KR100720052B1 - Microsphere or microbead coated with nanoparticle containing growth factor for regenerating cartilaginous tissue - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 코팅된 성장인자에 의한 신경의 재생에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 카르복실기가 밖으로 나와있는 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 양이온으로 구성된 폴리에틸렌이민으로 정전기적 결합을 시켜 양이온이 바깥쪽에 나와 있게 하여, 바깥 쪽 폴리에틸렌이민에 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체를 정전기적 반응에 의하여 코팅을 시켜, 줄기세포의 분화유도를 유발하여 연골조직재건을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드는 주사형 마이크로제작 스캐폴드로 이용될 수 있다.The present invention relates to the regeneration of nerves by growth factors coated on microspheres or microbeads, and more specifically, to a cation by electrostatic bonding of polyethyleneimine composed of cations to microspheres or microbeads in which carboxyl groups are out. By coating the polymer electrolyte complex containing growth factor in the outer polyethyleneimine to the outside by electrostatic reaction, inducing the differentiation of stem cells, microspheres or microbeads for cartilage tissue reconstruction are injected. It can be used as a microfabrication scaffold.

마이크로스피어, 마이크로비드, 성장인자, 나노입자, 체내주입형물질 Microspheres, Microbeads, Growth Factors, Nanoparticles, Injectable Substances

Description

성장인자를 함유한 나노입자가 코팅된 연골 조직 재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드 {Microsphere or microbead coated with nanoparticle containing growth factor for regenerating cartilaginous tissue}Microsphere or microbead coated with nanoparticle containing growth factor for regenerating cartilaginous tissue}

도 1은 TGF-b3가 함유된 나노입자들이 코팅되어 있는 마이크로스피어의 표면을 관찰한 도이고,1 is a view of the surface of the microspheres coated with nanoparticles containing TGF-b3,

도 2는 TGF-b3가 함유된 나노입자가 함유된 마이크로스피어 표면의 세포 점착을 관찰한 도이며,2 is a diagram illustrating the cell adhesion of the surface of the microspheres containing nanoparticles containing TGF-b3,

도 3은 TGF-b3가 1㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 콜라젠타입 II의 발현으로 관찰한 도이고,3 is a diagram illustrating the cartilage of mesenchymal stem cells in the expression of collagen type II in the nanospheres coated with nanoparticles containing TGF-b3 at a concentration of 1 μg / ml,

도 4는 TGF-b3가 1㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 면역조직학적 검사를 통해서 살펴본 도이다.FIG. 4 is a diagram illustrating cartilage of mesenchymal stem cells in nanospheres coated with nanoparticles containing TGF-b3 at a concentration of 1 μg / ml through immunohistochemistry. FIG.

조직공학기술은 인공장기, 의료용구 및 바이오 인공장기 개발 기술로써 국민보건 향상 및 삶의 질 향상이라는 측면과 함께 기술개발, 경제적 측면에서도 매우 중요하다. 관절 연골은 특이하게 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로의 재생이 불가능한 조직이다. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다.(Willers C et al, Tissue Engineering , 11(7-8), p.1065, 2005; Okamoto T et al, Nippon Rinsho Mar, 61(3), pp.432-438, 2003)Tissue engineering technology is a technology for developing artificial organs, medical devices, and bio-artificial organs, which is very important in terms of technology development and economics as well as improving public health and quality of life. Articular cartilage is a tissue that is uniquely devoid of blood vessels, nerves and lymphatic tissues and therefore is unable to regenerate itself after injury. Current medical methods are very limited in the ability to regenerate articular cartilage normally (Willers C et al, Tissue Engineering , 11 (7-8), p.1065, 2005; Okamoto T et al, Nippon). Rinsho Mar , 61 (3) , pp.432-438, 2003)

자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 예측 가능하고, 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력이 바로 연골의 조직공학적 재생이다.(kang et al. Tissue Engineering, 11(3-4), pp.438-447, 2005)The regeneration of cartilage tissue by autologous chondrocyte transplantation has been recently tried and is known to be a clinically effective surgical method, but it has limitations due to the fact that it cannot be used for a wide range of cartilage damage, the location of articular cartilage damage, and the age of the patient. . The effort to solve these problems and develop more predictable and safer surgical methods is histological regeneration of cartilage (kang et al. Tissue Engineering, 11 (3-4) , pp.438-447, 2005)

인공연골의 제작에 관한 연구가 이미 외국에서 활발하게 수행 중이며, 유럽에서는 이미 연골세포운반체와 함께 연골세포의 이식하는 치료법이 사용되고 있는 실정이다. (Meyer U et al, Eur Cell Mater, Apr 26(9), pp.39-49, 2005) 조직공학적으로 제작이 시도되고 있는 장기 중 관절 연골은 인공피부와 함께 실현 가능성이 가장 높고, 실용화가 빠른 장기 중의 하나로 인식되고 있다Research on the manufacture of artificial cartilage has already been actively conducted in foreign countries, and in Europe, the treatment method for transplanting chondrocytes together with the chondrocyte carriers has been used. Meyer U et al, Eur Cell Mater , Apr 26 (9) , pp.39-49, 2005) Articular cartilage has been recognized as one of the most feasible and quick to use with artificial skin.

인체에서 관절 연골의 특징은 관절 연골의 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 연골 총 부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성, 분비하므로 관절 연골 의 유지에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나로 생각되고 있다.( Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, Dec, 63(12), pp.1618-1622, 2004) The characteristic of articular cartilage in the human body is the tissue with the largest weight load among the human tissues of articular cartilage, which is easily exposed to damage caused by wear. Articular cartilage is a free cartilage (hyaline cartilage) consisting of chondrocytes and abundant extracellular matrix. Cartilage cells occupy less than 10% of the total volume of cartilage and play an important role in the maintenance of articular cartilage because it synthesizes and secretes extracellular matrix. Reduction of chondrocyte number and chondrocyte metabolism by aging is considered to be one of the etiologies of osteoarthritis, a high prevalence of senile diseases. (Bobacz K et al, Ann Rheum Dis , Dec, 63 (12) , pp. 1618-1622, 2004)

관절 연골의 조직공학적인 재생에 줄기세포가 효과적인 이유는 줄기세포 그 자체가 무한한 증식능력과 다양한 분화능력으로 인하여 연골뿐만 아니라 모든 장기의 재생에 이상적인 세포로 인식되고 있다. 특히 골수 줄기세포는 주위 환경에 따라 골 및 연골조직으로의 분화가 매우 용이하므로 연골조직의 공학적 제작에 유리하며, 직접적인 줄기세포의 이식은 골-연골 손상을 동시에 치유할 수 있을 것으로 생각되고 있다. (Spagnoli A et al. Endocr Dev, 9, pp.17-30, 2005; Song L et al, cytotherapy 6(6), pp.596-601, 2004)The reason why stem cells are effective for tissue engineering regeneration of articular cartilage is that stem cells themselves are recognized as ideal cells for regeneration of all organs as well as cartilage due to their infinite proliferation and differentiation capacity. In particular, bone marrow stem cells are very easy to differentiate into bone and cartilage tissues according to the surrounding environment, which is advantageous for the engineering of cartilage tissues, and direct stem cell transplantation is thought to be able to simultaneously treat bone-cartilage damage. Spagnoli A et al. Endocr Dev , 9, pp . 17-30, 2005; Song L et al, cytotherapy 6 (6) , pp. 596-601, 2004)

성체 줄기세포에서 연골세포로의 분화를 조절하는 마스터 유전자(master gene)에 관하여서는 자세히 밝혀져 있지 않다. 골수 줄기세포를 포함하여 성체 조직에 존재하고 있는 줄기세포는 그 분화 정도를 볼 때 매우 다양한 세포들의 복합체라고 할 수 있으며, 이들 세포군들이 가지는 연골세포로의 분화능력이 동일하지 않을 것이므로, 단일화된 세포들로 분리하는 방법이 개발된다면 보다 효과적인 조직재생이 이루어질 수 있을 것이다. The master gene that regulates the differentiation of adult stem cells into chondrocytes is not known in detail. Stem cells present in adult tissues, including bone marrow stem cells, can be regarded as complexes of a wide variety of cells in terms of their degree of differentiation. If a separation method is developed, more effective tissue regeneration can be achieved.

관절 연골의 성공적인 조직공학적인 제작에 있어 필수적으로 고려되어야 할 부분으로는 생체조직공학적 제작이 시도되고 있는 장기 중 연골은 실현 가능성이 가장 높고, 실용화가 빠른 장기 중의 하나로 인식되고 있다. As an essential part of successful tissue engineering of articular cartilage, cartilage is recognized as one of the most feasible and quick to use organs in which biotissue engineering is attempted.

줄기세포에서 분화된 연골세포의 조직공학적 관절연골 제작은 중심 요인들인 연골세포화된 줄기세포, 생분해성 지지체가 필수적이고 연골 세포화된 줄기세포는 골수로부터 단일핵 세포를 분리 후 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. 이상적인 연골세포는 증식능력이 좋아야 하며, 연골세포의 특이 표현형인 콜라젠 타입(collagen type) II를 유지하는 세포이다. 생분해성 지지체로서 합성고분자재료로는 PLA, PGA, PLGA 등이며 생분해 속도 조절이 가능한 장점이 있다. 천연고분자재료로는 콜라젠(collagen), 젤라틴(gelatin), 케라틴(keratin), 피브로넥틴(fibronectin) 등의 단백질과 셀룰로오스(cellurose), 덱스트란(dextran), 키틴(kitin), GAG와 같은 다당류 등이 있다. 이들은 세포접착성이 높다는 장점을 가지지만 낮은 기계적 물성이 단점이다.  Histologically engineered articular cartilage of differentiated chondrocytes from stem cells is essential for chondrocytes and biodegradable scaffolds, and chondrocytes are isolated from bone marrow and cultured into chondrocytes. Induce differentiation Ideal chondrocytes should have good proliferative capacity and maintain collagen type II, a specific phenotype of chondrocytes. As the biodegradable support, synthetic polymer material is PLA, PGA, PLGA and the like, and has the advantage of controlling biodegradation rate. Natural polymer materials include proteins such as collagen, gelatin, keratin, fibronectin and polysaccharides such as cellurose, dextran, chitin, and GAG. have. They have the advantage of high cell adhesion but low mechanical properties.

이에 본 발명자들은 생리활성물질인 TGF-b3를 마이크로스피어의 표면에 도입을 통해서 줄기세포를 원활히 점착시키고 배양액 존재 하에서 마이크로스피어의 표면에서 줄기세포를 연골세포로의 분화유도를 통하여 연골재생을 유도할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.The present inventors can induce cartilage regeneration by inducing the differentiation of stem cells into chondrocytes on the surface of the microspheres in the presence of culture medium by introducing the TGF-b3 bioactive substance to the surface of the microspheres smoothly. It was found that the present invention was completed.

본 발명의 목적은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체를 표면에 부착시킨 마이크로스피어를 이용하여 줄기세포를 점착시켜 연골세포로의 분화유도를 통한 연골조직재건 및 재생을 원활히 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide smooth cartilage tissue reconstruction and regeneration by inducing differentiation into chondrocytes by adhering stem cells using a microsphere attached to the surface of the polymer electrolyte complex containing a growth factor.

본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 연골조직재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 제공한다.The present invention provides microspheres or microbeads for cartilage tissue reconstruction and regeneration in which nanoparticles composed of a polymer electrolyte complex containing growth factors are attached to a surface thereof.

본원에서 정의되는 성장인자로는 TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-α, TGF-β, IGF-1, NGF 등을 포함하며 상기 성장인자의 농도가 0.01~1 ㎍/㎖임을 특징으로 하는 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 포함한다. Growth factors defined herein include TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-α, TGF-β, IGF-1, NGF and the like, and the concentration of the growth factor is 0.01-1 μg / ml. Characterized by microspheres or microbeads.

본원에서 정의되는 고분자전해질 복합체는 헤파린/폴리엘라이신인 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 포함한다.Polyelectrolyte complexes as defined herein include microspheres or microbeads that are heparin / polylysine.

본원에서 정의되는 마이크로스피어 또는 마이크로비드는 덱사메타손(dexamethasone) 또는 DHEA(Dehydroepiandrosterone)를 추가적으로 포함할 수 있다.Microspheres or microbeads as defined herein may further comprise dexamethasone or dehydroepiandrosterone (DHEA).

또한, 본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 마이크로스피어 또는 마이크로비드 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 연골조직재건 및 재생을 위한 약학조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for cartilage tissue reconstruction and regeneration comprising microspheres or microbeads and pharmaceutically acceptable excipients attached to the surface of the nanoparticles consisting of a polymer electrolyte complex containing growth factors.

상기 약학조성물은 주사제 형태인 것을 포함한다.The pharmaceutical compositions include those in the form of injections.

이하, 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 수득하는 방법을 상세히 설명한다. Hereinafter, a method of obtaining microspheres or microbeads will be described in detail.

생분해성 폴리머인 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)를 5 내지 20배, 바람직하게는 10배의 분량의 유기용매에 용해시키고, 이 용액을 폴리비닐 알코올(polyvinyl alchol)(Mw 13,000~23,000) 3% 수용액 50내지 300 ml, 바람직하게는 200 ml에 한 방울씩 가하고 바이오믹서(biomixer)를 사용하여 500 내지 20000 rpm, 바람직하게는 1,000 rpm에서 30초 이상, 바람직하게는 5분 동안 유화시켰다. 그 후 용매 증발을 위해 실온에서 30분 내지 24시간, 바람직하게는 3 시간 동안 일정속도로 기계적 교반기를 사용하여 교반시켰다. 현탁액은 500 내지 2000 rpm, 바람직하게는 1,000 rpm에서 30초 내지 30분, 바람직하게는 5분 동안 원심분리하고 남아 있는 계면활성제를 제거하기 위해 증류수를 10 내지 200 ml, 바람직하게는 100 ml를 1회 이상, 바람직하게는 3회로 나누어 세척한 후 동결 건조하여, 카르복실기를 갖는 마이크로스피어를 수득할 수 있다.A biodegradable polymer, PLGA (poly lactic-co-glycolic acid) is dissolved in an organic solvent of 5 to 20 times, preferably 10 times, and the solution is polyvinyl alchol (Mw 13,000 to 23,000). A drop of 50% to 300 ml, preferably 200 ml, of 3% aqueous solution was added dropwise and emulsified at 500 to 20000 rpm, preferably 1,000 rpm for at least 30 seconds, preferably 5 minutes using a biomixer. It was then stirred using a mechanical stirrer at constant speed for 30 minutes to 24 hours, preferably 3 hours at room temperature for solvent evaporation. The suspension is centrifuged at 500 to 2000 rpm, preferably at 1,000 rpm for 30 seconds to 30 minutes, preferably 5 minutes and 10 to 200 ml of distilled water, preferably 100 ml to remove the remaining surfactant. After washing three times or more, preferably three times, and freeze-drying, it is possible to obtain a microsphere having a carboxyl group.

상기 유기용매는 아세트산, 락트산, 포름산, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 디메틸술폭사이드, 디옥산, N-메틸피롤리돈 및 이들을 함유하는 수용액으로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 한다.The organic solvent is one or more selected from the group consisting of acetic acid, lactic acid, formic acid, acetone, acetonitrile, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, N-methylpyrrolidone and aqueous solutions containing them It is characterized by.

또한, DCM(dichloromethane)에 다양한 농도로 녹여진 PLGA(분산상, dispersion phase)를 주사기에 넣은 후, 중력을 이용하여 평편한 주사바늘(blunt needle; 27G)을 통해 용액을 방출함으로써 다양한 농도의 폴리비닐 알코올이 녹여진 증류수(연속상, continuous phase) 속에서 대략 지름 0.5~1 mm 정도인 방울(drop)을 만들고, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 기계적으로 저어줌으로써 분쇄 시킨 다음, 상온에서 6 시간 동안 방치하여 DCM을 제거하고 동결건조 하여 마이크로비드를 수득할 수 있다.In addition, PLGA (dispersion phase) dissolved in various concentrations in dichloromethane (DCM) was put into a syringe, and then the solution was discharged through a flat needle 27G using gravity to release polyvinyl chloride at various concentrations. Make a drop of approximately 0.5 to 1 mm in diameter in alcohol-dissolved distilled water (continuous phase), grind it by mechanical stirring using a magnetic bar, and then grind it at room temperature for 6 hours. May be left to remove DCM and lyophilized to afford microbeads.

본 발명의 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the microspheres or microbeads of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.

본 발명의 마이크로스피어 또는 마이크로비드의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. Pharmaceutical dosage forms of the microspheres or microbeads of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable collection.

산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 목초액을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수 성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. It can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions. Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising wood vinegar include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the extract. ) Or lactose, gelatin and the like are mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Preferred dosages of the compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the composition of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably at 0.001 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. The composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.

본 발명은 각각의 농도의 성장인자를 헤파린과 결합시키는 제 1단계; 헤파린 결합 후 교반시키면서 폴리엘라이신을 떨어트리는 제 2단계; 생성된 나노입자를 폴리에틸렌이민으로 코팅된 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 결합시키는 3단계를 포함하는 성장인자를 함유한 나노입자를 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 코팅하는 방법을 제공한다. The present invention comprises the first step of combining the growth factor of each concentration with heparin; A second step of dropping polylysine while stirring after heparin binding; Provided is a method of coating nanospheres containing microparticles or growth particles containing growth factors comprising three steps of binding the resulting nanoparticles to microspheres or microbeads coated with polyethyleneimine.

또한, 본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질 복합체를 표면에 부착시킨 마이 크로스피어 또는 마이크로비드에 줄기세포를 점착시킨 후 배양액 존재 하에서 연골세포 분화를 유도하는 연골세포 배양방법을 제공한다. The present invention also provides a method for culturing chondrocytes to induce chondrocyte differentiation in the presence of a culture medium after adhering stem cells to a microcross or microbead attached to the surface of the polymer electrolyte complex containing growth factors.

각각의 농도의 성장인자를 헤파린과 결합시키는 제 1단계; 헤파린 결합 후 교반시키면서 폴리엘라이신을 떨어트리는 제 2단계; 생성된 나노입자를 폴리에틸렌이민으로 코팅된 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 결합시키는 3단계; 성장인자를 함유한 마이크로스피어 또는 마이크로비드를 플레이트(plates)에 깔고 줄기세포를 점착시키는 4단계; 점착시킨 세포들을 2-3일 안정화 시킨 후 배양액 하에서 배양하는 5단계를 포함한다.  Combining the growth factors of each concentration with heparin; A second step of dropping polylysine while stirring after heparin binding; Binding the resulting nanoparticles to microspheres or microbeads coated with polyethyleneimine; Spreading microspheres or microbeads containing growth factors on plates and adhering stem cells; After stabilizing the adhered cells for 2-3 days includes five steps of culturing under culture.

상기 배양의 조건은 알파(alpha) MEM 배지(media)에서 안티(anti) 1% , FBS 10% 등의 용액을 이용하여 3~7일 배양하는 것을 포함한다.The culture conditions include culturing for 3 to 7 days using a solution such as anti 1%, 10% FBS, etc. in alpha MEM media.

상기 줄기세포 배양은 성장인자를 0.01~1 ㎍/㎖의 농도로 나노입자에 함유되어 8주 까지 수행하는 것이 바람직하며, TGF-b3가 0.01 ㎍/㎖미만으로 나노입자에 함유되면, 성장인자의 자극이 약하여 줄기세포의 배양에 영향을 미치지 못하며, 1 ㎍/㎖ 이상이면 1 ㎍/㎖의 농도와 비교할 때 세포가 받는 자극의 변화를 살펴볼 수 없어 바람직하지 않은 농도이다. The stem cell culture is preferably carried out by the growth factor contained in the nanoparticles at a concentration of 0.01 ~ 1 ㎍ / ㎖ up to 8 weeks, if TGF-b3 is contained in the nanoparticles less than 0.01 ㎍ / ㎖, growth factor The weak stimulus does not affect the culture of stem cells, and if the concentration of 1 ㎍ / ㎖ or more than 1 ㎍ / ㎖ compared to the concentration of the stimulation received by the cell is an undesirable concentration.

본 발명에서 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어 또는 마이크로비드 표면에 줄기세포를 점착시킨 후 배양액 존재 하에서 코팅된 나노입자와 결합된 성장인자의 자극에 의한 간엽줄기세포의 분화 유도 및 연골조직재생을 관찰하였다. 구체적으로 성장인자의 자극에 의하여 간엽줄기세포로부터 연골세포로의 전환을 관찰할 수 있었으며, 형성된 연골세포들의 연골조직화를 면역조직염색법을 통하여 관찰 할 수 있었다. 상기한 바와 같이, 상기 줄기세포 배양방법은 일반 주사기를 통한 주입이 가능하며, 이러한 주입형 마이크로스피어 또는 마이크로비드는 손상된 조직의 재생을 이루는 마이크로화된 스캐폴드로서 이용이 가능하다.Induction of differentiation of mesenchymal stem cells and stimulation of mesenchymal stem cells by stimulation of growth factors coupled with coated nanoparticles in the presence of culture medium after adhesion of stem cells to the surface of microspheres or microbeads coated with growth particles containing growth factors in the present invention Tissue regeneration was observed. Specifically, the conversion of mesenchymal stem cells to chondrocytes could be observed by stimulation of growth factors, and cartilage organization of the formed chondrocytes could be observed by immunohistostaining. As described above, the stem cell culture method can be injected through a general syringe, and such injectable microspheres or microbeads can be used as micronized scaffolds for regeneration of damaged tissue.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

단, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the content of the present invention is not limited to the scope of the present invention.

실시예Example 1. 카르복실기를 갖는  1. Having a carboxyl group 마이크로스피어Microsphere 제조 방법 Manufacturing method

먼저, 생분해성 폴리머인 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)를 500 mg을 유기용매 5 ml에 용해시키고, 이 용액을 폴리비닐 알코올(polyvinyl alchol)(Mw 13,000~23,000) 3% 수용액 200 ml에 한방울씩 가하고 바이오믹서(biomixer)를 사용하여 1,000 rpm에서 5분 동안 유화시켰다. 그 후 용매 증발을 위해 실온에서 3 시간 동안 일정속도로 기계적 교반기를 사용하여 교반시켰다. 현탁액은 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 남아 있는 계면활성제를 제거하기 위해 증류수를 100ml를 3회로 나누어 세척한 후 동결 건조하여, 카르복실기를 갖는 마이크로스피어를 제조하였다.First, 500 mg of polylactic-co-glycolic acid (PLGA), a biodegradable polymer, was dissolved in 5 ml of an organic solvent, and this solution was dissolved in 200 ml of a 3% aqueous solution of polyvinyl alchol (Mw 13,000-23,000). Each drop was added and emulsified at 1,000 rpm for 5 minutes using a biomixer. It was then stirred using a mechanical stirrer at constant speed for 3 hours at room temperature for solvent evaporation. The suspension was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes, and 100 ml of distilled water was washed three times to remove the remaining surfactant, followed by freeze drying to prepare a microsphere having a carboxyl group.

실시예Example 2.  2. 마이크로비드Microbeads 제조 방법 Manufacturing method

DCM(dichloromethane)에 다양한 농도로 녹여진 PLGA(poly lactic-co-glycolic acid, 분산상, dispersion phase)를 주사기에 넣은 후, 중력을 이용하여 평편한 주사바늘(blunt needle; 27G)을 통해 용액을 방출함으로써 다양한 농도의 폴리비닐 알코올이 녹여진 증류수(연속상, continuous phase) 속에서 대략 지름 0.5~1 mm 정도인 방울(drop)을 만들고, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 기계적으로 저어줌으로써 분쇄시킨 다음, 상온에서 6 시간 동안 방치하여 DCM을 제거하고 동결건조 하여 마이크로비드를 수득하였다.PLGA (poly lactic-co-glycolic acid, dispersed phase, dispersion phase) dissolved in various concentrations in dichloromethane (DCM) is injected into the syringe, and the solution is released through a flat needle (27G) using gravity. By making a drop of approximately 0.5 to 1 mm in diameter in distilled water (continuous phase) in which various concentrations of polyvinyl alcohol are dissolved, it is pulverized by mechanical stirring using a magnetic bar. Next, the mixture was left at room temperature for 6 hours to remove DCM and lyophilized to obtain microbeads.

실시예Example 3. 섬유아세포성장인자가 함유된 나노입자 코팅 3. Nanoparticle coating containing fibroblast growth factor

각각의 농도(0.01, 0.1, 1 ㎍/ml)의 섬유아세포성장인자를 헤파린과 결합시킨 후 교반시키면서 폴리엘라이신을 떨어트린다. 이렇게 생성된 나노입자를 폴리에틸렌이민으로 코팅된 마이크로스피어(1 g)과 결합시킨다. Fibroblast growth factor at each concentration (0.01, 0.1, 1 μg / ml) was combined with heparin and then dropped polylysine with stirring. The nanoparticles thus produced are combined with microspheres (1 g) coated with polyethyleneimine.

실시예Example 3.  3. 인간유래간엽줄기세포배양Human-derived mesenchymal stem cell culture ( ( HumanHuman FetalFetal LiverLiver PreparationPreparation andand CellCell CultureCulture ))

치료목적의 선택적 유산술(Therapeatic selective abortion)과정에서 채취된 10주 조직으로부터 태아 간 조직을 얻었다. 선택적 유산술로 채취된 유산조직을 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO)에 10% 소의 태아 혈청(fetal bovine serum) (FBS; Hyclone, USA)이 들어있는 배양액으로 옮겨져 해부현미경(SM 2645; Nikon) 아래에서 예리한 핀셋으로 간 조직만을 골라내었다. 채취한 간조직들은 DMEM 배양액에 씻어 혈청, 혈구 성분을 최대한 제거한 후 사용하였다. 치료용 목적으로 낙태된 10주의 인간 배아 조직에서 간 조직을 분리하여 수술용 칼로 얇게 세절한 다음 0.25% 트립신(trypsin)-0.5mM EDTA(GIBCO, USA)를 처리한 후 37℃에서 10분간 처리한다. 분리한 세포는 DMEM(GIBCO, USA)에 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)(Hyclone, USA ), 0.1mM 비필수 아미노산(nonessential amino acid)(GIBCO, USA), 0.053mM 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(GIBCO, USA), 1000units/ml 페니실린(penicillin)(GIBCO, USA), 1000μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)(GIBCO, USA)이 첨가된 배양용액으로 5% CO₂가 공급되는 배양기로 24시간동안 배양하였다.Fetal liver tissues were obtained from 10 weekly tissues harvested during therapeutic selective abortion. Lactic acid tissue collected by selective abortion was transferred to a culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, USA) in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO) and dissected under a microscope (SM 2645; Nikon). Below, only the liver tissue was selected with a sharp tweezers. The collected liver tissues were washed in DMEM culture and used to remove serum and blood cell components as much as possible. Liver tissues are isolated from 10 weeks of aborted human embryonic tissue for therapeutic purposes, thinly sliced with a surgical knife and treated with 0.25% trypsin-0.5mM EDTA (GIBCO, USA) for 10 minutes at 37 ° C. . The isolated cells were treated with 10% fetal bovine serum (Hyclone, USA), 0.1 mM nonessential amino acid (GIBCO, USA), 0.053 mM 2-mercaptoethanol in DMEM (GIBCO, USA). 2-mercaptoethanol (GIBCO, USA), 1000 units / ml penicillin (GIBCO, USA), 1000 μg / ml streptomycin (GIBCO, USA) added 5% CO ₂ as a culture solution The incubator was incubated for 24 hours.

하루가 지난 후 비부착 세포(nonadherent cell)를 수집하고 낮은-밀도 분획(low-density fraction)(Ficoll-paque ; Amersham Biosciences, Sweden) 1.077g/㎖ 로 원심분리하여 황갈색 막(buffy coat)층을 분리한다. 이를 인산염 완충염(phosphate buffered saline)(PBS; GIBCO, USA)에 약 2회 정도 수세하면서 원심분리하여 세포층을 수집한다.After one day, nonadherent cells were collected and centrifuged with a low-density fraction (Ficoll-paque; Amersham Biosciences, Sweden) 1.077 g / ml to form a buffer coat. Separate. The cell layer is collected by centrifugation while washing with phosphate buffered saline (PBS; GIBCO, USA) about twice.

피콜(Ficoll)로 분리한 세포를 DMEM-LG (Dulbecco's modified Eagle's medium 1g/L low glucose; GIBCO) 와 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum) (FBS; Hyclone, USA), 100U/㎖ 페니실린(penicillin), 100㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 헬라 세포(Helacell)로 5일간 배양한다. 이때 배양기 바닥에 붙지 않고 떠있는 세포들은 모두 제거한다. 동시에 배양된 배양기 중이 일부는 알칼린 포스파제(Alkaline phosphase)(Sigma; USA) 염색을 위하여 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정한다.Ficoll isolated cells were treated with DMEM-LG (Dulbecco's modified Eagle's medium 1 g / L low glucose; GIBCO) and 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, USA), 100 U / ml penicillin ), 37 ° C., 5% CO _{2 with} 100 μg / ml streptomycin Incubate with Helacell for 5 days. At this time, remove all the cells that do not adhere to the bottom of the incubator. Some of the co-cultured incubators were fixed with 3.7% formaldehyde for Alkaline phosphase (Sigma; USA) staining.

실시예Example 4.  4. 간엽줄기로부터From the mesenchymal stem 중간엽줄기세포의Mesenchymal stem cells 분리 및 확장  Detach and extend

중간엽줄기세포(MSC)는 증식을 멈추면 분화를 시작하기 때문에 융합전에 계대배양를 하면서 유지하여 주어야 한다. Ca^{2 +} 및 Fe^{2 +}이 첨가되지 않은 PBS로 약 3회 배양기 바닥을 씻어준 후 0.25% 트립신(Trypsin-EDTA; GIBCO, USA)용액으로 처치하여 배양기 바닥에서 세포가 떨어지기 시작하면 10% FBS로 트립신(trypsin) 작용을 억제시키고 15 ml 튜브에 옮긴 뒤 원심분리한다. 얻어진 세포들은 헤모사이토미터(hemocytometer)로 수를 세고 다시 배양기에 넣어 배양을 시작하는데 2차 배양(subculture)에 적합한 세포의 농도는 약 5X10⁴/cm²가 적당하다.Mesenchymal stem cells (MSCs) start differentiation when they stop proliferating, so they must be maintained with subculture before fusion. Ca ^{2 +} and Fe ^{2 +} is washed with approximately three times the incubator bottom with no added PBS 0.25% trypsin; by treatment with (Trypsin-EDTA GIBCO, USA) solution when starting to get the cells off the incubator bottom 10% FBS Inhibit trypsin action, transfer to 15 ml tubes and centrifuge. The obtained cells were counted with a hemocytometer and put back into the incubator to start cultivation. The concentration of cells suitable for the subculture was about 5 × 10 ⁴ / cm ² .

실험예 1. 배양된 세포의 면역형질 (Immunophenotyping of Cultured Cells ) Experimental Example 1. Immune transfected in cultured cells (Immunophenotyping of Cultured Cells )

증식된 세포의 특성을 형광-활성 세포 분류기(Fluorescence-activated cell sorter)(FACS Vantage SE; Becton Dickinson)를 이용하여 특이적인 표면 항원 발현자를 발색하여 보았다.The characteristics of the proliferated cells were characterized by the development of specific surface antigen expressors using a Fluorescence-activated cell sorter (FACS Vantage SE; Becton Dickinson).

세포의 염색은 4℃에서 30분간 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)(FITC) 또는 파이코에리스린(phycoerythrin; PE) 또는 항-표지 복합의 시-크롬 (cy-chrome conjugated anti-marker mAbs)(적정 농도에서) 발현시켰다. 조혈제 계통 표지(Hematopoietic lineage markers)(CD13, CD14, CD34, HLA-ABC, HLA-DR), 세포간질 수용기(matrix receptors)(CD44), CD106(관 세포 점착 분자(vascular cell adhesion molecule)), CD73, c-Kit, CDw90(Thy-1), 그리고 MSC 표지(SH-2, SH-3)를 인산염 완화 염(phosphate buffered saline)(PBS) 에 2% FBS가 첨가된 용액에 위와 같은 항체를 발현하였다.Staining of cells was carried out for 30 minutes at 4 ° C. fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE) or cy-chrome conjugated anti-marker mAbs) (at the appropriate concentration). Hematopoietic lineage markers (CD13, CD14, CD34, HLA-ABC, HLA-DR), matrix receptors (CD44), CD106 (vascular cell adhesion molecule), CD73 , c-Kit, CDw90 (Thy-1), and MSC markers (SH-2, SH-3) were expressed in a solution in which 2% FBS was added to phosphate buffered saline (PBS). It was.

증식 조사(proliferation study)와 세포 주기(cell cycle)를 보기 위해서 PI(propidium iodine; Pharmingen, USA) 10㎍으로 발색하며, RNAse A(sigma, USA)을 처리하여 분석하였다.In order to see the proliferation study and cell cycle, the cells were colored with 10 μg of propidium iodine (Pharmingen, USA) and analyzed by RNAse A (sigma, USA).

실험예Experimental Example 2. 인공연골의 조직학적 검사  2. Histological examination of artificial cartilage

조직 채취 후 바로 조직 구성 성분 및 구조의 변성을 방지하기 위하여 10% 포름알데히드(formaldehyde)에 담가 12~24시간 동안 고정하였다. 10%의 포름알데히드 고정 후 고정액을 제거하기 위해서 신선하게 계속 흐르는 물에 약 12~24시간 수세하고, 자동 침투기(autotechnicon)를 사용하여 탈수, 투명, 파라핀(paraffin) 침투 과정을 12단계의 과정을 거쳐 14~15 시간 동안 수행하였다. 파라핀 침투가 끝난 조직은 박절기로 얇게 박절하기 위해 파라핀 블록(paraffin block)으로 제작하는 포매(embedding) 작업을 수행하였다. 포매되어 만들어진 파라핀 블록은 회전형 박절기(rotary microtome)를 사용하여 4 ㎛의 두께로 박절(section)하여 부유 항온 수조에 띄워 박절 시 위축된 조직을 편 후 슬라이드에 부착시킨 후 물기를 제거하기 위해 45° 경사로 세워 2~3분 방치하여 수분을 완전 제거하였다. 이렇게 건조된 슬라이드는 60°C 정도의 신전기(slide warmer)에 30~60분간 올려놓고, 파라핀을 녹이면서 조직을 슬라이드 글라스에 단단히 접착시킨다. 위 과정을 다 거친 슬라이드의 상태를 관찰 한 후 H&E, 사프라닌-O, AB-PAS염색을 실시하였다. In order to prevent denaturation of tissue components and structure immediately after tissue collection, it was soaked in 10% formaldehyde (fixaldehyde) and fixed for 12 to 24 hours. After fixing 10% formaldehyde, wash with fresh running water for 12 ~ 24 hours to remove the fixed solution, and dehydration, transparent, and paraffin infiltration process using autotechnicon in 12 steps It was carried out for 14-15 hours. The paraffin-penetrated tissue was embedded into a paraffin block to thinly cut into thinners. The embedded paraffin block was cut into 4 μm thickness using a rotary microtome and floated in a floating constant temperature water bath. ° It was left on a slope and left for 2-3 minutes to completely remove moisture. The dried slide is placed on a slide warmer of about 60 ° C for 30 to 60 minutes, and the tissue is firmly adhered to the slide glass while melting paraffin. After observing the slides after the above procedure, H & E, safranin-O, and AB-PAS staining were performed.

실험예Experimental Example 3. 3. 면역조직화학적 검사 (Immunohistochemical test ( ImmunoImmuno -- histochemistryhistochemistry ))

포매 되어 만들어진 파라핀 블록을 회전형 박절기 (Rotary microtome)를 사용하여 4 ㎛의 두께로 박절(section)하여 부유 항온 수조에 띄워 박절 시 위축된 조직을 편 후 슬라이드에 부착시킨 다음 슬라이드를 56°C 정도의 신전기(slide warmer)에 4시간 올려놓고 파라핀을 녹이면서 조직을 슬라이드 글라스에 단단히 접착 시켰다. 이렇게 준비된 슬라이드를 자일렌(xylene) 처리하여 조직 내부와 외부에 포매된 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 탈수과정을 거쳤다. 증류수로 10분간 수세한 후 고정액(4% phosphate formaldehyde solution)에 담가 두었다가 3% 과산화수소를 사용하여 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)를 차단시키고 항원 용액이 조직 내부로 잘 흡수되도록 하기 위해 1% 트립신을 사용하여 투고성을 높여 주었다. PBS에 1% BSA가 포함된 용액(blocking solution)으로 실온에서 30분 이상 비특이적 반응을 차단한 후 1차 항체 콜라겐 타입 II(collagen type Ⅱ; Sigma, MA, USA)로 사람의 제 2형 교원질을 사용하여 4°C에서 12시간 처리 한다. 바이오틴(Biotin)이 부착된 2차 항체 (biotinylated secondary antibody)를 사용하여 1차 항체를 인식시키고, ABC 용액(avidin and biotinylated horseradish peroxidase macromolecular complex)을 처리하여 반응 부위를 증폭시킨다. 그 다음 2차 항체가 부착되어 있는 효소의 활성(peroxidase activity)으로 AEC 기질을 침착하게 하여 갈색의 염색물을 보이게 함으로써 1차 항원이 위치하는 곳과 발현되는 정도를 관찰한다. The embedded paraffin block was cut into 4 μm thick sections using a rotary microtome and floated in a floating constant temperature water bath. 4 hours on a slide warmer of the paraffin was dissolved in the slide glass while the tissue was firmly adhered. The slides thus prepared were xylene-treated to remove paraffin embedded in and outside the tissue, and dehydrated using alcohol. Rinse with distilled water for 10 minutes and soak in fixed solution (4% phosphate formaldehyde solution), then use 3% hydrogen peroxide to block endogenous peroxidase and 1% trypsin to ensure that the antigen solution is well absorbed into the tissue. Increased the contribution to use. Blocking the nonspecific reaction at room temperature with a blocking solution containing 1% BSA in PBS for at least 30 minutes, and then using collagen type II (Sigma, MA, USA) for human type 2 collagen 12 hours at 4 ° C. Biotinylated secondary antibody (biotinylated secondary antibody) is used to recognize the primary antibody, ABC solution (avidin and biotinylated horseradish peroxidase macromolecular complex) to amplify the reaction site. Then, the AEC substrate is deposited by the peroxidase activity attached to the secondary antibody to show a brown dye, where the primary antigen is located and the degree of expression is observed.

실험예Experimental Example 4. 1 ㎍/ 4. 1 μg / mlml 의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 Coated with nanoparticles 마이크로스피의Micro 주사현미 Scanning brown rice 경관찰Police officer

상기 실시 예의 줄기세포 배양방법에 의한 간엽줄기세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어의 표면분석을 주사현미경을 이용하여 관찰하였다.In order to observe the differentiation of mesenchymal stem cells by the stem cell culture method of the above embodiment, the surface analysis of the nanospheres coated with the growth factor was observed using a scanning microscope.

도 1에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 함유된 나노입자들이 마이크로스피어의 표면은 약 100~200 nm 정도의 나노입자가 정전기적 반응에 의하여 코팅되어 있는 모습이 관찰되었다. 대조군인 마이크로스피어(a)에서는 마이크로스피어의 표면이 매끄럽게 나타나 있는 반면에 TGF-b3가 함유된 나노입자가 얹어진 마이크로스피어(c)의 표면은 표면이 매끄럽지 못하고 우둘투둘한 모양을 하고 있다. 따라서, 헤파린/폴리엘라이신(poly(L-lysine)) 나노입자가 TGF-b3를 함유하고 있고 함유된 나노입자에서 조절된 TGF-b3가 방출됨으로서 줄기세포의 분화를 조절할 수 있다는 것을 증명하였다.As shown in Figure 1, the surface of the microspheres of nanoparticles containing TGF-b3 was observed that the nanoparticles of about 100 ~ 200 nm is coated by the electrostatic reaction. In the microsphere (a) as a control, the surface of the microsphere is shown smoothly, whereas the surface of the microsphere (c) on which the nanoparticles containing TGF-b3 are placed is not smooth and has a rugged shape. Thus, it was demonstrated that heparin / polylysine (poly (L-lysine)) nanoparticles contain TGF-b3 and can regulate stem cell differentiation by releasing regulated TGF-b3 from the contained nanoparticles.

실험예Experimental Example 5. 성장인자를 함유한 나노입자가 코팅된  5. Coating with nanoparticles containing growth factor 마이크로스피어에서In the microsphere 줄기세포의 H & E염색법 관찰 Observation of H & E staining method of stem cells

5-1. H&E 염색 5-1. H & E Dyeing

염색을 위해 탈 파라핀과 함수과정을 거친 슬라이드를 헤마톡실린(hematoxylin) 용액 (Gill`s hematoxylin)에 약 10분간 처리하였다가 흐르는 물에 과도의 헤마톡실린 여액을 세척하고 핵 이외의 부분에 염색된 헤마톡실린 용액을 제거하기 위해 0.5% 알콜성 HCl로 탈색한 후 중화과정으로 0.7% 암모니아를 처리한다. 그 다음 에오신(eosin) 용액에서 1분간 염색 후 탈수와 투명 과정을 거친 다음 광학 현미경으로 핵과 세포질의 염색 상태를 관찰한다. For staining, deparaffin and water-treated slides were treated with hematoxylin solution (Gill`s hematoxylin) for about 10 minutes, and then washed with excess hematoxylin filtrate in running water and stained at the non-nucleus area. To remove the hematoxylin solution, decolorization with 0.5% alcoholic HCl is followed by neutralization of 0.7% ammonia. Then, after staining for one minute in the eosin solution, after dehydration and transparent process, the state of staining of the nucleus and cytoplasm under an optical microscope.

5-2. 성장인자를 함유한 나노입자가 코팅된 5-2. Coated with nanoparticles containing growth factors 마이크로스피어에서In the microsphere 줄기세포의 H & E염색법 관찰 Observation of H & E staining method of stem cells

상기 실시 예의 줄기세포 배양방법에 의한 간엽줄기 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 세포의 핵염색법을 통하여 세포의 생존을 관찰하였다.In order to observe the differentiation of mesenchymal stem cells by the stem cell culture method of the above embodiment, the survival of the cells was observed through nuclear staining of the cells in the nanoparticles coated with the growth factor-containing nanospheres.

도 2에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 함유된 나노입자가 함유된 마이크로스피어 표면에 세포의 점착이 많음을 알 수 있다. 1 ㎍/ml의 TGF-b3가 함유된 나노입자가 함유된 마이크로스피어에서는 마이크로의 표면에 많은 수의 간엽줄기세포가 부착되어 있음을 관찰하였다.As shown in Figure 2, it can be seen that the adhesion of cells to the surface of the microspheres containing the nanoparticles containing TGF-b3. In microspheres containing nanoparticles containing 1 μg / ml TGF-b3, a large number of mesenchymal stem cells adhered to the surface of the microparticles.

실험예Experimental Example 6.  6. RTRT -- PCRPCR 법에 의한 연골세포 분화 Chondrocyte Differentiation by Method 마커인Marker 콜라겐 타입  Collagen type IIII 발현 관찰 Expression observation

상기 실시 예에서 수행한 줄기세포의 배양방법에 의한 간엽줄기 세포의 분화를 관찰하기 위하여 성장인자의 자극에 의한 연골세포의 분화마커를 RT-PCR 방법으로 관찰하였다. In order to observe the differentiation of mesenchymal stem cells by the stem cell culture method performed in the above example, the differentiation markers of chondrocytes by stimulation of growth factors were observed by RT-PCR method.

트리졸(Trizol) (Tel-Test Inc.)을 이용하여 세포에서 회수한 RNA 시료로 첫 번째 가닥(1st strand) cDNA 를 얻은 후, 콜라겐 타입 II 와 GAPDH 에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하였다. 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.The first strand cDNA was obtained from RNA samples recovered from cells using Trizol (Tel-Test Inc.), followed by PCR using primers specific for collagen type II and GAPDH. . The base sequence of the primer used is as follows.

토끼를 이용한 콜라겐 타입 II 의 센스프라이머는 5′-GCA CCC ATG GAC ATT GGA GGG-3(서열번호 1), 안티센스 프라이머는 5′-GAC ACG GAG TAG CAC CAT CG-3′(서열번호 2)이며, 토끼를 이용한 GAPDH의 센스 프라이머는 5′-AAC TCA CTG GCA TGG CCT T-3’(서열번호 3)이고, 안티센스 프라이머는 5′-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG-3′(서열번호 4)로서 256bp 의 PCR 산물을 아가로스 겔(agarose gel)에서 확인하였다.Collagen type II sense primers in rabbits were 5′-GCA CCC ATG GAC ATT GGA GGG-3 (SEQ ID NO: 1), and antisense primers were 5′-GAC ACG GAG TAG CAC CAT CG-3 ′ (SEQ ID NO: 2). , GAPDH sense primer using rabbit is 5'-AAC TCA CTG GCA TGG CCT T-3 '(SEQ ID NO: 3), antisense primer is 5'-GCT TCA CCA TCT TGA TG-3' (SEQ ID NO: 4) As a result, 256 bp PCR product was identified on an agarose gel.

도 3에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 1 ㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 연골세포의 분화 마커인 콜라겐 타입 II의 발현으로 관찰하였지만, TGF-b3가 1 ㎍/㎖의 농도로 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포에서는 콜라겐 타입 II의 발현을 관찰하지 못했다. 상기의 실험에서 보여주듯이 성장인자가 없는 마이크로스피어에서는 연골세포의 분화가 진행되지 않는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 3, cartilage of mesenchymal stem cells was observed in the nanospheres coated with TGF-b3 at a concentration of 1 μg / ml by expression of collagen type II, a differentiation marker of chondrocytes. Expression of collagen type II was not observed in mesenchymal stem cells in nanoparticle-coated microspheres containing TGF-b3 at a concentration of 1 μg / ml. As shown in the above experiments, it was confirmed that the differentiation of chondrocytes did not proceed in the microspheres without growth factors.

실험예Experimental Example 7. 주사현미경사진 관찰 7. Scanning Microscopy

상기 실시 5에서 수행한 신경세포의 배양방법에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하기 위하여 PC12 세포의 분화를 주사현미경으로 관찰하였다. 성장인자가 함유되지 않은 마이크로스피어에 점착된 PC12 세포를 비교 예로 하였다.In order to observe the differentiation of PC12 cells by the culturing method of neurons carried out in Example 5, the differentiation of PC12 cells was observed by a scanning microscope. PC12 cells adhered to microspheres containing no growth factor were used as comparative examples.

도4에서 보는 바와 같이, TGF-b3가 1 ㎍/ml의 농도로 함유된 나노입자가 코 팅된 마이크로스피어에서 간엽줄기세포의 연골화를 면역조직학적 검사를 통해서 살펴본 결과, 거의 모든 세포에서 연골세포의 분화 마커인 콜라겐 타입 II가 관찰되었다.As shown in FIG. 4, the results of immunohistochemical examination of cartilage of mesenchymal stem cells in nanospheres coated with nanoparticles containing TGF-b3 at a concentration of 1 μg / ml were found in chondrocytes in almost all cells. Collagen type II, a differentiation marker of, was observed.

제제예Formulation example 1. 주사제제의 제조 1. Preparation of Injection

실시예 1의 마이크로스피어...........................10㎎Microsphere of Example 1 10 mg

소디움 메타비설파이트..............................3.0㎎Sodium Metabisulfite ........................ 3.0mg

메틸파라벤.........................................0.8㎎Methylparaben ............... 0.8 mg

프로필파라벤.......................................0.1mgPropylparaben ....................... 0.1mg

주사용 멸균증류수...................................적량Sterile Distilled Water for Injection ...

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.The above ingredients are mixed and made into 2 ml by a conventional method, and then filled into 2 ml ampoules and sterilized to prepare an injection.

제제예Formulation example 2.  2. 환제의Pilled 제조 Produce

실시예 2의 마이크로비드..............................120㎎Microbead of Example 2 ...... 120 mg

옥수수 전분..........................................100㎎Corn starch ... 100 mg

멸균증류수............................................적량Sterilized Distilled Water ...............

상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제환하여 환제를 제조한다.The above components are mixed and refilled in a 0.3 cm diameter by a conventional pill manufacturing method to prepare pills.

제제예Formulation example 3. 정제의 제조 3. Preparation of Tablets

실시예 1의 마이크로스피어............................200 ㎎Microsphere of Example 1 ... 200 mg

유당.................................................100 ㎎Lactose ... 100 mg

전분.................................................100 ㎎Starch ..................... 100 mg

스테아린산 마그네슘....................................적량Magnesium Stearate ...............

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.A tablet is prepared by mixing and tableting the above components according to a conventional tablet manufacturing method.

제제예Formulation example 4. 캡슐제의 제조 4. Preparation of Capsules

실시예 2의 마이크로비드 .............................100 ㎎Microbead of Example 2 ... 100 mg

유당..................................................50 ㎎Lactose ... .50 mg

전분..................................................50 ㎎Starch ..................... .50 mg

탈크...................................................2 ㎎Talc .................. ..2 mg

스테아린산마그네슘.....................................적량Magnesium stearate .....................................

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.According to a conventional capsule preparation method, the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.

제제예Formulation example 5.  5. 액제의Liquid 제조 Produce

실시예 1의 마이크로스피어.............................1000 ㎎Microspheres of Example 1 ............. 1000 mg

설탕....................................................20 gSugar................................................. ... 20 g

이성화당................................................20 gIsomerized sugar ... 20 g

레몬향 .................................................적량Lemon scent ...... Quantity

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.Purified water was added to make a total of 1000 ml. According to the conventional method for preparing a liquid, the above components are mixed, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, use purpose.

상기와 같이, 본 발명은 성장인자를 함유한 고분자전해질복합체로 구성된 나노입자를 정전기적 반응에 의하여 코팅을 시켜, 연골조직재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드에 관한 것으로 주사형 마이크로제작 스캐폴드로 이용될 수 있다.As described above, the present invention relates to a microsphere or microbead for cartilage tissue reconstruction and regeneration by coating the nanoparticles consisting of a polymer electrolyte complex containing a growth factor by an electrostatic reaction, the scanning microfabrication scaffold It can be used as.

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Claims (7)

성장인자 TGF-b3을 0.01 내지 1㎍/㎖의 농도로 함유한 헤파린/폴리엘라이신(poly(L-lysine)) 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 연골조직재건 및 재생을 위한 마이크로스피어 또는 마이크로비드.Microspheres for cartilage reconstruction and regeneration of nanoparticles composed of heparin / polylysine (poly (L-lysine)) complexes containing growth factor TGF-b3 at a concentration of 0.01-1 μg / ml or Microbeads. 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서, 덱사메타손(dexamethasone) 또는 DHEA(Dehydroepiandro sterone)를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 마이크로스피어 또는 마이크로비드.The microsphere or microbead according to claim 1, further comprising dexamethasone or dehydroepiandro sterone (DHEA). 삭제delete 농도가 0.01 내지 1㎍/㎖인 성장인자 TGF-b3를 함유한 헤파린/폴리엘라이신(poly(L-lysine)) 복합체로 구성된 나노입자를 표면에 부착시킨 마이크로스피어 또는 마이크로비드 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 연골조직재건 및 재생을 위한 주사용 약학조성물.Microspheres or microbeads, which are adhered to the surface of nanoparticles composed of heparin / polylysine (poly (L-lysine)) complexes containing growth factor TGF-b3 at a concentration of 0.01 to 1 μg / ml and are pharmaceutically acceptable. Injectable pharmaceutical composition for cartilage tissue reconstruction and regeneration comprising possible excipients. 삭제delete

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