KR100694569B1 - 항염증 활성을 갖는 우묵사스레피 추출물 및 이로 부터분리된 화합물을 함유하는 조성물 - Google Patents
항염증 활성을 갖는 우묵사스레피 추출물 및 이로 부터분리된 화합물을 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 우묵사스레피(Eurya emarginata) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 유티고사이드 B, C(Eutigoside B,C)를 함유하는 항산화 및 항염증 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 추출물 또는 화합물 유티고사이드 B, C는 TNF-α, IL-6, IL-1β 등과 같은 초기-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생성억제, iNOS의 발현 및 COX-2의 생성억제효과를 유도함으로서 항산화 및 항염증 효과를 나타낸다.
항염증, 항산화, 사이토카인, 우묵사스레피, 유티고사이드 B, 유티고사이드 C
Description
도 1은 RAW 264.7 세포에서의 NO의 각 용매 분획물의 생성저해 효과를 나타낸 도이고,
도 2는 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성에 대한 우묵사스레피의 성분들의 저해 효과를 나타낸 도이고,
도 3은 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성에 대한 유티고사이드 B의 농도에 따른 저해효과를 나타낸 도이며,
도 4는 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성에 대한 유티고사이드 C의 농도에 따른 저해효과를 나타낸 도이며,
도 5은 RAW 264.7 세포에서의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 각 용매 분획물의 생성저해 효과를 나타낸 도이며,
도 6은 RAW 264.7 세포에서의 TNF-α 생성에 대한 유티고사이드 B 와 C의 저해 효과를 나타낸 도이며,
도 7는 RAW 264.7 세포에서의 IL-6 생성에 대한 유티고사이드 B 와 C의 저해 효과를 나타낸 도이며,
도 8는 활성화된 대식세포에서의 초기-염증성 사이토카인 mRNA 발현에 대한 우묵사스레피 추출물의 저해효과를 나타낸 도이며,
도 9은 활성화된 대식세포에서의 초기-염증성 사이토카인 mRNA 발현에 대한 우묵사스레피 하부 분획물의 저해효과를 나타낸 도이며,
도 10는 활성화된 대식세포에서의 iNOS, COX-2 및 β-액틴 mRNA 발현에 대한 우묵사스레피 하부 분획물의 저해효과를 나타낸 도이고,
도 11는 활성화된 대식세포에서의 초기-염증성 사이토카인 mRNA 발현에 대한 유티고사이드 B 와 C의 저해효과를 나타낸 도이고,
도 12은 활성화된 대식세포에서의 항염증 사이토카인 mRNA 발현에 대한 유티고사이드 B 와 C의 저해효과를 나타낸 도이고,
도 13는 활성화된 대식세포에서의 iNOS 및 β-액틴 생성 단백질 발현에 대한 우묵사스레피 추출물의 저해효과를 나타낸 도이며,
도 14은 활성화된 대식세포에서의 iNOS 및 β-액틴 생성 단백질 발현에 대한 우묵사스레피 하부 분획물의 저해효과를 나타낸 도이고,
도 15는 활성화된 대식세포에서 iNOS 생성 단백질 발현에 대한 유티고사이드 B 와 C의 저해효과를 나타낸 도이며,
도 16은 활성화된 대식세포에서 COX-2 단백질 발현에 대한 유티고사이드 B 와 C의 저해효과를 나타낸 도이며,
도 17은 우묵사스레피의 생리활성성분의 분리 과정을 나타낸 도이며,
도 18은 우묵사스레피의 생리활성성분의 분리 과정 중 에틸아세테이트/메탄올(10:1/ v/v) TLC 상의 스팟(spot)을 나타낸 도이고,
도 19은 우묵사스레피의 생리활성성분의 분리 과정 중 에틸아세테이트 분획 5-4의 TLC 상의 스팟(spot)을 나타낸 도이다.
도 20은 우묵사스레피로부터 유티고사이드 B와 C 분리 과정을 나타낸 도이며,
도 21은 유티고사이드 B의 1H-NMR 과 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이며,
도 22는 유티고사이드 C의 1H-NMR 과 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
본 발명은 항산화 및 항염증 활성을 갖는 우묵사스레피(Eurya emarginata) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물인 유티고사이드 B와 C를 함유하는 조성물로서, 각종 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침 윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
생체에 있어서 염증의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 니트릭옥사이드(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.
최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇 가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(induced NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35
, pp27-28, 1996).
또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Weisz A., Biochem. J., 316, pp209-215, 1996). NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 결장암(colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.
NF-κB는 Rel 유전자계(Rel gene family)의 핵단백질로서, 세포질에서는 I-κB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나, 유해산소(reactive oxygen), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1 (Interleukin-1)과 같은 케모카인(chemokines) 및 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 다양한 자극에 의해 I-κB 키나제(kinase)가 활성화된 후 인산화 과정을 통해 I-κB가 떨어져 나가게 된다. p50과 p65의 헤테로다이머(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 활성화된 후, 핵으로 이동하여 염증 반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Oh, G. T. et al., Atherosclerosis, 159(1), pp17-26, 2001 : Epstein, F. H. et al., The New England Journal of Medicine, 336(15), pp1066-1071, 1997 : Zhang W. J. et al., FASEB J., 15(130), pp2423-2432, 2001 : Denk, A. et al., J. Biol. Chem., 276(30), pp28451-28458, 2001 : Sahnoun Z. et al., Physiology, 53(4), pp315-339, 1998 : Lindner V., Pathobiology, 66(6), pp311-320, 1998 : Landry, D. B. et al., Am. J. Pathol., 151(4), pp1085-1095, 1997 : Gerritsen, M. E. et al., Am. J. Pathol., 147(2), pp278-292, 1995).
TNF-α와 같은 다 기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다(Verhoef, J. et al., J. Antimicrob. Chemother.,
35, 1996). 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 PGE2의 생성 억제를 통해 초기염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다. 세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇽(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다(Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am.,
74, 1994 : Giroir, B. P., Crit. Care Med.,
21, 1993 : Yamaguchi, Y. et al., J. Reticuloendothel. Soc.,
409
, 1982). 그러므로 약물 처리를 하여 LPS의 작용을 줄임으로서 효과를 볼 수 있을 것이다. 현재까지의 비스테로이드성 항-염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.
본 발명의 우묵사스레피(Eurya emarginata)는 차나무과의 상록 관목수로 제주도 같은 따뜻한 도서지방의 바닷가 산지에서 자라는 것으로, 민간에서는 이뇨와 담 제거 등의 약재로 쓰이고 있다(김태정, 한국의 자원식물(Ⅲ). 서울대학교 출판부, pp114-115, 1996). 그러나, 그 잎의 성분이나 생리활성에 대한 보고는 거의 없는 실정이다. 또한 상기 문헌 어디에도 우묵사스레피 추출물 및 이로 부터 분리된 화합물이 항염증 활성을 가지고 있음이 개시되거나 교시된 바 없다.
이에 본 발명자들은 민간에서 흔히 쓰이고 있는 이러한 천연물의 활성 성분을 추출하여 염증성 사이토카인 억제효과 및 그 작용기전을 관찰하여, 우묵사스레피 추출물의 우수한 항염증 효과를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항산화 및 항염증 효능을 갖는 우묵사스레피 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물인 유티고사이드 B와 C를 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 및 항염증 효과를 갖는 우묵사스레피 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 염증 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 우묵사스레피 유기용매 추출물은 우묵사스레피의 전초, 줄기, 잎 및 뿌리, 바람직하게는 우묵사스레피의 잎을 추출한 것을 사용할 수 있다.
상기 유기용매 추출물로는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C1 내지 C4의 저급알콜 등의 극성용매, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 등의 비극성용매 및 이들의 혼합용매로부터 추출된 추출물을 포함한다. 바람직하게는 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로부터 추출된 추출물을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 우묵사스레피 추출물로부터 분리된 항산화 및 항염증 효과를 갖는 하기 일반식 (Ⅰ) 의 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허 용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 염증관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.
상기 일반식 (Ⅰ)에서 R은 H 또는 OH기 이다.
본 발명에서 상기 일반식 (Ⅰ)에서 R이 H기인 경우는 유티고사이드 C(Eutigoside C)이고, R 이 OH기인 경우는 유티고사이드 B(Eutigoside B)로 명명한다.
상기 염증 관련 질환에는 류마티스 관절염, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 또는 염증성 장 질환이 포함된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
구체적으로, 본 발명의 우묵사스레피 추출물은 우묵사스레피 잎을 채집하여 음건한 다음 마쇄하여 분말화한 후, 우묵사스레피 시료 중량의 약 2 내지 20배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올을 가하여 20 내지 50℃에서 약 10시간 내지 48일, 바람직하게는 20시간 내지 30시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한 후에, 이를 통상의 방법에 따라 여과, 농축 및 건조하여 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 비극성 용매 가용 추출물은 상기 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 현탁액이 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수도 있으며, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis,
3rd Ed., p6-7, 1998).
예를 들어, 바람직한 본 발명의 우묵사스레피 유기용매 추출물은 상기의 메탄올 추출물에 에탄올, 부탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합용매, 바람직하게는 헥산, 부탄올, 에틸아세테이트로 계통적 추출방법에 의하여 수득될 수 있고, 특히 건조한 우묵사스레피 잎을 에틸아세테이트 및 부탄올로 추출하여 추출물을 얻은 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물을 수득할 수 있다.
더욱 구체적으로는 상기 공정으로 수득된 우묵사스레피 비극성용매 가용추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 용출용매로 20 내지 100%의 메탄올을 사용하여 역상 컬럼크로마토그래피를 수행하여 5 내지 8개의 분획으로 분리 한 후, 하부 분획 1을 디클로로메탄:아세톤:메탄올을 3 : 2 : 0, 1 : 4 : 0, 2 : 7 : 1의 비율로 혼합하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피를 수행하여 30내지 32개의 분획으로 분리하여 이중 하부분획 26과 30에서 각각 RP HPLC를 수행하여 본 발명의 유티고사이드 B와 C 화합물을 각각 수득할 수 있다.
본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 우묵사스레피 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물인 유티코사이드 B와 C를 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.
또한, 우묵사스레피는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물들 또는 이로 부터 분리된 화합물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
본 발명의 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 염증 관련 질환의 예방 효과를 나타내는 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 유티고사이드 B와 C 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
또한, 염증 관련 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본원에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하며 하기에 예시한다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 또는 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 우묵사스레피 메탄올 조추출물의 제조
제주도에 자생하고 있는 우묵사스레피의 잎을 채집하여 음건한 다음, 마쇄기로 갈아 미세말한 후, 우묵사스레피 잎 미세말 시료 175.8g에 80% 메탄올 2ℓ를 가한 후 상온에서 24시간 동안 교반하여, 진공여과에 의해 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은 후, 감압농축하여 우묵사스레피 메탄올 조추출물 58.21g을 수득하였다.
실시예 2. 용매별 우묵사스레피 분획물의 제조
상기 실시예 1에서 얻은 우묵사스레피 잎 메탄올 조추출물 58.21g을 물 1ℓ에 현탁시킨 후에, 헥산(1ℓ×3), 에틸아세테이트(1ℓ×3), 부탄올(1ℓ×3)로 각각 추출하여 각각의 분획을 진공건조하여 헥산 분획물(0.518g), 에틸아세테이트 분획물(9.976g), 부탄올 분획물(8.09g)을 수득하였다. 마지막으로 남은 수층을 감압농축하여 수층 분획물(8.759g)을 수득하였다. 이들 추출물 분획 중에서 에틸아세테이 트 추출물 분획 9.976g을 10㎖ 에틸아세테이트에 용해시킨 후 실리카겔(Kiesel gel 60)을 이용한 컬럼크로마토그래피(컬럼크기: 3×5㎝, 용출액: 에틸아세테이트/메탄올(10:1/ v/v), 유속;10㎖/분)로 분리하였으며, 동시에 동일용매로 TLC를 실시하여 TLC 상의 스팟(spot)의 Rf치 약 0.1 간격으로 7개의 분획을 분리하여 감압농축하였다. 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획 8.09g을 10㎖ 부탄올에 용해시켜 부탄올 분획 4개를 분리하여 감압농축하였다. 여기서 얻은 분획물을 실험시료로 사용하였다(도 17 내지 도19 참조).
실시예 3. 용매별 우묵사스레피 분획물로부터 유티고사이드의 분리 및 동정
상기 실시예 2에서 수득한 에틸아세테이트 분획물의 일부(1.5g)를 취하여 메탄올을 20 내지 100 %로 점점 증가시켜 역상 이산화 규소(SiO2) 컬럼을 통하여 5개의 분획물(fr.1 내지 fr.5)을 얻었다. 극성 분획물 fr.1(603㎎)은 디클로로메탄 : 아세톤 : 메탄올을 3 : 2 : 0 , 1 : 4 : 0 , 2 : 7 : 1의 비율로 한 세파덱스 LH-20컬럼 크로마토그래피를 이용하여 32개의 분획물을 수득하였다. 이 분획물 중에서 fr.26 (13㎎) 및 fr.30 (30㎎)을 C18 HPLC로 더욱 정제하여 하기와 같은 분광학적 데이터를 갖는 유티고사이드 C (5.3㎎) 및 유티고사이드 B(3.8㎎)를 수득하였다.(도 20참조)
유티고사이드 B : C
23
H
26
O
10.
1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) δ ppm 7.63 (1H, d, 16.0, H7''), 7.47 (2H, d, 8.6, H2'', H6''), 6.97 (2H, m, H2, H6), 6.81 (2H, br d, 8.6, H3'', H5''), 6.35 (1H, d, 16.0, H8''), 6.07 (2H, d, 10.0, H3, H5), 4.48 (1H, dd, 12.0, 2.2, H6'), 4.29 (1H, dd, 12.0, 6.0, H6'), 4.24 (1H, d, 7.8, H1'), 3.92 (1H, dt, 11.9, 6.1, H8), 3.64 (1H, dt, 11.9, 6.1, H8), 3.49 (1H, dd, 9.0, 6.0, H5'), 3.31-3.39 (2H, m, H3', H4'), 3.16 (1H, dd, 9.0, 7.8, H2'), 2.04 (2H, t, 6.1, H7).(도 21 참조)
13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) δ ppm 187.8 (C4), 169.1 (C9''), 161.4 (C4''), 154.4 (C2), 154.3 (C6), 146.8 (C7''), 131.2 (C2'', C6''), 128.0 (C3), 127.9 (C5), 116.9 (C3'', C5''), 115.0 (C8''), 104.4 (C1'), 77.9 (C3'), 75.5 (C5'), 75.0 (C2'), 71.8 (C4'), 69.2 (C1), 65.9 (C8), 74.6 (C6'), 41.0 (C7).(도 21 참조)
유티고사이드 C : C
23
H
26
O
9
.
1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) δ ppm 7.71 (1H, d, 16.0, H8''), 7.62 (2H, m, H2'' and H6''), 7.40 (3H, m, H3'', H4'', H5''), 6.97 (2H, m, H2, H6), 6.56 (1H, d, 16.0, H8''), 6.06 (2H, br d, 10.4, H3, H5), 4.50 (1H, dd, 11.8, 2.0, H6'), 4.32 (1H, dd, 11.8, 2.0, H6'), 4.25 (1H, d, 7.8, H1'), 3.92 (1H, dt, 10.2, 6.5, H8), 3.65 (1H, dt, 10.2, 6.5, H8), 3.51 (1H, dd, 9.0, 6.0, H5'), 3.34 (2H, m, H3', H4'), 3.16 (1H, dd, 9.0, 7.8, H2'), 2.04 (2H, t, 6.5).(도 22 참조)
13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) δ ppm 187.8 (C4), 168.5 (C9''), 154.4 (C2), 154.3 (C6), 146.5 (C7''), 135.7 (C1''), 131.6 (C4''), 130.1 (C2'', C6''), 129.3 (C3'', C5''), 128.0 (C3), 127.9 (C5), 118.7 (C8''), 104.4 (C1'), 77.9 (C3'), 75.4 (C2'), 75.0 (C5'), 71.7 (C4'), 69.2 (C1), 65.9 (C8), 64.8 (C6''), 41.0 (C7) (도 22참조)
실험예 1. 세포배양 및 시약
쥐의 대식세포주(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양 받아, 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 및 10 % FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 계대 배양은 3 내지 4일에 한번씩 시행하였으며, 리포폴리사카라이드(LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 시그마사로부터 구입하여 사용하였다. 인터페론-γ(mIFN-γ, recombinant E. coli)는 로쉐(Roche)사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
실험예 2. 우묵사스레피 항산화활성과 NO 생성억제율 검색
2-1. DPPH 라디컬 소거활성에 의한 항산화활성 검색
항산화활성은 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, 알드리치사)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과(radical scavenging effect)를 측정하는 블로이스(Blois)법을 활용하였다(Blois M. S., Nature
181, pp1198-1200, 1958). DPPH 약 2㎎을 에탄올 15㎖에 녹여 DPPH용액을 제조하였다. 이 용액 12㎖에 DMSO 6.25㎖를 첨가한 후, 이때 517㎚의 파장에서 대조군의 UV-Vis. 흡광도가 0.94-0.97이 되도록 에탄올로 희석하여 10초간 진탕시켰다. 그리고, 용매 1㎖에 분말로 추출된 시료 1㎎을 섞은 후 충분히 녹이고, 준비된 DPPH 450㎕에 시료용액 50㎕를 넣어 섞은 후, 실온에서 10분간 방치한 다음 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 BHA, 비타민 C, 비타민 E, 소나무 추출물인 피크노제놀(pycnogenol) 등을 사용하였고, 항산화효과는 DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 검체의 농도(RC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
상기 실험 수행의 결과, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, EF 5-4-6, EF 5-4-7, BF 1에서 합성 항산화제인 BHA와 비타민 C, 비타민 E, 소나무 추출물인 피크노제놀의 RC50값에 비하여 각각 10.9 ㎍/㎖, 12.7㎍/㎖, 9.93㎍/㎖, 10.09㎍/㎖, 9.09㎍/㎖정도의 높은 항산화활성을 보였다(표 1).
| 시료 | RC50(㎍/㎖) |
| DPPH 라디칼 소거 효과 | |
| 비타민 C | 3.0 |
| 비타민 E | 17.0 |
| 피크노제놀 | 6.3 |
| BHA | 9.04 |
| 80% 메탄올 추출물 | 32.3 |
| 헥산 분획물 | 89.0 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 10.9 |
| 부탄올 분획물 | 12.7 |
| 수층 분획물 | 89.3 |
| 부탄올-20%메탄올 분획물(BF1) | 9.93 |
| 부탄올-40%메탄올 분획물(BF2) | 19.74 |
| 부탄올-80%메탄올 분획물(BF3) | 97.94 |
| 부탄올-100%메탄올 분획물(BF4) | ＞100 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-1(EF 5-4-1) | ＞100 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-2(EF 5-4-2) | ＞100 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-3(EF 5-4-3) | ＞100 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-4(EF 5-4-4) | ＞100 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-5(EF 5-4-5) | 78.9 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-6(EF 5-4-6) | 10.09 |
| 에틸아세테이트 분획물 5-4-7(EF 5-4-7) | 9.09 |
2-2. NO 생성억제율 검색
2-2-1. 우묵사스레피 추출물의 효과
RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×105 세포/㎖로 조절한 후 24 웰 플레이트에 접종하고, 시험물질과 LPS(1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 48시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2
-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 그리스 시약(1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반 응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 540nm는 엘리사 리더(ELISA reader)를 이용하여 측정하였으며, 아질산 나트륨(sodium nitrite, NaNO2)를 표준물질(standard)로 비교하였다.
상기 실험 수행의 결과, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, EF 5-4-6-3-2, BF 1에서 대조구인 LPS 처리구보다 높은 NO 생성 억제활성을 보였다(도 1 참조; A: 80% 메탄올 추출물, B: 헥산 추출물, C:에틸아세테이트 추출물, D: 부탄올 추출물, E:수층 분획물, F:EF 5-4-6-3-2, G:EF 5-4-6-3-3, H:EF 5-4-7, I:BF 1).
2-2-2. 유티고사이드 B와 C 의 효과
유티고사이드 B와 C가 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 미치는 영향을 실험하기 위하여, 상기 실시예 3에서 수득된 유티고사이드 B와 C를 시료로 사용하여 상기 실험예 2-2-1과 동일한 실험과정을 수행하였다.
상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 대조구인 LPS 처리구 보다 우묵사스레피의 추출물을 투여한 경우 높은 NO생성 억제활성을 나타내었으며, 우묵사스레피 메탄올 조추출물, 에탄올 분획물의 순서로 높은 NO생성 억제활성을 확인할 수 있었고, 또한 유티고사이드 B와 C를 투여한 경우에 이보다 더 높은 NO 생성 억제 활성을 볼 수 있었다. 또한 도 3에서는 본 발명의 유티고사이드 B의 농도 의존적으로, 도 4에서는 유티고사이드 C의 농도 의존적으로 NO 생성 억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 유티고사이드 B는 24.41μM의 IC50 값을, 유티고사이드C는 24.66μM의 IC50 값을 가진다.
실험예 3. 초기-염증성 분자(Pro-inflammatory molecule) 생성에 미치는 영향 측정
3-1. 시험관내 사이토카인 생성 및 정량
3-1-1. 우묵사스레피 추출물의 효과
쥐의 대식세포 주(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.0×106 세포/㎖로 조절한 후, 24 웰 플레이트에 접종하고, 5 % CO2 항온기에서 18시간 전배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도로 조제된 시험물질 50㎕와 450㎕의 LPS 최종농도(1㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일한 조건에서 배양하였다. 6시간 후 TNF-α 와 IL-6는 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. IL-1β의 정량은 TNF-α 와 같은 방법으로 시험 약물을 처리하고 6시간 배양 후 150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl (pH7.6), 1.0 mM PMSF, 그리고 0.25 % Nonidet P-40을 포함하는 1 ㎖의 용해성 완충액(lysis buffer)을 이용하여 4℃에서 10 분방치후, 원심분리(12,000 rpm에서 2 분)하여 상층액을 얻었다. 모든 시료는 정량전까지 -20℃ 이하에 보관하였다.
TNF-α 및 그 외의 사이토카인 정량은 쥐 엘리사 키트(mouse ELISA kit)를 이용하여 정량하였으며 표준물질(standard)에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.
상기 실험 수행의 결과, TNF-α 생성억제는 EF 5-4-6-3-2, EF 5-4-6-3-3, EF 4-7, BF 1에서 각각 24.84 %, 16.77 %, 13.39 %, 19.35 % 로 억제 효과를 나타내었으며 IL-6와 IL-1β의 생성 억제에서도 TNF-α와는 약간의 차이가 있었지만, IL-6 생성억제는 EF 5-4-6-3-2, EF 5-4-6-3-3, EF 5-4-7, BF 1에서 각각 24.67 %, 12.1 %, 11.71 %, 46.14 %를 나타내었고, IL-1β 생성억제인 경우 EF 5-4-6-3-2, EF 5-4-6-3-3, EF 5-4-7, BF 1에서 각각 24.65 %, 15.21 %, 14.82 %, 44.32 %의 생성억제효과를 나타내어 우묵사스레피의 에틸 아세테이트 분획물에서 얻은 EF 5-4-6-3-2과 부탄올 분획물인 BF 1이 LPS에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 억제에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
3-1-2. 유티고사이드 B와 C의 효과
유티고사이드 B와 C의 TNF-α와 IL-6의 생성에 미치는 영향을 실험하기 위하여 상기 3-1-1과 동일한 실험과정을 수행하였다.
상기 실험의 수행결과 도 6과 도 7에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 3에서 수득한 유티고사이드 B와 C를 투여한 경우에는 LPS만 처리하고 이를 투여하지 않은 군에 비해 TNF-α와 IL-6의 생성이 현저하게 억제하여 항염증 사이토카인의 생성이 억제되었음을 확인할 수 있었다.
3-2. RNA 분리 및 RT-PCR
3-2-1. 우묵사스레피 추출물의 효과
RAW 264.7 세포(1.0×105 cells/㎖)로부터의 전체 RNA 추출은 TRI-시약(MRC) 를 이용하였으며, RNase-제거(free)된 조건 하에서 이루어졌다. 1 ㎍의 전체 RNA를 올리고(dT)18 프라이머, dNTP(0.5 μM), 1 단위 RNase 저해제(inhibitor) 및 M-MuLV 역전사효소(reverse transcriptase, 2U)로 70℃에서 5분, 37℃에서 5분, 37℃에서 60분, 그리고 70℃에서 10분 동안 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다.
유전자 증폭반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 합성된 cDNA로부터 TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, COX-2, β-액틴(Actin)을 증폭시키기 위하여, 2 ㎕ cDNA, 4μM의 5′과 3′ 프라이머, 10x 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% 트리톤 X-100), 250 μM dNTP, 25 mM MgCl2, 1 단위 태크 폴리머라아제(Taq polymerase, 프로메가사, 미국)를 섞고 증류수로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음, 퍼킨-엘머 유전자 증폭기(Perkin-Elmer Thermal Cycler)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94℃/45초, 55~60℃/45초, 72℃/60초, 35회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드(band)를 확인하였다.
상기 실험 수행의 결과, LPS 자극과 함께 처리하여 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성 억제에 대한 우묵사스레피의 용매분획물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, TNF-α 생성 억제는 에틸아세테이트 분획물에서 억제 효과를 나타냈으며, IL-6 생성 억제는 에틸아세테이트 분획물이, IL-1β 생성 억제는 부탄올 분획물에서 억제 효과를 나타내었다(도 8 참조; A:대조군(LPS+), B:80% 메탄올 추출물, C:헥산 추출물, D:에틸아세테이트 추출물, E:부탄올 추출물, F:수층 분획물). 또한 에틸아세테 이트 분획물에서 얻은 EF 5-4-6-3-2과 부탄올 분획물에서 얻은 BF 1 인 경우는 TNF-α 뿐만 아니라 IL-6, IL-1β에서도 높은 억제 효과를 나타내었다(도 9 참조; EF 5-4-6-3-2: 24.67%, EF 5-4-6-3-3: 12.1%, EF 5-4-7: 11.71%, BF 1: 46.14%). 또한 RAW 264.7 세포로부터 사이토킨의 발현 정도를 RT-PCR를 통해 알아 본 iNOS 와 COX-2 인 경우도 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 높은 억제 효과를 나타내었다(도 10 참조; A: EF 5-4-6-3-2, B: EF 5-4-6-3-3, C: EF 5-4-7, D: BF 1).
3-2-2. 유티고사이드 B와 C의 효과
상기 실험예 3-2-1의 우묵사스레피 추출물의 RT-PCR의 실험과 동일한 실험과정을 수행하여 유티고사이드 B와 C의 초기 염증성 분자의 생성에 미치는 영향을 실험하였다. 다만, 이 실험에서는 RAW264.7세포를 18시간동안 초기배양을 하고, 초기 염증성 사이토카인에 대한 mRNA의 발현량 정도는 이 세포에 LPS(1㎍/㎖)를 투여 후 6시간 후에 측정하였다.
상기 실험 수행의 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 유티고사이드 B 와 C 는 TNF-α와 IL-6의 생성을 현저히 억제시킴을 확인할 수 있었으나, IL-1β 생성에는 아무런 영향을 미치지 못함을 확인할 수 있었다. 그러나 도 12에서 보는 바와 같이, 유티고사이드 B와 C(100㎍/㎖)의 처리시에 오히려 IL-10의 생성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.
3-3. 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)
3-3-1. 우묵사스레피 추출물의 효과
RAW 264.7 세포(1.0×105 cells/㎖)에 우묵사스레피의 추출물 및 분획물을 100㎍/㎖의 농도로 각각 처리 후 세포를 수집하였다. 세포를 2 내지 3회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후, 1 ㎖의 용해 완충액(lysis buffer)을 첨가, 30분 내지 1시간동안 용해(lysis) 시킨 다음 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 바이오-레드 단백질 어세이 키트(Bio-Rad Protein Assay Kit)를 사용하여 정량하였다. 30 내지 50㎍의 세포용해물(lysate)을 8% 미니 겔(mini gel) SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF 세포막(BIO-RAD)에 200mA로 2시간 동안 전이하였다. 그리고 세포막의 차단(blocking)은 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% 트윈 20) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 항-마우스 iNOS (1: 1000) (Santa-Cruz)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 항-토끼 COX-2 (1: 1000) (Santa-Cruz)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 항-마우스 또는 항-토끼 IgG(Amersham Co.)를 1: 5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1~3분 간 반응 후, X-ray 필름에 감광하였다.
상기 실험 수행의 결과, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 현저히 저해되는 것을 확인할 수 있었으며(도 13 참조), 또한 에틸아세테이트 분획물에서 얻은 EF 5-4-6-3-2과 부탄올 분획물에서 얻은 BF 1에서 현저히 iNOS의 단백질 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다(도 14 참조; A: EF 5-4-6-3-2, B: EF 5-4-6-3-3, C: EF 5-4-7, D: BF 1).
3-3-2. 유티고사이드 B와 C의 효과
iNOS 와 COX-2 발현에 유티고사이드 B와 C가 미치는 영향을 실험하기 위하여, 상기 실시예 3에서 수득한 유티고사이드 B와 C를 실험의 시료로 사용하여 상기 실험예 3-3-1과 동일한 실험과정을 수행하였다. 다만, 이실험에서는 RAW264.7 세포를 18시간동안 초기 배양하고, LPS(1㎍/㎖)로 24시간 자극을 준후에 iNOS의 단백질 발현을 측정하였다.
상기 실험 수행의 결과, 본 발명의 유티고사이드 B와 C를 투여한 경우에는 iNOS의 발현량(도 15 참조)과 COX-2의 발현량(도 16참조)이 현저하게 저해되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 세포독성 시험
RAW 264.7 세포를 1.0×05 세포/㎖의 농도로 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 24시간 배양 한 후, 상기 실시예 2와 실시예 3에서 수득한 시료를 100㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 이를 24시간 배양한 다음, MTT 시료(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. 플레이트를 1000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, DMSO(Sigma) 150㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔 침전물을 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Carmichael, J., et al., Cancer Research, 47, pp936-941, 1987). 각 시료군에 대한 평균 흡광도값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사한 결과, 세포독성은 나타나지 않았다.
본 발명의 우묵사스레피 추출물 또는 유티고사이드 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1의 건조 추출물 300 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
유티고사이드 화합물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1의 건조 추출물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
유티고사이드 화합물 50 mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
유티고사이드 화합물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
실시예 1의 건조 추출물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
실시예 1의 건조 추출물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 우묵사스레피 추출물 또는 이로부터 분리된 유티고사이드 B와 C는 항산화 및 항염증 효과를 나타내므로, 염증 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로써 이용될 수 있다.
Claims (7)
- 항산화 및 항염증 효과를 갖는 우묵사스레피(Eurya emarginata) 유기용매 잎 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 류마티스 관절염 및 염증성 장 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올 극성용매, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름 또는 메틸렌클로라이드의 비극성용매 및 이들의 혼합용매인 약학조성물.
- 하기 일반식(Ⅰ)의 구조를 갖는 유티고사이드 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 류마티스 관절염 및 염증성 장 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물.(Ⅰ)
상기 식에서 R은 H 또는 OH기 이다. - 삭제
- 항산화 및 항염증 효과를 나타내는 우묵사스레피 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 및 염증성 장 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 삭제
- 항산화 및 항염증 효과를 나타내는 제 3항의 일반식(I) 구조의 유티고사이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 및 염증성 장 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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