 특징 분석과 셀루로즈, 자이란, 린첸안 및 만난을 동시에 분해하는 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기를 확인함으로써 본 발명을 달성하였다.After selecting strains with excellent plant cell wall degrading ability from the inside of ginseng roots, isolate new genes that decompose various plant cell walls as single enzymes and heterologously express these genes in E. coli, determine the nucleotide and amino acid sequences of the genes The present invention has been accomplished by the identification and enzymatic characterization of and the identification of essential active amino acid residues of genes that simultaneously degrade cellulose, xylan, lincian and mannan.
본 발명은 인삼뿌리 내부를 완충액을 넣고 분쇄한 후 한천배지에 도말하여 배양한 후 내생균을 분리하는 단계; 식물 세포벽 분해효소 활성을 조사하는 단계; 상기 분리된 균주를 형질도입하여 다기능 단일 유전자 스크리닝 단계; 중합효소연쇄반응을 이용하여 다기능 단일 유전자의 구조 분석 단계; 효소의 클로닝 및 형질전화하여 얻은 클론을 배양하여 그 상등액을 조효소로 사용하여 다기능 단일 유전자 산물을 확인하는 단계; 디니트로살리시릭산(dinitrosalicylic acid)을 이용한 환원당 정량법으로 다기능 단일효소의 생화학적 특징 검사 단계 및 부위 직접 돌연변이법으로 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기를 확인하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of separating the endogenous bacteria after incubation by crushing the inside of the ginseng root buffer and then pulverized agar medium; Examining plant cell wall degrading enzyme activity; Multi-functional single gene screening by transducing the isolated strain; Structural analysis of a multifunctional single gene using a polymerase chain reaction; Culturing clones obtained by cloning and transfecting enzymes and using the supernatant as coenzymes to identify multifunctional single gene products; Reducing sugar quantification using dinitrosalicylic acid consists of a biochemical characterization step of the multifunctional single enzyme and a site direct mutagenesis to identify essential active amino acid residues of the gene.
본 발명에서 분리된 균주를 대장균(E. coli) EP1300TM에 형질도입하였고 유 전자 스크리닝은 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 단일 유전자를 스크리닝하였다.The strain isolated in the present invention was transduced into E. coli EP1300TM and the gene screening was transformed into E. coli DH5α to screen a single gene.
본 발명에서 단일 유전자의 DNA 염기서열 분석은 PRISM Ready reaction dye terminator/primer cycle sequencing kit(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA)를 이용한 사슬종결법으로 DNA 염기서열 분석하였다.In the present invention, DNA sequencing of a single gene was performed by DNA chain sequencing using PRISM Ready reaction dye terminator / primer cycle sequencing kit (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA).
본 발명에서 단일 유전자의 DNA 염기서열의 연결 및 아미노산의 개방 해독 판독틀(open reading frame, ORF) 분석을 DNAMAN 분석 시스템(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 이용하여 분석하였다. In the present invention, the linkage of DNA sequences of a single gene and an open reading frame (ORF) analysis of amino acids were analyzed using a DNAMAN analysis system (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada).
본 발명에서 단일 유전자의 DNA와 아미노산의 상동성 조사는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 블라스트(BLAST) 네트워크 서비스와 DNAMAN 분석 시스템(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 이용하여 조사하였으며 다기능 단일효소를 생성하는 신규한 유전자(cel44C)는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록 번호 DQ367923으로 등록되었다.In the present invention, the homology of DNA and amino acid of a single gene is analyzed using the BLAST network service of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the DNAMAN analysis system (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). A new gene ( cel 44C), which produces multifunctional homoenzymes, was registered with the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under accession number DQ367923.
본 발명에서 단일 유전자의 필수 활성 아미노산 잔기는 부위 직접 돌연변이법으로 Site directed mutagenesis kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 사용하였고 중합효소연쇄반응을 실시한 후 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 DNA 염기서열을 분석한 후 효소들 간의 활성을 조사하였다.In the present invention, the essential active amino acid residue of the single gene was used as site directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) as a site direct mutagenesis and transformed to E. coli DH5α after polymerase chain reaction. DNA sequences were analyzed and enzyme activity was examined.
이하 본 발명의 구성을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명 의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited only to the following examples.
실시예1Example 1 : 균주 분리 및 분해효소 활성 조사: Strain Separation and Degradation Enzyme Activity
5년근 인삼뿌리를 세척한 후 물기를 제거하고 1% 염소로 10분 동안 침지하여 인삼뿌리 표면을 소독한다. 그 후에 인삼뿌리의 표면으로부터 약 0.5cm를 제거하고 남은 인삼뿌리 내부를 살균된 막자사발에 넣은 후 살균 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.2)을 넣고 완전히 마쇄한 후 트리피틱 소이 한천배지(TSA, Difco, USA)에 도말하여 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 내생 균주를 분리하였다. 상기 분리된 내생균주를 한천 확산법으로 셀루라아제, 자이란아제, 펙틴아제 및 프로테아제의 식물 세포벽 분해효소 활성을 조사한 결과 상기 내생균주 중 GS01 균주가 식물세포벽 분해효소 활성이 가장 우수하였다(표 1; -: 활성 없음, +: 약간 활성, ++: 중간 활성, +++: 강한 활성). GS01 균주는 16S rRNA 염기서열을 통해서 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)로 동정되었고 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01로 명명하였다. After 5 years old ginseng root is washed, it is drained and soaked with 1% chlorine for 10 minutes to disinfect the surface of ginseng root. After removing about 0.5cm from the surface of the ginseng root, put the remaining ginseng root inside the sterilized mortar, add sterilized 10mM phosphate buffer (pH 7.2) and completely crush it, and then try pulpy agar medium (TSA, Difco, USA). ) And incubated for 48 hours at 28 ℃ to isolate the endogenous strain. As a result of investigating plant cell wall degrading enzyme activity of cellulase, jalanase, pectinase and protease by using the isolated endogenous strains in the agar diffusion method, GS01 strain among the endogenous strains had the best plant cell wall degrading enzyme activity (Table 1; -: No activity, +: slightly active, ++: medium active, +++: strong active). GS01 strain was identified as Paenibacillus polymyxa via 16S rRNA sequence and Paenibacillus polymyxa ) was named GS01.
<표 1> 인삼뿌리 내부로부터 분리한 내생균들의 식물세포벽 분해 활성<Table 1> Plant Cell Wall Degradation Activity of Endogenous Bacteria Isolated from the inside of Ginseng Root
실시예2Example 2 . 균주 . Strain GS01GS01 게놈 라이브러리 구축 Build a Genome Library
균주 GS01의 토탈 게놈 DNA를 분리한 후 DNA 농도 측정하여 100 ㎍/㎖되게 희석을 한다. 상기 희석된 DNA를 1㎖씩 1.5㎖ 마이크로 듀브에 담은 후 1㎖의 주사기를 이용하여 DNA를 부분적으로 마쇄한 후 전기 영동하여 23 내지 49kb의 사이를 확인한 후 이차 사이즈 선발을 위하여 5 내지 40%의 슈크로오즈 밀도 구배 초원심분리법을 이용하여 원심분리한 후 정액펌프를 이용하여 500㎕씩 1.5 ㎖ 마이크로 듀브에 분취하고 전기 영동하여 23 내지 49kb의 사이즈를 확인하였다. 사이즈 확인된 라인을 모아서 DNA를 정제하고 DNA 끝을 수선(End-repair)한 후 코스미드 pCC1FOSTM 운반체에 연결하고 람다 DNA 페키징 키드에 포장하여 대장균(E. coli) EP1300TM 에 형질 도입하여(Epicentre, WI, USA), 약 4,000,000 클론의 코스미드 라이브러리 풀(pool)을 확보하였다. 이 코스미드 라이브러리를 384 격자에 넣어 배양한 후 한천 확산법으로 식물세포벽 분해 활성 클론을 스크린하였다(도 1 내지 3).Total genomic DNA of strain GS01 was isolated and DNA concentration was measured and diluted to 100 ㎍ / ml. After diluting the diluted DNA in 1.5ml micro-dive by 1ml and partially grinding the DNA using 1ml syringe, electrophoresis was performed to confirm the range of 23 to 49kb, and then 5 to 40% of the size was selected for the secondary size selection. After centrifugation using the sucrose density gradient ultracentrifugation method, 500 µl each was aliquoted into a 1.5 ml micro-dube using a semen pump, followed by electrophoresis to confirm the size of 23 to 49 kb. Collect the sized lines, purify the DNA, repair the DNA ends, connect them to the cosmid pCC1FOSTM carrier, package them in a lambda DNA packaging kit, and transduce them into E. coli EP1300TM (Epicentre, WI, USA), a pool of cosmid libraries of approximately 4,000,000 clones was obtained. The cosmid library was cultured in a 384 grid and screened for plant cell wall degradation activity clones by agar diffusion (FIGS. 1 to 3).
실시예3Example 3 . 다기능 단일 유전자의 . Of multifunctional single gene DNADNA 서열 및 아미노산 서열 Sequence and Amino Acid Sequence
DNA와 아미노산의 상동성 조사는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 블라스트(BLAST) 네트워크 서비스와 DNAMAN 분석 시스템(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 이용하여 조사하였다. 셀루라아제 분해활성이 있는 코스미드 클론(cel44F)을 퀴아젠 중간 플라스미 드(Qiagen midi plasmid kit, USA)를 이용하여 코스미드 플라스미드를 분리한 후 숏트간(shunt gun) 방법으로 서브클로닝하여 카복실메칠셀루로즈가 들어있는 배지에서 접종하여 활성이 있는 클론 선발하고 플라스미드를 분리하여 여러 제한효소를 처리하여 DNA 지도를 작성하는 동시에 다기능 단일효소를 코딩하는 유전자 서열 및 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 2와 같았다. DNA and amino acid homology was investigated using the BLAST network service of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the DNAMAN analysis system (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). Cellulase-degrading cosmid clone (cel44F) was isolated from cosmid plasmid using Qiagen midi plasmid kit (USA) and subcloned by shunt gun method to carboxyl Genes and amino acid sequences encoding a multifunctional homoenzyme are prepared by inoculating in a medium containing methyl cellulose and selecting active clones, separating plasmids, and processing various restriction enzymes to prepare DNA maps. It was like
개방 해독 판독틀(open reading frame, ORF)을 코딩하는 유전자는 4,056 bp이며 아미노산은 1,352로 구성되어져 있었다. ATG가 시작 코돈이고 오처(ochre) 코돈인 TAA가 종결 코돈이며, 프로모터 영역에 -35 지역, -10 지역, 및 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, RBS)인 GGAGG로 구성이 되어 있었다(도 4 내지 5).The gene encoding the open reading frame (ORF) was 4,056 bp and the amino acid consisted of 1,352. ATG is the start codon and Ocher codon TAA is the stop codon and the promoter region consists of the -35 region, -10 region, and the GGAGG ribosome binding sequence (RBS) (FIG. 4). To 5).
실시예4Example 4 . 다기능 단일유전자의 유전자 구조 분석. Gene Structure Analysis of Multifunctional Single Genes
본 발명 유전자의 구조 분석은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 기초로 하였다. 중합효소연쇄반응을 실시하기 위해 제작한 정방향 프라이머에는 BamHI의 제한효소를 만들고 역방향 프라이머에는 새로운 종결코든과 SalI의 제한 효소를 만들어 중합효소연쇄반응을 한 후 증폭산물과 운반체인 pBluescript II SK+를 BamHI과 SalI의 제한효소로 처리한 후 정제하여 연결하고 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 그 특성을 분석하였다. 본 발명 다기능 단일효소인 cel44C 유전자는 pBluescript II SK+ 운반체에 안에 약 5.1 kb 정도 클로닝 되었으며, 유전자의 구조 분석을 위하여 여러 프라이머를 제작하여 pBluescript II SK+ 운반체에 다시 서브클로닝 하였다. The structural analysis of the gene of the present invention was based on polymerase chain reaction (PCR). The primer prepared for the polymerase chain reaction was made with Bam HI restriction enzyme and the reverse primer was made with a new termination code and Sal I restriction enzyme, followed by polymerase chain reaction. PBluescript II SK + After treatment with Bam HI and Sal I restriction enzymes were purified and linked and transformed into E. coli DH5α to analyze its properties. The cel 44C gene of the present invention multifunctional single enzyme was cloned into the pBluescript II SK + carrier in about 5.1 kb. Subsequently, several primers were prepared for structural analysis of the gene and subcloned again in the pBluescript II SK + carrier.
다기능 단일효소인 cel44C 유전자 시그날 펩타이드(signal peptide, SP), 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44) 도메인, 피브로넥틴 타입 3(fibronectin type 3, Fn3) 도메인, 글루코실 하이도라제 패밀리 26(glycosyl hydrolase family 44, GH26) 도메인 및 셀루로즈 결합 타입3 모둘레스(cellulose-binding modules type 3, CBM3)로 구성되어 있다. 글루코실 하이도라제 패밀리 26(glycosyl hydrolase family 44, GH26) 도메인은 오로지 만난아제 활성만이 관여하는 도메인인 것으로 나타났으며, 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44) 도메인은 셀루라아제, 자이란아제, 및 린첸안아제을 동시에 분해하는 다기능 도메인인 것으로 나타났다. Cel 44C gene signal peptide (SP), glucosyl hydrolase family 44 (GH44) domain, fibronectin type 3 (Fn3) domain, glucosyl hydorase Glycosyl hydrolase family 44 (GH26) domain and cellulose-binding modules type 3 (CBM3). The glucosyl hydrolase family 44 (GH26) domain has been shown to be a domain in which only mannanase activity is involved, while the glucosyl hydrolase family 44 (GH44) domain is It has been shown to be a multifunctional domain that simultaneously cleaves ase, jalanase, and lincianase.
피브로넥틴 타입 3(fibronectin type 3, Fn3) 도메인과 셀루로즈 결합 모둘레스 타입3 (cellulose-binding modules type 3, CBM3)는 효소활성에 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다(표 2 및 도 6 내지 7).Fibronectin type 3 (Fn3) domains and cellulose-binding modules type 3 (cellulose-binding
표 2. 다기능 단일효소인 cel44C 유전자 구조 분석을 위한 프라이머Table 2. Primers for cel 44C gene structure analysis
실시예5Example 5 . 다기능 단일효소의 도메인별 . Per domain of multifunctional homoenzyme 상동성Homology 비교 compare
본 발명 다기능 단일효소인 cel44 유전자의 4가지 도메인과 기존에 밝혀진 도메인과 상동성을 비교한 결과 글루코실 하이도라제 패밀리 44(glycosyl hydrolase family 44, GH44) 도메인과 가장 높은 상동성은 페니바실러스 란투스(Paenibacillus latus)의 celA와 63.3%, 피브로넥틴 타입 3(fibronectin type 3, Fn3) 도메인은 페니바실러스 종(Paenibacillus sp.) BP-23의 cel48C와 47.8%, 글루코실 하이도라제 패밀리 26(glycosyl hydrolase family 44, GH26) 도메인은 딕툐그로무스 써모필윰(Dictyoglomus thermophilum) Rt46B.1의 manA와 59.1% 있었으며, 셀루로즈 결합 타입3 모둘레스(cellulose-binding modules type 3, CBM3)는 칼디바실러스 셀루로보란스(Caldibacillus cellulovorans)의 xylA와 60.7%로 가장 상동성이 높았다. 모든 도메인 기존에 알려진 것과 상동성이 높지 않은 것으로 보아 본 발명 다기능 단일효소인 cel44C는 신규한 효소이며 이를 코딩하는 유전자 역시 신규한 유전자인 것으로 확인이 되었다(표 3).Multifunctional monoenzyme of the present inventioncelComparing homology with the four domains of the 44 gene and the previously discovered domains, the highest homology with the glucosyl hydrolase family 44 (GH44) domain was found to be the same as those of the penivacillus lantus (Paenibacillus latus)ofcel63.3% of A and fibronectin type 3 (Fn3) domains were identified as penivacillus spp.Paenibacillus sp.) of BP-23cel48C and 47.8%, the glucosyl hydrolase family 44 (GH26) domains were derived from Dick Grommoth Thermophile (Dictyoglomus thermophilum) Of Rt46B.1man59.1% with A, and cellulose-binding modules type 3 (CBM3) was found to be Cardicillus celluloborance (CBM3).Caldibacillus cellulovorans)ofxylThe most homology with A was 60.7%. All domains of the present invention are not highly homologous to those known in the art.cel44C is a novel enzyme and the gene encoding it was also identified as a novel gene (Table 3).
표 3. 본 발명 다기능 단일효소 cel44C와 기존에 알려진 도메인별 상동성 비교Table 3. Comparison of homology between domains of the present invention and the previously known multifunctional single enzyme cel 44C
실시예6Example 6 : 다기능 단일효소의 : Of multifunctional single enzyme 유전자산물Gene product 확인 및 특징 Confirmation and features
본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 유전자 산물은 단백질 전기영동 후 활성 염색을 통하여 확인하였다. 셀루로즈, 자일이란, 리첸, 및 만난 기질에 대하여 각각 확인한 결과 모두 약 145,000Da으로 확인되었다. 또한 생물정보학 켬퓨터 등전점과 분자량을 측정한 결과 145,294Da로 동일한 결과를 보였다 (http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html). The gene product of the multifunctional single enzyme cel 44C of the present invention was confirmed through active staining after protein electrophoresis. The cellulose, xyl, lichen, and met substrates were respectively identified as about 145,000 Da. In addition, the bioinformatics on computer isoelectric point and molecular weight were measured to be the same as 145,294 Da (http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html).
본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과 셀루로즈와 리첸을 분해하는 셀루라아제와 리첸아제는 pH 7.0에서 최적 활성을 나타냈었으며, 자이란과 만난를 분해하는 자이란아제와 만난아제는 pH 5.0에서 최적 활성을 나타냈었다. 다기능 단일효소 cel44C의 온도에 대한 영향을 살펴본 결과 셀루로즈, 자일이란, 리첸, 및 만난의 모든 기질에 대해서 50℃에서 최적 활성을 나타내었다(도 8 내지 9). As a result of examining the effect on the pH of the multifunctional single enzyme cel 44C of the present invention, the cellulase and richenase decomposing cellulose and richen showed an optimal activity at pH 7.0, and met with the gyranase which decomposes zair and mannan. Aze showed optimal activity at pH 5.0. As a result of examining the effect on the temperature of the multifunctional single enzyme cel 44C, cellulose, xyllan, lichen, and all the substrates of mannan showed optimal activity at 50 ° C (FIGS. 8 to 9).
실시예7Example 7 : 다기능 단일효소의 필수 아미노산 : Essential amino acid of multifunctional homoenzyme 잔기Residue 확인 Confirm
본 발명 다기능 단일효소 cel44C 유전자의 활성 부위 조사는 부위 직접 돌연변이법으로 수행하였다(Site directed mutagenesis kit, Stratagene, La Jolla, CA, USA). 본 발명 cel44C 유전자가 코딩하는 아미노산 서열과 기존에 알려진 8개의 아미노산 서열을 정렬하여 글루타믹산(glutamic aicd, Glu, E)과 아스파틱산(aspartic acid, Asp, D)이 일치하는 14개의 지역을 선정한 후 글루타믹산과 아스파틱산 모두를 알라닌(Alanie, Ala, A)으로 대처한 프라이머를 제작한 후 pET-29(+)/P558 플라스미드를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 DpnI의 제 한효소로 처리한 후 대장균(E. coli) DH5α에 형질전환하여 얻은 클론에서 플라스미드를 정제하여 DNA 염기서열 분석하여 변화된 것을 확인 한 후 본 발명 다기능 단일효소 cel44C 유전자의 기존 효소와 무탄트(mutant)된 효소들 간의 활성을 조사하였다(표 4). Investigation of the active site of the multifunctional single enzyme cel 44C gene of the present invention was performed by site direct mutagenesis (Site directed mutagenesis kit, Stratagene, La Jolla, CA, USA). By aligning the amino acid sequence encoded by the cel 44C gene of the present invention and eight known amino acid sequences, 14 regions in which glutamic acid (glutamic aicd, Glu, E) and aspartic acid (Asp, D) coincide with each other after selection of glutaric then subjected to dynamic acid aspartate lactic acid] after the fabrication of a primer cope both with alanine (Alanie, Ala, a) pET -29 (+) / P558 plasmid to the used as a template PCR agent of the Dpn I After treating with an enzyme and confirming that the plasmid was purified from the clone obtained by transforming E. coli DH5α, DNA sequencing was confirmed, and then changed to the existing enzyme and mutant of the multifunctional single enzyme cel 44C gene of the present invention. The activity between the enzymes was examined (Table 4).
표 4. 본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 부위 직접 돌연변이법을 위한 프라이머Table 4. Primers for site direct mutagenesis of the present multifunctional single enzyme cel 44C
본 발명 다기능 단일효소 cel44C의 구십 한 번째 글루타믹산(E91A)과 이백 이십 두 번째 글루타믹산(E222A)을 알라닌(Alanie)으로 변화시킨 결과 셀루로즈, 자이란, 및 린첸안을 분해할 수 있는 효소 활성이 소실한 것으로 보아 셀루로즈, 자이란, 및 린첸안을 분해하는데 이 두 아미노산이 필수 아미노산 잔기인 것으로 확인되었다. 그 외 다른 무탄트 단백질들은 활성이 기존 단백질과 비슷하거나 2 내지 4배 정도로 활성이 작아졌다(표 5 및 도 10).As a result of transforming ninety-first glutamic acid (E91A) and two hundred twenty-second glutamic acid (E222A) of the multifunctional single enzyme cel 44C to alanine, it is possible to decompose cellulose, xylan, and lincian. The loss of enzymatic activity has confirmed that these two amino acids are essential amino acid residues for the degradation of cellulose, xylan, and lincian. Other no-mutant proteins have activity that is similar to that of existing proteins, or 2 to 4 times less activity (Table 5 and Figure 10).
표 5. 본 발명 다기능 단일효소 cel44C와 이들 무탄드 단백질의 셀루로즈, 자이란, 및 린첸안 분해를 위한 효소의 특정적 활성과 상대적 활성Table 5. Specific and Relative Activities of Enzymes for Cellulose, Jalan, and Lincian Degradation of the Multifunctional Single Enzyme cel 44C of the Invention
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) GS01 균주로부터 분리한 본 발명 cel44 유전자는 단일효소로서 셀로루즈, 자이란, 린첸안, 및 만난를 동시에 분해하는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 제지공업 및 유기농 생산을 위한 환경산업 및 농업산업에 있어 매우 유용한 발명인 것이다.As described through the above examples, the penicillus polymix yarn ( Paenibacillus polymyxa ) The cel 44 gene of the present invention isolated from the GS01 strain has a very excellent effect of simultaneously degrading cellulose, jalan, lincian, and mannan as a single enzyme, which is very useful in the environmental and agricultural industries for paper and organic production. It is a useful invention.
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