KR100695778B1 - 푸코이단을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 푸코이단의생산 방법 - Google Patents

푸코이단을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 푸코이단의생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물 및 이를 이용한 푸코이단 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 배양물에서 분리된 분획물을 해조류에 처리하여 푸코이단을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 분획물은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 활성이 있기 때문에 다양한 생리활성이 있는 푸코이단을 효율적으로 생산할 수 있는 효과가 있다.
푸코이단, 해조류, 카울로박터(Caulobacter), 효소

Description

푸코이단을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 푸코이단의 생산 방법{Microorganism producing fucoidan and method for producing fucoidan using the same}
도 1은 4개의 분리 균주가 미역귀를 분해하여 생성하는 황산기 함량을 측정한 결과이다.
도 2는 4개의 분리 균주가 미역귀를 분해하여 생성하는 푸코스 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203 균주로부터 얻은 효소 분획이 미역귀를 분해하여 생성하는 황산기 함량을 측정한 결과이다.
도 4는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203 균주로부터 얻은 효소 분획이 미역귀를 분해하여 생성하는 푸코스 함량을 측정한 결과이다.
도 5는 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp .) A2203 균주에서 분리한 해조류 다당분해제로 해조류(다시마)를 분해한 결과이다.
본 발명은 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물 및 이를 이용한 푸코이단 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 배양물에서 분리된 분획물을 해조류에 처리하여 푸코이단을 생산하는 방법에 관한 것이다.
푸코이단(fucoidan)은 평균 분자량 15~50만의 황산화 푸코스-함유 다당류의 총칭으로서, 1) 푸코스(fucose)와 황산기만으로 이루어진 황산화푸칸, 2) 글루쿠론산, 만노스, 푸코스 및 황산기를 함유하는 황산화푸코스글루로만난, 예컨대, WO 97/26896 공보에 기재된 황산화 푸코스-함유 다당-U(구성당 및 그의 몰비가 푸코스 : 만노스 : 갈락토스 : 우론산 : 황산기 = 약 10 : 7 : 4 : 5 : 20), 3) 푸코스 및 갈락토스로 이루어진 황산화푸코갈락탄, 예컨대, 국제특허출원 제PCT/JP00/00965호에 기재된 황산화푸코갈락탄(구성당 및 그의 몰비가 푸코스 : 갈락토스 = 1 : 1∼6), 및 4) 푸코스 및 만노스로 이루어진 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 등을 포함한다(Larsen, B., Acta . Chem . Scand ., 12:1395, 1970). 상기 푸코이단은 특히 홍조류 또는 다시마 및 미역 등과 같은 갈조류에 다량 함유되어 있다. 천연상태의 푸코이단은 해조류 내에서 알긴산, 단백질 및 푸코이단 등으로 이뤄진 거대분자의 구성성분 중 하나로 존재한다.
푸코이단은 항암 작용, 항종양 작용, 항혈액응고 작용, 면역력 강화 작용, 간세포 성장 촉진 작용 및 항알레르기 작용 등과 같은 다양하고 우수한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 대한민국 공개공보 제 2002-31411호에는 푸코이단의 싸이토카인 생성 조절을 요구하는 질환, 일산화질소 생성을 요구하는 질환 및 알레르기 질환의 치료 용도가 개시되어 있고, 대한민국 공개공보 제 1995-07868호에는 푸코이단의 궤양 치료 용도 및 파일로리의 정착 저해 용도가 개시되어 있으며, 대한민국 공개공보 제 2004-32992호에는 푸코이단의 유착, 관절염 및 건선 치료 용도가 개시되어 있다.
상기와 같은 다양하고 우수한 푸코이단의 활성이 알려지면서 해조류로부터 푸코이단을 분리 및 정제하기 위한 시도가 1980년대 이후 일본을 중심으로 이루어지고 있다. 일반적으로 해조류로부터 푸코이단을 생산하기 위해 사용되는 방법은 열수 추출법, 산 가수분해 추출법 및 효소 추출법 등을 포함한다.
상기 푸코이단 추출 방법들 중 산 가수분해 추출법이 가장 널리 사용되고 있다. 하지만, 산 가수분해 분해법은 중화공정을 반드시 필요로 하고, 중화적정조작이 미비할 경우 최종제품에 강산이 잔재하게 될 우려가 있다.
또한, 종래의 방법들은 푸코이단을 포함하는 수용성 성분의 추출을 용이하게 하게 하기 위하여, 통상적으로 해조류를 미세 분말화하는 전처리 과정을 거친다. 하지만, 해조류를 미세하게 분말화하면 그 표면적 확대로 인하여 수분을 과도하게 흡착하므로 추출 과정 중 과량의 용매가 필요하게 되는 문제가 있고, 또한 고형분의 함량이 매우 적어져 생산 경비에 비하여 그 수율이 현저히 낮아 비경제적이라는 문제가 있다.
본 발명자들은 해조류로부터 푸코이단을 추출하는 효과적인 방법을 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, 해조류로부터 푸코이단을 생성하는 효소를 생산하는 능력이 우수한 신규의 미생물을 분리 및 동정하고, 상기 미생물을 이용하여 해조류로부터 푸코이단을 고수율로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물을 이용하여 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해조류로부터 푸코이단을 생 산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물 및 상기 미생물의 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물의 배양물 및 상기 미생물의 배양액 또는 파쇄물에서 분리된 분획물을 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 미생물을 이용하여 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 신규의 미생물을 찾고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 자연계 200여 곳으로부터 시료를 채취하고 그로부터 미생물을 분리하여, 각 미생물의 푸코이단 생성 능력을 측정하였다. 상기 측정은 상기 미생물이 해조류 내에서 알긴산 및 라미라닌 등과 결합하여 고분자 형태로 존재하는 황산화푸코스형 다당을 황산화푸칸, 황산화푸코갈락탄(sulfateester-fucose-galactose 구성), 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 및 황산화푸코스글루로만난(sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose/xylose 구성) 등과 같은 푸코이단으로 분해시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이다. 이를 위해 구체적으로 푸코이단 형으로 분해 되어야만 검출 가능한 황산기 및 푸코스의 생성 정도를 측정하였다.
그 결과 200여개의 시료로부터 분리된 미생물 중 4종류의 미생물의 경우 황산기 함량 및 푸코스 함량이 높았으며, 이들을 각각 A2104 균주, B3321 균주, B2203 균주 및 B2206 균주로 명명하였다. 상기 4종류의 균주 중 B2203 균주 및 B2206 균주의 황산기 함량 및 구성 당 중 푸코스 함량이 상대적으로 더 높았다(도 1 및 도 2 참조).
상기에서 높은 푸코이단 생성능을 갖는 것으로 확인된 B2203 균주를 16S 리보솜 DNA(rDNA; 리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA)의 염기배열의 상동성에 기초한 분류법을 이용하여 동정한 결과 상기 B2203 균주는 카울로박터 속(Caulobacter sp.)의 신규 미생물로 확인되었다.
상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 푸코이단 생성능이 일반적인 카울로박터속 미생물의 성질인지를 확인하기 위하여, 한국유전자은행(KCCM)으로부터 상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203와 상동성이 95% 이상인 카울로박터 세그니스(Caulobacter segnis(기탁번호 : AB023427.1)), 카울로박터 비브리오이데스(Caulobacter vibrioides (기탁번호 : ATCC11764)), 카울로박터 크레세큰투스(Caulobacter cresecntus(기탁번호 : AJ227757.1))들을 분양받아 상기와 동일하게 황산기 및 푸코스 생성여부를 통해 푸코이단 생성여부를 실험한 결과 한국유전자은행(KCCM)으로부터 분양 받은 카울로박터속(Caulobacter sp.) 균주들은 푸코이단을 전혀 생성하지 못했다. 따라서, 본 발명자들은 카울로박터속(Caulobacter sp.) 미생물 중 해조류로부터 푸코이단을 생성하는 신규 미생물을 최초로 동정하였다.
상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 균학적 성질을 정리하면 하기와 같다.
1) 작용: 해조류로부터 황산화푸칸, 황산화푸코갈락탄(sulfate ester-fucose-galactose 구성), 황산화푸코스만난(sulfate ester-fucose-mannose 구성) 및 황산화푸코스글루로만난(sulfate ester-fucose-gluronic acid-mannose/xylose 구성) 등과 같은 푸코이단을 생산한다.
2) 형태적 특성 : 무색의 막대모양이며, 스턱(stalk)이 거의 대부분 중심부에 위치한다.
3) 생리화학적 성질
Gram stain negative
NaCl
≥ 0.05% required for growth +
4% tolerated -
Sugar Utilization
Glucose +
Galactose +
Mannose +
Fructose -
Sucrose +
Starch hydrolysis +
Amino acid utilization
Alanine +
Aspartate +
Glutamate +
Proline -
Utilization of primary alcohols
Methanol -
Ethanol -
Propanol -
Butaol -
Orgnic growth factors needed
Vitamin B2 -
Biotin -
생화학적, 배양학적 특성은 버기스 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)에 의거하여 분석하였다.
본 발명에 따른 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203 균주를 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 3월 24일에 기탁 신청하여, 수탁번호 KACC 91095로서 기탁하였다.
본 발명의 카울로박터속(Caulobacter sp.) 미생물을 이용하여 푸코이단을 생성할 수 있는 기질은 특별히 한정되지 않지만, 해조류가 바람직하다. 상기 해조류는 다시마(Laminaria japonica), 미역귀(Undaria pinnatifida Sporophyll), 아보레 센스(Padina arborescens), 푸쿠스 에바네센스(Fucus evanescens), 히만스리아(Himanthulia), 비푸카리아(Bifurcaria) 및 푸쿠스 베지쿨로수스(Fucus vesiculosus) 등을 포함하는 갈조류 및 에오파이세아 코다리아레스 네마시스투스(Phaeophyceae Chordariales nemacystus) 등을 포함하는 홍조류가 바람직하고, 갈조류가 보다 바람직하며, 다시마 또는 미역귀가 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물, 특히 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095) 미생물을 제공한다.
본 발명의 미생물은 통상적인 카울러박터 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다.
배양배지로는 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 해조류가 첨가된 배지를 사용할 수 있다. 예컨대, 펩톤, 이스트 추출물, 황산마그네슘, 아가 및 미역귀 분말이 함유된 배지에서 배양할 수 있다. 상기 미생물의 배양은 통상의 카울로박터 속 미생물 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 20℃ 내지 40℃에서 24시간 내지 80시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 30℃에서 72시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 상기 미생물의 배양물을 배양액과 파쇄물로 분리하게 위하여, 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따 라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 미생물의 배양액 또는 파쇄물을 당업계에 통상적인 방법으로 분자량별로 분획하여 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 수득할 수 있다. 바람직하게는 겔-컬럼 크로마토그래피에 의해 분자량 별로 분획물을 수득할 수 있다.
상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물은 푸코이단을 생산할 수 있으면 그 종류에 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 확인하기 위해, 상기 균주의 세포내 및 세포외에서 효소를 분리한 다음, 겔-칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분자량에 따라 세포외 5개 및 세포내 3개의 총 8개의 효소 분획을 얻었다. 상기에서 얻은 8개의 효소 분획에 대하여 각 온도(30℃ 및 50℃) 및 각 pH(pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 및 pH 9)에 따른 푸코이단 생성능을 푸코이단 형으로 유리되어야만 검출 가능한 황산기 및 푸코스의 함량으로 공지의 방법에 따라 측정하였다. 미역귀를 해조다당분해제로 미역귀다당액을 제조한 후 상기 미역귀다당액에 1 부피%의 각 분획물을 첨가하여 24시간 반응시켰다. 그 결과 총 8개의 효소 분획 중 CFN-2 및 CFX-2의 황산기 함량이 높게 나타났으며(도 3 및 표 4 참조), CFN-2 및 CFN-3의 푸코스 함량이 높게 나타났다(도 4 및 표 4 참조).
따라서, 상기 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물은 예컨대, 상기 CFN-2 분획의 효소, CFX-2 분획의 효소 및 CFN-3 분획의 효소일 수 있다.
카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물은 상기 미생물의 세포외 및 세포내의 분획물에서도 존재하였으므로 상기 미생물의 배양액 또는 상기 미생물의 파쇄물에서도 존재한다. 이 때, 배양액이란 상기 미생물을 본 발명에 의한 발명 또는 공지의 방법으로 배양한 경우에 상기 미생물을 제외한 나머지를 의미하며, 파쇄물이란 상기 미생물을 초음파 등 공지의 방법으로 파쇄시킨 것을 의미한다.
본 발명에 따른 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법은 보다 상세하게는, (a) 해조류를 분해하는 단계; (b) 상기 해조류분해물에서 알긴산 및 염을 제거하는 단계; (c) 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물에 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물 또는 그로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 처리하여 조푸코이단액을 얻는 단계; 및 (d) 상기 조푸코이단액을 정제하여 푸코이단을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 단계를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계: 해조류를 분해하는 단계
본 단계는 해조류를 수용성분을 함유하도록 분해하는 단계이다. 본 방법에 사용되는 해조류는 상기와 같이 갈조류 또는 홍조류인 것이 바람직하며 미역귀, 다시마가 가장 바람직하다. 상기 해조류는 공지의 방법에 의해 분해될 수 있으며, 해조류다당분해제를 가하여 분해하는 것이 바람직하다.
상기 해조류다당분해제는 해조류로부터 수용성 다당류 성분을 액화하고, 해조류 내에서 푸코이단, 알긴산 및 라미라닌 등으로 이루어진 다당복합체로부터 점질 다당류를 분해하는 효소 또는 그 효소가 포함된 조성물을 말한다. 예컨대, 상기 해조류다당분해제는 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)으로부터 분리한 것일 수 있지만, 그에 한정되는 것은 아니다.
상기 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)으로부터 분리된 해조류다당분해제는 다음과 같은 과정을 통해 얻을 수 있다. 마이크로박테리움속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)을 다시마 또는 미역 분말을 포함하는 배지(pH 7.0)상에 25℃에서 30시간동안 배양한 후 10000rpm으로 원심분리하여 세포를 침전시키고 상등액을 회수한다. 이 상등액을 해조류다당분해제로 사용할 수도 있지만, 아래와 같이 추가적인 분리과정을 거쳐 사용할 수도 있다. 즉, 회수된 상등액을 0.45μm 마이크로필터를 이용하여 1차 균체를 제거한 후, 분자량 100,000 내지 1,000,000의 조분해액(crude extract)를 분리하여 biomax 10(Phamacia co. Ltd, USA)로 pH 4.8 완충용액으로 버퍼교환을 실시한 추출액을 해조류다당분해제로 사용할 수 있다.
갈조류 등의 해조류는 고염분 및 고점성의 특성을 갖고 있어 생산현장에서의 정제 추출시 액의 추출을 높이는 공정에 무리가 따른다. 따라서 본 단계의 해조류다당분해제를 사용하면 해조류의 조체(藻體)를 신속하게 분해 시킬 수 있고, 수용성 다당류 성분을 효율적으로 액화할 수 있으며, 추출된 다당복합체에서 알긴산 등의 점질 다당류를 분해하여 그 점도를 낮출 수 있으므로, 푸코이단의 추출수율을 높일 수 있다. 본 단계의 해조류 다당분해제를 해조류에 대해서 반응시킨 결과는 도 5와 같다.
본 단계 이전에 1 중량부의 해조류를 10~20 중량부의 물로 수세하여 탈염한 후, 90 ~100℃의 열수로 수세하는 것이 바람직하다. 갈조류 등의 해조류는 염분의 농도가 높기 때문에 농축 공정 후 염의 제거비용이 높아지는 문제가 있으며, 또한 본 발명과 같이 해조류다당분해제의 처리를 통하여 가공하는 경우 외부 유래의 나트륨, 염소이온 등의 영향을 최소화할 필요가 있기 때문이다. 또한, 조해성으로 인한 분말화 공정의 난이성 등 이후 가공적성을 다양화하기 위해서도 본 탈염 공정을 수행하는 것이 바람직하다. 상기와 같이, 90~100℃의 열수로 수세함으로써 해조류가 물을 흡수하는 시간을 줄일 수 있다.
(b) 단계: 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물 제조 단계
본 단계는 (a)단계에서 제조한 해조류분해물에서 알긴산을 제거하고 탈염하는 단계이다.
알긴산의 제거는 알긴산의 등전침전을 이용하는 방법 또는 알긴산과 침전을 형성하는 염을 가하는 방법과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예컨대 에틸알콜 및 염화칼슘을 첨가하여 알긴산을 침전시키고 여과하여 알긴산을 제거할 수 있다.
여액을 회수하고, 이를 수차례 한외여과하여 탈염 및 농축시킨다. 이 때, 이후 (c)단계에서 효소에 의해 원활하게 분해작용이 일어날 수 있도록, 정제수를 가하여 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물 내 고형물의 함량이 약 5 Brix(60cP 정도의 점도) 내지 10 Brix(80cP 정도의 점도)로 조정하는 것이 바람직하다.
(c) 단계: 조푸코이단을 얻는 단계
본 단계는 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물에 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물, 상기 미생물의 배양액, 상기 미생물의 파쇄물 또는 상 기 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 처리하여 조푸코이단액을 얻는 단계이다. 이 때 상기 미생물, 상기 미생물의 배양액, 상기 미생물의 파쇄물 또는 상기 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물을 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물에 0.7 부피% 내지 1.0 부피%로 첨가하여 반응시키는 것이 바람직하다.
상기 미생물, 상기 미생물의 배양액, 상기 미생물의 파쇄물 또는 상기 미생물로부터 생성되는 푸코이단 생산 활성이 있는 분획물의 작용에 의하여 라미라닌 등과 결합하여 고분자 다당으로 존재하는 황산화푸코스형 다당이 황산화푸코갈락탄, 황산화푸코스만난 및 황산화푸코스글루로만난 등의 푸코이단으로 유리되어 조푸코이단액을 얻을 수 있다. 생성된 푸코이단은 분해 시간, 효소의 양에 따라 가변적일 수 있으나, 통상 평균 분자량 50만 정도의 푸코이단이다.
추가적으로 상기 조푸코이단액을 고온 및 고압 하에서 추출하여 저분자 푸코이단을 획득할 수 있다. 상기 고온 및 고압 추출은 100~135℃, 1.0~2.0 kgf/cm2 에서 1~3시간 동안 수행되는 것이 바람직하며 이로써 저분자 푸코이단을 획득할 수 있다. 추출 시간이 길수록 저분자량의 푸코이단을 얻을 수 있으며, 특히 2시간 이상 추출할 경우 평균 분자량 7000 정도의 저분자 푸코이단을 함유하는 조푸코이단액을 얻을 수 있다. 이는 일본 등에서 시도 되어지고 있는 초저분자 푸코이단기술에 상응하는 안전한 분해법이다.
(d) 푸코이단 수득 단계
본 단계는 상기 조푸코이단액을 정제하여 푸코이단을 수득하는 단계로서, 상기 조푸코이단액을 한외여과로 탈염, 농축한 후 이온교환칼럼에서 NaCl 농도구배로 용출하여 분획을 얻고, 분획물의 황산기 및 구성당조성을 측정하여 함량이 높은 분획을 수집하여 푸코이단을 수득한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
푸코이단 생성능을 갖는 미생물의 탐색
<1-1> 미생물의 분리 및 배양
1999년부터 전남 여수 인근의 해안, 토양, 식물체, 동물체 및 가축분변 등으로부터 200여개의 시료를 채취하였다. 상기 각 시료를 하기 표 1의 각 배지를 이용하여 1주일동안 계대배양한 다음 종균배양하였다. 하기 표 1의 각 배지는 분리 할 미생물 상을 고려하여 A는 박테리아, B는 진균, C는 해양박테리아의 분리를 위한 배지조성이다. 상기에서 배양된 각 미생물 시료를 A배지에서 48시간, B배지에서 96시간, C배지에서 48시간 배양하여, 박테리아 및 해양박테리아는 순수분리 후 그람염색하고 현미경 검경을 거친 후 보관하여 사용하였고, 진균류는 분리 후 재분리 배양하여 보관하였다.
조성물 A 배지(박테리아 분리용) B 배지(진균 분리용) C 배지(해양박테리아 분리용)
글루코스 1g 0.5g 1g
펩톤 5g 3g 3g
효모 추출물 1g 3g 1g
말트 추출물 0.5g 2g 1g
알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물 50mL(고형분 5 Brix) 50mL(고형분 5 Brix) 50mL(고형분 5 Brix)
알긴산 및 염이 제거된 다시마 해조류분해물 20mL(고형분 5 Brix) 20mL(고형분 5 Brix) 20mL(고형분 5 Brix)
NaCl 최종농도 20%
감자분말 5g
<1-2> 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물 제조
미역귀(Undaria pinnatifida Sporophyll) 200g을 증류수 2kg으로 2차례 수세하여 원료에 묻어 있는 만니톨 및 염분을 제거하였다. 여기에 90℃의 증류수 2kg을 가한 다음, 4℃의 증류수 1.6kg을 추가로 가하여 약 50℃로 맞춘 후, 구연산-탄산나트륨 버퍼를 첨가하여 pH 4.8로 조정하였다. 여기에 해조류다당분해제로서 본 발명자들이 기탁한 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096) 미생물로부터 분리한 해조류다당분해제(대한민국 특허출원 제2004-21662호)를 30g을 첨가하고 8시간 동안 분해하여 수용성성분을 액화하였다. 이를 다시 121℃에서 10분간 처리하여 점성을 60cP(25℃)이하로 낮추었다. 상기 해조류분해물에 에틸알콜을 1.7kg 첨가하고, 염화칼슘을 25g 첨가하여 30℃에서 2시간 교반하고, 원심분리(17,000g, 20분)하여 상등액을 수득하여 25㎛의 여과포가 장착된 원심탈수기에서 여과(1차 여과액 수득)하였다. 여과되지 않은 잔사를 증류수로 다시 수세하여 원심분리(17,000g, 20분)한 상등액을 상기와 같이 25㎛의 여과포가 장착된 원심탈수기에서 여과하여 여과액을 수득한다. 수득한 여과액을 상기 1차 여과액과 합친 후 한외여과기(Millipore Co. Ltd, USA) MWCO 5,000으로 4회 탈염 및 농축하였다. 여기에 증류수를 투입하여 고형분 함량이 5 Brix(60cP 점도; 25℃)이하 또는 10 Brix(80cP 점도; 25℃) 이하가 되도록 조정하여 알긴산 및 염이 제거된 해조류분해물을 제조하였다.
한편, 다시마(Laminarea japonica)에 대해서도 상기 방법과 동일하게 해조류분해물을 제조하였다.
<1-3> 푸코이단 생성능이 우수한 균주 분리
해조류로부터 푸코이단을 생성할 수 있는 미생물을 확인하기 위하여, 기질로서 상기 실시예 <1-2>에서 제조된, 고형분 함량이 10 Brix인 해조류분해물을 이용하여 상기 실시예 <1-1>에서 채취 및 분리한 각 미생물의 푸코이단 생성능을 조사하였다. 즉, 상기 실시예 <1-1>에서 채취 및 분리한 균주를 다시 종균 배양하고, 상기 해조류분해물에 대하여 1 부피%의 양으로 접종한 후 7시간 동안 방치하였다. 이후 하기의 방법에 따라 황산기 함량을 측정하고 구성 당 중 푸코스 함량을 측정하였다.
황산기 함량의 측정은 공지의 방법(Dogson, K. S. et al ., A Note on the Determination of the Ester Sulphate Content of Sulphated Polysaccharides. Biochem. J., vol 84, 106, 1962)에 따라 수행하였다. 즉, 상기 분해액 0.3mL에 4% TCA용액(Trichloroacetic acid, Sigma Co. Ltd, USA> 3.8mL 및 염화바륨-젤라틴시약 1mL를 첨가 및 교반한 다음 20분간 방치하여 360nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선은 K2SO4(Sigma Co. Ltd., USA)로 하였다. 이 때 염화바륨-젤라틴시약은 증류수 400ml에 젤라틴 2g 넣고 65℃에서 완전히 녹이고 4℃에서 하룻밤 방치한 후 염화바륨 2g을 넣어 녹이고 2시간동안 방치한 후 사용하였다.
푸코스 함량의 측정은 공지의 방법(Somogyi-Nelson법)에 따라 수행하였다. 즉, 조제한 시료용액 1㎖와 구리시약 1㎖를 시험관에 각각 넣고, 수조(water bath)에서 20분간 가열하여 산화 제1구리(Cu2O)를 생성시켰다. 여기에 몰리브덴용액 1㎖를 가하여 발색시킨 후 520㎚에서 흡광도를 측정하고, 검량선으로부터 푸코스-환원당을 정량하였다. 단, 검량선 작성시 푸코스를 표준품으로 하여 측정하였다.
구성 당 조성의 분석은 이온 크로마토그래피를 이용하여 수행하였다. 시료 50ml를 원심분리하여 상등액을 반응 바이얼(reaction vial)에 취하고 1N HCl 5ml를 가하여 110℃에서 5시간동안 가수분해한 후 NaOH로서 중화하고 증류수 20ml로 희석하여 감압농축 후 동결건조하여 분석시료로 하였다. 분석시료 1g을 증류수 10ml에 녹인후 Amberite IR 200에 통과시켜 금속이온을 먼저 제거한 뒤 이후 셉-팩(Sep-pak) 카트리지(Waters Co., LTD, USA)로 탈염하여 하기 표 2의 ion chromatography(IC) 분석조건으로 측정하였다. 표준 구성당으로는 L-fucose, D-galactose, D-xylose, L-ribose, D-glucose, L-rhamnose, mannitol을 사용하였고 standard peak에 대한 면적비로 구성당 함량을 산출하였다.
장치 디오넥스 600 이온크로마토그래피(Dionex Co., Ltd, USA)
칼럼 카보팩-PA10(Dionex Co., Ltd, USA)
용출액 16 mM NaOH
유속 1.0 mL/분
주입 부피 20 ㎕
검출 Amms-ice
분석 시간 60분 /1 샘플
그 결과 200여개의 시료로부터 분리된 미생물 중 황산기 함량 및 푸코스 함량이 높은 4종류를 선정하고, 각각 A2104 균주, B3321 균주, B2203 균주 및 B2206 균주로 명명하였다. 상기 4종류의 균주에 대한 황산기 함량 및 구성 당 중 푸코스 함량을 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다. 도 1 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 4종류의 균주 중 B2203균주 및 B2206 균주의 황산기 함량 및 구성 당 중 푸코스 함량이 A2104 균주 및 B3321 균주에 비해 상대적으로 높았다. 상기 결과로부터 B2203 균주 및 B2206 균주의 푸코이단 생성능이 가장 우수함을 알 수 있다.
<1-4> 푸코이단 생성능이 우수한 B2203 균주의 동정
상기에서 높은 푸코이단 생성능을 갖는 것으로 확인된 B2203 균주를 16S 리보솜 DNA(rDNA; 리보솜 RNA를 인코딩하는 DNA)의 염기배열의 상동성에 기초한 분류법을 이용하여 동정하였다. 동정 결과 상기 B2203 균주는 카울로박터속(Caulobacter sp.)의 신균주로 확인되었다.
상기 미생물의 생화학적, 배양학적 특성을 버기스 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)에 의거하여 분석한 결과 하기 표 3과 같았다.
Shape rod
Color colorless
Gram stain negative
Morphology Stalk invariably central
NaCl
≥ 0.05% required for growth +
4% tolerated -
Sugar Utilization
Glucose +
Galactose +
Mannose +
Fructose -
Sucrose +
Starch hydrolysis +
Amino acid utilization
Alanine +
Aspartate +
Glutamate +
Proline -
Utilization of primary alcohols
Methanol -
Ethanol -
Propanol -
Butaol -
Orgnic growth factors needed
Vitamin B2 -
Biotin -
상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 푸코이단 생성능이 카울로박터속 미생물의 일반적인 성질인지를 확인하기 위하여, 한국유전자은행(KCCM)으로부터 상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203 와 상동성이 95% 이상인 카울로박터 세그니스(Caulobacter segnis (AB023427.1)), 카울로박터 비브리오이데스(Caulrobacter vibrioides (ATCC11764)), 카울로박터 크레세큰투스(Caulobacter cresecntus (AJ227757.1))을 분양받아 상기와 동일한 실험을 수행한 결과 한국유전자은행(KCCM)으로부터 분양 받은 카울로박터속(Caulobacter sp.) 균주들의 황산기 흡광도는 0.325 이하로 현저히 낮았고, 구성 당 중 푸코스에 해당하는 피크는 전혀 관측되지 않았다. 상기 결과로부터, 상기 신균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203의 푸코이단 생성능은 상기 균주의 독특한 균학적 성질임을 확인할 수 있었다.
상기 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203을 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 3월 24일에 기탁 신청하여, 수탁번호 KACC 91095로서 기탁하였다.
<실시예 2>
카울로박터속 ( Caulobacter sp .) B2203로부터 푸코이단 생성 효소의 정제
<2-1> 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203로부터 효소 분획의 분리
상기 균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203로부터 균체내 및 균체외 조효소액을 분리하여 SDS-PAGE 전기영동으로 분자량 분포를 확인한 후 유효분자량 범위에서 겔-칼럼 크로마토그래피를 통하여 분자량 별로 분획을 수득하였다.
즉, 상기 균주 카울로박터속(Caulobacter sp.) B2203을 Peptone(Difco, USA) 2.0g, Yeast extract(Difco, USA) 1.0g, MgSO4?7H2O(Sigma Co Ltd, USA) 0.2g, Agar 10.0g, 증류수 1.0 L, 미역귀 분말 3g이 포함된 배지에 접종하여 10L 발효기(Korea fermenter Co., Ltd, Korea)에서 30℃를 유지하며 72시간동안 통기배양한 후 각각 균체외 조효소액 및 균체내 조효소액을 분리하였다.
균체외 조효소액은 상기 배양된 균주을 17,000g로 원심분리 한 후 상등액을 취하여 다중필터프레스(KHS Processtechnik, Germany) 9장으로 1차 여과하고, 0.1㎛ 마이크로여과기(millipore)로 2차 여과한 다음, 한외여과기(millipore) MWCO(molecular weight cut off) 5000으로 컷오프 하여 3회 반복 농축 탈염하였다. 이후 상기 조효소액 1mL을 취하여 유속 0.5ml/분, 이동상 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 OHpak SB-803, 804, 805, 806 HQ 컬럼을 사용하여 겔-침투 크로마토그래피(GPC, gel permeation chromatography) 로 280nm에서 분자량 분포를 확인하고, SDS-PAGE로 분자량을 확인한 뒤 유속 1ml/min, 이동상 (phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 Biogel p-100(Biorad Co Ltd)을 이용한 겔-칼럼 크로마토그래피(Gel-column chromatography; Biorad Co. Ltd, USA)를 통하여 해당 분자량 범위를 수집하여 분획하였다. 그 결과 5개의 분획을 획득하였고, 이를 CFX-1(평균분자량 85kD), CFX-2(평균분자량 73kD), CFX-3(평균분자량 52kD), CFX-4(평균분자량 13kD) 및 CFX-5(평균분자량 5.7kD)로 명명하였다. 이후 상기 각 분획에 pH 7.0의 인산완충용액을 5배의 양으로 첨가한 후 한외여과기 MWCO 5000으로 탈염 하였다.
균체내 조효소액은 상기 균주를 배양 후 17,000g로 원심분리 한 다음 상등액을 제거하고 균체를 회수하여 pH 7.0의 인산완충용액을 첨가하였다. 이후 초음파파쇄기로 균체를 파쇄한 다음, 상기 균체내 효소의 분획 방법과 동일한 방법을 사용하여 분획을 정제하였다. 그 결과 겔-칼럼 크로마토그래피(Gel-column chromatography; Biorad Co. Ltd)를 통하여 3개의 효소액 분획을 획득하였으며, 이를 각각 CFN-1(평균분자량 71kD), CFN-2(평균분자량 54kD) 및 CFN-3(평균분자량 27kD)으로 명명하였다.
<2-2> 푸코이단 생성 효소의 확인
상기 실시예 <2-1>에서 얻은 각 효소액 분획에 대하여 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 미역귀의 해조류분해물을 기질로 하여 푸코이단 분해실험을 수행하였다. 본 실시예에서는 푸코이단 형으로 유리되어야만 검출 가능한 황산기 및 구성 당 중 푸코스의 함량을 측정하였다.
상기 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물에 대하여 상기 각 효소액을 1 부피%가 되게 첨가한 후 24시간 반응시켰다. 이후 황산기 함량을 측정하고 구성 당 조성을 분석하였다. 구체적인 황산기 함량 측정 및 구성 당 중 푸코스의 함량 측정은 상기 실시예 <1-3>에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하여, 다양한 pH(pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 및 pH 9)의 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물에 대하여 수행하였다. 또한, 상기 각 조건의 측정 과정은 30℃ 및 50℃의 반응 온도로 측정하였다.
50℃에서 수행된 CFX-1, CFX-2, CFX-3, CFX-4, CFX-5, CFN-1, CFN-2 및 CFN-3의 분획의 황산기 함량 및 푸코스 함량을 도 3, 도 4 및 표 4에 각각 나타내었다. 도 4 및 표 4의 경우 알긴산 및 염이 제거된 미역귀 해조류분해물의 pH는 5.0인 결과이다. 도 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 황산기 함량은 CFN-2가 가장 높고 CFX-2가 그 뒤를 이었으며, 기질의 pH가 5.0일 때 가장 높고 pH 6.0일 때 다음으로 높았다. 또한, 도 4 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 푸코스 함량은 CFN-2가 가장 높고 CFN-3가 뒤를 이었다. 한편, 온도 조건은 50℃가 바람직하였으나 30℃와 큰 차이를 보이지 않았다.
분획 분해물의 황산기함량 (ABS 360nm) 분해물의푸코스함량 (ABS 520nm) 분획 평균분자량(Dalton)
CFX-1 0.402 0.020 85,000
CFX-2 0.821 0.040 73,000
CFX-3 0.556 0.025 52,000
CFX-4 0.454 0.035 13,000
CFX-5 0.354 0.012 5,700
CFN-1 0.604 0.015 71,000
CFN-2 1.210 0.099 54,000
CFN-3 0.304 0.065 27,000
상기 결과로부터, 본 발명의 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203)(KACC 91095)으로부터 분리된 효소액 중 CFN-2의 푸코이단 생성 능력이 가장 우수하고, CFX-2 및 CFN-3이 다음으로 우수함을 알 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 카울로박터 속(Caulobacter sp.) 미생물은 해조류로부터 푸코이단을 생산하는데 매우 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 미생물을 이용하는 경우 종래 산 분해 추출법에 비해 안전성의 향상, 생산 비용의 감소 및 생산 수율의 향상을 가져올 수 있으므로, 식품, 화장품 및 약품 분야에서 주목받는 푸코이단을 대량생산할 수 있는 장점이 있다.

Claims (14)

  1. 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095) 미생물.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 미생물을 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095) 미생물의 배양방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 배지에 해조류를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항의 방법으로 배양된 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095) 미생물의 배양물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항의 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095) 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 해조류에 처리하는 단계를 포함하는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    (a) 해조류를 분해하는 단계;
    (b) 상기 해조류 분해물에서 알긴산 및 염을 제거하는 단계;
    (c) 상기 알긴산 및 염이 제거된 해조류 분해물에 제 1항의 카울로박터 속(Caulobacter sp.) B2203(KACC 91095) 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 해조류에 처리하여 조푸코이단액을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 조푸코이단액을 정제하여 푸코이단을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 해조류로부터 푸코이단을 생산하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 (a)단계는 해조류에 해조류다당분해제를 가하여 분해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 해조류를 수세하여 탈염한 후 열수로 수세하는 해조류 전처리 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, (c)단계의 조푸코이단액을 100 ~ 135℃ 및 1.0 ~ 2.0 kgf/cm2 하에서 추출하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8항 내지 제 12항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 해조류는 다시마(Laminaria japonica), 미역귀(Undaria pinnatifida Sporophyll), 아보레센스(Padina arborescens), 푸쿠스 에바네센스(Fucus evanescens), 히만스리아(Himanthulia), 비푸카리아(Bifurcaria), 푸쿠스 베지쿨로수스(Fucus vesiculosus) 및 에오파이세아 코다리아레스 네마시스투스(Phaeophyceae Chordariales nemacystus)로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 해조류다당분해제가 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) A2203(KACC 91096)에서 분리된 것임을 특징으로 하는 방법.
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KR20050096450A (ko) * 2004-03-30 2005-10-06 배태진 다시마, 미역 분해능을 지닌 신규 마이크로박테리움 속 균주 와 그 효소

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KR20050096450A (ko) * 2004-03-30 2005-10-06 배태진 다시마, 미역 분해능을 지닌 신규 마이크로박테리움 속 균주 와 그 효소

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1020050087436 - 756492
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