KR100702728B1 - 환상 뎁시펩티드 합성효소 및 그의 유전자 및 환상뎁시펩티드의 대량생산계 - Google Patents
환상 뎁시펩티드 합성효소 및 그의 유전자 및 환상뎁시펩티드의 대량생산계 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100702728B1 KR100702728B1 KR1020027002704A KR20027002704A KR100702728B1 KR 100702728 B1 KR100702728 B1 KR 100702728B1 KR 1020027002704 A KR1020027002704 A KR 1020027002704A KR 20027002704 A KR20027002704 A KR 20027002704A KR 100702728 B1 KR100702728 B1 KR 100702728B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leu
- ala
- val
- ser
- arg
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
환상 뎁시펩티드(특히, PF 1022물질)합성효소 및 그의 유전자. 이들 환상 뎁시펩티드 합성효소는, (a) SEQ ID No. 2의 아미노산 서열; 또는 (b) 치환, 결실, 부가 및 삽입에서 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한 환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는 상기 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 함유한다. 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자는 상기 환상 뎁시펩티드 합성효소를 코드하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 또한, 환상 뎁시펩티드의 대량 생산계, 환상 뎁시펩티드 합성효소의 제조법 등이 제공된다.
Description
본 발명은 환상 뎁시펩티드 합성효소 및 그의 유전자 및 환상 뎁시펩티드의 대량 생산계에 관한 것이고, 더욱 상세하기는, 구충활성을 갖는 PF 1022물질의 합성효소 및 그의 유전자 및 PF 1022물질의 대량 생산계에 관한 것이다.
PF 1022물질 [시클로(D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)]은 아고노마이세탈레스 (Agonom ycetales)에 속하는 사상균, PF 1022균주 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 의해 생산되는 환상 뎁시펩티드이고, 동물 기생성의 선충류에 대해서 극히 높은 구충활성을 나타낸다 (특개평 3-35796호, Sasaki, T. et. al., J. Antibiotics, 45, 692, (1992)). 그 때문에, 이 물질은 동물용의 구충약으로서 유용함과 동시에, 또한 고활성인 이 물질의 유도체를 합성하기 위한 원료로서 유용하다.
일반적으로, 천연으로부터 분리된 미생물이 생산하는 이차 대사산물의 양은 미량이다. 그 때문에 이것을 산업적으로 이용하기 위하여는 이차 대사산물의 생산량을 향상시킬 필요가 있다. 생산량을 향상시키기 위해서는 배양방법의 검토, 배지성분의 검토, 및 전구체의 첨가라고 하는 발효조건의 개량, 및 자외선 조사 또는 돌연변이 유발제에 의한 돌연변이를 이용한 균주의 개량이 행해진다. 최근에는 이들의 방법에 더해서 유전자 재조합의 방법을 이용한 생산성의 향상도 행해지도록 되어 왔었다.
그의 방법으로서는 생합성 경로의 효소 유전자의 발현증가, 생합성의 제어유전자의 발현증강, 불필요한 생합성 경로의 차단 등이 행해지고 있다 (Khetan, A. and Hu, W.-S. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology 2nd edition, P. 717, (1999)). 또 특수한 예로서는 산소 이용능의 향상을 목적으로 해서, 세균의 헤모글로빈 유전자를 발현시켜 생산성을 향상시키는 방법도 알려져 있다(Minas, W. et. al., Biotechnol. Prog., 14, 561(1998)).
유전자 재조합의 방법을 사용해서 생산성의 향상을 도모할 때에, 가장 일반적인 방법은 생합성 경로의 효소유전자의 발현증강이다. 이 방법을 적응하기 위하여는, 대상으로 하는 미생물에 있어서 형질전환의 방법이 확립해 있는 것, 발현증강을 위하여 이용가능한 프로모터 및 터미네이터가 존재하는 것, 또 생합성 경로가 명확하게 되어 있고, 그들의 유전자가 단리되어 있는 것이 필요하다. PF 1022물질 생산균에 있어서는, 형질전환에 의해 외래유전자를 도입하는 것에 성공하고 있지만(WO97/00944호), 생합성경로의 유전자는 단리되지 않는다.
PF 1022물질은, L-N-메틸로이신, D-유산, 및 D-페닐유산이 에스테르결합 및 아미드결합을 통해서 결합한 구조로부터 되고, 생산균 중에서는 4분자의 L-로이신, 2분자의 D-유산, 2분자의 D-페닐유산으로부터, 어떤 종의 펩티드 합성효소에 의해 합성되는 것으로 생각되어 진다. 펩티드 합성효소라 함은 아미노산이나 히드록시산을 기질로 해서 펩티드, 뎁시펩티드, 리포펩티드, 펩티드락톤 등의 미생물의 이차 대사산물의 생합성을 행하는 효소이고, 이미 몇개의 펩티드 합성효소의 배열이 명확해졌다(Marahiel, M.A. et. al., Chem. Rev., 97, 2651, 1997)). 이 효소에 의한 반응은 mRNA를 주형으로 한 리보솜에 의한 단백질의 합성계와는 전혀 다르다. 펩티드 합성효소는 각 기질에 대해서 1개의 도메인을 갖고, 각 기질은 이 도메인에서 ATP에 의해 활성화되고, 도메인 중의 포스포판토텐산을 통해서 결합하고, 이들이 각 도메인간의 영역의 촉매작용에 의해 아미드결합이나 에스테르결합을 형성하는 것으로 생각되어진다.
본 발명은 환상 뎁시펩티드, 특히 PF 1022물질을 합성하는 효소 (이하, 「환상 뎁시펩티드 합성효소」라 한다)를 제공하는 것을 그의 목적으로 한다.
본 발명은 또, 환상 뎁시펩티드 합성효소를 코드하는 유전자 (이하, 「환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자」라 한다)를 제공하는 것을 그의 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 환상 뎁시펩티드 합성효소를 발현시키기 위한 재조합 벡터 및 형질전환체, 및 환상 뎁시펩티드의 대량생산계 및 그의 제조법의 제공을 그의 목적으로 한다.
본 발명은 환상 뎁시펩티드 합성효소의 제조법의 제공을 그의 목적으로 한다.
본 발명에 의한 환상 뎁시펩티드 합성효소는 하기로부터 되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 함유해서 되는 단백질이다:
(a) SEQ ID No. 2의 아미노산서열, 및
(b) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1이상의 개변을 갖고, 또한, 환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는 SEQ ID No. 2의 아미노산 서열의 개변 아미노산서열.
본 발명에 의한 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자는 환상 뎁시펩티드 합성효소를 코드하는 뉴클레오티드 서열로부터 되는 것이다.
본 발명에 의한 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자는 또, 하기로부터 되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열로부터 된다:
(c) SEQ ID No. 1의 DNA서열,
(d) SEQ ID No. 1의 DNA서열과 적어도 70%의 동일성을 갖고 또한 환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열,
(e) 치환, 결실, 부가, 및 삽입에서 선택되는 1이상의 개변을 갖고 또한 환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 SEQ ID No. 1의 DNA서열의 개변 DNA서열, 및
(f) 스트린전트(stringent) 조건하에서 SEQ ID No.1의 DNA서열과 혼성화 (hybridize)하고, 또한, 환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열.
본 발명에 의한 재조합 벡터는 본 발명에 의한 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자를 함유해서 되는 것이다.
본 발명에 의한 형질전환체 및 환상 뎁시펩티드의 대량 생산계는 본 발명에 의한 재조합 벡터를 함유해서 되는 숙주이다.
본 발명에 의한 환상 뎁시펩티드의 제조법은 본 발명에 의한 형질전환체를 배양하고, 배양물에서 환상 뎁시펩티드를 채취하는 것을 포함해서 되는 것이다.
본 발명에 의한 환상 뎁시펩티드 합성효소의 제조법은 본 발명에 의한 형질전환체를 배양하고, 배양물에서 환상 뎁시펩티드 합성효소를 채취하는 것을 포함해서 되는 것이다.
본 발명에 의하면, 환상 뎁시펩티드 합성효소를 PF 1022물질 생산균에서 과잉 발현시킬 수 있고 또 PF 1022물질을 대량으로 생산시킬 수 있다.
도 1은 플라스미드 pABP/PFsyn의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 2는 Abp1유전자를 함유하는 6kb의 HindⅢ단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 pABPd의 구성 및 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 친주 및 pABP/PFsyn을 도입한 유전자 도입주에서 추출한 단백질의 전기영동의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 친주 및 pABP/PFsynN을 도입한 유전자 도입주에서 추출한 단백질의 전기영동의 결과를 나타낸 것이다.
미생물의 기탁
실시예 1 1.에 기재되는 PF 1022균주는 1989년 1월 24일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반3고)에 기탁되었다. 수탁번호는 FERM BP-2671이다.
실시예 2 1.(1)에 기재되는 플라스미드 pPFsyn으로 형질전환된 대장균(DH5α)는 1999년 9월 1일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반3고)에 기탁되었다. 수탁번호는 FERM BP-7253이다.
실시예 2 1.(1)에 기재되는 플라스미드 pPFsynN으로 형질전환된 대장균(DH5α)는 1999년 9월 1일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반3고)에 기탁되었다. 수탁번호는 FERM BP-7254이다.
유전자 및 단백질
본 발명에 의하면 환상 뎁시펩티드 합성효소, 바람직하기는 PF 1022물질 합성효소, 및 그의 유전자가 제공된다.
본 발명에 의한 효소는, 4분자의 L-로이신, 2분자의 D-유산, 및 2분자의 D-페닐유산에 작용해서, PF 1022물질을 합성할 수 있다. D-유산, L-로이신, 및 D-페닐유산을 미리 수식해 놓음으로써 PF 1022물질의 유도체를 제조할 수 있다.
PF 1022물질의 유도체로서는 예를 들면, PF 1022물질 중의 2개의 페닐기의 파라위치가 아미노기에 의해 치환된 것을 들 수가 있다. 이 경우, PF 1022물질의 유도체의 합성기질로서는, 예를 들면, D-페닐유산 대신에 D-P-아미노페닐유산을 사용할 수 있다.
서열 (b)에 있어서, 개변의 수는 예를 들면 1~수개, 더욱 구체적으로는 1~6개일 수 있다.
서열 (e)에 있어서, 개변의 수는 예를 들면, 1~수십개일 수 있다.
서열 (b) 및 서열 (e)에 있어서, 변이가 복수개 존재하는 경우, 도입된 변이의 종류는 동일 또는 상이해도 좋다.
서열 (d)에 있어서, SEQ ID No. 1의 DNA서열과의 동일성은 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 적어도 90%, 가장 바람직하기는 적어도 95%일 수 있다.
서열 (f)에 있어서, 「스트린전트 조건」이라 함은, 혼성화 후의 멤브레인의 세정조작을, 고온하에 저염농도 용액 중에서 행하는 것을 의미하고, 예를 들면, 0.2 x SSC농도 (1 x SSC :15mM 구연산3나트륨, 150mM 염화나트륨), 0.1% SDS용액 중에서 60℃, 15분간의 세정조건을 의미한다.
서열 (b)에 관해서, 「환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는다」아닌지 여부는, 예를 들면 환상 뎁시펩티드의 기질을 준비하고, 피시험 단백질을 작용시켜, 환상 뎁시펩티드의 생성을 예를 들면, 크로마토그라피에 의해서 확인해서 평가할 수 있다.
서열 (d), (e), 및 (f)에 관해서, 「환상 뎁시펩티드 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코드한다」아닌지 여부는, 예를 들면, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 피시험 뉴클레오티드 서열을 숙주에서 발현시켜, 얻어진 단백질을 환상 뎁시펩티드의 기질과 작용시켜, 환상 뎁시펩티드의 생성을 예를 들면, 크로마토그라피에 의해서 확인해서 평가할 수 있다.
본 발명에 의한 합성효소의 아미노산 서열이 주어지면, 이것을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 용이하게 정해져, SEQ ID No. 2에 기재되는 아미노산 서열을 코드하는 여러가지의 뉴클레오티드 서열을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 합성효소를 코드하는 뉴클레오티드 서열이라 함은, SEQ ID No. 1에 기재된 DNA서열의 일부 또는 전부에 가해져, 동일한 아미노산을 코드하는 DNA서열에 있어서 축퇴성 코돈(degenerative codons)을 DNA서열로서 갖는 서열을 의미하는 것으로 하고, 또한 여기에 대응하는 RNA서열도 포함된다.
본 발명에 의한 유전자는, 예를 들면, 하기와 같이해서 얻을 수 있다.
PF 1022물질 생산균에서 게놈 DNA를 추출하고, 적당한 제한효소로 절단 후, 파아지 벡터를 사용해서, PF 1022물질 생산균의 게놈 DNA로부터 되는 라이브러리 (library)를 제작한다. 펩티드 합성효소의 아미노산 서열의 보존영역, 또는 PF 1022물질 생산균에서 정제한 환상 펩티드 합성효소의 부분 아미노산 서열을 기초로해서 적당한 프라이머를 합성하고, 그것을 사용해서 PF 1022물질 생산균 유래의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR법을 실시하여, 환상 펩티드 합성효소 유전자의 DNA단편을 증폭한다. 이 DNA단편을 프로브로서 사용하여, 게놈 라이브러리의 스크리닝을 행한다. 이와 같이해서, 환상 펩티드 합성효소 유전자의 전역(全域)을 단리할 수 있다. 이 DNA 단편의 염기서열을 결정한 후, 번역개시 코돈의 상류 및 번역정지 코돈의 하류에, PCR 등의 방법에 의해 적당한 제한효소 절단부위를 도입하여 환상 펩티드 합성효소 유전자만을 함유하는 유전자 단편을 얻을 수가 있다.
재조합 벡터
본 발명에 의하면 환상 뎁시펩티드 합성효소를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 함유해서 되는 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명에 의한 재조합 벡터의 구축의 순서 및 방법은 유전자공학의 분야에서 관용되고 있는 것을 사용할 수가 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 벡터로서는 숙주 염색체 DNA에 병합되는 것이나, 자기복제가능한 자율적 복제 서열을 갖는 벡터를 숙주 세포내에서 플라스미드 상태로 존재시키는 것을 들 수가 있고, 예를 들면, pUC계(pUC18 또는 pUC118 등), pBluescript계 (pBluescriptⅡ KS+등), 및 pBR322 등의 플라스미드를 들 수가 있다. 숙주세포 내에 존재하는 유전자의 카피수는 1 카피 또는 복수 카피이어도 좋다.
본 발명에 의한 재조합 벡터는 예를 들면, 환상 뎁시펩티드 합성효소를 코드하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 프로모터를, 또는 하류에 터미네이터를 각각 작동가능하게 연결하고, 경우에 따라서는 유전자 마커 및/또는 다른 제어서열을 작동가능하게 연결해서 제작할 수 있다.
본 발명에 의한 유전자으로의 프로모터 및 터미네이터의 연결, 및 발현 유닛트의 벡타으로의 삽입은 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다.
본 발명에 사용하는 프로모터 및 터미네이터는 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 3-포스포글리세레이트 키나제, 글리세릴 알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 에놀라제 등의 해당계(解糖系)효소 유전자의 제어 서열, 오르니틴 카바모일 트란스페라제, 트립토판 신타제 등의 아미노산 합성계 효소 유전자의 제어 서열, 아밀라제, 프로테아제, 리파제, 셀룰라제, 아세트아미다제 등의 가수분해효소 유전자의 제어 서열, 나이트레이트 리덕타제, 오로티딘-5'-포스페이트 디히드로게나제, 알콜 디히드로게나제 등의 산화환원효소 유전자의 제어 서열, 및 Abp1 등의 PF 1022물질 생산균 중에서 고발현하는 PF 1022물질 생산균 유래의 유전자의 제어 서열을 들 수가 있다.
본 발명에 의한 유전자를 다른 단백질의 번역영역을 코드하는 외래 유전자와 연결시켜서 융합 단백질로서 발현시켜도 좋다.
유전자 마커의 도입은 예를 들면, 제어 서열에 PCR법에 의해 적당한 제한효소 절단부위를 도입하고, 이것을 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 약제내성 유전자 및/또는 영양요구성 보충유전자 등의 선택 마커 유전자를 연결해서 행할 수 있다.
유전자 마커는 형질전환체의 선택방법에 따라서 적당히 선택할 수 있으나, 예를 들면 약제내성을 코드하는 유전자나 영양요구성을 보충하는 유전자를 사용할 수 있다. 약제내성 유전자로서는 데스토마이신, 베노밀, 올리고마이신, 하이그로마이신, G418, 블레오마이신, 비알라포스, 블라스토사이딘S, 플레오마이신, 포스피노트리신, 암피실린, 가나마이신 등의 약제에 대한 유전자를 들 수가 있다. 영양요구성을 보충하는 유전자로서는, amdS, pyrG, argB, trpC, niaD, TRP1, LEU2, URA3 등의 유전자를 들 수가 있다.
형질전환체 및 환상 뎁시펩티드의 제조
본 발명에 의하면 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주가 제공된다.
본 발명에 있어서 사용할 수 있는 숙주로서는 유전자 재조합의 숙주로서 사용가능한 미생물이면 특히 한정되는 것은 아니다. 사용할 수 있는 숙주의 예로서는 임의의 세균류 또는 진균류의 미생물을 들 수가 있고, 바람직하기로는 대장균, 바실루스속 세균, 방선균, 효모, 사상균, 더욱 바람직하기는, PF 1022물질을 생산하는 사상균, 가장 바람직하기는 PF 1022균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)이다.
숙주로의 유전자 발현용의 재조합 벡터의 도입은 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다. 도입법으로서는 예를 들면, 일렉트로포레이션법, 폴리에틸렌글리콜법, 아그로박테륨법, 리튬법 또는 염화칼슘법 등을 들 수가 있고, 숙주세포에 있어서 효율이 좋은 방법이 선택된다. PF 1022물질 생산균을 숙주로서 사용하는 경우, 바람직하기는 폴리에틸렌글리콜법이다.
형질전환체의 배양은 통상의 방법에 따라서, 배지, 배양조건 등을 적당히 선택해서 행할 수 있다. 배지로서는, 관용의 성분, 예를 들면, 탄소원으로서는 글루코스, 슈크로스, 셀룰로스, 물엿, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 당밀, 동·식물유 등을 사용할 수 있다. 또 질소원으로서는 대두분, 소맥배아, 파마메디아, 콘스팁·리카, 면실박, 부용(bouillon), 펩톤, 폴리펩톤, 몰트 엑스, 이스트 엑스, 황산암모늄, 질산나트륨, 요소 등을 사용할 수가 있다. 기타 필요에 따라서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온을 생산할 수 있는 무기염류, 예를 들면, 염화칼륨, 탄산칼슘, 인산수소2칼륨, 황산마그네슘, 인산1칼륨, 황산아연, 황산망간, 황산구리를 첨가하는 것도 유효하다. 또한, 필요에 따라서, 티아민(티아민염산염 등) 등의 각종 비타민, 글루타민산(글루타민산나트륨 등), 아스파라긴 (DL-아스파라긴 등) 등의 아미노산, 뉴클레오티드 등의 미량 영양소, 항생물질 등의 선발 약제를 첨가할 수도 있다. 또한, 균의 발육을 돕고, 환상 뎁시펩티드의 생산을 촉진하는 유기물 및 무기물을 적당히 첨가할 수 있다.
배양법으로서는, 호기적 조건에서의 진탕배양법, 통기교반배양법 또는 심부호기배양법(深部好氣培養法)에 의해 행할 수 있으나, 특히 심부호기배양법이 가장 적합하다. 배지의 pH는 예를 들면, pH6 ~ pH8정도이다. 배양에 적당한 온도는 15~40℃이지만, 많은 경우 26~37℃부근에서 생육한다. 환상 뎁시페티드 합성효소 및 환상 뎁시펩티드의 생산은 배지 및 배양조건, 또는 사용한 숙주에 따라 다르지만, 어느 배양법에 있어서도 통상 2~25일 사이에서 그의 축적이 최고에 달한다.
배양 중의 환상 뎁시펩티드 합성효소, 또는 환상 뎁시펩티드의 양이 최고로 되었을 때에 배양을 정지하여, 배양물에서 환상 뎁시펩티드 합성효소 또는 환상 뎁시펩티드를 단리·정제한다.
배양물에서 환상 뎁시펩티드 합성효소 또는 환상 뎁시펩티드를 채취하기 위해서는 그의 성상을 이용한 통상의 분리수단, 예를 들면, 용제추출법, 이온교환수지법, 흡착 또는 분배 칼럼 크로마토그라피법, 겔여과법, 투석법, 침전법, 결정화법을 단독으로, 또는 적당히 조합해서 추출 정제할 수 있다.
환상 뎁시펩티드 합성효소는 예를 들면, 부틸 아가로스 등을 사용한 소수성 크로마토그라피에 의해 효율 좋게 정제할 수 있다.
환상 뎁시펩티드는 예를 들면, 배양물 중에서는 아세톤, 메탄올, 부탄올, 아세트산에틸, 아세트산부틸 등으로 추출할 수 있다. 환상 뎁시펩티드를 더욱 정제하는데는 실리카겔, 알루미나 등의 흡착제, Sephadex LH-20 (Pharmacia사제) 또는 Toyopearl HW-40 (도소오사제) 등을 사용하는 크로마토그라피를 행하면 좋다. 이상과 같은 방법에 의해, 또는 이들을 적당히 조합시킴으로써, 순수한 환상 뎁시펩티드가 얻어진다.
본 발명에 의하면 환상 뎁시펩티드의 대량 생산계가 제공된다. 환상 뎁시펩티드의 생산계, 특히 PF 1022물질의 생산계로서 사용할 수 있는 숙주로서는, PF 1022물질을 생산하는 사상균이 바람직하고, 가장 바람직하기는 PF 1022균주 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671)이다. 형질전환에 사용되는 재조합 벡터로서는, PF 1022물질 생산균에서 기능하는 제어 서열(프로모터, 터미네이터 등)을 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 벡터가 바람직하고, 가장 바람직하기는 PF 1022균주 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에서 기능하는 제어 서열을 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자에 작동가능하게 연결한 발현 벡터이다. 환상 뎁시펩티드, 특히 PF 1022물질은 바람직하기는, PF 1022물질 생산균에서 기능하는 제어 서열이 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 벡터에 의해서 형질전환된 PF 1022물질 생산균을 배양하고, 배양물에서 환상 뎁시펩티드를 단리해서 제조할 수 있다.
PF 1022물질의 기질인 L-로이신, D-유산, 또는 D-페닐유산을 합성하지 않는 숙주에 있어서는 부족한 기질 또는 기질의 유도체를 첨가해서 배양함으로써, PF 1022물질 또는 PF 1022물질의 유도체를 생산시키는 것이 가능하다.
이하에, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: PF 1022물질 생산균에서의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 클로닝
1. 게놈 DNA의 단리와 게놈 라이브러리의 제작
게놈 DNA는, PF 1022균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 대해서 UV조사 또는 NTG처리에 의해 돌연변이를 유발하여, PF 1022의 생산성을 향상시킨 PF 1022물질 생산균 432-26주에서 추출했다. PF 1022물질 생산균 432-26주를 50㎖의 종배지[1% 이스트엑스, 1% 몰트엑스, 2% 폴리펩톤, 2.5% 글루코스, 0.1% 인산수소2칼륨, 0.05% 황산마그네슘(pH7.0)]에서 26℃에서 2일간 배양하고, 원심분리에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체를 액체 질소로 동결 후, 유발(乳鉢)과 유봉(乳棒)을 사용해서 마쇄했다.
이 마쇄한 균체에서 ISOPLANT(Nippon Gene Co., Ltd 제)에 의해, 첨부 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 단리했다. 단리한 게놈 DNA를 Sau 3AI에 의해 부분 분해한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 15~20kb의 DNA단편을 회수하고, 이 것을 알카리 포스파타제로 처리하여, DNA단편의 말단을 탈인산화했다. 이 DNA단편을 파아지 벡터의 Lambda DASHⅡ(Stratagene Co. 제)에 삽입했다. 이와 같이해서 얻어진 재조합 파아지 벡터에 대해서, GigapackⅢ Gold Packaging Extract(Stratagene Co. 제)에 의해 첨부 프로토콜에 따라서 인 비트로 팩케이징(in vitro packaging)을 행했다. 그 후, 이 재조합 파아지를 대장균 XL1-Blue MRA(P2)주에 감염시켜, 플레이트에서 배양하여 플라크를 형성시켰다.
2. 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 부분 DNA단편의 단리
공지의 펩티드 합성효소의 멀티플 얼라이먼트를 행하여, 양호하게 보존된 영역으로서, WTSMYDG(SEQ ID No. 3)와 VVQYFPT(SEQ ID No. 4)를 발견했다. 이들의 배열을 기초로 하여, 5'-TGGACIWSNATGTAYGAYGG-3'(SEQ ID No. 5) 및 5'-GTIGGRAARTAY TGIACNAC-3'(SEQ ID No. 6)의 프라이머를 합성했다. 이들의 프라이머를 사용하여, PF 1022물질 생산균에서 단리한 게놈 DNA를 주형으로해서 PCR를 행했다. PCR는, 50㎕의 반응액 중, 게놈 DNA 50ng을 주형으로 하고, 1.25unit의 ExTaq DNA 폴리머라제(寶酒造社제), 첨부 완충액(buffer) 및 dNTP 혼합물, 및 10uM의 프라이머를 사용하여, 이하의 조건으로 반응을 행했다. 94℃에서 3분간, [94℃ 1분간, 65℃(1 사이클마다 0.5℃내리다) 1분간, 72℃ 1분간] x 30회, 72℃ 3분간. 이 반응에 의해, 약 350bp의 DNA 단편을 증폭하고, 이 DNA단편을 Original TA Cloning Kit (Invitrogene 제)를 사용하고, 첨부 프로토콜에 따라서 pCR2.1 플라스미드 벡터에 삽입했다.
이와 같이해서 클로닝한 DNA단편의 염기서열의 결정은, DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems 제)와 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems 제)를 사용해서, 첨부 프로토콜에 따라서 행했다. 그 결과, 단리한 DNA단편의 염기서열은 펩티드 합성효소 유전자와 상동성을 나타내며, 목적으로 하는 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 일부인 것이 명확해졌다.
3. 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자 전역(全域)의 클로닝
게놈 라이브러리의 스크리닝에 사용한 프로브는 PCR에 의해 플루오레스세인(fluorescein)표지 dUTP를 DNA단편에 혼입시켜서 조제했다. PCR는 50㎕의 반응액 중, 100ng의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자 DNA단편이 삽입된 pCR2.1 플라스미드 벡터를 주형으로 하고, 1.25유니트의 ExTaq DNA 폴리머라제(寶酒造社제) 및 첨부 완충액, 0.2mM dATP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dGTP, 0.02mM dTTP, 0.18mM 플루오레스세인 표지 dUTP(FluoroGreen, Amersham Pharmacia Biotech 제) 및 10㎛의 프라이머(SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6)를 사용하여, 이하의 조건에서 반응을 행했다. 94℃ 2분간, (94℃ 30초간, 55℃ 1분간, 72℃ 1분간) x 25회, 72℃ 3분간. 이 반응에 의해, 약 350bp의 플루오레스세인 표지 프로브가 제작되었다.
실시예 1의 1에서 제작한 플라크의 형성된 플레이트 상에, Hybond-N+멤브레인 (Amersham Pharmacia Biotech 제)을 넣고, 플라크를 부착시켰다. 이 멤브레인을 알카리로 처리하고, 멤브레인상의 재조합 파아지 DNA를 단일가닥으로 변성하여 멤브레인에 흡착시켰다. 파아지 DNA을 흡착한 멤브레인을, 혼성화 완충액 Tablets (Amersham Pharmacia Biotech 제)를 사용해서 조제한 완충액에 넣은 후, 60℃에서 1시간 동안 배양했다. 여기에, 상기 플루오레스세인으로 표지된 프로브를 열변성하여 첨가하고, 60℃에서 하룻밤 동안 혼성화를 행했다. 그 후, 멤브레인을 1 x SSC(SSC: 15mM 구연산3나트륨, 150mM 염화나트륨)-0.1% SDS용액 중에서 60℃, 15분간 세정하고, 또한, 0.2 x SSC-0.1% SDS용액 중에서 60℃, 15분간 세정했다. 프루오레스세인이 결합한 플라크의 가시화는, DIG세정 블록 완충액 셋트(Boehringer-Manheim 제), 알카리 포스파타제로 표지된 항플루오레스세인 항체 (Anti-fluorescein-AP, Fab fragment, Boehringer-Manheim 제), 발색기질로서 니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(Boehringer-Manheim 제) 및 X-포스페이트(Boehringer-Manheim 제)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라서 행했다. 이와 같이해서 프로브에 상동(相同)한 영역의 5'-상류역 및 3'-하류역을 함유하는 클론을 선발했다.
4. 염기서열의 결정
이와 같이해서 단리된 양성 클론 중의 DNA단편을, 파아지 벡터의 서열인 5'-GCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACGAA-3'(SEQ ID No. 7) 및 5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCG AAGAA-3'(SEQ ID No. 8)을 프라이머로서 사용하여, PCR에 의해 증폭했다. PCR는 50㎕의 반응액 중, 양성 클론 DNA 100ng에 의해 주형으로 하고, 2.5 유니트의 LA Taq DNA 폴리머라제(寶酒造社제), 첨부 완충액 및 dNTP 혼합물, 2.5mM 염화마그네슘, 및 0.2uM의 프라이머를 사용하여, 이하의 조건에서 반응을 행했다. 94℃ 1분간, (98℃ 10초간, 68℃ 15분간) x 25회, 72℃ 15분간, 얻어진 PCR 산물을 정제한 후, 분무기(nebulizer)로 처리하고, 임의로(randomly) 0.5kb~2.0kb로 분해했다. 이 단편의 말단을 T4 DNA 폴리어라제로 평활화하고, T4 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 인산화한 후, pT7Blue(Novagen 제)의 EcoRV 부위에 삽입하고, 대장균 JM 109주에 도입했다. 이와 같이해서 얻어진 168개의 콜로니를 M13 프라이머 M4(寶酒造社제) 및 M13 프라이머 RV(寶酒造社제)를 사용해서 직접 PCR 하고, 이 것을 정제한 후, M13 Primer M4(寶酒造社제)를 프라이머로 해서 시퀀스를 행했다. PCR는 50㎕의 반응액 중, 1.25유니트의 ExTaq DNA 폴리머라제(寶酒造社제), 첨부 완충액 및 dNTP Mixture, 및 0.5㎛의 프라이머를 사용하고, 이하의 조건에서 반응을 행했다. 94℃ 4분간, (94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 2분간) x 30회, 72℃ 3분간. 또 시퀀스는 DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems 제)과 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems제)를 사용해서, 첨부 프로토콜에 따라서 행했다.
얻어진 결과로부터, 해석이 불충분한 영역에 대해서는 프라이머를 해석을 마친 염기서열을 기초로 새로이 설계해서 PCR에 의해 증폭하고, 이 것을 정제한 후, PCR에 사용한 프라이머를 사용해서 시퀀싱을 행했다. 이것에 의해, 양성 클론 중의 DNA단편 15606bp의 염기서열을 결정했다.
이 서열을 해석한 결과 9633bp로부터 되는 개방형 해독틀(ORF)이 존재하고, 이 서열에서 예측되는 단백질은 3210 아미노산 잔기, 354kDa이고, 펩티드 합성효소와 상동성을 나타내는 것이 명확해졌다. 또, 가장 높은 상동성을 나타낸 단백질은 에니아틴 합성효소(S39842)이고, 그의 상동성은 56%이였다. 이와 같이 단리한 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 ORF의 염기서열을 서열표의 SEQ ID No. 1에, 또 그의 아미노산서열을 SEQ ID No. 2에 나타냈다.
실시예 2. 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 과잉 발현에 의한 PF 1022 생산성의 향상
1. 유전자 발현용의 재조합 벡터의 구축(도 1)
(1) 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자 영역의 클로닝
실시예 1의 3에서 얻어진 양성 클론으로부터, 삽입된 DNA단편을 NotI에 의해 끊어내어, pBluescriptⅡ KS+(Stratagene Co. 제)의 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드 pPF7을 제작했다. pPF7을 BanⅢ 및 SmaI에 의해 절단한 후, 아가로스겔 전기영동하여, 약 8250bp의 DNA단편을 아가로스겔로부터 회수했다. 이 단편을 pBluescriptⅡ KS+에 삽입하여, 플라스미드 pPF7-1를 제작했다.
pPF7을 주형으로 하고, N말단 부근에서 BanⅢ부위까지의 약 440bp(SEQ ID No. 9 및 SEQ ID No. 10을 사용) 또는 약 470bp (SEQ ID No. 11 및 SEQ ID No. 10을 사용)를 증폭하기 위한 프라이머로서, 5'-AGCATCGGATCCTAACAATGGGCGTTGAGCAGCAAGCCCTA-3'(SEQ ID No. 9, ORF의 N말단에서 10번째의 Met로부터 번역개시하도록 설계) 또는 5'-AGCATCGGATCCTAACAATGTCAAACATGGCACCACTCCCTA-3' (SEQ ID No. 11, ORF의 N말단에서 1번째의 Met로부터 번역개시하도록 설계), 및 5'-TTTGCTTCGTACTCGGGTCCT-3' (SEQ ID No. 10)을 사용하고, 또, SmaI부위로부터 C말단까지의 약 920bp를 증폭하기 위한 프라이머로서, 5'-GCATCGCGATACTAGAGAAG-3' (SEQ ID No. 12) 및 5'-AGCATCGAATTCGGATCC CTAAACCAACGCCAAAGCCCGAAT-3' (SEQ ID No. 13)를 사용해서 PCR를 행했다.
이 때, 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 5'측 및 3'측에, BamHI부위를 도입하도록 프라이머의 설계를 행했다. PCR는 50㎕의 반응액 중, 150ng의 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 2.5유니트의 KOD DNA 폴리머라제(동양방적사제), 첨부 완충액 및 dNTP Mixture, 1mM 염화마그네슘, 및 0.5uM의 프라이머를 사용하여, 이하의 조건에서 반응을 행했다. 98℃ 30초간, (98℃ 15초간, 65℃ 2초간, 74℃ 30초간) x 10회, 74℃ 1분간, 각 프라이머를 사용해서 얻어진 PCR반응액을 에탄올로 침전시켜 PCR산물을 회수했다. N말단 영역에 관해서는, BamHI 및 BanⅢ에 의해 또, C말단 영역에 관해서는 SmaI 및 BamHI에 의해 절단한 후, 아가로스겔 전기영동하여 DNA단편을 아가로스겔에서 회수했다.
pPF7-1의 SmaI, BamHI 부위에 상기 C말단영역 PCR단편을 삽입하여 플라스미드 pPF7-2를 제작했다. 이 플라스미드를 BanⅢ 및 BamHI로 절단한 후, 아가로스겔 전기영동하여, 약 9170 bp의 DNA단편을 아가로스겔에서 회수했다. 이 DNA단편 및 SEQ ID No. 9 및 SEQ ID No. 10을 사용해서 제작한 N말단영역을 동시에, pBluescriptⅡ KS+의 BamHI 부위에 삽입함으로써, 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자를 재구축하여 플라스미드 pPFsyn (ORF의 N말단에서 10번째의 Met로부터 번역개시)을 제작했다.
한편, pPF7-2에서 끊어 낸 약 9170 bp의 DNA단편 및 SEQ ID No. 9 및 SEQ ID No. 11을 사용해서 제작한 N말단영역을 동시에, pHSG299(寶酒造社제)의 BamHI부위에 삽입함으로써, 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자를 재구축하여, 플라스미드 pPFsynN(ORF의 N말단에서 1번째의 Met로부터 번역개시)를 제작했다. 이와 같이해서 양말단에 BamHI 부위를 갖는 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자를 제조했다.
pPFsyn 또는 pPFsynN을 BamHI로 절단한 후, 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자 영역을 각각 겔로부터 회수했다.
(2) Abp1 유전자의 발현 제어 영역을 사용한 발현 벡터의 구축
PF 1022물질 생산균의 게놈 DNA의 단리
PF 1022물질 생산균(FERM BP-2671)의 게놈 DNA의 단리는 (H. Horiuchi et. al., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988))에 기재된 방법에 따랐다. 구체적으로는 우선 PF 1022균주(FERM BF-2671)를 종배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤 0.5%, 소맥배아 0.6%, 효모엑스 0.3%, 대두박 0.2%, 및 탄산칼슘 0.2%; 살균전 pH7.0 ; WO97/00944호, 실시예 1 참조)로 2일간 배양하고, 원심분리 (3500rpm, 10분)에 의해서 균체를 회수했다. 이어서 얻어진 균체를 동결건조 후, TE에 현탁하고, 3% SDS용액 중에서 60℃, 30분간 처리 후, TE 포화 페놀추출에 의해 균체잔사를 제거했다. 추출액은 에탄올 침전화 후, 리보뉴클레아제 A (Sigma사제) 및 프로테이나제 K(和光純藥社제)처리하고, 또한 12% 폴리에틸렌글리콜 6000에 의해 핵산을 침전화시켰다. 이것을 TE 포화 페놀추출, 에탄올 침전화를 행하고, 이 침전을 TE에 용해하여, 이것을 게놈 DNA로 했다.
PF 1022물질 생산균의 게놈 라이브러리의 제작
상기와 같이 조제한 PF 1022물질 생산균 유래 게놈 DNA를 Sau 3AI에 의해 부분소화했다. 이것을 파아지 벡터, λEMBL3 클로닝 킷트(Stratagene Co.제)의 BamHI 아암에 T4 리가제(寶酒造社제 Ligation Kit Ver.2)를 사용해서 연결시켰다. 이것을 에탄올로 침전시킨 후, TE에 용해했다. 연결 혼합물의 전량을 GigapackⅢ Plus Packaging Kit(Stratagene Co.제)를 사용해서 대장균 LE392주에 감염시켜 파아지 플라크를 형성했다. 이 방법에 의해 얻어진 1.3 x 104개 (2.6 x 104PFU/㎖)의 파아지 라이브러리를 사용해서 Abp1 유전자의 클로닝을 행했다.
PF 1022물질 생산균 유래의 게놈 DNA로부터의 Abp1 유전자 클로닝
프로브는 Abp1 유전자의 번역영역을 PCR법에 의해 증폭하여 사용했다. 상기한 바와 같이, PF 1022물질 생산균에서 조제한 게놈 DNA를 주형에, 8-73U 및 8-73R로 되는 합성 프라이머를 사용해서, LETS GO PCR 키트(SAWADY Technology 제)에 따라 PCR를 행했다. PCR의 반응조건은 94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 72℃ 90초간의 스텝을 25회 반복해서 증폭을 행했다. 이하에 8-73U 및 8-73R의 DNA서열을 나타냈다.
8-73U: CTCAAACCAGGAACTCTTTC (SEQ ID No. 14)
8-73R: GACATGTGGAAACCACATTTTG (SEQ ID No. 15)
이와 같이해서 얻어진 PCR산물은 ECL 다이렉트 시스템(Amersham Pharmacia Biotech 제)을 사용해서 표지화했다. 상기와 같이 작성한 파아지 플라크를, 하이본드N+나일론 트랜스퍼 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech 제)에 전사하고, 알카리 변성 후, 5배 농도 SSC(SSC: 15mM 구연산3나트륨, 150mM 염화나트륨)로 세정하고 건조시켜 DNA를 고정했다. 킷트에 기재된 방법에 따라서, 1시간의 예비혼성화(42℃) 후, 먼저 표지화한 프로브를 첨가하고, 16시간(42℃) 동안 혼성화를 행했다. 프로브의 세정은 상기 킷트에 기재된 방법에 따랐다. 프로브의 세정을 행한 나일론막은 검출용액에 1분간 침지한 후, 메디칼X선 필름(富士寫眞フイルム社제)에 감광시켜 1개의 양성 클론을 얻었다. 이 클론은 서던분석 결과, 적어도 6kb의 HindⅢ 단편이 게놈 DNA의 제한효소단편 길이와 일치했다. 이 HindⅢ 단편의 제한효소 지도를 도 2에 나타냈다. HindⅢ 단편은 pUC119에 서브클로닝하고(pRQHin/119), 이하의 실험에 제공했다.
발현 벡터의 구축
pRQHin/119를 주형에 Abp1 유전자의 프로모터 영역 및 터미네이터 영역을 PCR법을 사용해서 증폭했다. 프로모터의 증폭은 ABP-Neco 및 ABP-Nbam, 한편, 터미네이터의 증폭은 ABP-Cbam 및 ABP-Cxba로 되는 프라이머를 사용하여, PCR Super Mix High Fidelity(Lifetech Oriental Co., Ltd. 제)에 의해 PCR법을 행했다. 반응조건은 94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 72℃ 90초간의 스텝을 25회 반복해서 증폭시켰다. 이하에, ABP-Neco, ABP-Nbam, ABP-Cbam 및 ABP-Cxba의 DNA서열을 나타냈다.
ABP-Neco: GGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC (SEQ ID No. 16)
ABP-Nbam: GGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG (SEQ ID No. 17)
ABP-Cbam: GGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC (SEQ ID No. 18)
ABP-Cxba: GGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG (SEQ ID No. 19)
각 PC산물은 마이크로스핀 S-400칼럼(Amersham Pharmacia Biotech 제)로 정제하고, 에탄올로 침전화 후 프로모터는 EcoRI 및 BamHI, 터미네이터는 BamHI 및 XbaI로 소화하여, 동일한 효소로 소화한 pBluescriptⅡ KS+에 순차 연결했다. 이 것을 XbaI로 소화하고, pMKD01 (WO98/03667호) 유래 데스토마이신 내성 카셋트를 삽입하여 pABPd를 구축했다(도 3). pABPd는 Abp1 유전자의 프로모터 및 터미네이터를 갖는다.
상기와 같이 겔로부터 회수한 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자 영역을 pABPd의 BamHI 부위에 삽입하고, 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자를 발현시키기 위하여 발현 벡터인 pABP/PFsyn(ORF의 N말단에서 10번째의 Met로부터 번역개시) 및 pABP/PFsynN(ORF의 N말단 1번째의 Met에서 번역개시)를 제작했다.
2. PF 1022물질 생산균으로의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 도입과 발현
PF 1022균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)로의 발현 벡터의 도입은 WO 97/00944호에 기재된 실시예 1의 방법에 따라서 행하여 하이그로마이신B에 대한 내성도가 높은 균주를 선발했다. 이들 균주에 있어서 목적 유전자의 도입의 확인은, Abp1 프로모터의 서열에서 제작한 프라이머, 5'-TGATATGCTGGAGCTTCCCT-3' (SEQ ID No. 20) 및 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자의 서열에서 제작한 프라이머, 5'-GCACAACCTCTTTCCAGGCT-3' (SEQ ID No. 21)을 사용한 PCR에 의해 행했다. 이와 같이해서 하이그로마이신 B에 대한 내성도가 높은 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소 유전자가 도입된 유전자 도입주를 선발했다.
종배지 50㎖에서 유전자도입주 및 친주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)을 각각 따로 따로 26℃에서 2일간 배양한 후, 각각의 배양액 1㎖를 50㎖의 각각의 생산배지 [6% 물엿, 2.6% 전분, 2% 소맥배아, 1% 파아마 메디아, 0.2% 황산마그네슘 7 수화물, 0.2% 탄산칼슘, 0.3% 염화나트륨, (pH7.5)]에 접종하여, 26℃에서 4일간 배양했다. 배양액을 4500rpm으로 5분간 원심분리해서 집균(集菌)하여, 얻어진 각각의 균체를 0.3M 염화나트륨으로 세정했다. 각각의 균체를 액체 질소에 의해 동결시킨 후, 동결건조를 행했다.
이하에 나타낸 추출조작은 빙상, 또는 4℃의 저온실에서 실시했다. 동결건조한 균체 10㎎ 및 1.0㎖의 유리 비드(지름 0.5㎜)를 넣은 2㎖의 마이크로 튜브에, 1.0㎖의 추출 완충액[50mM 트리스-염산(pH8.0), 0.3M 염화칼륨, 60% 글리세롤, 10mM 에틸렌디아민4아세트산2나트륨, 5mM 디티오트레이톨, 10uM 로이펩틴, 1mM 페닐메탄술폰산, 60㎍/㎖ 키모스타틴]를 첨가했다. 이 마이크로 튜브를 Mini-Bead-Beater-8(Biospect 제)에 셋트하여, 최고속도로 3분간 운전해서 추출을 행했다. 이 것을 15000rpm으로 5분간 원심분리한 후, 상징액 100㎕를 10% 트리클로로아세트산 용액 100㎕ 중에 넣고 혼합했다. 이 혼합물을 15분간 방치한 후, 15000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 침전을, 알카리 용액 15㎕(2% 탄산나트륨, 0.4% 수산화나트륨)에 용해시키고, 샘플 완충액[125mM 트리스-염산 (pH6.8), 20% 글리세롤, 4% 도데실황산나트륨, 10% 2-머캅토에탄올, 50㎎/ℓ브롬페놀블루] 60㎕를 첨가했다. 이것을 끊는 물 중에서 5분간 가열한 후, 전기영동시스템(Defco사제)에 의해, 4~20%의 폴리아크릴아미드 겔을 사용해서 전기영동[Sodium Dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)]을 행했다. 전기영동 후, 폴리아크릴아미드 겔은 Quick-CBB(和光純藥社제)를 사용하여, 첨부 프로토콜에 따라 염색했다. 친주 및 pABP/PFsyn을 도입한 유전자 도입주에서 추출한 단백질의 전기영동의 결과를 도 4에 나타냈다. 또한 친주 및 pABP/PFsynN을 도입한 유전자 도입주로부터 추출한 단백질의 전기영동의 결과를 도 5에 나타냈다.
이와 같이 유전자 도입주의 환상 뎁시펩티드 합성효소의 발현량은 친주에 비해 현저히 높았다.
3. PF 1022물질의 추출과 정량
종배지 50㎖에서 유전자 도입주 및 친주를 각각 따로 따로 26℃에서 2일간 배양한 후, 각각의 배양액 1㎖를 각각의 생산배지 50㎖에 접종하여 26℃에서 6일간 배양했다. 각각의 배양액으로부터 10㎖분을 채취하여 3000rpm으로 10분간 원심분리하여 따로 따로 집균했다. 각각의 균체에 10㎖의 메탄올을 첨가해서 심하게 진탕한 후, 30분간 정치했다. 그 후, 다시 진탕하고 3000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상징액 중의 각각의 균체로부터 추출한 PF 1022물질을 액체 크로마토그라피에 의해 각각 정량했다. 칼럼으로서는, LiChrospher 100 RP-18(e)(關東化學社제)를 사용하고, 칼럼온도는 40℃, 이동상은 80% 아세토니트릴, 유속은 1.0㎖/분으로 해서, 210nm의 흡수에 의해 PF 1022물질을 검출했다. 이 조건에 있어서, PF 1022물질의 유지시간은 5~6분간 이였다. 실험은 2회 반복으로 행하여, 친주 및 pABP/PFsyn을 도입한 유전자 도입주로부터 추출한 PF 1022물질의 정량 결과의 평균치를 표 1에 나타냈다.
표 1
PF 1022물질 (㎍/㎖)
친주 88
유전자 도입주 222
유전자 도입주는 친주의 약 2.5배의 PF 1022물질의 생산성을 나타냈다. 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소를 과잉발현시킴으로써, PF 1022물질의 생산성이 높아지는 것이 명백해 졌다.
또, 친주 및 pABP/PFsynN을 도입한 유전자 도입주에서 추출한 PF 1022물질의 정량 결과의 평균치를 표 2에 나타냈다.
표 2
PF 1022물질 (㎍/㎖)
친주 29
유전자 도입주1 123
유전자 도입주2 136
유전자 도입주3 172
유전자 도입주는 친주의 4.3~6.0배의 PF 1022물질의 생산성을 나타냈다. 본 발명의 환상 뎁시펩티드 합성효소를 과잉 발현시킴으로써, PF 1022물질의 생산성이 높아지는 것이 명백해졌다.
SEQUENCE LISTING
<110> Meiji Seika Kaisha, Ltd.
<120> Cyclic depsipeptide synthetase and its gene and mass production system of cyclic depsipeptide
<130> 127184
<150> JP 253040/1999
<151> 1999-09-07
<150> JP 104291/2000
<151> 2000-04-06
<160> 21
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 9633
<212> DNA
<213> Mycelia sterilia
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(9633)
<223> peptide synthetase for PF1022
<220>
<221> mat_peptide
<222> (13)..(9630)
<400> 1
atg tca aac atg gca cca ctc cct acg atg ggc gtt gag cag caa gcc 48
Met Ser Asn Met Ala Pro Leu Pro Thr Met Gly Val Glu Gln Gln Ala
-1 1 5 10
cta tca ctt tca tgc ccc tta ctc cct cat gac gat gag aaa cac tca 96
Leu Ser Leu Ser Cys Pro Leu Leu Pro His Asp Asp Glu Lys His Ser
15 20 25
gac aac ctt tac gag caa gca act cgg cac ttc ggc ttg agc cga gac 144
Asp Asn Leu Tyr Glu Gln Ala Thr Arg His Phe Gly Leu Ser Arg Asp
30 35 40
aag atc gaa aat gtc tta cca tgt act tcc ttt caa tgt gat gtc ata 192
Lys Ile Glu Asn Val Leu Pro Cys Thr Ser Phe Gln Cys Asp Val Ile
45 50 55 60
gat tgc gcc gtc gac gat cgg cgg cat gct atc ggt cac gtc gtc tat 240
Asp Cys Ala Val Asp Asp Arg Arg His Ala Ile Gly His Val Val Tyr
65 70 75
gat atc ccc aat aca gtg gac atc cag cgt tta gcc gca gcc tgg aaa 288
Asp Ile Pro Asn Thr Val Asp Ile Gln Arg Leu Ala Ala Ala Trp Lys
80 85 90
gag gtt gtg cgg cag aca cca atc ttg agg acc ggc atc ttt aca tca 336
Glu Val Val Arg Gln Thr Pro Ile Leu Arg Thr Gly Ile Phe Thr Ser
95 100 105
gaa acc ggc gac tct ttt cag atc gtc ttg aaa gaa ggc tgc cta ccg 384
Glu Thr Gly Asp Ser Phe Gln Ile Val Leu Lys Glu Gly Cys Leu Pro
110 115 120
tgg atg tac gcg aca tgt ctc ggc atg aag ggg gca gtg ata caa gat 432
Trp Met Tyr Ala Thr Cys Leu Gly Met Lys Gly Ala Val Ile Gln Asp
125 130 135 140
gaa gca gtc gcc gct atg act gga ccg cgt tgc aat cga tat gtc gtc 480
Glu Ala Val Ala Ala Met Thr Gly Pro Arg Cys Asn Arg Tyr Val Val
145 150 155
ctg gag gac ccg agt acg aag caa agg ctg ctc atc tgg aca ttc agc 528
Leu Glu Asp Pro Ser Thr Lys Gln Arg Leu Leu Ile Trp Thr Phe Ser
160 165 170
cat gct tta gtg gat tat aca gtc cag gaa cgc atc ctt cag cgg gtt 576
His Ala Leu Val Asp Tyr Thr Val Gln Glu Arg Ile Leu Gln Arg Val
175 180 185
ctc aca gta tac gac ggc cgg gac gtc gag tgc cct cgc atc aag gat 624
Leu Thr Val Tyr Asp Gly Arg Asp Val Glu Cys Pro Arg Ile Lys Asp
190 195 200
aca gaa cat gtc tct cgg ttt tgg caa caa cac ttt gaa ggc tta gat 672
Thr Glu His Val Ser Arg Phe Trp Gln Gln His Phe Glu Gly Leu Asp
205 210 215 220
gcc tcc gta ttt ccc ctt cta cca tct cac cta act gtg tgc aat ccc 720
Ala Ser Val Phe Pro Leu Leu Pro Ser His Leu Thr Val Cys Asn Pro
225 230 235
aat gcg cgc gca gaa cat cat atc tca tac acg gga cca gtc cag agg 768
Asn Ala Arg Ala Glu His His Ile Ser Tyr Thr Gly Pro Val Gln Arg
240 245 250
aag tgg tcc cat aca agt atc tgt cgg gct gca ctc gca gtt ctt cta 816
Lys Trp Ser His Thr Ser Ile Cys Arg Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu
255 260 265
tct cgc ttt aca cac tct tcg gag gcc ctc ttc ggt gtt gtg aca gaa 864
Ser Arg Phe Thr His Ser Ser Glu Ala Leu Phe Gly Val Val Thr Glu
270 275 280
caa tct cac aac tcc gag gac caa aga cgg tca att gat ggc ccc gca 912
Gln Ser His Asn Ser Glu Asp Gln Arg Arg Ser Ile Asp Gly Pro Ala
285 290 295 300
agg aca gta gtg cct atc cgc gtc ctt tgt gcc cca gat caa tat gtg 960
Arg Thr Val Val Pro Ile Arg Val Leu Cys Ala Pro Asp Gln Tyr Val
305 310 315
tcg gat gtc att ggg gca atc acc gca cac gaa cac gcc atg cgc ggg 1008
Ser Asp Val Ile Gly Ala Ile Thr Ala His Glu His Ala Met Arg Gly
320 325 330
ttt gag cac gct gga ctt cgc aat atc cgc cgt acc gga gac gac ggg 1056
Phe Glu His Ala Gly Leu Arg Asn Ile Arg Arg Thr Gly Asp Asp Gly
335 340 345
tct gct gct tgt gga ttc cag acc gtg cta ctg gtg act gac ggt gat 1104
Ser Ala Ala Cys Gly Phe Gln Thr Val Leu Leu Val Thr Asp Gly Asp
350 355 360
gct ccc aag acc cct ggg agt gta ctt cat cga agt gta gaa gaa tcg 1152
Ala Pro Lys Thr Pro Gly Ser Val Leu His Arg Ser Val Glu Glu Ser
365 370 375 380
gat aga ttc atg ccc tgc gct aat cgt gcc ctt ctg ctc gac tgc cag 1200
Asp Arg Phe Met Pro Cys Ala Asn Arg Ala Leu Leu Leu Asp Cys Gln
385 390 395
atg gct ggc aac tcg gca tcc cta gtc gca cga tat gat cat aat gtg 1248
Met Ala Gly Asn Ser Ala Ser Leu Val Ala Arg Tyr Asp His Asn Val
400 405 410
atc gac cca cgc cag atg tct cgc ttc ctg cga cag cta gga tac ctg 1296
Ile Asp Pro Arg Gln Met Ser Arg Phe Leu Arg Gln Leu Gly Tyr Leu
415 420 425
atc caa caa ttt cat cat cac gtc gat ctg cct ctg gtc aaa gaa ctg 1344
Ile Gln Gln Phe His His His Val Asp Leu Pro Leu Val Lys Glu Leu
430 435 440
gac gtc gtg acg gcg gag gat tgt gcg gaa atc gag aaa tgg aat tca 1392
Asp Val Val Thr Ala Glu Asp Cys Ala Glu Ile Glu Lys Trp Asn Ser
445 450 455 460
gaa cgc cta aca atg caa gac gcc tta atc cac gac acc ata tcc aag 1440
Glu Arg Leu Thr Met Gln Asp Ala Leu Ile His Asp Thr Ile Ser Lys
465 470 475
tgg gct gct ggc gat ccc aac aaa gct gca gtt ttc gct tgg gat ggg 1488
Trp Ala Ala Gly Asp Pro Asn Lys Ala Ala Val Phe Ala Trp Asp Gly
480 485 490
gaa tgg aca tac gcc gag cta gac aac ata tcc tcc cgt ctc gcc gtg 1536
Glu Trp Thr Tyr Ala Glu Leu Asp Asn Ile Ser Ser Arg Leu Ala Val
495 500 505
tat atc caa tcc ctg gac ttg aga cca gga caa gca ata ctc cca ctc 1584
Tyr Ile Gln Ser Leu Asp Leu Arg Pro Gly Gln Ala Ile Leu Pro Leu
510 515 520
tgc ttc gag aag tca aaa tgg gtc gtc gcc aca att ctc gcc gtc ctc 1632
Cys Phe Glu Lys Ser Lys Trp Val Val Ala Thr Ile Leu Ala Val Leu
525 530 535 540
aaa gtc ggt cgg gca ttc aca ctc atc gac ccg tgc gac ccc tcg gca 1680
Lys Val Gly Arg Ala Phe Thr Leu Ile Asp Pro Cys Asp Pro Ser Ala
545 550 555
agg atg gcc cag gtc tgt cag cag acc tcc gcc aca gtc gct ctc acc 1728
Arg Met Ala Gln Val Cys Gln Gln Thr Ser Ala Thr Val Ala Leu Thr
560 565 570
tcc aaa ctc cac aac acc acc tta cgt tcc gtc gtt tcc cgc tgc att 1776
Ser Lys Leu His Asn Thr Thr Leu Arg Ser Val Val Ser Arg Cys Ile
575 580 585
gtg gtc gac gac gac ctc ctt cgg tcc tta ccc cac gcc gat ggc cgc 1824
Val Val Asp Asp Asp Leu Leu Arg Ser Leu Pro His Ala Asp Gly Arg
590 595 600
tta aag gcc acc gtg aag cca cag gac ttg gcc tat gtt att ttc aca 1872
Leu Lys Ala Thr Val Lys Pro Gln Asp Leu Ala Tyr Val Ile Phe Thr
605 610 615 620
tct ggc agc aca gga gag ccg aaa ggc atc atg atc gaa cat cgg ggg 1920
Ser Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Gly Ile Met Ile Glu His Arg Gly
625 630 635
ttc gtg tcg tgt gct atg aaa ttt ggc ccc gcg ctc gga atg gat gag 1968
Phe Val Ser Cys Ala Met Lys Phe Gly Pro Ala Leu Gly Met Asp Glu
640 645 650
cac acg cgc gct ctt caa ttc gcc tca tat gcg ttt ggc gct tgt ctg 2016
His Thr Arg Ala Leu Gln Phe Ala Ser Tyr Ala Phe Gly Ala Cys Leu
655 660 665
gta gaa gtt gtg aca gct ctg atg cac ggc ggc tgc gtc tgc atc cct 2064
Val Glu Val Val Thr Ala Leu Met His Gly Gly Cys Val Cys Ile Pro
670 675 680
tcc gat gac gat cgc ttg aac aat gta ccg gag ttc atc aaa agg gcc 2112
Ser Asp Asp Asp Arg Leu Asn Asn Val Pro Glu Phe Ile Lys Arg Ala
685 690 695 700
cag gtg aac tgg gtg ata ctc act ccg tcg tat atc ggg aca ttc cag 2160
Gln Val Asn Trp Val Ile Leu Thr Pro Ser Tyr Ile Gly Thr Phe Gln
705 710 715
ccg gaa gat gtc cct gga cta caa aca ctg gta ttg gtt gga gaa cct 2208
Pro Glu Asp Val Pro Gly Leu Gln Thr Leu Val Leu Val Gly Glu Pro
720 725 730
atc tca gcg tct att cgg gat acc tgg gcc tcc cag gtt cga ctc ctg 2256
Ile Ser Ala Ser Ile Arg Asp Thr Trp Ala Ser Gln Val Arg Leu Leu
735 740 745
aat gcc tac ggt cag agt gaa agc tca act atg tgc agc gtc acg gaa 2304
Asn Ala Tyr Gly Gln Ser Glu Ser Ser Thr Met Cys Ser Val Thr Glu
750 755 760
gtc agc ccg ctc tcc ctc gaa ccg aac aat atc ggt cgg gct gta ggc 2352
Val Ser Pro Leu Ser Leu Glu Pro Asn Asn Ile Gly Arg Ala Val Gly
765 770 775 780
gca cga tcc tgg atc att gat ccc gac gag cct gat cgt ctt gct cca 2400
Ala Arg Ser Trp Ile Ile Asp Pro Asp Glu Pro Asp Arg Leu Ala Pro
785 790 795
att ggc tgc att gga gag cta gtg atc gaa agt ccg ggc att gcg cgc 2448
Ile Gly Cys Ile Gly Glu Leu Val Ile Glu Ser Pro Gly Ile Ala Arg
800 805 810
gac tat atc atc gcg ccg ccg ccg gac aag tcc ccc ttt ctc cta gca 2496
Asp Tyr Ile Ile Ala Pro Pro Pro Asp Lys Ser Pro Phe Leu Leu Ala
815 820 825
ccc ccg gcc tgg tat cca gcc ggg aaa tta tcc aac gcc ttt aaa ttt 2544
Pro Pro Ala Trp Tyr Pro Ala Gly Lys Leu Ser Asn Ala Phe Lys Phe
830 835 840
tac aag act gga gat ctc gtg cgt tat gga cct gac ggc acc atc gtc 2592
Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Arg Tyr Gly Pro Asp Gly Thr Ile Val
845 850 855 860
tgc ctg gga cgc aaa gat tcg caa gtg aag atc cga ggg cag cgc gta 2640
Cys Leu Gly Arg Lys Asp Ser Gln Val Lys Ile Arg Gly Gln Arg Val
865 870 875
gag atc agc gca gtg gaa gcc agt cta cga cga caa cta cct agt gac 2688
Glu Ile Ser Ala Val Glu Ala Ser Leu Arg Arg Gln Leu Pro Ser Asp
880 885 890
atc atg ccc gtg gcc gaa gct atc aaa cgc tcg gat tcg tca ggc agc 2736
Ile Met Pro Val Ala Glu Ala Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ser Gly Ser
895 900 905
aca gtc ttg act gcc ttc ttg ata ggg tca tct aag agc gga gat ggt 2784
Thr Val Leu Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Gly
910 915 920
aat ggc cac gct tta tct gcg gca gac gcc gtt atc ttg gat cac ggt 2832
Asn Gly His Ala Leu Ser Ala Ala Asp Ala Val Ile Leu Asp His Gly
925 930 935 940
gct acc aac gag ata aac gcg aag ttg cag caa atc ctt ccc cag cat 2880
Ala Thr Asn Glu Ile Asn Ala Lys Leu Gln Gln Ile Leu Pro Gln His
945 950 955
tcc gtt cca tcc tat tat atc cac atg gaa aat ctt cct cga act gcc 2928
Ser Val Pro Ser Tyr Tyr Ile His Met Glu Asn Leu Pro Arg Thr Ala
960 965 970
acc ggc aaa gcg gac agg aaa atg ctt cga tct att gct agc aag cta 2976
Thr Gly Lys Ala Asp Arg Lys Met Leu Arg Ser Ile Ala Ser Lys Leu
975 980 985
ttg ggt gaa ttg tct cag aac gtg aca tct caa ccg att gag aag cac 3024
Leu Gly Glu Leu Ser Gln Asn Val Thr Ser Gln Pro Ile Glu Lys His
990 995 1000
gat gcc cca gca act ggt ata gag gtc aag ctg aag gag ctt tgg ttt 3072
Asp Ala Pro Ala Thr Gly Ile Glu Val Lys Leu Lys Glu Leu Trp Phe
1005 1010 1015 1020
ctg agc ttg aat ctt aat ccc aac tct caa gat gtc gga gcg agt ttc 3120
Leu Ser Leu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Gln Asp Val Gly Ala Ser Phe
1025 1030 1035
ttt gac tta ggc gga aat tcc att atc gcc atc aaa atg gta aac atg 3168
Phe Asp Leu Gly Gly Asn Ser Ile Ile Ala Ile Lys Met Val Asn Met
1040 1045 1050
gcg agg tca gct ggg ata gca ctg aag gta tcc gac ata ttc cag aat 3216
Ala Arg Ser Ala Gly Ile Ala Leu Lys Val Ser Asp Ile Phe Gln Asn
1055 1060 1065
ccc acg ctc gcc ggc ctt gtg gat gtc atc ggg cga gac ccg gct ccg 3264
Pro Thr Leu Ala Gly Leu Val Asp Val Ile Gly Arg Asp Pro Ala Pro
1070 1075 1080
tac aac ctc atc cca aca aca gca tac agc gga cct gtt gag cag tcg 3312
Tyr Asn Leu Ile Pro Thr Thr Ala Tyr Ser Gly Pro Val Glu Gln Ser
1085 1090 1095 1100
ttc gcc cag ggc cgt cta tgg ttc ttg gac cag atc gaa ctc gat gcg 3360
Phe Ala Gln Gly Arg Leu Trp Phe Leu Asp Gln Ile Glu Leu Asp Ala
1105 1110 1115
ttg tgg tac ctt cta cca tac gcc gtt cgc atg cgc ggg cca ttg cat 3408
Leu Trp Tyr Leu Leu Pro Tyr Ala Val Arg Met Arg Gly Pro Leu His
1120 1125 1130
att gat gcg ctc act att gcg ttg cta gct ata cag caa cga cat gaa 3456
Ile Asp Ala Leu Thr Ile Ala Leu Leu Ala Ile Gln Gln Arg His Glu
1135 1140 1145
acc ttg cgg aca acc ttt gag gag cag gac ggc gta ggc gtt cag gtt 3504
Thr Leu Arg Thr Thr Phe Glu Glu Gln Asp Gly Val Gly Val Gln Val
1150 1155 1160
gtc cat gcg agc ccc atc tcc gac ttg agg ata atc gac gta tca ggc 3552
Val His Ala Ser Pro Ile Ser Asp Leu Arg Ile Ile Asp Val Ser Gly
1165 1170 1175 1180
gac cga aac agt gac tac ctc cag ttg cta cac caa gag cag acg act 3600
Asp Arg Asn Ser Asp Tyr Leu Gln Leu Leu His Gln Glu Gln Thr Thr
1185 1190 1195
cca ttc att cta gca tgt cag gca gga tgg agg gta tca ctg att aga 3648
Pro Phe Ile Leu Ala Cys Gln Ala Gly Trp Arg Val Ser Leu Ile Arg
1200 1205 1210
cta gga gaa gat gat cac atc ctc tct atc gta atg cat cac atc atc 3696
Leu Gly Glu Asp Asp His Ile Leu Ser Ile Val Met His His Ile Ile
1215 1220 1225
tcc gac ggc tgg tct atc gac att cta cgc cgg gaa cta agc aat ttc 3744
Ser Asp Gly Trp Ser Ile Asp Ile Leu Arg Arg Glu Leu Ser Asn Phe
1230 1235 1240
tat tca gcc gct ctc cgg ggc tct gat cct cta tcg gtg gtg agc cca 3792
Tyr Ser Ala Ala Leu Arg Gly Ser Asp Pro Leu Ser Val Val Ser Pro
1245 1250 1255 1260
ctc cca ctc cac tac cgc gac ttt tcc gtt tgg caa aag cag gtc gaa 3840
Leu Pro Leu His Tyr Arg Asp Phe Ser Val Trp Gln Lys Gln Val Glu
1265 1270 1275
cag gag acc gaa cat gag cgg caa ctc gaa tac tgg gtc aag cag ctc 3888
Gln Glu Thr Glu His Glu Arg Gln Leu Glu Tyr Trp Val Lys Gln Leu
1280 1285 1290
gca gac agc tcg gcc gcc gaa ttc cta acc gac ttc ccc cga ccc aac 3936
Ala Asp Ser Ser Ala Ala Glu Phe Leu Thr Asp Phe Pro Arg Pro Asn
1295 1300 1305
ata ctg tcc ggt gaa gca ggt tcc gtg cca gtg acg atc gaa ggc gaa 3984
Ile Leu Ser Gly Glu Ala Gly Ser Val Pro Val Thr Ile Glu Gly Glu
1310 1315 1320
ctg tat gaa agg ctc caa gaa ttc tgt aaa gta gag caa atg acg cct 4032
Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Glu Phe Cys Lys Val Glu Gln Met Thr Pro
1325 1330 1335 1340
ttc gcc gtg ttg tta ggg gcc ttc cgc gcg acc cat tat cgt ctc acc 4080
Phe Ala Val Leu Leu Gly Ala Phe Arg Ala Thr His Tyr Arg Leu Thr
1345 1350 1355
ggc gcc gaa gac tcg atc atc ggc acg ccc atc gcg aac cgc aac cgc 4128
Gly Ala Glu Asp Ser Ile Ile Gly Thr Pro Ile Ala Asn Arg Asn Arg
1360 1365 1370
cag gag ctt gaa aac atg atc ggc ttc ttc gtc aac acc caa tgc atg 4176
Gln Glu Leu Glu Asn Met Ile Gly Phe Phe Val Asn Thr Gln Cys Met
1375 1380 1385
cga atc acg gtc gac ggc gac gac act ttt gaa agc ctg gtg cga caa 4224
Arg Ile Thr Val Asp Gly Asp Asp Thr Phe Glu Ser Leu Val Arg Gln
1390 1395 1400
gtt cgg acc acg gcg acg gcg gca ttc gag cac caa gac gtc ccc ttt 4272
Val Arg Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Glu His Gln Asp Val Pro Phe
1405 1410 1415 1420
gag cgc gtc gtg acg gca ctc ctt cca cgc tcg aga gac cta tcc cga 4320
Glu Arg Val Val Thr Ala Leu Leu Pro Arg Ser Arg Asp Leu Ser Arg
1425 1430 1435
aac cca cta gca cag ctc acc ttc gct ctt cat tct caa cag gac ctc 4368
Asn Pro Leu Ala Gln Leu Thr Phe Ala Leu His Ser Gln Gln Asp Leu
1440 1445 1450
ggc aag ttc gag ctg gag ggt ctc gta gcg gaa ccc gtc tcg aac aag 4416
Gly Lys Phe Glu Leu Glu Gly Leu Val Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys
1455 1460 1465
gta tac acc agg ttc gac gtg gag ttt cac ctg ttc caa gaa gcc gga 4464
Val Tyr Thr Arg Phe Asp Val Glu Phe His Leu Phe Gln Glu Ala Gly
1470 1475 1480
aga cta agc ggt aac gtg gca ttt gcg gca gat cta ttc aag cct gag 4512
Arg Leu Ser Gly Asn Val Ala Phe Ala Ala Asp Leu Phe Lys Pro Glu
1485 1490 1495 1500
acc att agc aat gta gtc gcc ata ttt ttc caa atc ctg cga caa ggc 4560
Thr Ile Ser Asn Val Val Ala Ile Phe Phe Gln Ile Leu Arg Gln Gly
1505 1510 1515
att cgc cag cct cgg act cca atc gct gtt ctc ccg ctt acc gat ggg 4608
Ile Arg Gln Pro Arg Thr Pro Ile Ala Val Leu Pro Leu Thr Asp Gly
1520 1525 1530
tta gcg gac ctt cgt gcc atg ggc ttg ctt gag atc gag aag gca gaa 4656
Leu Ala Asp Leu Arg Ala Met Gly Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala Glu
1535 1540 1545
tac ccg cgg gag tcg agc gtc gtc gac gtc ttc cgc aag cag gtg gcc 4704
Tyr Pro Arg Glu Ser Ser Val Val Asp Val Phe Arg Lys Gln Val Ala
1550 1555 1560
gct cac ccg cac gct ttt gcc gtt gtc gat tcg gca tcg cgc ctc aca 4752
Ala His Pro His Ala Phe Ala Val Val Asp Ser Ala Ser Arg Leu Thr
1565 1570 1575 1580
tat gct gat ctc gat cgt caa tcc gat caa ctc gcg acc tgg ctc ggt 4800
Tyr Ala Asp Leu Asp Arg Gln Ser Asp Gln Leu Ala Thr Trp Leu Gly
1585 1590 1595
cgg cgc aat atg acg gct gag acg ctg gtc ggg gtg tta gca ccg cgg 4848
Arg Arg Asn Met Thr Ala Glu Thr Leu Val Gly Val Leu Ala Pro Arg
1600 1605 1610
tca tgt caa aca gtt gtt gcc att tta ggt atc ctg aaa gcg aat ctc 4896
Ser Cys Gln Thr Val Val Ala Ile Leu Gly Ile Leu Lys Ala Asn Leu
1615 1620 1625
gca tat ctc ccg ctt gat gtg aat tgt cct acc gcc cgc ctg caa aca 4944
Ala Tyr Leu Pro Leu Asp Val Asn Cys Pro Thr Ala Arg Leu Gln Thr
1630 1635 1640
atc cta tct aca ttg aat cgg cac aag ttg gtc cta ctc ggc tct aac 4992
Ile Leu Ser Thr Leu Asn Arg His Lys Leu Val Leu Leu Gly Ser Asn
1645 1650 1655 1660
gca act act ccg gat gtc cag ata cct gat gta gag ctg gta cga atc 5040
Ala Thr Thr Pro Asp Val Gln Ile Pro Asp Val Glu Leu Val Arg Ile
1665 1670 1675
agc gat atc tta gat cgc ccc atc aat ggc cag gca aag cta aat ggt 5088
Ser Asp Ile Leu Asp Arg Pro Ile Asn Gly Gln Ala Lys Leu Asn Gly
1680 1685 1690
cat aca aaa tcg aat ggc tac tca aag cca aac ggc tat acg cat ctg 5136
His Thr Lys Ser Asn Gly Tyr Ser Lys Pro Asn Gly Tyr Thr His Leu
1695 1700 1705
aaa ggc tat tca aac cta aac ggt tat tca aaa caa aat ggt tat gca 5184
Lys Gly Tyr Ser Asn Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Gln Asn Gly Tyr Ala
1710 1715 1720
caa ctc aac ggc cat aga gag cgt aac aat tat tta gat cta aat ggg 5232
Gln Leu Asn Gly His Arg Glu Arg Asn Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Gly
1725 1730 1735 1740
cac tca ctg cta aat ggg aat tca gac atc acc aca tca ggg ccc tca 5280
His Ser Leu Leu Asn Gly Asn Ser Asp Ile Thr Thr Ser Gly Pro Ser
1745 1750 1755
gca aca agc ctt gcc tac gtg atc ttc aca tcc ggc tca acc gga aag 5328
Ala Thr Ser Leu Ala Tyr Val Ile Phe Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys
1760 1765 1770
ccc aaa gga gtc atg gtc gaa cac cgc agc atc atc cga ctt gca aag 5376
Pro Lys Gly Val Met Val Glu His Arg Ser Ile Ile Arg Leu Ala Lys
1775 1780 1785
aag aac aga atc ata tcc agg ttc cca tct gta gcc aag gta gct cac 5424
Lys Asn Arg Ile Ile Ser Arg Phe Pro Ser Val Ala Lys Val Ala His
1790 1795 1800
ctc tca aac atc gcc ttt gac gcc gcc act tgg gaa atg ttc gca gcc 5472
Leu Ser Asn Ile Ala Phe Asp Ala Ala Thr Trp Glu Met Phe Ala Ala
1805 1810 1815 1820
ctt cta aac ggc gga acg ctg gtc tgt atc gac tat atg acc acc ctg 5520
Leu Leu Asn Gly Gly Thr Leu Val Cys Ile Asp Tyr Met Thr Thr Leu
1825 1830 1835
gac agc aaa acg ctc gag gcc gcg ttt gca cga gaa caa atc aac gcc 5568
Asp Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ala Phe Ala Arg Glu Gln Ile Asn Ala
1840 1845 1850
gcg tta ctc acg ccc gct ttg ttg aag cag tgc cta gcc aac att ccc 5616
Ala Leu Leu Thr Pro Ala Leu Leu Lys Gln Cys Leu Ala Asn Ile Pro
1855 1860 1865
act acc cta ggc agg ctg agt gca ctc gtt att gga ggt gat agg ctt 5664
Thr Thr Leu Gly Arg Leu Ser Ala Leu Val Ile Gly Gly Asp Arg Leu
1870 1875 1880
gac ggc caa gac gcg atc gca gca cat gcg ctt gtc ggt gct ggc gtg 5712
Asp Gly Gln Asp Ala Ile Ala Ala His Ala Leu Val Gly Ala Gly Val
1885 1890 1895 1900
tat aat gcg tat ggc ccg acc gaa aac gga gtg atc agt acg att tat 5760
Tyr Asn Ala Tyr Gly Pro Thr Glu Asn Gly Val Ile Ser Thr Ile Tyr
1905 1910 1915
aat atc act aaa aac gac tcg ttc atc aac gga gtc ccc atc ggc tgt 5808
Asn Ile Thr Lys Asn Asp Ser Phe Ile Asn Gly Val Pro Ile Gly Cys
1920 1925 1930
gca atc agc aat tcc ggc gcc tac atc aca gac cca gac cag cag ctc 5856
Ala Ile Ser Asn Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Asp Pro Asp Gln Gln Leu
1935 1940 1945
gta cct cct ggc gtc atg ggt gaa ctc gtc gtt acc ggt gac ggg ctc 5904
Val Pro Pro Gly Val Met Gly Glu Leu Val Val Thr Gly Asp Gly Leu
1950 1955 1960
gcg cgg ggg tat aca gac cca gca cta gac gcg ggc cgc ttc gtc cag 5952
Ala Arg Gly Tyr Thr Asp Pro Ala Leu Asp Ala Gly Arg Phe Val Gln
1965 1970 1975 1980
atc atg atc aat gac aag gcc gtg agg gcg tac cga acg ggt gac cgg 6000
Ile Met Ile Asn Asp Lys Ala Val Arg Ala Tyr Arg Thr Gly Asp Arg
1985 1990 1995
gca cga tat cgc gta gga gac ggt cag atc gag ttc ttc gga cgc atg 6048
Ala Arg Tyr Arg Val Gly Asp Gly Gln Ile Glu Phe Phe Gly Arg Met
2000 2005 2010
gat cag caa gtc aag atc cga ggt cac cgc att gaa cca gcc gaa gtg 6096
Asp Gln Gln Val Lys Ile Arg Gly His Arg Ile Glu Pro Ala Glu Val
2015 2020 2025
gag cgt gct att ctc gac caa gac tcg gcc cgc gac gcc gtc gtt gtc 6144
Glu Arg Ala Ile Leu Asp Gln Asp Ser Ala Arg Asp Ala Val Val Val
2030 2035 2040
atc cgg cac caa gaa ggt gaa gaa ccg gag atg gtt ggt ttc gtc gcg 6192
Ile Arg His Gln Glu Gly Glu Glu Pro Glu Met Val Gly Phe Val Ala
2045 2050 2055 2060
acc cac ggc gat cac tct gcc gaa caa gag gaa gca gac gac cag gtt 6240
Thr His Gly Asp His Ser Ala Glu Gln Glu Glu Ala Asp Asp Gln Val
2065 2070 2075
gaa ggt tgg aaa gac ttc ttc gag agc aat aca tat gcc gac atg gat 6288
Glu Gly Trp Lys Asp Phe Phe Glu Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Met Asp
2080 2085 2090
acc atc ggc cag tct gct ata ggc aac gac ttt acg ggc tgg acg tcc 6336
Thr Ile Gly Gln Ser Ala Ile Gly Asn Asp Phe Thr Gly Trp Thr Ser
2095 2100 2105
atg tac gac ggg agc gag atc aac aag gcc gag atg cag gag tgg ctc 6384
Met Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Asn Lys Ala Glu Met Gln Glu Trp Leu
2110 2115 2120
gac gac acc atg cgc aca ctc ctc gat ggc caa gcg ccg ggt cac gta 6432
Asp Asp Thr Met Arg Thr Leu Leu Asp Gly Gln Ala Pro Gly His Val
2125 2130 2135 2140
ctc gaa ata ggc aca ggc agt ggc atg gta ttg ttt aac tta ggg gcc 6480
Leu Glu Ile Gly Thr Gly Ser Gly Met Val Leu Phe Asn Leu Gly Ala
2145 2150 2155
ggg cta caa agc tac gta ggt ctt gaa cca tct aga tct gca gcc acg 6528
Gly Leu Gln Ser Tyr Val Gly Leu Glu Pro Ser Arg Ser Ala Ala Thr
2160 2165 2170
ttt gtt acc aaa gcg atc aat tcc acc cca gct ctt gca gga aag gcc 6576
Phe Val Thr Lys Ala Ile Asn Ser Thr Pro Ala Leu Ala Gly Lys Ala
2175 2180 2185
gaa gtg cac gtc ggc aca gcg aca gac ata aac cga ctt cgt gga ctt 6624
Glu Val His Val Gly Thr Ala Thr Asp Ile Asn Arg Leu Arg Gly Leu
2190 2195 2200
cgt ccc gat cta gtt gtg ctc aac tcg gta gtc cag tat ttc ccc acg 6672
Arg Pro Asp Leu Val Val Leu Asn Ser Val Val Gln Tyr Phe Pro Thr
2205 2210 2215 2220
ccc gag tac cta cta gag gtc gtg gag agt ctc gtc cgg att ccg ggc 6720
Pro Glu Tyr Leu Leu Glu Val Val Glu Ser Leu Val Arg Ile Pro Gly
2225 2230 2235
gtc aag cgc gtg gtc ttc ggc gac ata cga tct cac gcc acg aac aga 6768
Val Lys Arg Val Val Phe Gly Asp Ile Arg Ser His Ala Thr Asn Arg
2240 2245 2250
cat ttt ctt gct gcc agg gcg ctg cat tcg ctg ggc tcc aag gcg acc 6816
His Phe Leu Ala Ala Arg Ala Leu His Ser Leu Gly Ser Lys Ala Thr
2255 2260 2265
aaa gat gct ata cgt caa aag atg acg gag atg gaa gag cgc gag gaa 6864
Lys Asp Ala Ile Arg Gln Lys Met Thr Glu Met Glu Glu Arg Glu Glu
2270 2275 2280
gag ctg ctc gtc gac ccg gcc ttc ttc acg gcg ctg ctg cag ggc cag 6912
Glu Leu Leu Val Asp Pro Ala Phe Phe Thr Ala Leu Leu Gln Gly Gln
2285 2290 2295 2300
ctt gcc gat cga atc aag cac gtc gag atc ctc ccg aag aac atg cgc 6960
Leu Ala Asp Arg Ile Lys His Val Glu Ile Leu Pro Lys Asn Met Arg
2305 2310 2315
gcc acg aac gag ctg agc gcg tac cgg tat aca gcc gtc att cac gta 7008
Ala Thr Asn Glu Leu Ser Ala Tyr Arg Tyr Thr Ala Val Ile His Val
2320 2325 2330
cgc ggc cca gag gaa cag tcg cgg ccc gtg tat ccg atc caa gtg aac 7056
Arg Gly Pro Glu Glu Gln Ser Arg Pro Val Tyr Pro Ile Gln Val Asn
2335 2340 2345
gac tgg atc gac ttt cag gcc tca cgc att gac cgc cgc gcc ctt ctc 7104
Asp Trp Ile Asp Phe Gln Ala Ser Arg Ile Asp Arg Arg Ala Leu Leu
2350 2355 2360
cga ctc cta cag cgc tcg gca gac gcc gcg acc gtc gcc gtc agc aac 7152
Arg Leu Leu Gln Arg Ser Ala Asp Ala Ala Thr Val Ala Val Ser Asn
2365 2370 2375 2380
atc ccc tac agc aag acg att gta gaa cgc cat gtc gtc gag tcc ctt 7200
Ile Pro Tyr Ser Lys Thr Ile Val Glu Arg His Val Val Glu Ser Leu
2385 2390 2395
gac aat aac aac agg gag aat acg cat aga gca cca gac ggc gcg gct 7248
Asp Asn Asn Asn Arg Glu Asn Thr His Arg Ala Pro Asp Gly Ala Ala
2400 2405 2410
tgg atc tcg gcc gtc cgc tcc aag gcc gag cgc tgc acg tcc ctc tcc 7296
Trp Ile Ser Ala Val Arg Ser Lys Ala Glu Arg Cys Thr Ser Leu Ser
2415 2420 2425
gtg acc gat ctt gtg cag ctc ggg gaa gaa gcc ggc ttt cgc gta gaa 7344
Val Thr Asp Leu Val Gln Leu Gly Glu Glu Ala Gly Phe Arg Val Glu
2430 2435 2440
gtc agc gca gcg cgg cag tgg tct caa agc ggc gcg ctc gat gcc gtc 7392
Val Ser Ala Ala Arg Gln Trp Ser Gln Ser Gly Ala Leu Asp Ala Val
2445 2450 2455 2460
ttt cac cgc tat aat ttg ccc act caa agc aat agt cgc gtt ctg att 7440
Phe His Arg Tyr Asn Leu Pro Thr Gln Ser Asn Ser Arg Val Leu Ile
2465 2470 2475
cag ttc cct acc gaa gat ggc cag acg cga aga tcc gcc act ctg aca 7488
Gln Phe Pro Thr Glu Asp Gly Gln Thr Arg Arg Ser Ala Thr Leu Thr
2480 2485 2490
aac cga cca cta cag cgt ctg cag agc cgt cgg ttc gca tca cag atc 7536
Asn Arg Pro Leu Gln Arg Leu Gln Ser Arg Arg Phe Ala Ser Gln Ile
2495 2500 2505
cgc gaa cag ctg aag gcc gtg ctc ccg tca tac atg atc ccc tcc cgc 7584
Arg Glu Gln Leu Lys Ala Val Leu Pro Ser Tyr Met Ile Pro Ser Arg
2510 2515 2520
atc gtg gtc ata gac cag atg cct ctc aat gcc aat ggc aag gtc gac 7632
Ile Val Val Ile Asp Gln Met Pro Leu Asn Ala Asn Gly Lys Val Asp
2525 2530 2535 2540
cgg aaa gaa ctt acc aga agg gcc caa atc gcg ccg aaa tct cag gcg 7680
Arg Lys Glu Leu Thr Arg Arg Ala Gln Ile Ala Pro Lys Ser Gln Ala
2545 2550 2555
gct ccc gcc aaa ccc gtc aaa cag gtc gat ccg ttc gtc aac ctg gaa 7728
Ala Pro Ala Lys Pro Val Lys Gln Val Asp Pro Phe Val Asn Leu Glu
2560 2565 2570
gcc att tta tgt gag gag ttc gcg gag gtg ctg ggc atg gaa gtc ggc 7776
Ala Ile Leu Cys Glu Glu Phe Ala Glu Val Leu Gly Met Glu Val Gly
2575 2580 2585
gtg aac gac cac ttc ttc caa cta ggc gga cac tct ctc ttg gcc acg 7824
Val Asn Asp His Phe Phe Gln Leu Gly Gly His Ser Leu Leu Ala Thr
2590 2595 2600
aag ctc gtc gcg cgt ctc agt cgt cgg cta aac ggt cgt gtg tct gtg 7872
Lys Leu Val Ala Arg Leu Ser Arg Arg Leu Asn Gly Arg Val Ser Val
2605 2610 2615 2620
agg gat gtg ttc gac cag cct gtg att tcc gac ctc gca gtc acc ctc 7920
Arg Asp Val Phe Asp Gln Pro Val Ile Ser Asp Leu Ala Val Thr Leu
2625 2630 2635
cgc cag gga ctg acc ttg gaa aac gcc att ccc gca acg ccg gac agc 7968
Arg Gln Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Ile Pro Ala Thr Pro Asp Ser
2640 2645 2650
ggg tat tgg gag cag aca atg tcc gca ccg aca acc ccg agc gac gac 8016
Gly Tyr Trp Glu Gln Thr Met Ser Ala Pro Thr Thr Pro Ser Asp Asp
2655 2660 2665
atg gag gcc gtg cta tgc aag gag ttt gcg gat gtg ctt ggc gtc gaa 8064
Met Glu Ala Val Leu Cys Lys Glu Phe Ala Asp Val Leu Gly Val Glu
2670 2675 2680
gtc agc gcc acc gac agc ttc ttc gat ctc ggt ggg cat tcc ctc atg 8112
Val Ser Ala Thr Asp Ser Phe Phe Asp Leu Gly Gly His Ser Leu Met
2685 2690 2695 2700
gct acg aag ctc gct gcg cgt att agc cgt cgg cta gat gta ccg gtg 8160
Ala Thr Lys Leu Ala Ala Arg Ile Ser Arg Arg Leu Asp Val Pro Val
2705 2710 2715
tca atc aaa gac ata ttc gat cac tca gtt cct cta aac ctt gcg agg 8208
Ser Ile Lys Asp Ile Phe Asp His Ser Val Pro Leu Asn Leu Ala Arg
2720 2725 2730
aag att cgg ctc act caa gca aaa ggc cac gaa gcg acc aat gga gta 8256
Lys Ile Arg Leu Thr Gln Ala Lys Gly His Glu Ala Thr Asn Gly Val
2735 2740 2745
caa atc gcc aac gac gcc cca ttc caa ctc att tcc gta gaa gat cca 8304
Gln Ile Ala Asn Asp Ala Pro Phe Gln Leu Ile Ser Val Glu Asp Pro
2750 2755 2760
gag ata ttc gtc caa cgt gaa atc gcc cct caa cta caa tgc tca ccc 8352
Glu Ile Phe Val Gln Arg Glu Ile Ala Pro Gln Leu Gln Cys Ser Pro
2765 2770 2775 2780
gag aca atc cta gac gtc tac ccc gcc acg caa atg caa agg gtc ttc 8400
Glu Thr Ile Leu Asp Val Tyr Pro Ala Thr Gln Met Gln Arg Val Phe
2785 2790 2795
ctc ctc aac cca gta aca gga aag ccg cgc tca cca acg cca ttt cac 8448
Leu Leu Asn Pro Val Thr Gly Lys Pro Arg Ser Pro Thr Pro Phe His
2800 2805 2810
ata gac ttc ccg ccg gac gca gac tgc gcc agc ctg atg cgg gca tgt 8496
Ile Asp Phe Pro Pro Asp Ala Asp Cys Ala Ser Leu Met Arg Ala Cys
2815 2820 2825
gca tct cta gcg aag cat ttc gat atc ttc agg acg gtg ttc ctc gaa 8544
Ala Ser Leu Ala Lys His Phe Asp Ile Phe Arg Thr Val Phe Leu Glu
2830 2835 2840
gcc aga ggc gaa ctc tac caa gta gtt cta aaa cac gtc gac gtg ccc 8592
Ala Arg Gly Glu Leu Tyr Gln Val Val Leu Lys His Val Asp Val Pro
2845 2850 2855 2860
atc gag atg ctc cag acc gaa gaa aac atc aac agc gcg acc cgg tcg 8640
Ile Glu Met Leu Gln Thr Glu Glu Asn Ile Asn Ser Ala Thr Arg Ser
2865 2870 2875
ttc ctg gac gta gac gca gaa aaa ccc atc cgg cta ggc cag cca ctg 8688
Phe Leu Asp Val Asp Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Gly Gln Pro Leu
2880 2885 2890
atc cgc atc gcg ata cta gag aag ccc ggg tcc acg ctg cgc gtc atc 8736
Ile Arg Ile Ala Ile Leu Glu Lys Pro Gly Ser Thr Leu Arg Val Ile
2895 2900 2905
cta cga tta tcc cac gcc tta tac gac ggc ctg agc cta gag cac atc 8784
Leu Arg Leu Ser His Ala Leu Tyr Asp Gly Leu Ser Leu Glu His Ile
2910 2915 2920
ctg cac tct ctg cac atc ctc ttt ttc ggc ggc agt ctt ccc ccg ccg 8832
Leu His Ser Leu His Ile Leu Phe Phe Gly Gly Ser Leu Pro Pro Pro
2925 2930 2935 2940
ccc aag ttc gcc ggg tac atg caa cac gtc gcg agc agt cgc aga gaa 8880
Pro Lys Phe Ala Gly Tyr Met Gln His Val Ala Ser Ser Arg Arg Glu
2945 2950 2955
ggc tac gat ttc tgg cgt tcc gtt ctc cga gat tcg tct atg aca gtc 8928
Gly Tyr Asp Phe Trp Arg Ser Val Leu Arg Asp Ser Ser Met Thr Val
2960 2965 2970
atc aaa ggc aac aat aat aca act cca cca cct cct cct caa caa caa 8976
Ile Lys Gly Asn Asn Asn Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Gln
2975 2980 2985
tcc acc ccc tcc gga gcc cac cac gcc tcc aaa gta gtc act atc cca 9024
Ser Thr Pro Ser Gly Ala His His Ala Ser Lys Val Val Thr Ile Pro
2990 2995 3000
acc caa gcc aac aca gac agc cgg atc acg cgc gcc acg atc ttc act 9072
Thr Gln Ala Asn Thr Asp Ser Arg Ile Thr Arg Ala Thr Ile Phe Thr
3005 3010 3015 3020
acc gct tgc gca cta atg ctc gcg aaa gaa gac aac tcc agc gac gtc 9120
Thr Ala Cys Ala Leu Met Leu Ala Lys Glu Asp Asn Ser Ser Asp Val
3025 3030 3035
gtc ttc ggg cgt acg gta tcg ggg cgt caa ggc ctg ccc cta gcc cac 9168
Val Phe Gly Arg Thr Val Ser Gly Arg Gln Gly Leu Pro Leu Ala His
3040 3045 3050
caa aac gtg atc gga cca tgt ctc aac caa gtg ccc gtg cgc gcg cgc 9216
Gln Asn Val Ile Gly Pro Cys Leu Asn Gln Val Pro Val Arg Ala Arg
3055 3060 3065
ggt tta aac cga gga acc act cac cac cga gaa ctt ctc cgc gag atg 9264
Gly Leu Asn Arg Gly Thr Thr His His Arg Glu Leu Leu Arg Glu Met
3070 3075 3080
caa gag caa tat ctc aac agt ctc gct ttc gaa act ctc ggg tac gac 9312
Gln Glu Gln Tyr Leu Asn Ser Leu Ala Phe Glu Thr Leu Gly Tyr Asp
3085 3090 3095 3100
gag atc aag gcg cac tgc aca gac tgg ccg gac gtg cca gcg acc gcg 9360
Glu Ile Lys Ala His Cys Thr Asp Trp Pro Asp Val Pro Ala Thr Ala
3105 3110 3115
agc ttc ggg tgc tgc atc gtg tac cag aac ttc gat tcg cac ccg gac 9408
Ser Phe Gly Cys Cys Ile Val Tyr Gln Asn Phe Asp Ser His Pro Asp
3120 3125 3130
agc cga gtc gaa gag cag cgg ctg cag atc ggg gtc ttg tcg cgg aac 9456
Ser Arg Val Glu Glu Gln Arg Leu Gln Ile Gly Val Leu Ser Arg Asn
3135 3140 3145
tac gag gct att aat gag ggg ctc gtg cat gat ctt gtt att gct ggg 9504
Tyr Glu Ala Ile Asn Glu Gly Leu Val His Asp Leu Val Ile Ala Gly
3150 3155 3160
gag tcg gag cct gat ggg gat gat ttg agg gtt act gtt gtg gcg aat 9552
Glu Ser Glu Pro Asp Gly Asp Asp Leu Arg Val Thr Val Val Ala Asn
3165 3170 3175 3180
cgg agg ttg tgc gat gag gaa agg ttg aag agg atg ctg gag gag ctg 9600
Arg Arg Leu Cys Asp Glu Glu Arg Leu Lys Arg Met Leu Glu Glu Leu
3185 3190 3195
tgt ggg aat att cgg gct ttg gcg ttg gtt tag 9633
Cys Gly Asn Ile Arg Ala Leu Ala Leu Val
3200 3205
<210> 2
<211> 3210
<212> PRT
<213> Mycelia sterilia
<400> 2
Met Ser Asn Met Ala Pro Leu Pro Thr Met Gly Val Glu Gln Gln Ala
1 5 10 15
Leu Ser Leu Ser Cys Pro Leu Leu Pro His Asp Asp Glu Lys His Ser
20 25 30
Asp Asn Leu Tyr Glu Gln Ala Thr Arg His Phe Gly Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Lys Ile Glu Asn Val Leu Pro Cys Thr Ser Phe Gln Cys Asp Val Ile
50 55 60
Asp Cys Ala Val Asp Asp Arg Arg His Ala Ile Gly His Val Val Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Pro Asn Thr Val Asp Ile Gln Arg Leu Ala Ala Ala Trp Lys
85 90 95
Glu Val Val Arg Gln Thr Pro Ile Leu Arg Thr Gly Ile Phe Thr Ser
100 105 110
Glu Thr Gly Asp Ser Phe Gln Ile Val Leu Lys Glu Gly Cys Leu Pro
115 120 125
Trp Met Tyr Ala Thr Cys Leu Gly Met Lys Gly Ala Val Ile Gln Asp
130 135 140
Glu Ala Val Ala Ala Met Thr Gly Pro Arg Cys Asn Arg Tyr Val Val
145 150 155 160
Leu Glu Asp Pro Ser Thr Lys Gln Arg Leu Leu Ile Trp Thr Phe Ser
165 170 175
His Ala Leu Val Asp Tyr Thr Val Gln Glu Arg Ile Leu Gln Arg Val
180 185 190
Leu Thr Val Tyr Asp Gly Arg Asp Val Glu Cys Pro Arg Ile Lys Asp
195 200 205
Thr Glu His Val Ser Arg Phe Trp Gln Gln His Phe Glu Gly Leu Asp
210 215 220
Ala Ser Val Phe Pro Leu Leu Pro Ser His Leu Thr Val Cys Asn Pro
225 230 235 240
Asn Ala Arg Ala Glu His His Ile Ser Tyr Thr Gly Pro Val Gln Arg
245 250 255
Lys Trp Ser His Thr Ser Ile Cys Arg Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu
260 265 270
Ser Arg Phe Thr His Ser Ser Glu Ala Leu Phe Gly Val Val Thr Glu
275 280 285
Gln Ser His Asn Ser Glu Asp Gln Arg Arg Ser Ile Asp Gly Pro Ala
290 295 300
Arg Thr Val Val Pro Ile Arg Val Leu Cys Ala Pro Asp Gln Tyr Val
305 310 315 320
Ser Asp Val Ile Gly Ala Ile Thr Ala His Glu His Ala Met Arg Gly
325 330 335
Phe Glu His Ala Gly Leu Arg Asn Ile Arg Arg Thr Gly Asp Asp Gly
340 345 350
Ser Ala Ala Cys Gly Phe Gln Thr Val Leu Leu Val Thr Asp Gly Asp
355 360 365
Ala Pro Lys Thr Pro Gly Ser Val Leu His Arg Ser Val Glu Glu Ser
370 375 380
Asp Arg Phe Met Pro Cys Ala Asn Arg Ala Leu Leu Leu Asp Cys Gln
385 390 395 400
Met Ala Gly Asn Ser Ala Ser Leu Val Ala Arg Tyr Asp His Asn Val
405 410 415
Ile Asp Pro Arg Gln Met Ser Arg Phe Leu Arg Gln Leu Gly Tyr Leu
420 425 430
Ile Gln Gln Phe His His His Val Asp Leu Pro Leu Val Lys Glu Leu
435 440 445
Asp Val Val Thr Ala Glu Asp Cys Ala Glu Ile Glu Lys Trp Asn Ser
450 455 460
Glu Arg Leu Thr Met Gln Asp Ala Leu Ile His Asp Thr Ile Ser Lys
465 470 475 480
Trp Ala Ala Gly Asp Pro Asn Lys Ala Ala Val Phe Ala Trp Asp Gly
485 490 495
Glu Trp Thr Tyr Ala Glu Leu Asp Asn Ile Ser Ser Arg Leu Ala Val
500 505 510
Tyr Ile Gln Ser Leu Asp Leu Arg Pro Gly Gln Ala Ile Leu Pro Leu
515 520 525
Cys Phe Glu Lys Ser Lys Trp Val Val Ala Thr Ile Leu Ala Val Leu
530 535 540
Lys Val Gly Arg Ala Phe Thr Leu Ile Asp Pro Cys Asp Pro Ser Ala
545 550 555 560
Arg Met Ala Gln Val Cys Gln Gln Thr Ser Ala Thr Val Ala Leu Thr
565 570 575
Ser Lys Leu His Asn Thr Thr Leu Arg Ser Val Val Ser Arg Cys Ile
580 585 590
Val Val Asp Asp Asp Leu Leu Arg Ser Leu Pro His Ala Asp Gly Arg
595 600 605
Leu Lys Ala Thr Val Lys Pro Gln Asp Leu Ala Tyr Val Ile Phe Thr
610 615 620
Ser Gly Ser Thr Gly Glu Pro Lys Gly Ile Met Ile Glu His Arg Gly
625 630 635 640
Phe Val Ser Cys Ala Met Lys Phe Gly Pro Ala Leu Gly Met Asp Glu
645 650 655
His Thr Arg Ala Leu Gln Phe Ala Ser Tyr Ala Phe Gly Ala Cys Leu
660 665 670
Val Glu Val Val Thr Ala Leu Met His Gly Gly Cys Val Cys Ile Pro
675 680 685
Ser Asp Asp Asp Arg Leu Asn Asn Val Pro Glu Phe Ile Lys Arg Ala
690 695 700
Gln Val Asn Trp Val Ile Leu Thr Pro Ser Tyr Ile Gly Thr Phe Gln
705 710 715 720
Pro Glu Asp Val Pro Gly Leu Gln Thr Leu Val Leu Val Gly Glu Pro
725 730 735
Ile Ser Ala Ser Ile Arg Asp Thr Trp Ala Ser Gln Val Arg Leu Leu
740 745 750
Asn Ala Tyr Gly Gln Ser Glu Ser Ser Thr Met Cys Ser Val Thr Glu
755 760 765
Val Ser Pro Leu Ser Leu Glu Pro Asn Asn Ile Gly Arg Ala Val Gly
770 775 780
Ala Arg Ser Trp Ile Ile Asp Pro Asp Glu Pro Asp Arg Leu Ala Pro
785 790 795 800
Ile Gly Cys Ile Gly Glu Leu Val Ile Glu Ser Pro Gly Ile Ala Arg
805 810 815
Asp Tyr Ile Ile Ala Pro Pro Pro Asp Lys Ser Pro Phe Leu Leu Ala
820 825 830
Pro Pro Ala Trp Tyr Pro Ala Gly Lys Leu Ser Asn Ala Phe Lys Phe
835 840 845
Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Val Arg Tyr Gly Pro Asp Gly Thr Ile Val
850 855 860
Cys Leu Gly Arg Lys Asp Ser Gln Val Lys Ile Arg Gly Gln Arg Val
865 870 875 880
Glu Ile Ser Ala Val Glu Ala Ser Leu Arg Arg Gln Leu Pro Ser Asp
885 890 895
Ile Met Pro Val Ala Glu Ala Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ser Gly Ser
900 905 910
Thr Val Leu Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ser Ser Lys Ser Gly Asp Gly
915 920 925
Asn Gly His Ala Leu Ser Ala Ala Asp Ala Val Ile Leu Asp His Gly
930 935 940
Ala Thr Asn Glu Ile Asn Ala Lys Leu Gln Gln Ile Leu Pro Gln His
945 950 955 960
Ser Val Pro Ser Tyr Tyr Ile His Met Glu Asn Leu Pro Arg Thr Ala
965 970 975
Thr Gly Lys Ala Asp Arg Lys Met Leu Arg Ser Ile Ala Ser Lys Leu
980 985 990
Leu Gly Glu Leu Ser Gln Asn Val Thr Ser Gln Pro Ile Glu Lys His
995 1000 1005
Asp Ala Pro Ala Thr Gly Ile Glu Val Lys Leu Lys Glu Leu Trp Phe
1010 1015 1020
Leu Ser Leu Asn Leu Asn Pro Asn Ser Gln Asp Val Gly Ala Ser Phe
025 1030 1035 1040
Phe Asp Leu Gly Gly Asn Ser Ile Ile Ala Ile Lys Met Val Asn Met
1045 1050 1055
Ala Arg Ser Ala Gly Ile Ala Leu Lys Val Ser Asp Ile Phe Gln Asn
1060 1065 1070
Pro Thr Leu Ala Gly Leu Val Asp Val Ile Gly Arg Asp Pro Ala Pro
1075 1080 1085
Tyr Asn Leu Ile Pro Thr Thr Ala Tyr Ser Gly Pro Val Glu Gln Ser
1090 1095 1100
Phe Ala Gln Gly Arg Leu Trp Phe Leu Asp Gln Ile Glu Leu Asp Ala
105 1110 1115 1120
Leu Trp Tyr Leu Leu Pro Tyr Ala Val Arg Met Arg Gly Pro Leu His
1125 1130 1135
Ile Asp Ala Leu Thr Ile Ala Leu Leu Ala Ile Gln Gln Arg His Glu
1140 1145 1150
Thr Leu Arg Thr Thr Phe Glu Glu Gln Asp Gly Val Gly Val Gln Val
1155 1160 1165
Val His Ala Ser Pro Ile Ser Asp Leu Arg Ile Ile Asp Val Ser Gly
1170 1175 1180
Asp Arg Asn Ser Asp Tyr Leu Gln Leu Leu His Gln Glu Gln Thr Thr
185 1190 1195 1200
Pro Phe Ile Leu Ala Cys Gln Ala Gly Trp Arg Val Ser Leu Ile Arg
1205 1210 1215
Leu Gly Glu Asp Asp His Ile Leu Ser Ile Val Met His His Ile Ile
1220 1225 1230
Ser Asp Gly Trp Ser Ile Asp Ile Leu Arg Arg Glu Leu Ser Asn Phe
1235 1240 1245
Tyr Ser Ala Ala Leu Arg Gly Ser Asp Pro Leu Ser Val Val Ser Pro
1250 1255 1260
Leu Pro Leu His Tyr Arg Asp Phe Ser Val Trp Gln Lys Gln Val Glu
265 1270 1275 1280
Gln Glu Thr Glu His Glu Arg Gln Leu Glu Tyr Trp Val Lys Gln Leu
1285 1290 1295
Ala Asp Ser Ser Ala Ala Glu Phe Leu Thr Asp Phe Pro Arg Pro Asn
1300 1305 1310
Ile Leu Ser Gly Glu Ala Gly Ser Val Pro Val Thr Ile Glu Gly Glu
1315 1320 1325
Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Glu Phe Cys Lys Val Glu Gln Met Thr Pro
1330 1335 1340
Phe Ala Val Leu Leu Gly Ala Phe Arg Ala Thr His Tyr Arg Leu Thr
345 1350 1355 1360
Gly Ala Glu Asp Ser Ile Ile Gly Thr Pro Ile Ala Asn Arg Asn Arg
1365 1370 1375
Gln Glu Leu Glu Asn Met Ile Gly Phe Phe Val Asn Thr Gln Cys Met
1380 1385 1390
Arg Ile Thr Val Asp Gly Asp Asp Thr Phe Glu Ser Leu Val Arg Gln
1395 1400 1405
Val Arg Thr Thr Ala Thr Ala Ala Phe Glu His Gln Asp Val Pro Phe
1410 1415 1420
Glu Arg Val Val Thr Ala Leu Leu Pro Arg Ser Arg Asp Leu Ser Arg
425 1430 1435 1440
Asn Pro Leu Ala Gln Leu Thr Phe Ala Leu His Ser Gln Gln Asp Leu
1445 1450 1455
Gly Lys Phe Glu Leu Glu Gly Leu Val Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys
1460 1465 1470
Val Tyr Thr Arg Phe Asp Val Glu Phe His Leu Phe Gln Glu Ala Gly
1475 1480 1485
Arg Leu Ser Gly Asn Val Ala Phe Ala Ala Asp Leu Phe Lys Pro Glu
1490 1495 1500
Thr Ile Ser Asn Val Val Ala Ile Phe Phe Gln Ile Leu Arg Gln Gly
505 1510 1515 1520
Ile Arg Gln Pro Arg Thr Pro Ile Ala Val Leu Pro Leu Thr Asp Gly
1525 1530 1535
Leu Ala Asp Leu Arg Ala Met Gly Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala Glu
1540 1545 1550
Tyr Pro Arg Glu Ser Ser Val Val Asp Val Phe Arg Lys Gln Val Ala
1555 1560 1565
Ala His Pro His Ala Phe Ala Val Val Asp Ser Ala Ser Arg Leu Thr
1570 1575 1580
Tyr Ala Asp Leu Asp Arg Gln Ser Asp Gln Leu Ala Thr Trp Leu Gly
585 1590 1595 1600
Arg Arg Asn Met Thr Ala Glu Thr Leu Val Gly Val Leu Ala Pro Arg
1605 1610 1615
Ser Cys Gln Thr Val Val Ala Ile Leu Gly Ile Leu Lys Ala Asn Leu
1620 1625 1630
Ala Tyr Leu Pro Leu Asp Val Asn Cys Pro Thr Ala Arg Leu Gln Thr
1635 1640 1645
Ile Leu Ser Thr Leu Asn Arg His Lys Leu Val Leu Leu Gly Ser Asn
1650 1655 1660
Ala Thr Thr Pro Asp Val Gln Ile Pro Asp Val Glu Leu Val Arg Ile
665 1670 1675 1680
Ser Asp Ile Leu Asp Arg Pro Ile Asn Gly Gln Ala Lys Leu Asn Gly
1685 1690 1695
His Thr Lys Ser Asn Gly Tyr Ser Lys Pro Asn Gly Tyr Thr His Leu
1700 1705 1710
Lys Gly Tyr Ser Asn Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Gln Asn Gly Tyr Ala
1715 1720 1725
Gln Leu Asn Gly His Arg Glu Arg Asn Asn Tyr Leu Asp Leu Asn Gly
1730 1735 1740
His Ser Leu Leu Asn Gly Asn Ser Asp Ile Thr Thr Ser Gly Pro Ser
745 1750 1755 1760
Ala Thr Ser Leu Ala Tyr Val Ile Phe Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys
1765 1770 1775
Pro Lys Gly Val Met Val Glu His Arg Ser Ile Ile Arg Leu Ala Lys
1780 1785 1790
Lys Asn Arg Ile Ile Ser Arg Phe Pro Ser Val Ala Lys Val Ala His
1795 1800 1805
Leu Ser Asn Ile Ala Phe Asp Ala Ala Thr Trp Glu Met Phe Ala Ala
1810 1815 1820
Leu Leu Asn Gly Gly Thr Leu Val Cys Ile Asp Tyr Met Thr Thr Leu
825 1830 1835 1840
Asp Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ala Phe Ala Arg Glu Gln Ile Asn Ala
1845 1850 1855
Ala Leu Leu Thr Pro Ala Leu Leu Lys Gln Cys Leu Ala Asn Ile Pro
1860 1865 1870
Thr Thr Leu Gly Arg Leu Ser Ala Leu Val Ile Gly Gly Asp Arg Leu
1875 1880 1885
Asp Gly Gln Asp Ala Ile Ala Ala His Ala Leu Val Gly Ala Gly Val
1890 1895 1900
Tyr Asn Ala Tyr Gly Pro Thr Glu Asn Gly Val Ile Ser Thr Ile Tyr
905 1910 1915 1920
Asn Ile Thr Lys Asn Asp Ser Phe Ile Asn Gly Val Pro Ile Gly Cys
1925 1930 1935
Ala Ile Ser Asn Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Asp Pro Asp Gln Gln Leu
1940 1945 1950
Val Pro Pro Gly Val Met Gly Glu Leu Val Val Thr Gly Asp Gly Leu
1955 1960 1965
Ala Arg Gly Tyr Thr Asp Pro Ala Leu Asp Ala Gly Arg Phe Val Gln
1970 1975 1980
Ile Met Ile Asn Asp Lys Ala Val Arg Ala Tyr Arg Thr Gly Asp Arg
985 1990 1995 2000
Ala Arg Tyr Arg Val Gly Asp Gly Gln Ile Glu Phe Phe Gly Arg Met
2005 2010 2015
Asp Gln Gln Val Lys Ile Arg Gly His Arg Ile Glu Pro Ala Glu Val
2020 2025 2030
Glu Arg Ala Ile Leu Asp Gln Asp Ser Ala Arg Asp Ala Val Val Val
2035 2040 2045
Ile Arg His Gln Glu Gly Glu Glu Pro Glu Met Val Gly Phe Val Ala
2050 2055 2060
Thr His Gly Asp His Ser Ala Glu Gln Glu Glu Ala Asp Asp Gln Val
065 2070 2075 2080
Glu Gly Trp Lys Asp Phe Phe Glu Ser Asn Thr Tyr Ala Asp Met Asp
2085 2090 2095
Thr Ile Gly Gln Ser Ala Ile Gly Asn Asp Phe Thr Gly Trp Thr Ser
2100 2105 2110
Met Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Asn Lys Ala Glu Met Gln Glu Trp Leu
2115 2120 2125
Asp Asp Thr Met Arg Thr Leu Leu Asp Gly Gln Ala Pro Gly His Val
2130 2135 2140
Leu Glu Ile Gly Thr Gly Ser Gly Met Val Leu Phe Asn Leu Gly Ala
145 2150 2155 2160
Gly Leu Gln Ser Tyr Val Gly Leu Glu Pro Ser Arg Ser Ala Ala Thr
2165 2170 2175
Phe Val Thr Lys Ala Ile Asn Ser Thr Pro Ala Leu Ala Gly Lys Ala
2180 2185 2190
Glu Val His Val Gly Thr Ala Thr Asp Ile Asn Arg Leu Arg Gly Leu
2195 2200 2205
Arg Pro Asp Leu Val Val Leu Asn Ser Val Val Gln Tyr Phe Pro Thr
2210 2215 2220
Pro Glu Tyr Leu Leu Glu Val Val Glu Ser Leu Val Arg Ile Pro Gly
225 2230 2235 2240
Val Lys Arg Val Val Phe Gly Asp Ile Arg Ser His Ala Thr Asn Arg
2245 2250 2255
His Phe Leu Ala Ala Arg Ala Leu His Ser Leu Gly Ser Lys Ala Thr
2260 2265 2270
Lys Asp Ala Ile Arg Gln Lys Met Thr Glu Met Glu Glu Arg Glu Glu
2275 2280 2285
Glu Leu Leu Val Asp Pro Ala Phe Phe Thr Ala Leu Leu Gln Gly Gln
2290 2295 2300
Leu Ala Asp Arg Ile Lys His Val Glu Ile Leu Pro Lys Asn Met Arg
305 2310 2315 2320
Ala Thr Asn Glu Leu Ser Ala Tyr Arg Tyr Thr Ala Val Ile His Val
2325 2330 2335
Arg Gly Pro Glu Glu Gln Ser Arg Pro Val Tyr Pro Ile Gln Val Asn
2340 2345 2350
Asp Trp Ile Asp Phe Gln Ala Ser Arg Ile Asp Arg Arg Ala Leu Leu
2355 2360 2365
Arg Leu Leu Gln Arg Ser Ala Asp Ala Ala Thr Val Ala Val Ser Asn
2370 2375 2380
Ile Pro Tyr Ser Lys Thr Ile Val Glu Arg His Val Val Glu Ser Leu
385 2390 2395 2400
Asp Asn Asn Asn Arg Glu Asn Thr His Arg Ala Pro Asp Gly Ala Ala
2405 2410 2415
Trp Ile Ser Ala Val Arg Ser Lys Ala Glu Arg Cys Thr Ser Leu Ser
2420 2425 2430
Val Thr Asp Leu Val Gln Leu Gly Glu Glu Ala Gly Phe Arg Val Glu
2435 2440 2445
Val Ser Ala Ala Arg Gln Trp Ser Gln Ser Gly Ala Leu Asp Ala Val
2450 2455 2460
Phe His Arg Tyr Asn Leu Pro Thr Gln Ser Asn Ser Arg Val Leu Ile
465 2470 2475 2480
Gln Phe Pro Thr Glu Asp Gly Gln Thr Arg Arg Ser Ala Thr Leu Thr
2485 2490 2495
Asn Arg Pro Leu Gln Arg Leu Gln Ser Arg Arg Phe Ala Ser Gln Ile
2500 2505 2510
Arg Glu Gln Leu Lys Ala Val Leu Pro Ser Tyr Met Ile Pro Ser Arg
2515 2520 2525
Ile Val Val Ile Asp Gln Met Pro Leu Asn Ala Asn Gly Lys Val Asp
2530 2535 2540
Arg Lys Glu Leu Thr Arg Arg Ala Gln Ile Ala Pro Lys Ser Gln Ala
545 2550 2555 2560
Ala Pro Ala Lys Pro Val Lys Gln Val Asp Pro Phe Val Asn Leu Glu
2565 2570 2575
Ala Ile Leu Cys Glu Glu Phe Ala Glu Val Leu Gly Met Glu Val Gly
2580 2585 2590
Val Asn Asp His Phe Phe Gln Leu Gly Gly His Ser Leu Leu Ala Thr
2595 2600 2605
Lys Leu Val Ala Arg Leu Ser Arg Arg Leu Asn Gly Arg Val Ser Val
2610 2615 2620
Arg Asp Val Phe Asp Gln Pro Val Ile Ser Asp Leu Ala Val Thr Leu
625 2630 2635 2640
Arg Gln Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Ile Pro Ala Thr Pro Asp Ser
2645 2650 2655
Gly Tyr Trp Glu Gln Thr Met Ser Ala Pro Thr Thr Pro Ser Asp Asp
2660 2665 2670
Met Glu Ala Val Leu Cys Lys Glu Phe Ala Asp Val Leu Gly Val Glu
2675 2680 2685
Val Ser Ala Thr Asp Ser Phe Phe Asp Leu Gly Gly His Ser Leu Met
2690 2695 2700
Ala Thr Lys Leu Ala Ala Arg Ile Ser Arg Arg Leu Asp Val Pro Val
705 2710 2715 2720
Ser Ile Lys Asp Ile Phe Asp His Ser Val Pro Leu Asn Leu Ala Arg
2725 2730 2735
Lys Ile Arg Leu Thr Gln Ala Lys Gly His Glu Ala Thr Asn Gly Val
2740 2745 2750
Gln Ile Ala Asn Asp Ala Pro Phe Gln Leu Ile Ser Val Glu Asp Pro
2755 2760 2765
Glu Ile Phe Val Gln Arg Glu Ile Ala Pro Gln Leu Gln Cys Ser Pro
2770 2775 2780
Glu Thr Ile Leu Asp Val Tyr Pro Ala Thr Gln Met Gln Arg Val Phe
785 2790 2795 2800
Leu Leu Asn Pro Val Thr Gly Lys Pro Arg Ser Pro Thr Pro Phe His
2805 2810 2815
Ile Asp Phe Pro Pro Asp Ala Asp Cys Ala Ser Leu Met Arg Ala Cys
2820 2825 2830
Ala Ser Leu Ala Lys His Phe Asp Ile Phe Arg Thr Val Phe Leu Glu
2835 2840 2845
Ala Arg Gly Glu Leu Tyr Gln Val Val Leu Lys His Val Asp Val Pro
2850 2855 2860
Ile Glu Met Leu Gln Thr Glu Glu Asn Ile Asn Ser Ala Thr Arg Ser
865 2870 2875 2880
Phe Leu Asp Val Asp Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Gly Gln Pro Leu
2885 2890 2895
Ile Arg Ile Ala Ile Leu Glu Lys Pro Gly Ser Thr Leu Arg Val Ile
2900 2905 2910
Leu Arg Leu Ser His Ala Leu Tyr Asp Gly Leu Ser Leu Glu His Ile
2915 2920 2925
Leu His Ser Leu His Ile Leu Phe Phe Gly Gly Ser Leu Pro Pro Pro
2930 2935 2940
Pro Lys Phe Ala Gly Tyr Met Gln His Val Ala Ser Ser Arg Arg Glu
945 2950 2955 2960
Gly Tyr Asp Phe Trp Arg Ser Val Leu Arg Asp Ser Ser Met Thr Val
2965 2970 2975
Ile Lys Gly Asn Asn Asn Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Gln
2980 2985 2990
Ser Thr Pro Ser Gly Ala His His Ala Ser Lys Val Val Thr Ile Pro
2995 3000 3005
Thr Gln Ala Asn Thr Asp Ser Arg Ile Thr Arg Ala Thr Ile Phe Thr
3010 3015 3020
Thr Ala Cys Ala Leu Met Leu Ala Lys Glu Asp Asn Ser Ser Asp Val
025 3030 3035 3040
Val Phe Gly Arg Thr Val Ser Gly Arg Gln Gly Leu Pro Leu Ala His
3045 3050 3055
Gln Asn Val Ile Gly Pro Cys Leu Asn Gln Val Pro Val Arg Ala Arg
3060 3065 3070
Gly Leu Asn Arg Gly Thr Thr His His Arg Glu Leu Leu Arg Glu Met
3075 3080 3085
Gln Glu Gln Tyr Leu Asn Ser Leu Ala Phe Glu Thr Leu Gly Tyr Asp
3090 3095 3100
Glu Ile Lys Ala His Cys Thr Asp Trp Pro Asp Val Pro Ala Thr Ala
105 3110 3115 3120
Ser Phe Gly Cys Cys Ile Val Tyr Gln Asn Phe Asp Ser His Pro Asp
3125 3130 3135
Ser Arg Val Glu Glu Gln Arg Leu Gln Ile Gly Val Leu Ser Arg Asn
3140 3145 3150
Tyr Glu Ala Ile Asn Glu Gly Leu Val His Asp Leu Val Ile Ala Gly
3155 3160 3165
Glu Ser Glu Pro Asp Gly Asp Asp Leu Arg Val Thr Val Val Ala Asn
3170 3175 3180
Arg Arg Leu Cys Asp Glu Glu Arg Leu Lys Arg Met Leu Glu Glu Leu
185 3190 3195 3200
Cys Gly Asn Ile Arg Ala Leu Ala Leu Val
3205 3210
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:concensus sequence
<400> 3
Trp Thr Ser Met Tyr Asp Gly
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:concensus sequence
<400> 4
Val Val Gln Tyr Phe Pro Thr
1 5
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 5
tggacnwsna tgtaygaygg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 6
gtnggraart aytgnacnac 20
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 7
gcggaattaa ccctcactaa agggaacgaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 8
gcgtaatacg actcactata gggcgaagaa 30
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 9
agcatcggat cctaacaatg ggcgttgagc agcaagccct a 41
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 10
tttgcttcgt actcgggtcc t 21
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 11
agcatcggat cctaacaatg tcaaacatgg caccactccc ta 42
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 12
gcatcgcgat actagagaag 20
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 13
agcatcgaat tcggatccct aaaccaacgc caaagcccga at 42
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp1 gene
<400> 14
ctcaaaccag gaactctttc 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp1 gene
<400> 15
gacatgtgga aaccacattt tg 22
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp1 gene
<400> 16
ggggaattcg tgggtggtga tatcatggc 29
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp1 gene
<400> 17
gggggatcct tgatgggttt tggg 24
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp1 gene
<400> 18
gggggatcct aaactcccat ctatagc 27
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp1 gene
<400> 19
gggtctagac gactcattgc agtgagtgg 29
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for Abp 1 gene promoter
<400> 20
tgatatgctg gagcttccct 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for cyclic depsipeptide synthetase gene
<400> 21
gcacaacctc tttccaggct 20
Claims (14)
- SEQ ID No 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
- 제 1항에 기재된 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 2항에 있어서, SEQ ID No. 1의 DNA서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 2항 또는 제 3항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 7항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 Mycelia sterilia.
- 제 8항에 있어서, 환상 뎁시펩티드 합성효소를 발현하고 있는 Mycelia sterilia.
- 제 8항에 있어서, 시클로(D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)의 생산균인 Mycelia sterilia.
- 환상 뎁시펩티드의 제조방법으로, 제 8항에 기재된 Mycelia sterilia를 배양하고, 배양물로부터 환상 뎁시펩티드를 채취하는 것을 포함하는 제조방법.
- 제 11항에 있어서, 환상 뎁시펩티드가 PF 1022물질 (시클로(D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)) 및 그것의 유도체 (PF 1022물질의 두개의 페닐기의 파라위치가 아미노기에 의해 치환된 것)인 제조방법.
- 환상 뎁시펩티드 합성효소의 제조방법으로, 제 8항에 기재된 Mycelia sterilia를 배양하고, 배양물로부터 환상 뎁시펩티드 합성효소를 채취하는 것을 포함하는 제조방법.
- 제 13항에 있어서, 환상 뎁시펩티드가 PF 1022물질 (시클로(D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)) 및 그것의 유도체 (PF 1022물질의 두개의 페닐기의 파라위치가 아미노기에 의해 치환된 것)인 제조방법.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JPJP-P-1999-00253040 | 1999-09-07 | ||
JP25304099 | 1999-09-07 | ||
JP2000104291 | 2000-04-06 | ||
JPJP-P-2000-00104291 | 2000-04-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20020029767A KR20020029767A (ko) | 2002-04-19 |
KR100702728B1 true KR100702728B1 (ko) | 2007-04-03 |
Family
ID=26541010
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020027002704A KR100702728B1 (ko) | 1999-09-07 | 2000-09-07 | 환상 뎁시펩티드 합성효소 및 그의 유전자 및 환상뎁시펩티드의 대량생산계 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7285404B1 (ko) |
EP (1) | EP1215281B1 (ko) |
JP (1) | JP3961289B2 (ko) |
KR (1) | KR100702728B1 (ko) |
CN (1) | CN1183248C (ko) |
AT (1) | ATE327321T1 (ko) |
AU (1) | AU784466B2 (ko) |
CA (1) | CA2384122C (ko) |
DE (1) | DE60028217T2 (ko) |
NO (1) | NO330902B1 (ko) |
NZ (1) | NZ517588A (ko) |
WO (1) | WO2001018179A1 (ko) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE354650T1 (de) * | 2000-04-26 | 2007-03-15 | Meiji Seika Kaisha | Neuartige (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionat (d- phenyllaktat) dehydrogenase und für diese kodierendes gen |
US7326546B2 (en) * | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
US20090325155A1 (en) * | 2005-08-26 | 2009-12-31 | Elhammer Ake P | Aureobasin a synthetase |
AU2011210968B2 (en) | 2010-01-26 | 2015-05-07 | Mitsui Chemicals Crop & Life Solutions, Inc. | Nucleic acid structure containing a pyripyropene biosynthesis gene cluster and a marker gene |
KR102159415B1 (ko) | 2012-07-09 | 2020-09-23 | 메이지 세이카 파루마 가부시키가이샤 | Uk-2 생합성 유전자 및 그것을 사용한 uk-2 생산성을 향상시키기 위한 방법 |
ES2682743T3 (es) * | 2014-03-20 | 2018-09-21 | Technische Universität Berlin | Procedimiento de obtención de péptidos no ribosómicos mediante expresión heteróloga de al menos una sintetasa de péptido no ribosómico en Aspergillus niger |
CN106749569B (zh) * | 2017-03-03 | 2021-10-15 | 重庆乾泰生物医药有限公司 | 一种pf1022a的分离纯化方法 |
WO2018166899A1 (en) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Acidophil Ltd | Methods for production of pf1022a derivatives |
CN113046332B (zh) * | 2021-03-29 | 2023-08-01 | 华东理工大学 | 一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NO176766C (no) * | 1989-02-07 | 1995-05-24 | Meiji Seika Kaisha | Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med anthelmintaktivitet |
EP0578616A3 (en) * | 1992-07-09 | 1994-06-01 | Sandoz Ltd | Cylosporin synthetase |
WO1997000944A1 (fr) * | 1995-06-22 | 1997-01-09 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Transformant produisant la substance pf1022 et procede pour transformer des micro-organismes appartenant a la classe des hyphomycetes |
US6057491A (en) * | 1997-05-29 | 2000-05-02 | Borad Of Regents For University Of Oklahoma | Protein having insecticidal activities and method of use |
-
2000
- 2000-09-07 CA CA2384122A patent/CA2384122C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-07 KR KR1020027002704A patent/KR100702728B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-09-07 NZ NZ517588A patent/NZ517588A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-09-07 US US10/070,387 patent/US7285404B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-07 AU AU68741/00A patent/AU784466B2/en not_active Ceased
- 2000-09-07 JP JP2001522391A patent/JP3961289B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-07 AT AT00957009T patent/ATE327321T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-07 EP EP00957009A patent/EP1215281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-07 WO PCT/JP2000/006103 patent/WO2001018179A1/ja active IP Right Grant
- 2000-09-07 CN CNB008153019A patent/CN1183248C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-07 DE DE60028217T patent/DE60028217T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-06 NO NO20021100A patent/NO330902B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU6874100A (en) | 2001-04-10 |
ATE327321T1 (de) | 2006-06-15 |
DE60028217D1 (de) | 2006-06-29 |
CN1387566A (zh) | 2002-12-25 |
NO20021100D0 (no) | 2002-03-06 |
NZ517588A (en) | 2005-01-28 |
KR20020029767A (ko) | 2002-04-19 |
DE60028217T2 (de) | 2007-04-26 |
JP3961289B2 (ja) | 2007-08-22 |
CA2384122C (en) | 2010-05-04 |
EP1215281B1 (en) | 2006-05-24 |
CN1183248C (zh) | 2005-01-05 |
NO20021100L (no) | 2002-05-07 |
US7285404B1 (en) | 2007-10-23 |
EP1215281A4 (en) | 2003-07-02 |
NO330902B1 (no) | 2011-08-15 |
WO2001018179A1 (fr) | 2001-03-15 |
CA2384122A1 (en) | 2001-03-15 |
AU784466B2 (en) | 2006-04-06 |
EP1215281A1 (en) | 2002-06-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101690802B1 (ko) | 피리피로펜 a 생합성 유전자 | |
CN105586355B (zh) | 在镶片镰孢的酶缺陷突变体中产生多肽的方法 | |
CN112292452B (zh) | 生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法 | |
KR101911186B1 (ko) | 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법 | |
KR100702728B1 (ko) | 환상 뎁시펩티드 합성효소 및 그의 유전자 및 환상뎁시펩티드의 대량생산계 | |
KR101459817B1 (ko) | 신규한 사이토크롬 p450 수산화효소 및 이를 이용한 수산화된 사이클로스포린 a의 생산방법 | |
CN113462678B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶突变体 | |
WO2006085535A1 (ja) | テトラヒドロビオプテリン生合成酵素を用いたビオプテリン類の製造方法 | |
CN104928272A (zh) | 融合多肽、编码它的核酸分子以及使用它产生衣康酸的方法 | |
CN1894404B (zh) | 有机酸存在下的启动子及其用途 | |
AU783603B2 (en) | Transformant producing secondary metabolite modified with functional group and novel biosynthesis genes | |
CA2407059C (en) | Novel (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid (d-phenyllactic acid) dehydrogenase and gene encoding the same | |
RU2576001C2 (ru) | Конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие кластер генов биосинтеза пирипиропена и маркерный ген | |
TWI331630B (en) | Saponin-decomposing enzyme, gene thereof and large-scale production system f or producing soyasapogenol b | |
US20020068349A1 (en) | Gene encoding recombinant trehalose phosphorylase, vector containing the gene, transformant transformed by the gene, and method for producing recombinant trehalose phosphorylase with the use of transformant | |
JP3330670B2 (ja) | アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法 | |
CN1194002A (zh) | 来自产黄青霉的苯乙酰基CoA连接酶 | |
KR101592269B1 (ko) | 전사조절 시그마 인자 SigA-vm 및 이 인자의 과발현에 의한 글라이코펩타이드 계열 화합물의 생산성 증대 방법 | |
WO2003078616A1 (en) | Production of ugppase | |
JP2002218986A (ja) | 新規グルタミナーゼ及びその製造方法 | |
JP2004024199A (ja) | マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
AMND | Amendment | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
J201 | Request for trial against refusal decision | ||
B701 | Decision to grant | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20120302 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130304 Year of fee payment: 7 |
|
LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |