KR100703067B1 - Primer sets specific to the oil-degrading bacterium Nocardia sp. H17-1 and a monitoring method of the bacterium by using the said primer sets - Google Patents

Primer sets specific to the oil-degrading bacterium Nocardia sp. H17-1 and a monitoring method of the bacterium by using the said primer sets Download PDF

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Abstract

본 발명은 유류분해세균 노카르디아 속(Nocardia sp.) H17-1에 특이적인 프라이머 세트 및 이를 이용한 균주 모니터링 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유류 오염토양 복원을 위해 토양에 노카르디아 속 H17-1이 적용되었을 때 동 균주에 대해 특이적이고 민감성이 높은 프라이머 세트 및 이를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법으로 유류 오염 토양에 적용된 노카르디아 속 H17-1를 모니터링 하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set specific for the oil-degrading bacterium Nocardia sp. H17-1 and a strain monitoring method using the same. More specifically, the present invention relates to the genus H17 in soil for oil contaminated soil restoration. A method for monitoring the genotype H17-1 applied to oil contaminated soil by real time PCR using a set of primers that are specific and sensitive to the strain and -1 is applied will be.

유류분해세균, 균주 특이적 프라이머, 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR) Lactobacillus bacteria, strain specific primers, real time PCR

Description

유류분해 세균 노카르디아 속 Ｈ１７―１에 특이적인 프라이머 세트 및 이를 이용한 균주 모니터링 방법{Primer sets specific to the oil-degrading bacterium, Nocardia sp. H17-1 and a monitoring method of the bacterium by using the said primer sets}Primer sets specific to the oil-degrading bacterium Nocardia genus H17-1 and strain monitoring method using the same {Primer sets specific to the oil-degrading bacterium, Nocardia sp. H17-1 and a monitoring method of the bacterium by using the said primer sets}

도 1은 프라이머 세트 [서열번호 1 및 서열번호 3 (A), 서열번호 1 및 서열번호 4 (B), 서열번호 2 및 서열번호 3 (C), 서열번호 2 및 서열번호 4 (D), 그리고 E. coli 의 유니버셜 프라이머 서열번호 5 및 서열번호 6 (E)]을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타낸 그래프이다.1 shows a primer set [SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 (A), SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 (B), SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 (C), SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 (D), And electrophoresis results of PCR amplification products using E. coli universal primers SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (E)].

레인 1 및 레인 16, 100 bp 마커;Lane 1 and lane 16, 100 bp markers;

레인 2, Nocardia sp. H17-1; Lane 2, Nocardia sp. H17-1;

레인 3, R. erythropolis KCTC 9077; Lane 3, R. erythropolis KCTC 9077;

레인 4, R. rhodochrous KCTC 9086; Lane 4, R. rhodochrous KCTC 9086;

레인 5, N. beijingensis KCTC 19931; Lane 5, N. beijingensis KCTC 19931;

레인 6, N. flavorosea KCTC 9371; Lane 6, N. flavorosea KCTC 9371;

레인 7, N. ignorata KCTC 19935; Lane 7, N. ignorata KCTC 19935;

레인 8, Mycobacterium dierfoeri KCTC 9506; Lane 8, Mycobacterium dierfoeri KCTC 9506;

레인 9, Corynebacterium sp. KCTC 1450; Lane 9, Corynebacterium sp. KCTC 1450;

레인 10, Pseudomonas putida KCTC 1770; Lane 10, Pseudomonas putida KCTC 1770;

레인 11, Burkholderia vietnamiensis KCTC 2974; Lane 11, Burkholderia vietnamiensis KCTC 2974;

레인 12, E. coli JM109; Lane 12, E. coli JM109;

레인 13, Alcaligenes faecalis subsp. faecals KCTC 2678; Lane 13, Alcaligenes faecalis subsp. faecals KCTC 2678;

레인 14, Bacillus subtilis C9; 및Lane 14, Bacillus subtilis C9; And

레인 15, Acinetobacter sp. A54. 이다.Lane 15, Acinetobacter sp. A54. to be.

도 2는 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 얻은 노카르디아 속 H17-1의 16S rDNA의 표준곡선 그래프이다.2 is a standard curve graph of 16S rDNA of genus H17-1 obtained from real-time polymerase chain reaction.

도 3은 시간에 따른 석유계 총탄화수소(TPH) 분해 양상을 나타낸 그래프이다. 3 is a graph showing the decomposition of petroleum-based total hydrocarbon (TPH) over time.

도 4는 시간에 따른 노카르디아 속 H17-1 16S rDNA 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the change of H17-1 16S rDNA genus Nocardia over time.

도 5는 석유계 총탄화수소(TPH)의 양과 노카르디아 속 H17-1 16S rDNA의 상관관계를 나타낸 그래프이다.5 is a graph showing the correlation between the amount of petroleum-based total hydrocarbon (TPH) and H17-1 16S rDNA genus Nocardia.

본 발명은 유류분해세균 노카르디아 속(Nocardia sp.) H17-1에 특이적인 프 라이머 세트 및 이를 이용한 균주 모니터링 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유류 오염토양 복원을 위해 토양에 노카르디아 속 H17-1이 적용되었을 때 동 균주에 대해 특이적이고 민감성이 높은 프라이머 세트 및 이를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법으로 유류 오염 토양에 적용된 노카르디아 속 H17-1를 모니터링 하는 방법에 관한 것이다.The present invention is oil decomposition bacteria The present invention relates to a primer set specific to Nocardia sp. H17-1 and a method for monitoring strains using the same. More specifically, Nocardia sp. H17-1 has been applied to soil to restore oil contaminated soil. When a specific and highly sensitive primer set for the strain and a real time PCR method using the same method for monitoring the genus H17-1 applied to oil contaminated soil.

현대 사회에서 원유(crude oil)는 그 이용범위와 사용량이 지속적으로 증가하고 있으나 생산, 운반, 저장 등의 과정에서 사고나 고의적인 유출 등으로 인하여 자연환경에 유출되어 환경을 오염시켜 전세계적으로 심각한 문제로 대두되고 있다. 유출원유의 제거는 물리 · 화학적인 방법이 널리 이용되고 있으나, 경제적인 부담 및 2차적인 오염문제가 대두되고 있어 자연계에 다양하게 분포되어 있는 유류분해 세균에 의해 해결하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 최근 오염된 토양의 처리를 위해 시도되고 있는 생물학적 정화방법에는 오염지에 질소와 인 같은 영양원을 주입하거나 공기 등을 주입하여 토착미생물을 활성화하는 방법, 오염지에서 분리된 미생물의 재적용, 분해능이 우수한 균주의 적용과 같은 방법이 있지만, 지금까지의 연구결과를 볼 때 실험실에서 배양한 미생물의 현장적용이 성공한 예는 많지 않다. 이는 오염지역의 생태계를 고려하지 않은 제어된 환경에서의 연구 결과를 현장에 적용하였기 때문이다.In the modern society, crude oil is continuously increasing in its range of use and usage, but it is polluted by the natural environment due to accidents or intentional spills in the process of production, transportation, storage, etc. It is a problem. Physical and chemical methods are widely used for the removal of spilled crude oil. However, due to economic burdens and secondary pollution problems, studies are being actively conducted to solve by oil-degrading bacteria that are widely distributed in nature. . Recently, biological purification methods that have been attempted to treat contaminated soil include methods of activating indigenous microorganisms by injecting nutrients such as nitrogen and phosphorus into the contaminated soil or by injecting air, reapplying microorganisms separated from contaminated soil, and having excellent resolution. Although there are methods such as the application of strains, the results of the previous studies show that there are not many successful cases of field application of microorganisms cultured in a laboratory. This is because the study results were applied to the site in a controlled environment without considering the ecosystem of the contaminated area.

오염토양의 생물학적 정화(bioremediation)시 처리효율에 영향을 미치는 인자들은 온도, 수분, pH, 토양 조직(soil texture) 등의 환경요인, 오염토양에 존재하는 미생물의 종과 수와 같은 생물학적 요인과 오염원의 화학적 구조, 형태 및 양 과 같은 화학적 요인이 있으며, 이들 환경이 적합하지 않을 경우에는 분해효율이 낮아지므로, 적절한 조건을 유지시키는 일이 중요하다. 특히, 유류의 오염은 현장조건이나 농도 분포에 따라 다르지만 일정농도 이상에서는 미생물에 독성을 유발하여 미생물의 활성과 유류의 분해속도에 영향을 미치므로 미생물의 활성에 영향을 주지 않는 농도에 적용하는 것이 바람직하다. 또한 접종되어지는 균은 토양에 존재하는 토착미생물과의 경쟁하고, 오염 환경에 적응하기 위해 일정농도 이상의 접종이 요구되어진다. Factors affecting the treatment efficiency during bioremediation of contaminated soil are environmental factors such as temperature, moisture, pH, soil texture, biological factors such as species and number of microorganisms in contaminated soil There are chemical factors such as chemical structure, morphology and quantity, and if the environment is not suitable, the degradation efficiency is low, so it is important to maintain proper conditions. In particular, oil pollution varies depending on the site conditions and concentration distribution, but above a certain concentration, it causes toxicity to microorganisms and affects the activity of microorganisms and the decomposition rate of oil. desirable. Also, the inoculated bacteria are required to be inoculated above a certain concentration in order to compete with indigenous microorganisms present in the soil and to adapt to the contaminated environment.

지금까지의 연구결과를 볼 때 실험실에서 배양한 미생물의 현장적용이 성공한 예는 많지 않다. 이는 오염지역의 생태계를 고려하지 않은 제어된 환경에서의 연구 결과를 현장에 적용하였기 때문에 첨가된 미생물들이 오염지에서의 낮은 생존력 혹은 그들의 분해 활성을 잃어버리기 때문으로 판단된다. 따라서 생물학적 정화 효율을 높이기 위해 첨가된 미생물들의 조절 및 모니터링이 매우 중요하다. 그러나 기존의 평판배양법, 최확수법, 현미경 방법은 토착미생물과의 구별이 어려울 뿐만 아니라 넣어준 미생물만을 검출하는 것은 많은 시간 및 노동력을 요구하므로 새로운 시도가 요구되어진다. 근래에 분자생물학적 기법의 발달로, 배양단계를 거치지 않고, 게놈 DNA 중의 특정부위의 유전자만을 증폭시켜서 증폭된 유전자 산물을 전기영동을 통하여 확인함으로써 특정 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 프라이머라 불리우는 10 ~ 20 bp로 구성된 특정 DNA 단편을 이용하는 중합효소연쇄반응(PCR)에 기초한 것으로서, 민감도 및 특이성이 뛰어나며, 시료의 처리과정 및 수행과정이 비교적 간편하다. 그러 나, 통상의 PCR을 정량에 이용하기에는 증폭산물이 반드시 주형(template) DNA의 양을 반영하는 것이 아니기 때문에 주형의 양을 측정하기에 곤란한 문제가 있었다. 이에 최근에는 기존의 PCR법 보다도 신속하고, 고감도로 증폭되고, 오염을 줄일 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법이 개발되고 있다.Based on the research results so far, there are not many examples of successful application of microorganisms grown in a laboratory. This is because the applied microorganisms lose their viability or their degradation activity in the contaminated site because the results of the study in a controlled environment without considering the ecosystem of the contaminated area are lost. Therefore, it is very important to control and monitor the added microorganisms to increase the efficiency of biological purification. However, the conventional plate culture method, the best harvest method, and the microscopic method are difficult to distinguish from indigenous microorganisms, and the detection of only the microorganisms put in requires a lot of time and labor, and therefore, a new trial is required. Recently, with the development of molecular biological techniques, a method of detecting and diagnosing DNA polymorphism of a specific bacterial species has been developed by amplifying only a gene of a specific region in genomic DNA and confirming the amplified gene product through electrophoresis without undergoing a culture step. . This method is based on polymerase chain reaction (PCR) using a specific DNA fragment composed of 10 to 20 bp, called a primer, and has excellent sensitivity and specificity, and relatively simple processing and execution of a sample. However, there is a problem in that it is difficult to measure the amount of the template because the amplification product does not necessarily reflect the amount of template DNA in order to use conventional PCR for quantification. Recently, real-time polymerase chain reaction (real time PCR) has been developed, which is faster than conventional PCR, can be amplified with high sensitivity, and can reduce contamination.

유류분해 세균 노카르디아 속 H17-1(KCTC 8705P)은 그람 양성의 간균으로 최적 배양온도 30 ℃인 호기성균으로 유류 오염토양에서 분리된 유류분해능이 뛰어난 균으로 알려져 있으나(한국 등록특허 제10-0348984호), 유류 오염토양 복원을 위해 노카르디아 속 H17-1이 적용되었을 때 동 균주에 대해 특이적이고 민감성이 높은 프라이머 세트 및 이를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법으로 유류 오염 토양에 적용된 노카르디아 속 H17-1를 모니터링 하는 방법에 대해서는 아직까지 보고된 바 없었다. The oil-degrading bacterium Nocardia genus H17-1 (KCTC 8705P) is a gram-positive bacterium that is known to be an aerobic bacterium with an optimal culture temperature of 30 ° C. No. 0348984), When a Nocardia genus H17-1 is applied to restore oil-contaminated soils, a specific and highly sensitive primer set for this strain and oil-contaminated soils by real-time polymerase chain reaction using the same No method of monitoring H17-1 of the genus Nocardia has been reported.

따라서, 본 발명은 유류분해 세균 노카르디아 속 H17-1에 대해 특이적이고 민감성이 높은 프라이머 세트를 개발하여, 이 균주 특이적 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법으로 유류 오염 토양에 적용된 노카르디아 속 H17-1의 모니터링 방법을 제공하는 데에 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention has developed a primer set that is specific and highly sensitive to the oil-degrading bacterium Nocardia genus H17-1, and using this strain-specific primer set, oil is produced by real time PCR. The aim is to provide a method for monitoring H17-1 of the genus Nocardia applied to contaminated soil.

본 발명은 노카르디아 속(Nocardia sp.) H17-1에 특이적인 (ⅰ) 서열번호 1 및 서열번호 3으로 구성된 프라이머 세트 또는 (ⅱ) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 프라이머 세트를 제공하는 것이다.The present invention provides a primer set consisting of (i) SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 or (ii) SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 specific for Nocardia sp. will be.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1) 및 핫-스타트 중합효소(Hot-start polymerase)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 통해 노카르디아 속(Nocardia sp.) H17-1를 간편하고 신속·정확하게 정량하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention using the primer set, SYBI Green 1 (SYBR Green 1) and hot-start polymerase (Hot-start polymerase) through the real time PCR (real time PCR) through the genus Nocardia ( Nocardia sp.) Provides a simple, rapid and accurate method for quantifying H17-1.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.

본 발명은 노카르디아 속 H17-1의 검출하기 위해 노카르디아 속 H17-1의 16S rDNA 서열을 리보소멀 데이터베이스 프로젝트[Maidak et al., Nucleic Acids Res. 28: 82-85] 및 진뱅크 뉴클레오타이드 데이터베이스(GenBank nucleotide database)에서 서열을 비교하고, 16S rDNA의 특이적인 서열 배열 설계도(specific sequence alignment)를 회수하여, 잠재적인 프라이머 표적 부위를 선정하여, 프라이머 세트를 제조하고, 제조된 프라이머 세트의 노카르디아 속 H17-1에 대한 특이성과 민감성을 측정하여 (ⅰ) 서열번호 1 및 서열번호 3으로 구성된 프라이머 세트 또는 (ⅱ) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 프라이머 세트를 선별하였다.The present invention provides a 16S rDNA sequence of Nocardia genus H17-1 for detection of Nocardia genus H17-1 by Ribosomal Database Project [Maidak et al. 28: 82-85] and GenBank nucleotide database to compare sequences, recover specific sequence alignment of 16S rDNA, select potential primer target sites, and select primer sets. Was prepared and the specificity and sensitivity of the prepared primer set to the genus H17-1 was determined by (i) a primer set consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 or (ii) SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: The constructed primer set was selected.

또한 노카르디아 속 H17-1 검출을 위한 PCR법의 반응조건은 우선 94 ℃에서 5 분간 열처리를 한 후, 94 ℃에서 45 초, 60 ℃에서 45 초, 72 ℃에서 45 초를 1사이클로 총 30회 반복하여 증폭한 후, 마지막 DNA 합성단계는 72 ℃에서 7 분간 실시한다. PCR 반응 증폭 산물은 1% 아가로오스 젤 전기영동을 실시하고, 에티듐 브로마이드 염색하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 합성되었는지를 확인한다.In addition, the reaction conditions of the PCR method for detecting H17-1 genus Nocardia were first heat treated at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 45 seconds at 72 ° C. for a total of 30 cycles. After repeated amplifications, the final DNA synthesis step is carried out at 72 ° C. for 7 minutes. PCR reaction amplification products were subjected to 1% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining to confirm that DNA fragments of expected size were synthesized.

또한 노카르디아 속 H17-1 정량을 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법을 위해서는 노카르디아 속 H17-1에 특이적인 프라이머 세트, 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1), 핫-스타트 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 및 PCR 완충액 등을 필요로 한다. 또한 본 발명에서는 노카르디아 속 H17-1에 특이적인 프라이머 세트가 개발되었으므로 프라이머 비특이적 형광물질인 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1)을 이용하여 사전-변성 단계(pre-denaturation step)를 수행하고 난 후, 변성 단계(denaturation step), 어닐링 단계(annealing step) 및 신장 단계(extention step)로 이루어진 사이클을 40 회 반복하고 최종 신장 단계(final extention step)를 수행하는 단계로 간편하게 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.In addition, for real time PCR for quantification of H17-1 genus Nocardia, primer set specific to nocardia genus H17-1, SYBR Green 1, hot-start Polymerases, dNTP mixtures (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), PCR buffers and the like. In addition, in the present invention, since a primer set specific to the genus H17-1 was developed, a pre-denaturation step was performed using SBR BRIE 1, a primer nonspecific fluorescent substance. After that, a cycle consisting of a denaturation step, an annealing step, and an extension step is repeated 40 times and a final extension step is performed to simply perform a real-time polymerase chain reaction. real time PCR) was performed.

종래 일반적으로 사용되고 있는 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)은 주로 타크만 프로브(Taqman probe) 방법을 이용하고 있으며, 이는 내부에 형광물질을 포함하는 프로브를 필요로 하며, 이는 목적하는 표적에 특이적이어야 하므로, 프라이머에 따라 별도로 제작이 필요하였으나, 본 발명에서는 복잡한 프로브 설계를 배제하며, 특정 관심 대상에 대해 어떤 프라이머든 함께 간편하게 사용될 수 있는 형광물질 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1)을 사용하였다.Real time PCR, which is commonly used in the related art, mainly uses a Taqman probe method, which requires a probe including a fluorescent material therein, which is specific to a target of interest. Since it was necessary to manufacture a separate, depending on the primer was required, but in the present invention excludes a complex probe design, the fluorescent material SSYBI Green 1 (SYBR Green 1) that can be easily used with any primer for a particular interest was used. .

에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1)은 DNA 이중가닥(ds DNA) 속에 삽입되는 DNA 결합 물질로서, DNA 이중가닥의 작은 홈(minor groove)에 결합하여 형광이 증가된다. 그래서 PCR 동안 DNA 산물이 기하급수적으로 증가하는 단계에서 에스와이비알 그린 1의 형광도 증가하게 된다. 에스와이비알 그린 1은 비록 비특이 적 결합으로 인해 민감성이 떨어질 수 있으나, 본 발명에서는 상기 균주 특이적인 프라이머 세트와 하기의 핫-스타트 PCR을 이용함으로써 원하는 민감성을 얻을 수 있었다.SYBR Green 1 (SYBR Green 1) is a DNA binding material that is inserted into the DNA double strand (ds DNA), the fluorescence is increased by binding to the small groove (minor groove) of the DNA double strand. Therefore, the fluorescence of SWIBIAL Green 1 also increases when the DNA product increases exponentially during PCR. Although SWBIAL Green 1 may be less sensitive due to nonspecific binding, in the present invention, the desired sensitivity was obtained by using the strain-specific primer set and the following hot-start PCR.

타크 중합효소(Taq polymerase)는 37 ℃에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 첫 번째 변성 과정이 완전히 진행되기도 전에 프라이머가 주형에 어닐링(annealing)되어 신장(extension)이 일어나는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 어닐링이 일어날 경우 프라이머가 원하는 DNA부위에 결합하지 않을 확률이 높고, 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 밴드를 얻게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 핫-스타트 PCR을 이용하여 민감성이 높은 정량방법을 제공할 수 있게 되었다. 본 발명의 핫-스타트 중합효소는 Tbr DNA 중합효소(Thermus brockianus 유래)가 바람직하고, 어닐링 온도는 55 ~ 65 ℃가 바람직하다. 만일, 55 ℃ 보다 낮은 온도에서는 비특이적(nonspecific) 어닐링이 일어나 정확한 정략적 반응이 불가능하고, 65 ℃ 보다 높은 온도에서는 H17-1 유래 DNA의 어닐링이 일어나지 않아 PCR 반응이 불가능하다. Taq polymerase has good activity even at 37 ° C, so the primer may be annealed to the template before the first denaturation process is completed. When annealing occurs at such a low temperature, the primer is unlikely to bind to the desired DNA site, resulting in less accurate bands. In order to solve this problem, the present invention can provide a highly sensitive quantitative method using hot-start PCR. The hot-start polymerase of the present invention is preferably Tbr DNA polymerase (from Thermus brockianus ), and the annealing temperature is preferably 55 to 65 ° C. If the temperature is lower than 55 ° C., nonspecific annealing occurs, so that no accurate quantitative reaction is possible. At temperatures higher than 65 ° C., the annealing of H17-1-derived DNA does not occur, and thus the PCR reaction is impossible.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.

실시예 1 ~ 4Examples 1-4

실시예 1: 프라이머의 선정 및 제조Example 1 Selection and Preparation of Primers

본 발명은 노카르디아 속 H17-1의 검출하기 위해 노카르디아 속 H17-1의 16S rDNA 서열을 리보소멀 데이터베이스 프로젝트[Maidak et al., Nucleic Acids Res. 28: 82-85] 및 진뱅크 뉴클레오타이드 데이터베이스(GenBank nucleotide database) 에서 서열을 비교하고, 16S rDNA의 특이적인 서열 배열 설계도(specific sequence alignment)를 회수하여, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 잠재적인 프라이머 표적 부위를 선정하여, 표 1의 프라이머를 제조하였다The present invention provides a 16S rDNA sequence of Nocardia genus H17-1 for detection of Nocardia genus H17-1 by Ribosomal Database Project [Maidak et al., Nucleic Acids Res. 28: 82-85] and GenBank nucleotide database to compare sequences, recover specific sequence alignment of 16S rDNA, and display the potentials represented by SEQ ID NOS: 1-4 The primer primer sites were selected to prepare primers of Table 1.

노카르디아 속 H17-1에서 선정된 프라이머Primers selected from the genus H17-1 서열번호SEQ ID NO: 16S rDNA내의 위치Location in 16S rDNA 포워드 프라이머 5'→3 염기서열'Forward primer 5 '→ 3 nucleotide sequence' 1One 168-187168-187 TCCTATCGCATGGTGGGTTCCTATCGCATGGTGGGT 22 575-591575-591 ACCAGCAGCTCAACTGCTACCAGCAGCTCAACTGCT 리버스 프라이머 5'→3 염기서열Reverse primer 5 '→ 3 base sequence 33 989-972989-972 GCCACATCTCGTCAGCTTGCCACATCTCGTCAGCTT 44 1096-10791096-1079 GCTGGCAACATAAGATAGGCTGGCAACATAAGATAG

또한 균주 비특이적인 유니버셜 프라이머로 E. Coli의 16S rDNA 서열에서 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 선정하여, 표 2의 프라이머를 제조하였다.In addition, primers represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the 16S rDNA sequence of E. Coli as strain non-specific universal primers were selected to prepare the primers of Table 2.

E. Coli에서 제조된 유니버셜 프라이머Universal primer made by E. Coli 서열번호SEQ ID NO: 16S rDNA내의 위치Location in 16S rDNA 포워드 프라이머 5'→3 염기서열'Forward primer 5 '→ 3 nucleotide sequence' 55 9-289-28 GAGTTTGATCCTGGCTCAGGAGTTTGATCCTGGCTCAG 리버스 프라이머 5'→3 염기서열Reverse primer 5 '→ 3 base sequence 66 536-544536-544 GAATTACCGCGGCAGCTGGAATTACCGCGGCAGCTG

실시예 2: 균주 특이적 프라이머 세트 선별 Example 2: Strain Specific Primer Set Selection

노카르디아 속 H17-1의 검출을 위한 프라이머 세트의 특이성을 측정하기 위해 N. beijingensis KCTC 19931, N. flavorosea KCTC 9371, N. ignorata KCTC 19935, Rhodococcus rhodochrous KCTC 9086, R. erythropolis KCTC 9077, M. dierhoferi KCTC 9506, Corynebacterium sp. KCTC 1450, Pseudomonas putida KCTC 1770, Burkholderia vietnamiesnsis (KCTC 2974), Alcaligenes faecalis subsp. faecals (KCTC 2678), Bacillus subtilis C9 및 Acinetobacter sp. A54을 이용하였다. 각각의 균주를 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)에서 24시간 동안 키운 후 원심분리하여 세포를 회수한 다음 10%의 소디움도데실설페이트(sodium-dodecyl-sulfate)가 함유된 분해 용액를 처리한 후 -80 ℃에서 20분간 얼렸다가 다시 60 ℃에서 20분간 녹이는 과정을 3번 반복하였다. 이 시료들을 원심분리하여 얻은 수층에 페놀/클로로포름을 처리하여 게놈 DNA를 얻었다. 추출된 DNA의 농도와 순도는 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 이용하여 260 및 280 nm에서 측정하였다. 이 DNA 시료들은 실험 전까지 -20 ℃에서 보관하였다. N. beijingensis KCTC 19931, N. flavorosea KCTC 9371, N. ignorata KCTC 19935, Rhodococcus rhodochrous KCTC 9086, R. erythropolis KCTC 9077, M. dierhoferi KCTC 9506, Corynebacterium sp. KCTC 1450, Pseudomonas putida KCTC 1770, Burkholderia vietnamiesnsis (KCTC 2974), Alcaligenes faecalis subsp. faecals (KCTC 2678), Bacillus subtilis C9 and Acinetobacter sp. A54 was used. Each strain was grown in tryptic soy broth for 24 hours, then centrifuged to recover cells, and then treated with 10% sodium-dodecyl-sulfate digestion solution. After freezing at 80 ° C. for 20 minutes, the process was repeated 3 times at 60 ° C. for 20 minutes. The samples obtained by centrifugation were treated with phenol / chloroform to obtain genomic DNA. The concentration and purity of the extracted DNA were measured at 260 and 280 nm using a spectrophotometer (Shimadzu UV-160A, Japan). These DNA samples were stored at -20 ° C until the experiment.

16S rDNA 증폭을 위한 중합효소연쇄반응은 얻어진 DNA 1 ㎕를 주형으로 해서, 반응액 부피는 50 ㎕로 하고, 1×PCR 완충액, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP 혼합물, 5 U 타크 중합효소(Taq polymerase, 일본국, 타카라제품)를 첨가하여 수행하였다. 프라이머 세트로서는, 표 1 및 표 2의 프라이머를 이용하여 균주 특이적 프라이머 4 세트와 eubacterial 16S rDNA 유니버셜 프라이머 1세트를 각각 20 pmol을 사용하였다.The polymerase chain reaction for 16S rDNA amplification was performed using 1 μl of the obtained DNA as a template, and 50 μl of the reaction solution volume, 1 × PCR buffer, 20 mM MgCl 2, 40 mM dNTP mixture, and 5 U tag polymerase (Taq). polymerase, Japan, Takara) was added thereto. As a primer set, 20 pmol of 4 strain specific primers and 1 set of eubacterial 16S rDNA universal primers were used using the primers of Table 1 and Table 2, respectively.

반응조건은 우선 주형이 되는 DNA를 1본쇄로 변성시키기 위해 94 ℃에서 5 분간 열처리를 한 후, 94 ℃에서 45 초간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation); 60 ℃에서 45 초간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing); 72 ℃에서 45 초간 DNA를 합성하는 단계(extention)을 총 30회 반복하여 증폭한 후, 마지막 DNA 합성단계는 72 ℃에서 7 분간 실시하였다. 중합효소연쇄반응 증폭 산물은 1% 아가로오스 젤 전기영동을 실시하고, 에티듐 브로마이드 염색하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 합성되었는지를 확인하였다. Reaction conditions include the following steps of first heat-treating at 94 ° C. for 5 minutes to denature DNA as a template, followed by denaturation of DNA at 94 ° C. for 45 seconds; Annealing with primers at 60 ° C. for 45 seconds; After amplifying a total of 30 repeated DNA synthesis at 45 ° C. for 45 seconds, the final DNA synthesis step was performed at 72 ° C. for 7 minutes. The polymerase chain amplification product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and ethidium bromide staining was performed to determine whether DNA fragments of the expected size were synthesized.

각각의 프라이머 세트를 조합하여 PCR을 수행한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 3, 서열번호 1 및 서열번호 4, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 4인 프라이머 세트에서 각각 803, 397, 910, 그리고 504 bp 크기의 산물을 증폭하였다. 도 1에서 보여지는 것처럼 서열번호 2 및 서열번호 4인 프라이머 세트는 Rhodococcus erythropolis KCTC 9077(레인 3)에서도 증폭이 일어났지만, 이를 제외한 나머지 세 프라이머 세트인 서열번호 1 및 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 1 및 서열번호 4에서는 노카르디아 속 H17-1를 제외한 모든 균주에서 증폭이 일어나지 않았음이 관찰되었다. 서열번호 5 및 서열번호 6의 유니버셜 프라이머 세트의 경우에는 모든 균주에서 증폭이 일어났다. 이로부터 제작된 프라이머 세트 중 서열번호 1 및 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 1 및 서열번호4의 프라이머 세트가 노카르디아 속 H17-1에 매우 특이적임을 알 수 있었다.PCR was performed by combining the respective primer sets, and as a result, each of the primer sets having SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively 803, 397, 910, and 504 bp sized products were amplified. As shown in FIG. 1, the primer sets of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 were also amplified in Rhodococcus erythropolis KCTC 9077 (lane 3), but the remaining three primer sets, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and In SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, it was observed that no amplification occurred in all strains except H17-1 of the genus Nocardia. In the case of the universal primer sets of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, amplification occurred in all strains. It was found that the primer sets of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 were highly specific for the genus H17-1. .

실시예 3: 균주 특이적 프라이머 세트의 민감도 측정Example 3: Determination of Sensitivity of Strain Specific Primer Sets

제작된 프라이머 세트의 민감도를 측정하기 위해 순수배양으로부터 얻은 게놈 DNA를 10배 씩 희석한 후 표 3의 프라이머 세트를 이용하여 핫-스타트 PCR을 수행하였다. 토양 추출 DNA 1 ㎕와 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1) 0.5 ㎕, 각각 20 pmol의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머, PCR 완충액, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP 혼합물, 핫-스타트 중합효소(Hot-start polymerase; Finzyme, 미국)를 첨가하여 중합효소연쇄반응(MJ phamatech, 미국)을 수행하였다. 반응조건은 DNA를 1본쇄로 변성시키기 위해 95 ℃에서 2 분간 열처리하는 사전-변성 단계(pre-denaturation step)를 수행한다. 그 후, 94 ℃에서 45 초간 변성 단계(denaturation step); 60 ℃에서 45 초간 DNA와 프라이머와의 어닐링 단계(annealing step); 72 ℃에서 45 초간의 DNA 신장 단계(extention step)을 총 40회 반복하여 증폭한 후, 최종 신장 단계(final extention step)는 72 ℃에서 5 분간 실시하였다. 그 결과, 서열번호 1 및 서열번호 4, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 4인 프라이머 세트는 100 fg의 DNA까지 검출이 가능한 반면, 서열번호 1 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 3인 프라이머 세트는 10 fg의 DNA 까지 검출이 가능하여, 서열번호 1 및 서열번호 4, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 4인 프라이머 세트에 비하여 민감도가 10배 우수했다(표 3). 또한 서열번호 1 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 3은 토양에서 각각 3.5 × 105 와 1.0 × 104 CFU/g 토양 까지 검출이 가능하였다. 상기 프라이머 세트에 따른 특이성과 민감도 결과를 표 3에 나타내었다.In order to measure the sensitivity of the prepared primer set, genomic DNA obtained from the pure culture was diluted 10-fold, and hot-start PCR was performed using the primer sets of Table 3. 1 μl soil extract DNA and 0.5 μl SYBR Green 1, 20 pmol forward and reverse primers, PCR buffer, 20 mM MgCl 2, 40 mM dNTP mixture, and hot-start polymerase (Hot-start). polymerase chain reaction (MJ phamatech, USA) was performed by addition of polymerase (Finzyme, USA). The reaction conditions are carried out a pre-denaturation step of heat treatment at 95 ℃ for 2 minutes to denature the DNA into a single strand. Then a denaturation step at 94 ° C. for 45 seconds; Annealing step of DNA and primer at 60 ° C. for 45 seconds; After amplifying the DNA extension step for 45 seconds at 72 ° C. a total of 40 times, the final extension step was performed at 72 ° C. for 5 minutes. As a result, the primer sets SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 can detect up to 100 fg of DNA, while SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 The primer set was able to detect up to 10 fg of DNA and was 10 times more sensitive than the primer sets SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 (Table 3). In addition, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 was able to detect up to 3.5 × 10 5 and 1.0 × 10 4 CFU / g soil in the soil, respectively. Specificity and sensitivity results according to the primer set are shown in Table 3.

프라이머 세트의 특이성 및 민감도Specificity and Sensitivity of Primer Sets 프라이머 세트Primer set 특이성Specificity 민감도responsiveness 순수배양 (fg DNA)Pure culture (fg DNA) 토양 (CFU/g 토양)Soil (CFU / g soil) 서열번호 1 및 서열번호 3SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 유U 1010 3.5 × 105 3.5 × 10 5 서열번호 2 및 서열번호 3SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 유U 1010 1.0 × 104 1.0 × 10 4 서열번호 1 및 서열번호 4SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 유U 100100 1.5 × 107 1.5 × 10 7 서열번호 2 및 서열번호 4SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 무radish 100100 1.0 × 107 1.0 × 10 7

또한 증폭된 산물을 젤로부터 추출하고 클로닝 과정을 거쳐 염기서열을 분석한 결과, 노카르디아 속 H17-1와 염기서열이 100% 일치하였고, 노카르디아 속 H17-1이 첨가되지 않은 토양에서는 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 DNA 증폭이 관찰되지 않았다. 이 결과로부터 본 서열번호 1 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트는 노카르디아 속 H17-1에 특이적이며, 민감도가 높아 노카르디아 속 H17-1이 적용된 오염지역에서 동균주의 모니터링에 매우 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다. In addition, the amplified product was extracted from the gel and subjected to cloning to analyze the nucleotide sequence. As a result, 100% of the sequence of Nocardia genus H17-1 was matched. DNA amplification was not observed when polymerase chain reaction was performed using the primer set. From these results, the primer sets of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are specific for H17-1 genus Nocardia and have high sensitivity, and contaminated regions to which H17-1 is applied to Nocardia genus It can be seen that it can be used very effectively for the monitoring of copper strains.

비교예Comparative example

핫-스타트 PCR을 이용한 본 발명과의 민감도를 비교하기 위해 순수배양으로부터 얻은 게놈 DNA를 10배 씩 희석한 후 표 3에 제시된 노카르디아 속 H17-1에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시예 3의 핫-스타트 중합효소 대신에 타크 중합효소(Taq polymerase, 일본국, 타카라제품)를 사용하였고, 반응 조건은 어닐링 온도를 56 ℃로 한 것 이외의 방법 및 조건은 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 그 결과, 서열번호 1 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 3인 프라이머 세트는 각각 50 fg의 DNA, 50 fg의 DNA 까지 검출이 가능하여, 실시예 3의 핫-스타트 PCR을 이용했을 때에 비하여 민감도가 약 5배 정도 낮음을 알 수 있었다.(표 4). 또한 서열번호 1 및 서열번호 3, 그리고 서열번호 2 및 서열번호 3은 토양에서 각각 5.6 × 105 와 1.2 × 104 CFU/g 토양 까지 검출이 가능하였다. 상기 PCR 방법에 따른 민감도 결과를 표 4에 나타내었다.To compare sensitivity with the present invention using hot-start PCR, genomic DNA obtained from pure culture was diluted 10-fold, and then polymerase chains were prepared using primer sets specific for the genus H17-1 shown in Table 3. The reaction was carried out. Instead of the hot-start polymerase of Example 3, Tak polymerase (Taq polymerase, manufactured by Takara, Japan) was used, and the reaction conditions were the same as those of Example 3, except that the annealing temperature was 56 ° C. Was performed. As a result, the primer sets of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 were able to detect up to 50 fg of DNA and 50 fg of DNA, respectively, and the hot-start PCR of Example 3 was used. Sensitivity was about 5 times lower than when compared to Table 4 (Table 4). In addition, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 was able to detect up to 5.6 × 10 5 and 1.2 × 10 4 CFU / g soil, respectively. The sensitivity results according to the PCR method are shown in Table 4.

일반 타크 중합효소를 이용했을 때의 민감도Sensitivity when using generic tar polymerase 프라이머 세트Primer set 민감도responsiveness 순수배양 (fg DNA)Pure culture (fg DNA) 토양 (CFU/g 토양)Soil (CFU / g soil) 서열번호 1 및 서열번호 3SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 5050 5.6 × 105 5.6 × 10 5 서열번호 2 및 서열번호 3SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 5050 1.2 × 104 1.2 × 10 4

실시예 4: 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 노카르디아 속 H17-1의 정량Example 4 Quantification of Genus H17-1 by Nocardia by Real-time PCR

(1) 토양 시료의 제조(1) Preparation of Soil Samples

유류 오염토양에서 노카르디아 속 H17-1의 생존 및 증식을 모니터링하기 위해 사양토(유기물 3.8%, pH 7.1)에 아라비아 경질 원유(Arabian light crude oil)를 50 g/kg의 농도로 오염시킨 후 야외에서 한달간 방치하였다. 토양 1 kg씩을 2.25 L 폴리에틸렌 용기에 담아 준비하였다. 2개의 용기에는 노카르디아 속 H17-1를 첨가하였고, 두 용기에는 토착미생물의 영향을 조사하기 위하여 대조구로 사용하였다. 대수증식기 말기까지 자란 노카르디아 속 H17-1는 원심분리 후 멸균 증류수로 두 번 세척한 후 오염토양과 고르게 섞이도록 섞어주었으며, 균주를 첨가하지 않은 대조구에는 동량의 멸균 증류수를 첨가하여 오염토양과 고르게 섞어주었다. 2주마다 일정량의 토양을 채취하여 토양내 잔류 유류의 농도와 게놈 DNA를 분석하였다. In order to monitor the survival and proliferation of H17-1 of the genus H17-1 in oil-contaminated soils, the soil is lightly contaminated with arabic light crude oil at a concentration of 50 g / kg in sandy loam (3.8% organic matter, pH 7.1). Left for a month. 1 kg of soil was prepared in a 2.25 L polyethylene container. Two vessels were added to the genus H17-1, and two vessels were used as controls to investigate the effects of indigenous microorganisms. Nocardia genus H17-1, grown until the end of the logarithmic growth stage, was washed twice with sterile distilled water after centrifugation and mixed to mix with contaminated soil evenly. Mix it evenly. A certain amount of soil was collected every two weeks to analyze the concentration of residual oil and genomic DNA in the soil.

(2) 토양에서 DNA의 추출(2) extraction of DNA from soil

오염토양 1g을 실리카 비드(직경 0.1 mm + 0.5 mm + 0.5 mm)가 들어있는 2 ㎖ 용적의 튜브에 넣은 후 추출 완충액(100 mM 인산나트륨, 10% (w/v) 소디움도데실설페이트, 100 mM 트리스, 100 mM EDTA) 1 ㎖를 첨가한 후 세포파쇄기(minibead beator)로 90초간 5000 rpm 으로 파쇄한 다음 토양용 FastDNA SPIN kit(Qgene, 미국)에서 제시한 대로 토양 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 농도와 순도는 실시예 2에서와 마찬가지로 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 이용하여 260 및 280 nm에서 측정하였다. 이 DNA 시료들은 실험 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.1 g of contaminated soil is placed in a 2 ml volume tube containing silica beads (0.1 mm + 0.5 mm + 0.5 mm in diameter), followed by extraction buffer (100 mM sodium phosphate, 10% (w / v) sodium dodecyl sulfate, 100 mM). After adding 1 ml of Tris, 100 mM EDTA), the cells were crushed at 5000 rpm for 90 seconds using a minibead beator, and the soil DNA was extracted as suggested by the soil FastDNA SPIN kit (Qgene, USA). The concentration and purity of the extracted DNA were measured at 260 and 280 nm using a spectrophotometer (Shimadzu UV-160A, Japan) as in Example 2. These DNA samples were stored at -20 ° C until the experiment.

(3) 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 균주 정량(3) Strain quantification using real-time PCR

제작된 프라이머 세트 서열번호 2 및 서열번호 3을 이용하여 추출된 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)법을 이용하여 각 시간대별로 오염토양에 존재하는 노카르디아 속 H17-1을 정량하였다. 토양내 존재하는 노카르디아 속 H17-1을 정량을 위한 실시간 중합효소연쇄반응 증폭의 반응은 20 ㎕로 하고, 토양 추출 DNA 1 ㎕와 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1) 0.5 ㎕, 20 pmol의 서열번호 2의 포워드 프라이머와 서열번호 3의 리버스 프라이머, PCR 완충액, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP 혼합물, 핫-스타트 중합효소(Hot-start polymerase; Finzyme, 미국)를 첨가하여 중합효소연쇄반응(MJ phamatech, 미국)을 수행하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법의 반응조건은 실시예 3과 동일하게 수행하였다. 얻어진 임계 사이클(Ct) 값은 순수배양한 노카르디아 속 H17-1 게놈 DNA를 농도별로 희석하여(4.5 ~ 450 pg/PCR) 동일 조건하에서 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 얻은 표준 정량곡선(도 2, y=-3.83x + 37.33, r2=0.98)에 준하여 계산하였다. DNA extracted using the prepared primer set SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 quantitative H17-1 genus Nocardia in the contaminated soil at each time zone using real-time PCR It was. The reaction of real-time polymerase chain amplification for the determination of H17-1 in the Nocardia genus in the soil was 20 μl, and 1 μl of soil-derived DNA and 0.5 μl, 20 pmol of SYBR Green 1 The polymerase chain reaction was performed by adding a forward primer of SEQ ID NO: 2, a reverse primer of SEQ ID NO: 3, a PCR buffer, 20 mM MgCl 2, a 40 mM dNTP mixture, and a hot-start polymerase (Finzyme, USA). MJ phamatech, USA). The reaction conditions of the real time PCR method were performed in the same manner as in Example 3. The obtained critical cycle (Ct) value is a standard quantitative curve obtained by real-time polymerase chain reaction under the same conditions by diluting purely cultured H17-1 genomic DNA (4.5-450 pg / PCR). 2, y = -3.83x + 37.33, r 2 = 0.98).

실제 오염토양에서 노카르디아 속 H17-1의 생존 및 증식을 모니터링하기 위한 실험을 120일 동안 실시하였다. 노카르디아 속 H17-1 첨가구에서는 실험 초기 28일 동안 급격한 석유계 총탄화수소(Total Petroleum Hydrocarbon; TPH) 감소가 관찰되었으며, 이 기간에 약 72%의 석유계 총탄화수소가 감소되었다. 반면 노카르디아 속 H17-1을 첨가하지 않은 토착미생물 처리구는 120일 동안 지속적으로 석유계 총탄화수소가 감소되었으며, 실험 초기 28일 동안에는 약 21%의 석유계 총탄화수소만이 감소되었다(도 3).Experiments were conducted for 120 days to monitor the survival and proliferation of Nocardia genus H17-1 in actual contaminated soil. In the Nocardia H17-1 addition, a rapid decrease in Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) was observed during the first 28 days of the experiment, with about 72% reduction in total Petroleum Hydrocarbon. On the other hand, the indigenous microorganism treatment group without addition of H17-1 in Nocardia continuously reduced petroleum-based total hydrocarbons for 120 days, and only about 21% of petroleum-based total hydrocarbons was reduced during the initial 28 days (Fig. 3). .

서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트를 이용하여 실시된 실시간 중합효소연쇄반응으로 노카르디아 속 H17-1을 정량한 결과 노카르디아 속 H17-1을 첨가하지 않은 처리구에서는 중합효소연쇄반응이 일어나지 않았으나, 노카르디아 속 H17-1을 첨가한 토양에서는 시간이 증가함에 따라 노카르디아 속 H17-1의 양 또한 급격하게 증가하는 것으로 조사되었다(도 4). TPH양과 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 얻은 노카르디아 속 H17-1 16S rDNA 유전자의 양의 상관관계는 r2=0.71로서 높은 상관관계를 나타내었다(도 5). 이러한 높은 상관관계는 노카르디아 속 H17-1의 실시간 중합효소연쇄반응법을 통한 모니터링을 통해 유류 오염토양의 생물학적 정화의 효율을 높일 수 있음을 나타낸다.As a result of quantifying nocardia genus H17-1 by real-time polymerase chain reaction using the primer sets of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, the polymerase chain reaction was not carried out in the treatment group without addition of no cardiac genus H17-1. Although it did not occur, it was observed that the amount of nocardia genus H17-1 also increased rapidly with the time added to the nocardia genus H17-1 (FIG. 4). The correlation between the amount of TPH and the amount of H17-1 16S rDNA gene in the genus Nocardia obtained from real-time polymerase chain reaction showed a high correlation as r 2 = 0.71 (FIG. 5). This high correlation indicates that the efficiency of biological purification of oil-contaminated soils can be enhanced by monitoring the real-time polymerase chain reaction of H17-1 in the genus Cardiac.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 유류분해 세균 노카르디아 속 H17-1에 특이적이고 민감도가 높은 프라이머 세트를 제공하며, 상기 프라이머세트, 사용용이성이 뛰어난 비특이적 형광물질인 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1) 및 민감성을 높이기 위한 핫-스타트 중합효소를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응을 통해, 노카르디아 속 H17-1가 유류 오염토양 정화에 적용되었을 때 간편하고 신속·정확하게 노카르디아 속 H17-1의 정량하는 방법을 제공한다.As described above, the present invention provides a primer set that is specific and highly sensitive to the oil-degrading bacterium Nocardia genus H17-1, and the primer set is a non-specific fluorescent substance having excellent ease of use. 1) and through the real-time polymerase chain reaction using hot-start polymerase to increase the sensitivity, it is simple, quick and accurate when the Nocardia genus H17-1 is applied to the oil contaminated soil purification. It provides a method of quantifying.

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Claims (4)

노카르디아 속(Nocardia sp.) H17-1에 특이적인 (ⅰ) 서열번호 1 및 서열번호 3으로 구성된 프라이머 세트 또는 (ⅱ) 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 프라이머 세트.A primer set consisting of (i) SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 specific to Nocardia sp. H17-1 or (ii) a primer set consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. 청구항 1의 프라이머 세트, 에스와이비알 그린 1(SYBR Green 1) 및 핫-스타트 중합효소(Hot-start polymerase)를 첨가하여 95 ℃에서 2 분간 열처리하는 사전-변성 단계(pre-denaturation step)를 수행하고 난 후, The pre-denaturation step of heat treatment at 95 ° C. for 2 minutes is performed by adding the primer set of claim 1, SYBR Green 1 and Hot-start polymerase. After I 94 ℃에서 45 초간의 변성 단계(denaturation step); 55 ~ 65 ℃에서 45 초간의 어닐링 단계(annealing step); 72 ℃에서 45 초간의 신장 단계(extention step)로 이루어진 사이클을 40회 반복하고, 최종 신장 단계(final extention step)는 72 ℃에서 5 분간 실시하는 반응 조건 하에서 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 이용한 노카르디아 속(Nocardia sp.) H17-1를 정량 방법.Denaturation step at 94 ° C. for 45 seconds; Annealing step for 45 seconds at 55-65 ° C .; The cycle consisting of an extension step of 45 seconds at 72 ℃ is repeated 40 times, the final extension step (final extention step) is characterized in that the polymerase chain reaction is carried out under the reaction conditions carried out for 5 minutes at 72 ℃ Method for quantifying Nocardia sp. H17-1 using real time PCR. 삭제delete 삭제delete
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