KR100716394B1

KR100716394B1 - 안정화 변성 리포단백질 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100716394B1
Application number: KR1020017015514A
Authority: KR
Inventors: 다까시 시게마쯔; 준지 기무라; 히로아끼 고노; 노부유키 수에시게
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2007-05-11
Also published as: JP4611585B2; AU4781800A; DE60034227T2; DE60034227D1; ES2280214T3; CN1193043C; CA2375868A1; CN1367794A; ATE358683T1; EP1184392A4; TWI262191B; KR20020011429A; EP1184392B1; WO2000075189A1; EP1184392A1; CA2375868C

Abstract

장기보존안정성이 우수한(즉, 단백질의 변성이 일어나기 어려운), 혈액 중의 변성 리포단백질량의 측정이나 생리활성의 측정용 표준물질로써 사용되는 변성 리포단백질 및 그 제조방법을 제공한다. 본 발명의 안정화 변성 리포단백질의 제조방법은, 리포단백질을 인공적으로 변성시켜 변성 리포단백질을 얻고, 얻어진 변성 리포단백질을 동결건조하는; 또는 변성 리포단백질을 함유하는 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 첨가해 용액 중에 포함된 리포단백질을 변성시켜 변성 리포단백질을 얻고, 얻어진 변성 리포단백질을 동결건조하는 것에 의해 생성된다.

Description

안정화 변성 리포단백질 및 그 제조방법{Stabilized denatured lipoprotein and process for producing the same}

본 발명은 안정화 변성 리포단백질 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 리포단백질을 변성시킨 변성 리포단백질을 동결 건조함으로써 얻어지는 장기 보존 안정성이 우수한 변성 리포단백질 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 변성 리포단백질의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은, 리포단백질을 함유하는 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 가함으로써 상기 리포단백질을 변성시키는 것으로 이루어지는 변성 리포단백질의 제조방법, 또는 상기 방법에 의해 제조된 변성 리포단백질을 추가로 동결건조함으로써 얻어지는 장기 보존 안정성이 우수한 변성 리포단백질 및 그 제조방법에 관한 것이다.

변성 리포단백질은, 심근경색이나 협심증 등의 관상동맥계 질환, 뇌경색이나 뇌혈관계 치매 등의 뇌동맥계 질환, 혹은 신장 질환, 당뇨병성 신장질환 등의 신장동맥계 질환 혹은 말초동맥 폐색증과 같은 말초동맥계 질환 등의 각종 순환기계 질환과의 연관이 강하게 시사되어 있고, 변성 리포단백질량의 측정용 표준물질 및 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 각종 실험용 시약은 결과를 좌우하는 매우 중요한 물질이다. 따라서, 안정화된 변성 리포단백질은, 예를 들어, 변성 리포단백질을 인식하는 항체와 접촉시키고, 상기 항체의 시료에 대한 반응성을 측정하는 것에 의해 혈액성분 중에 포함되는 변성 리포단백질을 측정하는 방법에 사용되는 표준물질이나, 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 각종 실험용 시약으로써 유용하다.

심근경색이나 협심증 등의 관상동맥계 질환, 뇌경색이나 뇌혈관계 질환 등의 뇌동맥계 질환, 또는 신장질환, 당뇨병성 신장질환 등의 신장동맥계 질환 및 말초동맥 폐색증과 같은 말초동맥계 등의 각종 순환기계 질환에 있어서는, 혈청중의 지질이 중요한 역할을 담당하고 있다는 것이 강하게 시사되어 있으며, 혈청지질 저하약, 특히 콜레스테롤 저하약에는 막대한 보건 의료비가 지불되고 있다. 그러나, 최근 연구에 따르면 이러한 환자군과 건강한 정상인군을 비교한 경우, 혈청지질의 절대량은 양군간에 그다지 큰 차이가 없으며, 오히려 저밀도 리포단백질(LDL)의 변성물인 산화 LDL의 혈청중의 존재량이 양군간에서 명확히 다르다는 것이 보고되었다[Toshima, S. et al. (1996) Circulation,94, Suppl. I:1288]. 또한, 변성 리포단백질의 하나인 산화 리포단백질과 죽상경화병소의 진전과의 관련성이, 스타인버그(Steinberg) 등에 의해 지적되었다[Steinberg, D., Parthasarathy, S., Carew, T.E., Khoo, J.C., and Witztum, J. L., (1989) N. Engl. J. Med.,320 : 915]. 이를 위해, 근래 변성 리포단백질을 사용한 여러가지 측정법이 개발되어[특개평 8-304,395호; 특개평 9-288,106호], 변성 리포단백질의 생리적 역할을 조사하 기 위한 시험의 중요성이 늘고 있다.

그러나, 이러한 실험을 행하는 데 있어서, 측정을 위한 표준물질을 얻는 것에 대한 곤란함이 사정을 복잡하게 했다. 즉, 변성 리포단백질의 생리적 역할을 조사한 뒤에는, 예를 들어, 혈청중의 변성 리포단백질을 복수의 시설로부터 다수 모아서 비교하는 필요성이 있어, 이를 위해서는 각각의 시험때마다의 측정치가 변동하지 않는 것이 필수적이나, 이러한 시험에 소요되는 기간 동안 안정하고 재현성이 좋은 표준물질의 존재 없이는, 측정간의 재현성을 확보할 수 없다. 또한, 다른 표준물질을 사용함에 따라, 측정자간의 실험 결과가 현저히 변동된다는 것은, 그 생리적 역할에 대한 해석을 복잡하게 해서, 일정의 결론을 얻는 것이 불가능하다. 이러한 안정하고 보존가능한 표준물질을 얻을 수 없는 것이, 그 생리적 중요성을 지적하면서도, 예를 들어, 변성 리포단백질의 존재량의 측정에 의한 질병의 정확한 판단수단으로의 응용의 길을 닫게 했다.

통상, 예를 들어, 혈청중의 단백질량의 측정에 있어서는, 소위 말하는 표준혈청과 같은 것이나, 목적하는 성분을 단리한 상태에서, 이것을 안정화시켜 표준물질로 사용하여 왔다. 리포단백질의 경우, 예를 들어, 리포단백질 함유 혈장 또는 혈청을, 필요할 경우, 수크로스 등의 비환원성당과 혼합하여, 수분함량이 1∼10 질량%의 범위가 될 때까지 동결건조하는 것에 의해 장기보존에 안정한 표준혈장 또는 표준혈청을 제조하는 방법[EP-A-617289호공보], 아포리포단백질 및 지질로부터 얻은 재구성 리포단백질을 수크로스나 만니톨 등의 안정화제의 존재하에 동결건조하여 안정화시킨 안정 동결 건조물의 공업적 제조방법[US-A-5,652,399호]이 보고되어 있다. 그러나, 상기 공보에는, 리포단백질을 변성되지 않도록 안정화하는 수단으로써 리포단백질의 안정화가 도모되어 있을 뿐, 안정화된 변성 리포단백질 및 그 제조방법에 대해서는 여전히 개시되어 있지 않다.

　한편, 종래 널리 공지된 방법에 의하여, 예를 들어, 초원심분리법에 의하여 리포단백질을 단리 및 정제하고, 이것을 구리이온 등의 금속이온으로 산화시키거나, 무수초산과 반응시켜 아세틸화하거나, 혹은, 말론디알데히드 등과 반응시키는 등의 방법으로, 각각의 산화리포단백질, 아세틸화 리포단백질 및 말론디알데히드화 리포단백질 등의 변성 리포단백질을 얻는 방법이 알려져 있다. 그렇지만, 이러한 방법으로 제조된 변성 리포단백질은, 미변성 리포단백질 보다 불안정하며, 그대로의 상태로는 장기간의 보존이 불가능하였다.

이러한 상황에 비추어, 특개평 9-288,106호에 인지질을 인공적으로 산화시켜 얻은 인지질의 산화물을 혈장 리포단백질에 집어넣은 것을 표준품으로 사용하여 인간 산화 리포단백질을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법으로 개시되는 표준물질은 보존안정성이 충분하지 않고, 사용할 때마다 조제할 필요가 있고, 조작이 번잡하다.

이러한 여럿 사정을 감안하면, 장기간 안정하고 보존 가능한 변성 리포단백질 및 그 제조방법이 강하게 요구되어져 왔다.　그러므로, 본 발명은 혈액성분 중에 포함된 변성 리포단백질량의 측정용 표준물질이나 변성 리포단백질의 생리적 역할 등의 생리활성을 조사하기 위한 각종 실험용시약으로써 사용되는 장기보존안정성이 우수한(즉, 보존기간에 따라 측정치의 변동이 보이지 않음) 변성 리포단백질 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 목적을 해결하려고 예의 노력한 결과, 리포단백질을 포함한 난황, 유즙, 전혈, 혈청과 혈장, 이것들로부터 부분 분화된 리포단백질화분, 및 초원심분리법 등에 따라 분화 정제된 리포단백질 등의 리포단백질을 구리이온 등의 금속이온 등으로 대표되는 촉매에 의해 산화된 산화 리포단백질, 무수초산 등에 의하여 아세틸화된 아세틸화 리포단백질 또는 말론디알데히드 등에 의해 알데히드화된 말론디알데히드화 리포단백질 등의 인공적으로 변성시킨 변성 리포단백질을 동결건조함으로써, 변성 리포단백질의 장기 보존안정성을 현저하게 향상시키는 것이 가능하고, 따라서, 본 발명의 목적이 해결되는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, 동결건조시에 수크로스, 락토오스, 트레할로오스, 소혈청알부민(BSA) 또는 인간혈청알부민(HSA)등을 안정화제로써 존재시키는 것에 의해, 변성 리포단백질의 장기 보존안정성을 더욱더 향상시키는 것이 가능하고, 이것으로 상기 모든 문제를 좀더 잘 해결할 수 있다는 것도 발견하였다.

본 발명자는 또한 상기 목적을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 리포단백질을 포함한 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 가해 당해 용액 중에 포함된 리포단백질을 변성시킴으로써 혈액중의 변성 리포단백질량의 측정용 표준물질이나 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 각종 실험용 시약으로써 사용될 수 있는 변성 리포단백질이 얻어진다는 것, 더 나아가 이렇게 해서 얻어진 변성 리포단백질을 동결 건조함으로써, 변성 리포단백질의 건조 상태에서의 장기 보존안정성 및 건조상태의 변성 리포단백질을 용액에 용해한 후의 보존안정성을 현저하게 향상시킬 수 있고, 따라서, 본 발명의 목적이 해결되는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, 여기서도 동결 건조시에 수크로스, 락토오스, 트레할로오스, 소혈청알부민(BSA)또는 인간혈청알부민(HSA)등을 안정화제로써 존재시키는 것에 의해, 변성 리포단백질의 장기 보존안정성을 더욱더 향상시키는 것이 가능해져, 이것으로 인해 상기 모든 문제를 좀더 잘 해결할 방안도 발견하였다.

상기 발견을 근거로 하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 상기 목적은, 리포단백질을 인공적으로 변성시켜 변성 리포단백질을 얻고, 얻어진 변성 리포단백질을 동결건조하는 것에 의하여 상기 변성 리포단백질을 안정화시키는 것으로 이루어지는 안정화 변성 리포단백질의 제조방법에 의해서 달성된다.　상기 목적은 또한, 리포단백질을 포함한 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 가하는 것에 의해, 상기 용액 중에 포함되는 리포단백질을 변성시키는 것으로 이루어지는 변성 리포단백질의 제조방법에 의해서도 달성된다.　상기 목적은 더욱이, 리포단백질을 포함한 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 가하는 것에 의해 용액 중에 포함된 리포단백질을 변성시켜 변성 리포단백질을 얻고, 얻어진 변성 리포단백질을 더욱더 동결건조하는 것에 의하여 그 변성 리포단백질을 안정화시키는 것으로 이루어지는 안정화 변성 리포단백질의 제조방법에 의해서도 달성된다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 제일의 태양에 따르면, 리포단백질을 인공적으로 변성시켜 변성 리포단백질을 얻고, 얻어진 변성 리포단백질을 동결건조함으로써 변성 리포 단백질을 안정화시키는 것으로 이루어지는 안정화 변성 리포단백질의 제조방법이 제공된다.　본 명세서에서, "변성 리포단백질"이라 함은, 산화 리포단백질, 아세틸화 리포단백질 및 말론디알데히드등의 작용에 따른 알데히드화 리포단백질 등의 화학변화를 받은 변성 리포단백질, 또는 응집이나 3차원 구조의 변화라는 구조적 변화를 받은 변성 리포단백질 쌍방을 의미하고, 미변성 리포단백질과 비교하여 하전의 변화, 분자량의 변화, 생체내 수용체에의 친화성 변화, FOH1a/DLH3(수탁번호:FERM BP-7171)에 의해 생산되는 항체[J. Biol. Chem. 1994. 269:15274-15279;및 특개평 7-238,098호]를 대표로 하는 변성 리포단백질 특이적 항체와의 결합성의 변화 등에 의하여 확인되는 경우도 포함한다. 이때, 상기 FOH1a/DLH3에 의해 생산되는 항체를 대표로 하는 변성 리포단백질 특이적 항체와의 결합성의 변화는, 예를 들어, 미변성 리포단백질과 본 발명에 관계되는 변성 리포단백질을 항원으로써 불용화고상으로 고상화하고, 당해 항체를 반응시켜 고상화항원에 결합한 당해 항체량을 당해 항체에 특성을 가진 효소표식화 항체를 사용하여 효소량으로써 검출하는 경우에 있어서의, 미변성 리포단백질 항원으로부터 얻은 시그날량과 변성한 리포단백질 항원으로부터 얻은 시그날량과의 상위를 나타낸다.

본 발명에 사용되는 리포단백질은, 어떠한 생물 유래의 것으로도 좋으며, 예를 들어, 인간, 소, 말, 염소, 양, 토끼, 개 및 기니아피그 등의 포유류; 닭이나 메추리 등의 조류; 연어나 청어 등의 어류; 혹은 세균이나 진균 등의 미생물에서 유래하는 리포단백질이 열거된다. 더욱이, 본 발명에 사용되는 리포단백질의 구체적인 예로써는, 상기한 원유래의, 세포막, 미토콘드리아막, 미에인구조막과 세균세포막 등의 생체막 등에 존재하는 구조 리포단백질; 혈장, 난황이나 유즙 등에 존재하는 가용성 리포단백질; 또는, 이것들을 초원심분리법에 의하여, 카이로미크론, 초저밀도리포단백질(VLDL), 저밀도리포단백질(LDL), 리포단백질X, 중간밀도리포단백질(IDL), 리포단백질a [Lp(a)], HDL2 및 HDL3등의 고밀도리포단백질(HDL), 및 초고밀도리포단백질 (VHDL)에서 분화된 리포단백질 화분 등이 열거된다. 이러한 리포단백질은, 단독으로 사용되어도 또는 2종 이상의 혼합물의 형태로써도 좋다. 이것들 중에서, 인간유래의 리포단백질인 것이 바람직하고, 인간혈장 및 혈청유래의 카이로미크론, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 또는 HDL3, 또한 이것들의 혼합물이 더욱더 바람직하고, 가장 바람직하게는 인간혈장 및 혈청유래의 LDL이 사용된다.

본 발명에서 대표적으로 사용되는 인간 리포단백질은, 인간혈청으로부터 원심침항법이나 초원심분리법 등의 공지의 방법을 사용하여 소정의 비중을 가지는 화분을 얻어, 이 화분을 투석이나 탈염 등의 공지의 방법에 따라 정제함으로써 조제된다. 예를 들어, 저밀도리포단백질(LDL)을 조제하는 방법으로써는, 이하의 (1)∼(3)의 방법이 열거된다.

(1) 정상인간혈청 20∼30 mL에, 에틸렌디아민사질산나트륨(EDTA-2Na)을 첨가해, 최종농도를 1 mmol/L로 한다. 여기에, NaBr을 첨가, 비중을 1.000으로 조정한다. 원심튜브에 나누어 넣고, 그 위에 NaBr을 사용하여 비중을 1.15, 1.063, 1.019 및 1.006으로 조정한 완충액을 차례로 중층하고, 이것을 4℃에서 24시간 원심(120,000 ×g)한다. 상단부터 차례로 분화하고, 각 화분의 비중을 굴절계로 측정하고, 비중이 1.019∼1.063의 화분을 LDL화분으로써 채취한다. 이렇게 해서 얻어진 LDL분화를, 채취한 후 즉시, 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS[10 mmol/L의 인산완충액, 140 mmol/L NaCl(pH 7.4)]로 투석한다[특개평 7-238,098호, 단락번호 0040];

(2) 헤파린 채혈로 얻은 인간혈장에 최종농도가 0.25 mmol/L이 되도록 EDTA를 첨가하고, 0.75 mL씩을 초원심분리용시험관(1∼4 mL용)에 넣고, 0.3 mmol/L　EDTA를 포함한 0.15 mol/L NaCl을 250 μL중층하여 185,000 ×g로 10℃에서 2.5시간동안 원심한다. 상층 150 μL을 버리고, 하층 750 μL을 분리채취하여, KBr용액(50w/v%) 150μL을 첨가하여 비중을 1.063으로 조정한다. 초원심분리용시험관(1∼4mL용)의 바닥에 비중조정한 혈장을 옮기고 244,000 ×g로 10℃에서 16시간 원심한다. 상층의 오렌지색밴드(약 100∼150 μL)를 주의깊게 회수해서, 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS에 대하여 4℃, 6시간(3리터를 2시간 간격으로 2회 교환) 투석한다[특개평8-304,395호공보, 단락번호0050];

(3) EDTA을 항응고제로써 얻은 인간혈장로부터 초원심분리법으로 1.019∼1.063의 부분을 LDL화분으로써 회수한다. 아가로스 전기영동법으로 오직날카로운밴드를 얻는 것으로 인하여 LDL의 순도를 확인한 다음, 0.25 mmol/L EDTA를 포함한PBS용액(pH 7.4)에 대하여 충분히 투석한다[특개평 9-288,106호, 단락번호 0062].

또한, 예를 들어, 리포단백질a [Lp(a)]를 조제하는 방법의 한 예는 아래와 같다: 헤파린 채혈로 얻은 인간혈장에 최종농도가 0.25 mmol/L이 되도록 EDTA를 첨가해, 0.3 mmol/L　EDTA를 포함한 0.15 mol/L NaCl 250 μL을 중층하여 105,000 ×g로 8℃에서 20시간 원심한다. 상층을 버리고, 하층에 미리 막자사발로 분말화한 KBr를 첨가하고, 4℃에서 거품이 일어나지 않도록 하여 용해하고, 비중을 1.125로 조정하고, 105,000 ×g로 8℃에서 20시간 원심한다. 상층의 오렌지색 밴드를 주의깊게 회수하고, 바이오겔 A-5m(바이오랏도사제조)를 이용한 1 mol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 10 mmol/L 인산완충액을 전개용매로써 겔여과한다. 얻은 각 분획을 Lp(a) 측정 키트(델모주식회사제조)로 측정하고, Lp(a)화분을 회수한다. 이 화분을 리진세파로스 4B(팔마시아제조)에 걸어, 흡착화분을 0.2 mol/L ε-아미노카프론산을 포함한 완충액에 의해 용출하고, 0.25 mmol/L EDTA을 포함한 PBS에 대하여 투석한다[특개평 8-304,395호, 단락번호 0052].

본 발명에 있어서, 리포단백질을 인공적으로 변성하는 방법은, 특히 제한되는 것이 아니고 공지의 방법이 사용된다. 예를 들어, 인간 리포단백질을 사용한 경우의 변성방법으로써는, 이하의 방법이 열거된다: 인간 리포단백질을 금속이온의 존재하에서 산화하는 방법; 인간 리포단백질을 아세틸화하는 방법; 인간 리포단백질을 말론디알데히드를 사용해서 알데히드화하는 방법; 및 인지질을 인공적으로 산화하여 얻은 화합물(예를 들어,1-파르미토일-2-(9-옥소노나노일)-글루세로-3-포스포클인 및 1-파르미토일-2-(5-옥소바레로일)-글루세로-3- 포스포클인)을 적당한 용매(예를 들어, DMSO)에 용해한 용액을, 인간 리포단백질에 첨가하는 방법이 열거될 수 있다. 이것들 중에서, 인간 리포단백질을 금속이온의 존재하에서 산화하는 방 법; 인간 리포단백질을 아세틸화하는 방법; 및 인간 리포단백질을 말론디알데히드를 사용해서 알데히드화하는 방법이 바람직하게 사용된다.　여기서, 상기 바람직한 3가지 방법에 대하여 대표적으로 이하에서 상술한다.

첫번째, 인간 리포단백질을 금속이온의 존재하에서 산화하는 실시 태양에 대해서 이하에서 상술한다. 상기 실시 태양의 일예를 이하에서 기재한다: 상기에서 조제된 인간 리포단백질(화분)을 EDTA을 포함하지 않은 완충액[예를 들어, PBS(pH 7.4)]으로 투석하는 것 등에 의해 EDTA을 제거하고, 소정의 단백질 농도(50∼2000 μg/mL, 바람직하게는 100∼500 μg/mL)로 조정한 후, 황산구리(CuSO₄)를 소정 농도가 되도록 첨가하고, 약 36∼38℃에서, 반응시킨다.

상기 실시태양에서 사용되는 금속이온은 불화구리(II)이수화물, 브롬화구리(II), 산화구리(II), 수산화구리(II), 황산구리(II), 황산구리(II)오수화물, 셀렌화구리(I), 셀렌화구리(II), 셀렌산구리(II)오수화물, 핵사플루오로규산 구리(II)사수화물, 질산구리(II)일수화물, 테트라아민구리(II)황산염일수화물, 및 비스(에틸렌디아민)구리(II)황산염이수화물 유래의 구리이온; 염화철(II), 브롬화철(II)육수화물, 질산철(II)육수화물, 티오시안산(II)삼수화물, 질산철(II)사수화물, 브롬산철(III)오수화물, 황산암모늄철(II)육수화물, 황산칼륨철(III)십이수화물, 황산암모늄철(II)십이수화물 및 황산철 유래의 철이온; 헤모글로빈(Hb), 트랜스페인(Tf) 및 락토페린(Lf)의 금속이온 및 이것들의 혼합물이 열거되고, 이것들 중에서, 황산구리(II), 황산구리(II)오수화물 유래의 구리이온 또는 이것들의 혼합 물이 바람직하게 사용된다. 또한, 이것들의 금속이온은, 단독으로 사용되어도 혹은 2종 이상의 혼합물의 형태로 사용되어도 좋다.

또한, 상기 실시 태양에 있어서, 금속이온의 사용량은, 인간 리포단백질을 충분히 산화할 수 있는 양이면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 금속이온의 농도가, 산화되는 인간 리포단백질 1 g에 대하여, 10∼200 μmol/L, 바람직하게는 25∼100 μmol/L의 양이다.

또한, 상기 실시 태양에 있어서, 반응시간이 너무 짧을 경우에는, 리포단백질의 변성(산화)이 충분히 일어나지 않고, 한편, 반응시간이 너무 긴 경우에는, 리포단백질 자체의 과잉분해가 일으켜, 예를 들어, 아포단백질의 항원성등을 잃어버리고 마는 것으로 바람직하지 않다. 또한, 반응시간은, 잔존하는 EDTA량이나 용액 전체의 양 등에 의하여 변동하므로 일률적으로는 규정할 수 없으나, 상기 실시 태양에 있어서 조제되는 리포단백질(화분)의 경우에는, 약 36∼38℃에서, 1∼24시간, 바람직하게는 2∼4시간이다.

두번째, 인간 리포단백질을 아세틸화하는 실시 태양에 관해서 이하에 상술한다. 상기 실시태양의 일 예를 이하에서 기재한다: 소정 단백질 농도 (약 500∼2000 μg/mL, 바람하게는 500∼1000 μg/mL)의 상기와 같이하여 조제된 인간 리포단백질(화분)의 용액에 포화질산나트륨을 등용적으로 첨가해, 0∼4℃에서 1∼2시간, 교반한다. 그 후, 무수초산을 0.25∼4 μL (즉, 인간 리포단백질에 대하여, 0.5∼2 μL/mg), 바람직하게는 0.4∼2.4 μL (즉, 인간 리포단백질에 대하여, 0.8∼1.2 μL/mg) 첨가하여, 0∼4℃에서 60∼120분간 교반한 후, 0.25 mmol/L　EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 2∼8℃에서 충분히(500∼1000배용으로 2∼3회 (2시간이상/회)) 투석한다.

세번째, 인간 리포단백질을 말론디알데히드를 사용하여 알데히드화하는 실시태양에 대하여 이하에서 상술한다. 상기 실시태양의 일 예를 이하에서 기재한다: 0.1 mol/L 인산 완충액(pＨ 6.5)에 있어서의, 소정 단백질 농도(약 0.25∼1 mg/mL, 바람직하게는 0.25∼0. 5 mg/mL)의 상기와 같이하여 조제된 인간 리포단백질(화분) 용액에, 말론디알데히드 용액(말론디알데히드비스디메틸아세탈 1 mol/L를 0.1 mol/L 염산 존재하에서 100℃에서 5분 가열하고 가수분해한 것)을 0.625∼10 μL(즉, 인간 리포단백질에 대하여, 2.5∼10 μL/mg), 바람직하게는1∼6 μL(즉, 인간 리포단백질에 대하여, 4∼6 μL/mg) 첨가하고, 30∼40℃에서 2∼4시간 동안 반응시킨 후, 이 반응액을 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 2∼8℃에서 충분히 (500∼1000배용으로 2∼3회(2 시간 이상/회)) 투석한다.

본 발명의 방법은, 이렇게 하여 얻어진 변성 리포단백질의 안정화를 목적으로 하는 동결건조하는 공정을 포함하는 것을 필수로 한다. 본 명세서에 있어서, "동결건조"라 함은, 당해 분야에 있어서 사용되는 같은 의미로 사용되고, 다시 말하면, 시료를 동결시켜 동결상태 그대로 감압하여 시료로부터 물이나 승화성의 물질을 제거하고 건조시키는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 동결건조의 조건은, 변성 리포단백질을 안정화시킬 수 있는 조건이라면 특히 제한되는 것은 없으나, 통상, -80∼20℃, 바람직하게는 -80∼15℃의 온도에서, 0.667∼13.33 Pa, 바람직하게는 0.667∼1.333 Pa의 압력에서, 12∼72시간, 바람직하게는 24∼72시간 동안 동결 건조한다. 이러한 동결건조 공정에 의해, 변성 리포단백질을 포함한 동결 건조물 중의 수분함량은, 통상, 10 질량% 이하, 바람직하게는 1 질량% 이하이다.

본 발명에 있어서, 동결건조 공정 중에서 안정화제를 존재시키는 것이 바람직하다. 상기 태양에 사용되는 안정화제로는, 당해 분야에서 통상 사용되는 안정화제가 사용되지만, 구체적으로는, 수크로스, 락토오스, 트레할로오스 등의 당류; 소혈청알부민(BSA), 인간 혈청알부민 (HSA) 등의 단백질 등이 열거된다. 이것들 중에서, 수크로스, 락토오스, 트레할로오스, 소혈청알부민(BSA) 및 인간혈청알부민(HSA)이 안정화제로써 바람직하게 사용된다. 또, 상기한 안정화제는, 단독으로 사용되거나 또는 2종 이상의 혼합물의 형태로 사용되어도 좋다. 또한, 이 때의 안정화제의 사용량은, 변성 리포단백질의 안정화가 측정되는 양이라면 특별히 제한되는 것이 아니지만, 통상, 1∼20 질량%, 바람직하게는 2∼5 질량%이다.

또한, 본 발명에 있어서, 동결건조 공정 중에 안정화제를 존재시키는 경우의 안정화제의 첨가시기는, 특히 제한되는 것이 아니지만, 동결건조 전에 미리 안정화제를 첨가하는 것이 바람직하고, 변성공정과 동결건조 공정 사이에 안정화제를 첨가하는 것이 특히 바람직하다. 더우기, 동결건조 후, 안정화제를 제거하는 공정은 필요하지 않으며, 변성 리포단백질의 보존안정성을 고려하면, 오히려 동결건조 상태를 보전하는 동안에 안정화제를 존재시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 두번째의 태양에 따르면, 리포단백질을 포함한 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 첨가하여 당해 용액중에 포함되는 리포단백질을 변성시키는 것으로 이루어지는 변성 리포단백질의 제조방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 세번째의 태양에 따르면, 이렇게 해서 얻은 변성 리포단백질을 더욱더 동결건조하는 것에 의하여 당해 변성 리포단백질을 안정화시키는 것으로 이루어지는 안정화변성 리포단백질의 제조방법이 제공된다. 본 발명자들은, 리포단백질을 포함한 용액에 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 가해서 당해 용액에 포함된 리포단백질을 변성시킴으로써 얻어지는 변성 리포단백질도 또한, 혈액중의 변성 리포단백질량의 측정에 사용되는 표준물질이나 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 시약으로써 사용될 수 있고, 얻은 변성 리포단백질을 더욱더 동결건조하는 것에 인하여 변성 리포단백질은 건조상태에서의 장기보존안정성 및 그 건조상태의 변성 리포단백질을 용액에 용해한 후의 보존안정성에서 우수함을 발견하고, 이것에 기초하여 상기 태양의 방법을 얻었다.

두번째 또는 세번째의 태양에 관한 방법은, 리포단백질을 포함한 용액을 동결하는 공정을 포함하는 것을 필수요건으로 한다. 두번째 또는 세번째의 태양에 있어서, "리포단백질"이라 함은, 상기 첫번째의 태양에 있어서 정의와 같다. 리포단백질을 포함한 용액으로는, 예를 들어, 혈청, 혈장, 및 카이로미크론, 초저밀도리포단백질(VLDL), 저밀도리포단백질(LDL), 리포단백질X, 중간밀도리포단백질 (IDL), 리포단백질a [Lp(a)], HDL2 및 HDL3 등의 고밀도리포단백질(HDL) 및 초고밀도 리포단백질(VHDL) 등의 리포단백질 화분 등이 들 수 있다. 이러한 것들 중에서, 혈청, 혈장, 카이로미크론, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 또는 HDL3, 또는 이것들의 혼합물이 리포 단백질을 포함한 용액으로써 더 바람직하고, 가장 바람직하게는, 인간혈장, 인간혈청, 혹은 인간혈장 및 혈청유래의 LDL가 사용된다.

두번째 태양의 방법은, 리포단백질을 포함한 용액에 대하여 동결을 포함한 공정을 가하는 것을 필수로 한다. 본 명세서에 있어서, "동결을 포함한 공정"이라 함은, 당해 용액 중에 포함된 리포단백질 내의 또는 그 리포단백질을 실질적으로 둘러싸는 환경중의 수분의 일부 또는 전부를 동결하는 공정을 적어도 일회 포함한 공정을 의미하고, 본 발명에 관한 동결을 포함한 공정을 행하는 것에 의해 얻어지는 변성 리포단백질로서는, 상기 첫번째의 태양에 있어서 기재한 변성 리포단백질의 어느 것이 열거된다. 바람직하게는, 본 발명에 관한 동결을 포함한 공정을 행하는 것에 의해 얻어지는 변성 리포단백질은, 산화리포단백질, 알데히드화리포단백질, 또는 하이브리도마셀루라인 FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM BP-7171)에 의해 생산되는 항체(본 명세서 중에서, 단순히 "DLH3 항체"라고도 한다)와 반응하는 리포단백질이다. 또한, 상기 방법에 사용되는 하이브리도마셀루라인 FOH1a/DLH3는, 1994년 2월 17일에, 일본 이바라기현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번 3호에 소재하는 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁번호　FERM　P-14153로써 「Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3」의 표시로 기탁되어, 당 기탁은, 2000년 5월 26일에 부다페스트조약에 입각한 기탁에 새로 바꾸고, 수탁번호 FERM　BP-7171로써 같은 장소에 보관되고 있다.

상기 태양에 있어서, 리포단백질을 포함한 용액에 대하여 변성을 목적으로 가한 동결을 포함한 공정의 조건은, 상기 용액 중에 포함되는 리포단백질을 통상 변성가능한 조건이라면 특별히 제한되는 것이 아니고, 또한, 동결을 포함한 공정에 있어서는, 동결을 행할 때의 리포단백질을 실질적으로 둘러싸는 환경에 의하여 그 동결의 효과는 크게 좌우되기 때문에 일률적으로는 한정이 불가능하나, 예를 들어, 동결을 포함한 공정중의 동결의 조건은, 0.01∼10℃/분, 바람직하게는 0.01∼1℃/분의 항온속도에서, 0∼-196℃, 바람직하게는 -5∼-85℃의 온도가 될 때까지 항온하여 동결하고, 0∼36시간, 바람직하게는 0∼16시간, 소정의 온도를 유지하는 조건이다. 또한, 두번째 태양에 있어서, 리포단백질의 변성을 위한 동결을 포함한 공정은, 적어도 일회 행할 필요가 있으며, 또한, 되풀이해서 행하여도 특별히 상관은 없다. 되풀이하여 행할 경우의 동결을 포함한 공정수는, 1∼10회, 보다 바람직하게는 1∼4회인 것이 좋다. 본 발명에 있어서, 되풀이하는 공정내용은 동결을 포함한 공정마다 같지 않아도 좋으며, 또한, 각 공정의 동결조건은 동일하거나 또한 그렇지 않더라도 좋다. 이 경우, 동결건조 공정수가 10회를 초과하면, 이것에 대응하는 리포단백질의 변성효과가 약하게되어, 경제적이지 못하다.

또는, 상기 두번째 태양에 따른 리포단백질의 변성을 위한 동결을 포함한 공정은, 동결 후에 융해를 포함한 공정이 되어도 좋다. 상기 두번째 태양에 있어서 동결을 포함한 공정 내에 융해를 포함하는 경우, 그 조건은 특별히 제한되는 것이 아니지만, 융해는, 0.01∼10℃/분, 바람직하게는 0.1∼10℃/분의 항온속도로, 0∼42℃, 바람직하게는 0∼37℃의 온도가 될 때까지 항온하는 것으로 행하여진다.

또는, 상기 두번째 태양에 따른 리포단백질의 변성을 위한 동결을 포함한 공정은, 그 공정내에서 건조를 포함한 공정이 되어도 좋다. 이 경우의 동결후의 건조를 포함한 공정의 조건은, 특별히 제한되는 것이 아니지만, 건조는, 예를 들어, - 80∼20℃, 바람직하게는 -80∼15℃의 온도에서, 0.6∼13 Pa, 바람직하게는 0.6∼1.3 Pa의 압력에서, 12∼72시간, 바람직하게는 24∼72시간, 건조하는 것에 따라 행하여진다.

또는, 상기 두번째 태양에 따른 리포단백질의 변성을 위한 동결을 포함한 공정은, 리포단백질을 포함한 용액을 동결건조하고, 얻은 건조물을 용매에 용해한 후, 당해 용액을 다시 동결건조하는 것으로 이루어지는 공정이라도 좋다. 이 경우의 동결건조공정은 첫번째 태양에 있어서의 정의와 같다. 또한, 최초의 동결건조에서 얻은 건조물을 용해하는 용매는, 건조물을 용해가능한 것이라면 특별히 제한되는 것은 없으나, 예를 들어, 물, 탈이온수 및 증류수 등이 들 수 있다.

세번째 태양의 방법은, 상기 두번째의 태양의 방법에 따라 얻은 변성리포 단백질을 더욱더 동결건조하고, 얻어진 변성 리포단백질을 안정화시키는 것을 필수요건으로 하는 것이다. 상기 태양에 따른 동결건조 공정은, 안정화제의 첨가시기 이외에 대하여서는 첫번째 태양에 있어서의 정의와 같다. 즉, 세번째 태양에 있어서, 안정화제는, 두번째 태양에 있어서 동결을 포함한 공정내용에 따라 달라지나, 예를 들어, 변성 리포단백질을 함유하는 용액에 동결을 포함한 공정을 가하는 때에는, 안정화제는, 동결을 포함한 공정전에 미리 첨가해 놓아도, 또는 변성을 목적으로 하는 동결을 포함한 공정과 안정화를 목적으로 하는 동결건조 공정과의 사이에 첨가하여도 좋다. 또한, 변성 리포단백질을 함유하는 용액을 동결할 때에는, 안정화제는 동결을 포함한 공정 이전에 미리 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 네번째 태양에 따르면, 상기 첫번째 또는 세번째 태양에 의하여 제조되는 안정화 변성 리포단백질이 제공된다.

이렇게 하여 제조된 변성 리포단백질 및 안정화 변성 리포단백질은 장기간 보존안정성이 뛰어나므로, 예를 들어, 변성 리포단백질을 인식하는 항체와 접촉시켜, 그항체의 시료에 대한 반응성을 측정함으로써 혈액성분 중에 포함되는 변성 리포단백질을 측정하는 방법에 사용되는 표준물질이나, 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 각종 실험용시약으로써 유용하다.

그러므로, 본 발명의 다섯번째 태양에 따르면, 상기 첫번째 또는 세번째 태양에 따라 제조되는 안정화 변성 리포단백질을 표준물질로써 사용하는 변성 리포단백질의 측정방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 여섯번째 태양에 따르면, 상기 첫번째 또는 세번째 태양에 따라 제조되는 안정화 변성 리포단백질을 표준물질로써 함유하는 변성 리포단백질의 측정용 시약키트가 제공된다.

상기 다섯번째 태양에 있어서, 변성 리포단백질의 측정방법은 특별히 제한되는 것이 아니고, 널리 알려진 방법으로 사용가능 하지만, 구체적으로는, 변성 리포단백질을 인식하는 항체와 접촉시켜서, 상기 항체의 시료에 대한 반응성을 측정하는 것으로 이루어지는 혈액성분 중에 포함된 변성 리포단백질을 면역학적으로 측정하는 방법, 예를 들어, 방사면역분석(RIA), 효소면역분석(ELISA), 형광면역분석(FIA), 발광면역분석, 응집면역분석, 면역비탁계측법 및 혼탁면역분석법 등을 들 수 있다. 또한, 측정양식으로는 경합법 및 샌드위치법 등을 들 수 있다. 이러한 방법들 중에서, 본 발명에 따른 안정화 변성 리포단백질은, 면역학적으로 측정하는 방법, 특히 방사면역분석, 효소면역분석, 형광면역분석 및 발광면역분석에 있어서 표준물질로써 바람직하게 사용된다.

또한, 상기 여섯번째 태양에 있어서, 변성 리포단백질의 측정용 시약키트는, 본 발명에 따른 안정화 변성 리포단백질을 표준물질로써 함유하는 것이라면 특별히 제한되는 것이 아니고, 본 발명에 따른 안정화 변성 리포단백질을 표준물질로써 사용하는 이외에는, 공지의 키트의 구성과 같은 구성으로 이루어진다. 예를 들어, 본 발명에 따른 안정화 변성 리포단백질을 ELISA법에 있어 표준물질로써 사용하는 경우에는, 본 시약키트는, 검체희석액, 항체고상화고상(a solid phase formed by immobilizing an antibody), 반응용완충액, 세정액, 표식화2차항체(바람직하게는, 효소표식화 2차항체), 검출용시약(예를 들어, 발색액), 및 표준물질로써의 본 발명에 관한 안정화 변성 리포단백질의 전부 또는 일부를 포함한 구성으로 이루어진다. 상기 태양도 또한 본 발명의 개념에 포함되는 것이다. 따라서, 일곱번째 태양에 따르면, 검체희석액, 항체고상화고상, 반응용완충액, 세정액, 표식화 2차항체, 검출용시약, 및 표준물질로써의 상기 첫번째 또는 세번째 태양에 따라 제조된 안정화 변성 리포단백질의 전부 또는 일부를 구성요소로써 포함한 변성 리포단백질의 측정용 시약키트가 제공된다.

상기 일곱번째 태양에 있어서, 표준물질이 시약키트에 포함되어 있지 않은 경우라도, 실질적으로 키트로 사용하는 것을 전제로 하는 경우에는, 본 발명에 관한 표준물질은 시약키트의 구성요소로써 인지되어야만 한다.　다음은, ELISA법에 따른 변성 리포단백질의 활성측정법을 예를 들어, 하기 실시예를 참조하면서, 본 발명에 따른 변성 리포단백질의 제조방법 및 그 효과에 대하여 상세히 설명하나, 본 발명의 태양이 하기 실시예에 한정되는 것이 아님은 당연하다 하겠다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 얻은 산화 LDL(구리로 산화한 LDL를 동결건조한후, 소정의 방법으로 용해한 것)를 시료로써 작성한 검량선을 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 실시예1에서 얻은 산화 LDL(구리로 산화한 LDL를 동결건조한 것)를 4℃에서 보존해, 일정간격으로 소정의 방법으로 용해한 것을 시료로써 측정한 경우와, 구리로 산화한 LDL를 동결건조하지 않고 그대로 4℃에서 보존해, 일정간격으로 시료로써 측정한 경우와의 측정치비교를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 실시예 2에서 얻은 산화 HDL(구리로 산화한 HDL를 동결건조한 후, 소정의 방법으로 용해한 것)를 시료로써 작성한 검량선을 나타내는 도면이다.

도 4는 본 발명의 실시예 2에서 얻은 산화 HDL(구리로 산화한 HDL를 동결건조한 것)를 4℃에서 보존해, 일정간격으로 소정의 방법으로 용해한 것을 시료로써 측정한 경우와, 구리로 산화한 HDL를 동결건조하지 않고 그대로 4℃에서 보존해, 일정간격으로 시료로써 측정한 경우와의 측정치를 비교한 도면이다.

도 5는 본 발명의 실시예 3에서 얻은 산화리포단백질a[Lp(a)](구리로 산화한 Lp(a)를 동결건조한 후, 소정의 방법으로 용융한 것)를 시료로써 작성한 검량선을 나타내는 도면이다.

도 6은 본 발명의 실시예 3에서 얻은 산화 Lp(a)(구리로 산화한 Lp(a)를 동결건조한 것)를 4℃에서보존해, 일정간격으로 소정의 방법으로 용해한 것을 시료로 써 측정한경우와, 구리로 산화한 Lp(a)를 동결건조하지 않고 그대로 4℃에서 보존해, 일정간격으로 시료로써 측정한 경우와의 측정치를 비교한 도면이다.

도 7은 본 발명의 실시예 4에서 혈장에 대하여 동결을 포함한 공정을 가함으로써, 변성 리포단백질이 제조되는 것을 나타내는 도면이다.

도 8은 실시예 5에서, 실시예 5(2)로 조제된 동결 변성 인간혈청 표준품 및 실시예 1(3)로 조제된 산화 LDL 표준품에관한 ELISA법에 의한 용해한 후 보존안정성을 평가한 후의 측정치(흡광도)의 비교를 나타내는 도면이다.

도 9는 실시예 6에서 인간 LDL에 동결을 포함한 공정을 가함으로써, 변성 리포단백질이 제조되는 것을 나타내는 도면이다.

도 10은 실시예 6에서, 실시예 6(2)에서 조제된 동결변성 LDL 표준품 및 실시예 1(3)에서 조제된 산화 LDL 표준품에 관한 ELISA법에 의해 용해한 후 보존안정성을 평가한 후의 측정치(흡광도)의 비교를 나타내는 도면이다.

실시예 1

(1) LDL의 조제

EDTA를 항응고제로써 얻은 인간혈장으로부터 초원심분리법(10℃에 비중 1.019로 조정, 120,000 ×g, 20시간 후, 상층을 회수하고, 1.063으로 비중조정하여, 더욱이 120,000 ×g, 24시간)으로 비중 1.019∼1.063의 부분을 LDL 화분으로써 회수하였다. 이때, LDL의 순도는, 아가로스 전기영동법으로 단일의 날카로운 밴드를 얻은 것으로 확인하였다.

다음은, 이 LDL 화분을, 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)로 충분히(16시간 또는 하룻밤) 투석하여 정제하였다. 정제된 LDL를, LDL 단백질 농도가 1 mg/mL이 되도록 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 용해하고, 사용하기 전까지 4℃에서 보존하였다. 또한, 본 실시예에 있어서, 단백질량은, 라우리 변형 방법(Lowry modified Method)를 사용하였다. 간단하게 말하면, 2(w/v)% 탄산나트륨, 0.4(w/v)% 수산화나트륨, 0.16(w/v)% 주석산, 1(w/v)% SDS 용액 및 4(w/v)% 황산구리용액을 100대1로 혼합한 시약 1.5 mL을, 각각, 샘플 및 표준물질(BSA) 0.5 mL에 혼합하였다. 실온에서 20분간 반응시킨 후, 페놀시약 0.15 mL을 첨가하고, 바로 혼합하였다. 실온에서 45분간 반응후, 660 nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

(2) LDL의 산화

(1)에서 조제된 LDL를, 500∼1000배 용적 이상의 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 대하여 3회 이상(2시간이상/회) 투석함으로써 EDTA를 제거하고, LDL의 농도가 200 μg/mL이 되도록 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 녹였다. 이 LDL 용액 10 mL에, 황산구리(CuSO₄)를 최종농도가 5 μmol/L이 되도록 첨가하고, 37℃에서 3시간 배양함으로써 LDL를 산화시켰다. 이 용액에, EDTA를 최종농도가 1 mmol/L 되도록 첨가하여 산화반응을 정지시킨 후, 500∼1000배 이상의 EDTA를 1 mmol/L 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 3회 이상(2시간이상/회) 투석함으로써, CuSO₄를 제거하고, 산화 LDL를 조제하고, 이것을 4℃에서 보존하였다. 또한, 본 실시예에 있어서, 산화 LDL량의 표현은, 원료인 LDL의 단백질량으로 정의하였다.

(3) 산화 LDL의 동결건조품의 조제

(2)에서 조제된 산화 LDL를, 단백질 농도가 6.25 ng/mL("L 타입"이라고 한다) 및 12.5 ng/mL("H 타입"이라고 한다)이 되도록 PBS(pH 7.4)로 희석한 후, BSA를 전체농도 2(w/v)%로, 및 수크로스를 최종농도가 5(w/v)%이 되도록 각각 첨가하고 잘 섞었다. 이 혼합액을 유리병에 1 mL씩 나누어 넣고, 공화진공 동결건조장치 RL-201BS(공화진공기술주식회사제조)를 이용하여, -50℃에서 16시간 동결한 후, 20℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간 동결건조함으로써 수분을 기화·제거한 후, 밀봉하고, 4℃에서 보존하였다. 또, 이때, 동결 건조품 중의 수분함량은 0.8 질량%이었다.

(4) 산화 LDL의 동결 건조품을 표준품으로 사용한 검량선의 작성

a. 페록시다제 표식항체의 제작

정제 항인간아포 B항체(염소, 케미콘사제조) 용액(5 mg/mL, 0.1 mol/L　붕산완충액　pH 8.0) 1 mL에, 50 μL의 2-이미노티오란-HCl용액(60 mmol/L, 0.1 mol/L　붕산완충액 pH 8.0)을 첨가하고, 30℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응용액을, 5 mmol/L의 EDTA를 포함한 0.1 mol/L의 인산 완충액 (pH 6.0)으로 평형화한 셀파덱스 G-25칼럼 (1cm ×30cm)(팔마시아사제조)로써, 용출된 항체화분을 회수하였다. 서양고추냉이 페록시다제(「HRP」라고 함. 동양방사제조) 용액(10 mg/mL, 0.1 mol/L　인산완충액 pH 7.0) 1 mL에 50 μｌ의 EMCS 용액(동인화학사제조, 50 mmol/L　DMSO 용액)을 첨가하여, 30℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응용액을 0.1 mol/L의 인산완충액(pH 6.5)으로 평형화한 셀파덱스 G-25칼럼 (1cm ×30cm)(파르마시아사제조)로 써, 용출된 HRP 화분을 회수하였다. 회수된 항체화분 및 HRP 화분을 혼합하고, 30℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응용액을 0.1 mol/L의 인산완충액 (pH 7.0)으로 평형화한 셀파덱스 G-200칼럼(1cm ×100cm)(파르마시아사제조)에 걸어, 용출된 항체-HRP 복합화분을 혼합·회수하고, 이것을 페록시다제 표식 항인간아포 B항체로 하였다. 회수된 화분은, 바로 최종농도가 1(w/v)% 되도록 BSA를 첨가하고, 사용하기 전까지 -50℃에서 보존하였다.

b. DLH3 항체의 조제

8주령 이상의 수컷의 Balb/c 마우스의 복강 내에, 0.5 mL/마리의 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸)을 주입하고 2주간 사육하였다. 그 후, 이 마우스에, 소망의 모노콜로날항체를 생산하는 세포인, 하이브리도마셀루라인 FOH1a/DLH3 (수탁번호: FERM　BP-7171; J. Biol. Chem. 1994. 269: 15274-15279; 및 특개평 7-238,098호)를 1×10⁶/마리 복강내 접종하였다. 7∼14일 후, 마우스의 복강내에 충분히 복수가 찬 시점에서, 복강으로부터 18G의 주사침를 사용하여 복수를 회수하고, 3000rpm으로 10분간 원심분리한 다음, 상등액을 회수하였다. 이 상등액에, 같은 양의 PBS(pH 7.4)를 첨가한 후, 이 혼합액과 같은 양의 포화황산암모늄용액을 충분히 교반하면서 1시간에 걸쳐서 적하하고, 추가로 1시간동안 교반을 계속한 후, 3000rpm으로 10분간 원심분리해서 상등액을 폐기하고, 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 0.5 mol/L의 NaCl을 포함한 PBS(pH 7.4)를 첨가하여 용해하고, 이 용액을, 0.5 mol/L의 NaCl을 포함한 PBS(pH 7.4)로 평형화한 Sephacryl S-300칼럼 (2.5cm ×100cm)(파르마시아사제조)에 걸어, IgM 화분을 회수하고, 이것을 DLH3 항체로 하였다. 또한, DLH3 항체의 농도는, 광로길이 1cm의 280 nm에 있어서의 흡광도를 측정하고, 얻은 흡광도를 1.3으로 제하고, 이 수치를 항체농도(mg/mL)로 하였다.

c. 센드위치 ELISA 분석

(3)에서 조제된 산화 LDL의 동결 건조품에 정제수 1 mL를 첨가하여 용해한 후, 소정농도(0 ng/mL, 3.125 ng/mL, 6.25 ng/mL, 12.5 ng/mL, 및 25 ng/mL)가 되도록, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS로 희석하였다.

96F 마이크로플레이트(눈크사제조)의 각 웰에, 상기 b)에서 조제된 DLH3 항체를 Tris-HCl(pH 8.0)에 10 μg/mL에 희석한 것을, 1 μg/웰이 되도록 첨가하여, 4℃에서 16시간 배양하였다. 항체용액을 버리고, 1(w/v)% BSA를 포함한 Tris-HCl(pH 8.0) 350 μL를 첨가하여 실온에서 2시간 배양한 후 0.05(v/v)% Tween 20을 포함하는 PBS(pH 7.4)로 4회 세정하였다.

상기에서 조제된 소정농도의 산화 LDL 동결 건조품을 포함한 희석액을, 각각, 100 μL씩 웰에 나누어 넣고, 실온에서 2시간 인큐베이터안에 방치한 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정하였다.

또한, 각웰에, 상기 a)에서 조제된 페록시다제 표식 항인간아포 B항체를 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS(pH 7.4)로 1000배로 희석한 용액 100 μL을 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이터안에 방치하였다. 그 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정한 후, o-페닐렌디아민(화광순약공업사제조) 3 mg/mL를 포함한 0.03(w/v)% 과산화수소수 100 μL를 첨가해서 30분간 발색시킨 후, 1 mol/L 황산 50 μL을 첨가해서 반응을 정지시켜, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 것처럼, 본 발명의 산화 LDL의 동결 건조품을 사용해서 깨끗한 검량선이 작성되었다.

(5) 보존안정성의비교

(3)에서 조제된 산화 LDL의 동결 건조품[산화 LDL 표준품(1): 12.5ng (H 타입) 및 산화 LDL 표준품 (2): 6.25ng (L타입)]을, 소정기간동안(0, 1, 3, 4주간) 4℃에서 보존하였다. 또한, (2)에서 조제된 산화 LDL를, 단백질농도가 6.25 ng/mL ("L 타입"이라 한다) 및 12.5 ng/mL("H 타입"이라 한다)가 되도록 PBS(pH 7.4)로 희석한 후, 추가로 BSA를 최종농도 2(w/v)%로, 및 수크로스를 최종농도가 5(w/v)%가 되도록 각각 첨가한 후 잘 혼합하였다. 이 혼합용액을 동결건조하지 않고 그대로 4℃에서 냉장보존한 것[각각, 산화 LDL 비교품 (1) (H타입): 12.5 ng/mL; 및 산화 LDL 비교품 (2): 6.25 ng/mL (L타입)라 한다]을 소정기간(0, 1, 3, 4주간)동안 4℃에서 보존하였다.

소정기간 보존한 후, 산화 LDL 표준품 (1) 및 (2)에서 정제수 1 mL를 첨가해 용해한 것 혹은 산화 LDL 비교품 (1) 및 (2)에 대하여, 각각, 상기 (4)c와 같은 조작을 행하여, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.　도 2에 표시된 것처럼, 본 발명에 의해 동결건조된 산화 LDL 표준품 (1) 및 (2)에서는 조제 직후(0주)와 비교한 측정치가 거의 변동되지 않은 것에 비해, 냉장보존 된 산화 LDL 비교품 (1) 및 (2)에서는 조제 직후(0주)와 비교한 4주간 경과 후의 측정치가 각각 약 50% 및 약 45% 저하되어, 본 발명에 의한 산화 LDL 표준품 (1) 및 (2)에 비해 보존안정성이 현저히 뒤떨어진 것을 알 수 있다.

실시예 2

(1) HDL의 조제

EDTA을 항응고제로 해서 얻은 인간혈장으로부터 LDL를 제거한 후, 1.21로 비중조정하고 초원심분리법(10℃에서 120,000 ×g, 48시간)으로 비중 1.063∼1.21의 부분을, HDL화분으로써 회수하였다. 이때, HDL의 순도는, 아가로스전기영동법으로 단일의 날카로운 밴드가 얻어지는 것으로 확인하였다.

그 후, 이 HDL화분을, 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 충분히(16시간) 투석함으로써 정제하였다. 정제된 HDL를, HDL 단백질농도가 1 mg/mL이 되도록 0.25 mmol/L　EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 용해하고, 사용하기 전까지 4℃로 보존하였다. 본 실시예에 있어서, 단백질량은, 실시예 1(1) 기재의 라우리 변형 방법(Lowry modified Method)을 사용하였다.

(2) HDL의 산화

(1)에서 조제된 HDL를, 500∼1000배 용적 이상의 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 대하여 3회 이상(2시간이상/회) 투석함으로써 EDTA를 제거하고, HDL의 농도가 100 μg/mL이 되도록 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 녹였다. 다음에, 이 HDL 용액 10 mL에, 황산구리(CuSO₄)를 최종농도가 10 μmol/L이 되도록 첨가 하고, 37℃에서 18시간 인큐베이터안에 방치함으로써 HDL를 산화하였다. 이 용액에, EDTA를 최종농도가 1 mmol/L 이 되도록 첨가함으로써, 산화반응을 정지한 후, 500∼1000배용적 이상의 EDTA를 1 mmol/L 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 3회 이상(2시간이상/회) 투석함으로써, CuSO₄를 제거하고, 산화 HDL를 조제하고, 이것을 4℃로 보존하였다.　본 실시예에 있어서, 산화 HDL량의 표현은 원료인 HDL의 단백질량으로 정의하였다.

(3) 산화 HDL의 동결 건조품의 조제

(2)에서 조제된 산화 HDL에, BSA를 최종농도가 2(w/v)%되도록, 및 수크로스를 최종농도가 5(w/v)%되도록, 각각 첨가하고, 잘 혼합한 후, 유리병에 1 mL씩 나누어 넣고, 공화진공동결건조장치　RL-201BS(공화진공기술주식회사제조)를 이용하여, -50℃에서 16시간 동결한 후, 20℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간 동결건조함으로써, 수분을 기화·제거시킨 후, 밀봉하고, 4℃에서 보존하였다. 이때, 동결 건조품 중의 수분함량은 0.8 질량%이었다.

(4) 산화 HDL의 동결 건조품을 표준품으로써 사용한 검량선의 작성

a. 농도조정　

(3)에서 조제된 산화 HDL의 동결 건조품에 정제수 1 mL를 첨가하여 용해한 후, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS로 소정농도(0 ng/mL, 3.125 ng/mL, 6.25 ng/mL, 12.5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL 및 75 ng/mL)가 되도록 희석하였다.

b. 샌드위치 ELISA 분석

96F 마이크로플레이트(눈크사제조)의 각웰에, 탄산버퍼(pH 9.5)로 10 μg/mL의 농도로 희석된 항인간아포 AI마우스 모노클로날항체(메이콘사제조) 용액 0.1 mL/웰을 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이터안에 방치하였다. 항체용액을 버리고, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS(pH 7.4) 350 μL를 첨가하고 실온에서 2시간동안 인큐베이터안에 방치함으로써 블로킹한 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정하였다.

다음에, 상기 a)에서 조제된 소정농도의 산화 HDL 동결 건조품을 포함한 희석액을, 각각, 100 μL씩 웰에 나누어 넣고, 실온에서 2시간 인큐베이터안에 방치한 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정하였다.

또한, 각 웰에, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS(pH 7.4)로 150배로 희석된 DLH3 항체 100 μL을 첨가하고, 실온에서 1시간동안 인큐베이터 안에 방치하였다. 그 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정한 후, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS로 1000배로 희석된 페록시다제 표식 항마우스 IgM 항체(자이멧트사제조) 100 μL을 첨가해, 실온에서 30분간동안 인큐베이터 안에 방치하였다. 0.05(v/v) % Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정한후, o-페닐렌디아민 3 mg/mL을 포함한 0.03(w/v)% 과산화수소수 100 μL을 첨가해 발색시키고, 30분간 방치한 후, 1 mol/L 황산 50 μL를 첨가해 반응을 정지시키고, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 표시하였다. 도 3에 표시된 것처럼, 본 발명의 산화 HDL의 동결 건조품을 이용하여 깨끗한 검량선이 작성되었다.

(5) 보존안정성의 비교

(3)에서 조제된 산화 HDL의 동결 건조품[산화 HDL 표준품 (1) (H타입):12.5ng; 및 산화 HDL 표준품 (2):6.25ng (L타입)]을, 소정기간동안 (0, 1, 2, 3, 4주간) 4℃에서 보존하였다. 또한, (2)에서 조제된 산화 HDL를, 단백질농도가 6.25 ng/mL ("L타입"이라 한다) 및 12.5 ng/mL("H타입"이라 한다)이 되도록 PBS(pH 7.4)로 희석한 후, BSA를 최종농도 2(w/v)%로, 및 수크로스를 최종농도 5(w/v)%가 되도록 각각 첨가하한 후 잘 혼합하였다. 이 혼합용액을 동결건조하지 않고 그대로 4℃에서 냉장보존한 것[각각, 산화 HDL 비교품 (1)(H타입):12.5 ng/mL;및 산화 HDL 비교품 (2):6.25 ng/mL (L타입)]을, 소정기간(0, 1, 2, 3, 4주간)동안 4℃에서 보존하였다.

소정기간 보존한 후, 산화 HDL 표준품 (1) 및 (2)에 정제수 1 mL를 첨가 용해한 것 및 산화 HDL 비교품 (1) 및 (2)에 대하여, 각각, 상기 (4)b와 같은 조작을 행하여, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 표시된 것처럼, 본 발명에 의해 동결건조된 산화 HDL 표준품 (1)및 (2)에서는 조제 직후(0주)와 비교한 측정치가 거의 변동되지 않은 것에 비해, 냉장보존된 산화 LDL 비교품 (1) 및 (2)에서는 조제 직후(0주)와 비교한 측정치가 각각 약 40% 및 약 30% 저하되어, 본 발명에 의한 산화 HDL 표준품 (1) 및 (2)에 비해 보존안정성이 현저히 뒤떨어진 것을 알 수 있다.

실시예 3

(1) Lp(a)의 조제

EDTA를 항응고제로써 얻은 인간혈장으로부터 초원심분리법(15℃에서 120,000 ×g,48시간)으로 비중1.060∼ 1.125의 부분을 회수한 후, 바이오겔 A-5m (바이오랏도사 제조)로 겔여과하여 Lp(a) 화분을 회수하였다. 이때, Lp(a)의 순도는, 아가로스전기영동법으로 단일의 날카로운 밴드를 나타내는 것에 의해 확인하였다. 그 후, 이 Lp(a) 화분을, 0.25 mmol/L　EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 충분히(16시간) 투석함으로써 정제하였다.

그 후, 정제된 Lp(a)를, Lp(a) 단백질 농도가 1 mg/mL이 되도록 0.25 mmol/L EDTA를 포함한 PBS(pH 7.4)에 용해하고, 사용하기 전까지 4℃에서 보존하였다. 본 실시예에 있어서, 단백질량은 실시예 1(1)에 기재의 라우리 변형 방법을 사용하였다.

(2) Lp(a)의 산화

(1)에서 조제된 Lp(a)를, 500∼1000배 용적 이상의 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 대하여 3회 이상(2시간이상/회) 투석함으로써 EDTA를 제거하고, Lp(a)의 농도가 100 μg/mL 이 되도록 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 녹였다. 그 후, 이 Lp(a) 용액 10 mL에, 황산구리(CuSO₄)를 최종농도가 10 μmol/L가 되도록 첨가하고, 37℃에서 18시간동안 인큐베이터안에 방치함으로써, Lp(a)를 산화하였다. 이 용액에, EDTA를 최종농도가 1 mmol/L이 되도록 첨가함으로써, 산화반응을 정지시킨 후, EDTA를 1 mmol/L 포함한 PBS(pH 7.4)에 대하여 500 ∼1000배 용적으로 2∼3회(2시간이상/회) 투석함으로써, CuSO₄를 제거하고, 산화 Lp(a)를 조제, 이것을 4℃에서 보존하였다.　본 실시예에 있어서, 산화 Lp(a)량의 표현은 원료인 Lp(a)의 단백질량으로 정의하였다.

(3) 산화 Lp(a)의 동결 건조품의 조제

(2)에서 조제된 산화 Lp(a)에, BSA를 최종농도 2(w/v)%로, 및 수크로스를 최종농도 5(w/v)%가 되도록, 각각 첨가하고 잘 혼합한 후, 유리병에 1 mL씩 나누어 넣고, 공화진공동결건조장치 RL-201BS(공화진공기술주식회사제조)를 사용해, -50℃에서 16시간 동결한 후, 20℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간동안 동결건조함으로써, 수분을 기화·제거시킨후, 밀봉하고, 4℃에서 보존하였다. 이때, 동결 건조품 중의 수분함량은 0.8 질량% 이었다.

(4) 산화 Lp(a)의 동결 건조품을 표준품으로 사용하는 검량선의 작성

a. 농도조정

(3)에서 조제된 산화 Lp(a)의 동결 건조품을, 소정농도(0 ng/mL, 0.15625 ng/mL, 0.3125 ng/mL, 0.625 ng/mL, 1.25 ng/mL, 2.5 ng/mL, 및 5 ng/mL)가 되도록, 정제수 1 mL 중에 용해하였다.

b. 샌드위치 ELISA 분석

96F 마이크로플레이트(눈크사제조)의 각 웰에, 항인간 Lp(a) 마우스모노클로날항체(메이콘사제조)를 탄산버퍼(pH 9.5)로 10 μg/mL에 희석한 것을, 1 μg/웰이 되도록 첨가해, 4℃에서 16시간동안 배양하였다. 항체용액을 버리고, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS(pH 7.4) 350 μL를 첨가하여 실온에서 2시간동안 배양함으로써 블로킹한 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정하였다.

그 후, 상기 a)에서 조제된 소정농도의 산화 Lp(a) 동결 건조품을 포함한 수 용액을, 각각, 100 μL씩 웰에 나누어 넣고, 실온에서 2시간동안 배양한 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정하였다.

각 웰에, 실시예 1(4)b에서 조제된 DLH3 항체를 1(w/v)% BSA를 함유하는 20 mmol/L　Tris-HCl용액(pH 7.4)으로 10 μg/mL의 농도로 희석된 희석액 100 μL을 첨가해, 실온에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정한 후, 1(w/v)% BSA를 포함한 PBS로 1000배로 희석된 페록시다제 표식 항마우스 IgM항체(메이콘사제조) 100 μL를 첨가하여, 실온에서 30분간 배양하였다. 0.05(v/v)% Tween 20을 포함한 PBS(pH 7.4)로 4회 세정한 후, ｏ-페닐렌디아민 3 mg/mL을 포함한 0.03(w/v)% 과산화수소수 100 μL을 첨가하여 30분간 발색시킨 후, 1 mol/L 황산 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 표시하였다. 도 5에 표시한 것처럼, 본 발명의 산화 Lp(a)의 동결 건조품을 사용하여 깨끗한 검량선이 작성되었다.

(5) 보존안정성의 비교

(3)에서 조제된 산화 Lp(a)의 동결 건조품 [산화 Lp(a) 표준품 (1)(H타입):12.5 ng; 및 산화 Lp(a) 표준품 (2): 6.25 ng(L타입)]을, 소정기간 (0, 1, 2, 3, 4주간)동안 4℃에서 보존하였다. 또한, (2)에서 조제된 산화 Lp(a)를, 단백질농도가 6.25 ng/mL("L타입"이라 한다) 및 12.5 ng/mL ("H타입"이라 한다)이 되도록 PBS(pH 7.4)로 희석한 후, 추가로 BSA를 최종농도 2(w/v)%로, 및 수크로스를 최종농도 5(w/v) %가 되도록 각각 첨가한 후 잘 혼합하였다. 이 혼합용액을 동결건조시키지 않고 그대로 4℃에서 냉장보존한 것[각각, 산화 Lp(a) 비교품 (1)(H타입):12.5 ng/mL; 및 산화 Lp(a) 비교품 (2): 6.25 ng/mL (L타입)]을 소정기간(0, 1, 2, 3, 4주간)동안 4℃에서 보존하였다.

소정기간 보존한 후, 산화 Lp(a) 표준품 (1) 및 (2)에 정제수 1 mL를 첨가 용해한 것 또는 산화 Lp(a) 비교품 (1) 및 (2)에 대하여, 각각, 상기(4)b와 같은 조작을 행하여, 492 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 표시하였다. 도 6에 표시한 것처럼, 본 발명에 의해 동결건조된 산화 Lp(a) 표준품 (1) 및 (2)에서, 조제 직후(0주)와 비교한 측정치가 거의 변동하지 않은 것에 대하여, 냉장보존된 산화 Lp(a) 비교품 (1) 및 (2)에서는 조제 직후(0주)와 비교한 측정치가, 4주간 경과후에는, 각각 약 50% 및 약 40%저하되어, 본 발명에 의한 산화 Lp(a) 표준품 (1) 및 (2)에 비해 보존안정성이 현저히 뒤떨어진 것을 알 수 있다.

실시예 4

(1) 동결 변성 인간혈장의 조제

피검자 4인에게서 항응고제로써 헤파린을 사용하여 채혈하고, 보통방법을 사용하여 혈장을 채취하고, 실시예 1(4)에 기재되는 ELISA법과 같은 방법에 따라, 분석하였다.

그 후, 각 혈장을 유리병에 2 mL씩 나누어 넣고, 실온(25℃)에서 고내온도 -30℃의 후리자로 옮기고, 3시간 이상 경과시킨 후, 실온으로 조정하고, 완전히 내용물를 융해하였다. 이 동결을 포함한 공정을 가한 각자의 혈장을, 실시예 1(4)에 기재된 ELISA법과 같은 방법에 따라, 분석하였다. 이들의 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 것처럼, 혈장에 대하여 동결을 포함한 공정을 가함으로써, 혈장 중에 포함된 리포단백질이 유의하게 변성되어 동결변성 리포단백질(산화 LDL)이 생산되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 동결 변성 인간혈장의 동결 건조품의 조제

상기 (1)의 동결을 포함한 공정을 4회 가한 각자의 혈장을 각각 등용혼합하여, 이 혼합액에 대하여, 실시예 1(4)에 기재된 ELISA법에 따라 실시예 1(4)에 나타낸 검량선으로부터 변성 LDL(산화 LDL)의 농도를 산출하였다.

그 후, (1)에서 조제된 동결 변성 인간혈장을, 산화 LDL 농도가 6.25 ng/mL (L타입) 및 12.5 ng/mL (H타입)이 되도록, 140 mmol/L NaCl, 최종농도 2(w/v)% BSA, 최종농도 5(w/v)% 수크로스, 0.25 mmol/L EDTA-2Na를 포함한 10 mmol/L　인산완충액(pH 7.4)으로 희석하였다. 이 희석액을 유리병에 1 mL씩 나누어 담고, 공화진공동결건조장치 RL-201BS(공화진공기술주식회사제조)를 사용하여, -50℃에서 16시간 동결한 후, 5℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간 동결건조함으로써, 수분을 기화ㆍ제거시킨 후, 밀봉하고, 사용하기 전까지 4℃에서 보존하고, 이것을 동결 변성 인간혈장의 동결 건조품으로 하였다. 이 동결 건조품중의 수분함량은 0.8 질량%이었다.

(3) 동결 변성 인간혈장의 동결 건조품의 농도 측정

(2)에서 조제된 동결 변성 인간혈장의 동결 건조품에 정제수 1 mL를 첨가해 용해한 후, 이 용액에 대하여, 실시예 1(4)에 기재된 샌드위치 ELISA법에 의한 산화 LDL의 측정방법에 따라, 492 nm에서의 흡광도를 측정하고, 이 값으로부터 실시예 1(4)에서 작성된 검량선을 사용하여 산화 LDL 농도를 확인한 결과, 동결 건조품 중의 산화 LDL 농도의 변화는 동결건조 공정전후에서 거의 발견되지 않았다.

(4) 보존안정성의 비교

(2)에서 조제된 동결변성 인간혈장의 동결 건조품[동결변성 인간혈장 표준품 (1)(H타입):12.5 ng; 및 동결 변성 인간혈장 표준품 (2):6.25 ng(L타입)]을, 소정기간동안(0, 6, 12개월간) 4℃에서 보존하였다. 또한, 실시예 1(3)에서 조제된 산화 LDL 동결 건조품[산화 LDL 표준품 (1)(H타입):12.5 ng; 및 산화 LDL 표준품 (2)(L타입):6.25 ng]을, 소정기간동안(0, 6, 12개월간) 4℃에서 보존하였다.

소정기간 보존한 후, 동결 변성 인간혈장 표준품 (1) 및 (2) 또는 산화 LDL 표준품 (1) 및 (2)에 정제수 1 mL를 첨가해 용해하고, 이 용액을, 실시예 1(4)에서 기재된 ELISA법과 같은 방법에 따라, 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

보존 기간 (월)	OD₄₉₂
보존 기간 (월)	동결 변성 인간혈장 표준품 (1)	동결 변성 인간혈장 표준품 (2)	산화 LDL 표준품 (1)	산화 LDL 표준품 (2)
0	0.740	0.272	0.758	0.283
6	0.727	0.270	0.508	0.222
12	0.677	0.274	0.430	0.207

표 1에 표시되어 있는 것처럼, 본 발명에 의한 산화 LDL 표준품도 저농도[산화 LDL 표준품 (2)]이라면 보존안정성이 뛰어나지만, 동결에 의한 리포단백질의 변성을 행한 후 추가로 동결건조에 의해 안정화된 본 발명에 의한 동결 변성 인간혈장 표준품은, 농도가 높아져도[동결 변성 인간혈장 표준품 (1)], 본 발명의 산화 LDL 표준품에 비해, 유의있게 장기간의 보존안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.

실시예 5

(1) 동결 변성 인간혈청의 조제

피검자4인에서 채혈하여, 보통의 방법을 사용하여 혈청을 분리하여 혼합하였다. 이 혈청에, BSA를 최종농도 2(w/v)%로, 및 수크로스를 최종농도 5(w/v)%가 되도록, 각각 첨가하여, 잘 혼합한 후, 유리병에 2 mL씩 나누어 넣고, 공화진공동결건조장치 RL-201BS(공화진공 기술주식회사제조)를 사용해, -50℃에서 16시간 동결한 후, 5℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간동안 동결건조함으로써, 수분을 기화·제거시킨 후, 밀봉하고, 4℃에서 보존하였다. 이 동결건조품중의 수분함량은 0.8 질량%이었다.

(2) 동결 변성 인간혈청의 동결 건조품의 조제

(1)에서 조제된 동결 변성 인간혈청을 포함한 유리병에, 2 mL의 정제수를 첨가하여 내용물을 충분히 용해하였다. 이 용해액에 대하여, 실시예 1(4)에 기재된 ELISA법에 의한 산화 LDL의 측정방법에 따라, 실시예 1(4)에서 작성된 검량선으로부터 산화 LDL 농도를 산출하였다.

그 후, (1)에서 조제된 동결 변성 인간혈청을, 산화 LDL 농도를 6.25 ng/mL (L타입) 및 12.5 ng/mL (H타입)이 되도록, 140 mmol/L NaCl, 최종농도 2(w/v)% BSA, 최종농도 5(w/v)% 수크로스, 0.25 mmol/L　EDTA-2Na를 포함한 10 mmol/L　인산완충액(pH 7.4)으로 희석하였다. 이 희석액을 유리병에 1 mL씩 나누어 넣고, 공화진공동결건조장치 RL-201BS(공화진공기술주식회사제조)를 사용하여, -50℃에서 16시간 동결한 후, 5℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간동안 동결 건조함으로써, 수분을 기화ㆍ제거한 다음, 밀봉하고, 사용하기 전까지 4℃에서 보존하고, 이것을 동결 변성 인간혈청의 동결 건조품으로 하였다. 이 동결 건조품 중의 수분함량은 0.8 질량%이었다.

(3) 동결 변성 인간혈청의 동결 건조품의 농도 측정

(2)에서 조제된 동결 변성 인간혈청의 동결 건조품에 정제수 1 mL를 첨가해 용해한 후, 이 용액에 대하여, 실시예 1(4)에 기재된 ELISA법에 의한 산화 LDL의 측정방법에 따라, 실시예 1(4)에서 작성된 검량선으로부터 산화 LDL 농도를 확인한 결과, 동결 건조품 중의 산화 LDL 농도의 변화는 동결건조 공정전후에 거의 발견되지 않았다.

(4) 용해후 보존 안정성의 비교

(2)에서 조제된 동결 변성 인간혈청의 동결 건조품을 각각, 정제수 1 mL 를 첨가해 용해하여, 산화 LDL 농도가 각각 12.5 ng/mL 및 6.25 ng/mL의 동결 변성 인간혈청 표준품 (1)(H타입) 및 (2)(L타입)로 하고, 이것들을 소정기간동안(0, 3, 7, 10, 14일간) 4℃에서 보존하였다. 또한, 실시예 1(3)에서 조제된 산화 LDL의 동결 건조품도 상기와 같은 방법으로 용해하여, 산화 LDL 농도가 각각 12.5 ng/mL 및 6.25 ng/mL인 산화 LDL 표준품 (3)(H타입) 및 (4)(L타입)로 하고, 같은 방법으로, 소정기간동안(0, 3, 7, 10, 14일간) 4℃에서 용해상태로 보존하였다.

소정기간 보존한 후, 동결 변성 인간혈청 표준품 (1) 및 (2) 또는 산화 LDL 표준품 (3) 및 (4)에 대하여, 각각, 실시예 1(4)에 기재된 샌드위치 ELISA법에 의한 산화 LDL의 측정방법을 따라, 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 8에 나타 내었다.

보존 기간 (일)	OD₄₉₂
보존 기간 (일)	동결변성 인간혈청 표준품 (1)	동결변성 인간혈청 표준품 (2)	산화 LDL 표준품 (3)	산화 LDL 표준품 (4)
0	0.8175	0.3693	0.7689	0.3608
3	0.8107	0.3533	0.6762	0.3615
7	0.7602	0.3387	0.6705	0.3473
10	0.7800	0.3440	0.5772	0.3240
14	0.7630	0.3400	0.5760	0.2985

표 2에서 나타낸 것처럼, 본 발명에 의한 산화 LDL 표준품도 저농도[산화 LDL 표준품 (4)]이라면 용해후의 보존안정성이 뛰어나고 있지만, 동결에 의한 리포단백질의 변성을 행한 후, 추가로 동결건조에 의한 안정화한 본 발명에 의한 동결 변성 인간혈청 표준품은, 농도가 높아져도[동결 변성 인간혈청 표준품(1)], 본 발명의 산화 LDL 표준품에 비해, 유의있게 용해후의 보존안정성이 뛰어난 것을 알 수 있었다.

실시예 6

(1) 동결 변성 LDL의 조제

실시예 1(1)에서 조제된 LDL를, 500∼1000배 용적 이상의 EDTA를 포함하지 않는 PBS(pH 7.4)에 대하여 3회 이상(2시간이상/회) 투석함으로써 EDTA를 제거하고, LDL의 농도가 1 mg/mL가 되도록, 140 mmol/L 　NaCl, 최종농도 2(w/v)% BSA, 최종농도 5(w/v)% 수크로스, 0.25 mmol/L EDTA-2Na를 포함한 10 mmol/L　인산완충액(pH7. 4)으로 희석하고 잘 혼합하였다. 그 후, 이 희석액을 유리병에 2 mL 씩 나누어 넣고, 실온(22℃)으로부터 고내온도가 각각-85℃ 및 -30℃의 후리자에 옮기 고, 1시간이상 경과시킨 후, 실온으로 다시 돌린 후, 완전히 내용물을 융해하였다. 상기 동결·융해를 포함한 공정을 10회 반복하였다. 또한, 상기 동결·융해를 포함한 공정 간에, 내용물의 일부를 회수한 후, 이 샘플에 대하여, 실시예 1(4)에 기재된 샌드위치 ELISA법을 따라 분석하였다. 이것들의 결과를, 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 것처럼, 고내온도가 -30℃에서는 동결·융해를 포함한 공정을 3회 반복하면 LDL의 변성은 거의 포화상태에 달하는 것에 비해, 고내온도가 -85℃에서는 동결·융해를 포함한 공정을 9회 정도 반복하지 않으면 LDL의 변성이 포화상태에 달하지 않고, 항온온도에 의해 변성 LDL의 생산량이 변하는 것을 알 수 있었다.

(2) 동결 변성 LDL의 동결 건조품의 조제

(1)에 있어서 고내온도가 -30℃에서의 동결을 포함한 공정을 4회 행하는 것에 의해 조제된 동결 변성 LDL를, 산화 LDL 농도가 6.25 ng/mL(L타입) 및 12.5 ng/mL(H타입)이 되도록, 140 mmol/L NaCl, 최종농도 2(w/v)% BSA, 최종농도 5(w/v)% 수크로스, 0.25 mmol/L　EDTA-2Na을 포함한 10 mmol/L　인산완충액(pH 7.4)으로 희석하였다. 그 후, 이 희석액을 유리병에 1 mL씩 나누어 넣고, 공화진공동결건조장치 RL-201BS(공화진공기술주식회사제조)를 사용하여, -50℃에서 16시간 동결한 후, 5℃에서, 1.33 Pa의 감압하에서 48시간동안 동결건조함으로써, 수분을 기화ㆍ제거한 후 밀봉하고, 사용하기 전까지 4℃에서 보존하고, 이것을 동결 변성 LDL의 동결 건조품으로 하였다. 이 동결 건조품 중의 수분함량은 0.8 질량%이었다.

(3) 동결 변성 LDL의 동결 건조품의 농도 측정

(2)에서 조제된 동결 변성 LDL의 동결 건조품에 정제수 1 mL를 첨가해 용해 한 후, 이 용액에 대하여, 실시예 1(4)에 기재된 ELISA법에 의한 산화 LDL의 측정방법에 따라, 실시예 1(4)에서 작성된 검량선으로부터 산화 LDL 농도를 확인한 결과, 동결 건조품 중의 산화 LDL 농도의 변화는 동결건조 공정전후에서 거의 발견되지 않았다.

(4) 용해후 보존안정성의 비교

(2)에서 조제된 동결 변성 LDL의 동결 건조품을, 각각, 정제수 1 mL를 첨가해 용해하고, 산화 LDL 농도가 각각 12.5 ng/mL 및 6.25 ng/mL의 동결 변성 LDL 표준품 (1)(H타입) 및 (2)(L타입)라고 하고, 이것들을 소정기간동안(0, 3, 7, 10, 14일간) 4℃에서 보존하였다. 또한, 실시예 1(3)에서 조제된 산화 LDL의 동결 건조품도 상기와 같은 방법으로 용해하여, 산화 LDL 농도가 각각 12.5 ng/mL 및 6.25 ng/mL인 산화 LDL 표준품 (3)(H타입) 및 (4)(L타입)라 하고, 같은 방법으로, 소정기간동안(0, 3, 7, 10, 14일간) 4℃에서 용해상태로 보존하였다.

소정기간 보존한 후, 동결 변성 LDL 표준품 (1) 및 (2) 또는 산화 LDL 표준품(3) 및 (4)에 대하여, 각각, 실시예 1(4)에 기재된 샌드위치 ELISA법에 의한 산화 LDL의 측정방법에 따라, 492 nm에서의 흡광도를 측정하고, 이 수치로부터 실시예 1(4)에서 작성된 검량선을 사용하여, 각 표준품 중의 산화 LDL을 산출하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 10에 나타내었다.

보존기간 (일)	OD₄₉₂
보존기간 (일)	동결 변성 LDL 표준품 (1)	동결 변성 LDL 표준품 (2)	산화 LDL 표준품 (3)	산화 LDL 표준품 (4)
0	0.8633	0.3826	0.7689	0.3608
3	0.8265	0.3532	0.6762	0.3615
7	0.7924	0.3516	0.6705	0.3473
10	0.7952	0.3439	0.5772	0.3240
14	0.7886	0.3476	0.5760	0.2985

표 3에 나타낸 것처럼, 본 발명에 의한 산화 LDL 표준품도 저농도[산화LDL표준품(4)]이라면 용해후의 보존안정성이 뛰어나고 있지만, 동결에 의한 리포단백질의 변성을 행한 후, 추가로 동결건조에 의한 안정화한 본 발명에 의한 동결 변성 인간혈청 표준품은 농도가 높아져도[동결 변성 인간혈청 표준품(1)], 본 발명의 산화 LDL 표준품에 비해, 유의있게 용해후의 보존안정성이 뛰어난 것을 알 수 있었다.

상술한 것처럼, 본 발명은, 리포단백질을 인공적으로 변성시켜서 얻은 변성 리포단백질을 동결건조함으로써 얻어지는 보존안정성이 뛰어난 변성 리포단백질 및 이것을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 변성 리포단백질을 함유하는 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 첨가하여 그 용액 중에 포함되는 리포단백질을 변성하는 것으로 이루어지는 변성 리포단백질의 제조방법; 혹은 이 같은 방법에 의하여 얻은 변성 리포단백질을 더욱더 동결건조함으로써 얻어지는 보존 안정성이 뛰어난 변성 리포단백질 및 이것을 제조하는 방법에 관한 것이다.

변성 리포단백질은, 심근경색이나 협심증등의 관상동맥계질환, 뇌경색이나 뇌혈관계치매 등의 뇌동맥계질환, 또는 신장질환, 당뇨병성신장질환 등의 신장동맥계질환 및 말초동맥폐색증과 같은 말초동맥계질환등의 각종 순환기계 질환과 강하게 관계되어 있음이 시사되어 있어, 혈액 중의 변성 리포단백질량의 측정용 표준물질이나 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 시약은 이것들의 시험의 결과를 좌우하는 매우 중요한 물질이다.

그러므로, 본 발명의 방법에 의해, 보존안정성에 뛰어난, 다시 말하면 언제나 일정의 측정치를 나타내는 변성 리포단백질을 제조하는 것이 가능하게 되었다. 상기 이점에 더하여, 변성 리포단백질을 함유하는 용액에 대하여 적어도 일회의 동결을 포함한 공정을 첨가해 변성시킨 변성 리포단백질을 동결건조함으로써 얻은 안정화 리포단백질은, 보존안정성 뿐만 아니라 용해 후의 보존안정성도 뛰어나므로, 본 발명에 의한 안정화 변성 리포단백질을 실제에 사용하는 형태인 용액의 형태인 경우의 안정성도 뛰어나므로, 변성 리포단백질의 측정에 있어서 매우 유익하다.

따라서, 본 발명에 의한 안정화 변성 리포단백질은, 예를 들어, 변성 리포단백질을 인식하는 항체와 접촉시켜, 그 항체의 시료에 대한 반응성을 측정함으로써 혈액성분 중에 포함되는 변성 리포단백질을 측정하는 방법에 사용되는 표준물질이나, 변성 리포단백질의 생리적 역할이나 생리활성을 조사하기 위한 각종 실험용 시약으로써 유용하며, 더욱더, 상기 서술한 것과 같은 목적의 진단기술의 상품화나 시약개발에 있어서 특별히 중요한 영향을 미치는 것이 명백하다.

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리포단백질을 함유하는 용액을 동결하여 동결용액을 생산하고; 상기 동결용액을 해동하여 안정화된 산화 리포단백질을 함유하는 용액의 생산을 포함하며, 상기 안정화된 산화 리포단백질은 하이브리도마셀라인, Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM　BP-7171)에 의해 생산되는 DLH3 항체와 반응하는 안정화된 산화 리포단백질의 생산방법.
삭제
제 22 항에 있어서, 상기 리포단백질은 카이로미크론, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 및 HDL3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법.
제 22 항의 방법에 따라 생산되며, 하이브리도마셀라인 Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM　BP-7171)에 의해 생산되는 DLH3 항체와 반응하는 안정화된 산화 리포단백질.
삭제
리포단백질을 함유하는 용액을 동결하여 동결용액을 생산하고; 상기 동결용액을 해동하여 안정화된 산화 리포단백질을 함유하는 용액을 생산하고; 상기 용액을 동결건조하는 것을 포함하며, 상기 안정화된 산화 리포단백질은 하이브리도마셀라인 Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM　BP-7171)에 의해 생산되는 DLH3 항체와 반응하는 안정화된 산화 리포단백질의 생산방법.
삭제
제 27 항에 있어서, 상기 리포단백질은 카이로미크론, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 및 HDL3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
제 27 항의 방법에 따라 생산되며, 하이브리도마셀라인 Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM　BP-7171)에 의해 생산되는 DLH3 항체와 반응하는 안정화된 산화 리포단백질.
삭제
리포단백질을 함유하는 용액을 동결하여 동결용액을 생산하고; 상기 동결용액을 해동하여 안정화된 산화 리포단백질을 함유하는 용액을 생산하고; 상기 용액에 안정화제를 첨가하고; 상기 용액을 동결건조하는 것을 포함하며, 상기 안정화된 산화 리포단백질은 하이브리도마셀라인 Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM　BP-7171)에 의해 생산되는 DLH3 항체와 반응하는 안정화된 산화 리포단백질의 생산방법.
삭제
제 32 항에 있어서, 상기 리포단백질은 카이로미크론, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2 및 HDL3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
제 32 항의 방법에 따라 생산되며, 하이브리도마셀라인 Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3(수탁번호: FERM　BP-7171)에 의해 생산되는 DLH3 항체와 반응하는 안정화된 산화 리포단백질.
삭제
제 25 항에 따른 안정화된 산화 리포단백질을 표준물질로서 선택하고; 상기 산화 리포단백질에 결합하는 항체와 시료를 반응시키고; 시료와 항체와의 반응성을 측정하고; 상기 반응성을 안정화된 산화 리포단백질로부터 미리 만들어진 검정곡선(calibration curve)과 비교하는 것을 포함하는 시료 중 산화 리포단백질의 측정방법.
제 37 항에 있어서, 상기 측정은 면역학적 측정인 방법.
제 38 항에 있어서, 상기 면역학적 측정은 방사면역분석, 효소면역분석, 형광면역분석, 발광면역분석, 응집면역분석, 면역비탁계측법 및 혼탁면역분석법에서 선택되는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 면역학적 측정은 경합법 또는 샌드위치법인 방법.
제 37 항에 있어서, 상기 안정화된 산화 리포단백질은 혈액 중 산화 리포단백질 측정용 표준물질 또는 산화 리포단백질의 생리학적 활성 또는 생리학적 역할 조사용 실험시약인 방법.
제 30 항에 따른 안정화된 산화 리포단백질을 표준물질로 선택하고; 상기 산화 리포단백질에 결합하는 항체와 시료를 반응시키고; 시료와 항체와의 반응성을 측정하고; 상기 반응성을 안정화된 산화 리포단백질로부터 미리 만들어진 검정곡선(calibration curve)과 비교하는 것을 포함하는 시료 중 산화 리포단백질의 측정방법.
제 42 항에 있어서, 상기 측정은 면역학적 측정인 방법.
제 43 항에 있어서, 상기 면역학적 측정은 방사면역분석, 효소면역분석, 형광면역분석, 발광면역분석, 응집면역분석, 면역비탁계측법 및 혼탁면역분석법에서 선택되는 방법.
제 44 항에 있어서, 상기 면역학적 측정법은 경합법 또는 샌드위치법인 방법.
제 42 항에 있어서, 상기 안정화된 산화 리포단백질은 혈액 중 산화된 리포단백질 측정용 표준물질 또는 산화 리포단백질의 생리학적 활성 또는 생리학적 역할 조사용 실험시약인 방법.
제 35 항에 따른 안정화된 산화 리포단백질을 표준물질로 선택하고; 상기 산화 리포단백질에 결합하는 항체와 시료를 반응시키고; 시료와 항체와의 반응성을 측정하고; 상기 반응성을 안정화된 산화 리포단백질로부터 미리 만들어진 검정곡선(calibration curve)과 비교하는 것을 포함하는 시료 중 산화 리포단백질의 측정방법.
제 47 항에 있어서, 상기 측정은 면역학적 측정인 방법.
제 48 항에 있어서, 상기 면역학적 측정은 방사면역분석, 효소면역분석, 형광면역분석, 발광면역분석, 응집면역분석, 면역비탁계측법 및 혼탁면역분석법에서 선택되는 방법.
제 49 항에 있어서, 상기 면역학적 측정은 경합법 또는 샌드위치법인 방법.
제 47 항에 있어서, 상기 안정화된 산화 리포단백질은 혈액 중 산화 리포단백질 측정용 표준물질 또는 산화 리포단백질의 생리학적 활성 또는 생리학적 역할 조사용 실험시약인 방법.
표준물질로서 제 25 항의 안정화된 산화 리포단백질을 포함하는 산화 리포단백질 측정용 시약 키트.
표준물질로서 제 30 항의 안정화된 산화 리포단백질을 포함하는 산화 리포단백질 측정용 시약 키트.
표준물질로서 제 35 항의 안정화된 산화 리포단백질을 포함하는 산화 리포단백질 측정용 시약 키트.
검체희석액, 항체고상화고상, 반응용완충액, 세정액, 표식화 2차항체, 검출용시약, 및 표준물질로써 제 25 항의 안정화된 산화 리포단백질의 전부 또는 일부를 구성요소로써 포함하는 산화 리포단백질의 측정용 시약 키트.
검체희석액, 항체고상화고상, 반응용완충액, 세정액, 표식화 2차항체, 검출용시약, 및 표준물질로써 제 30 항의 안정화된 산화 리포단백질의 전부 또는 일부를 구성요소로써 포함하는 산화 리포단백질의 측정용 시약 키트.
검체희석액, 항체고상화고상, 반응용완충액, 세정액, 표식화 2차항체, 검출용시약, 및 표준물질로써 제 35 항의 안정화된 산화 리포단백질의 전부 또는 일부를 구성요소로써 포함하는 산화 리포단백질의 측정용 시약 키트.