KR100687599B1 - 쌀도정 부산물을 이용한 ｇａｂａ의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쌀도정 부산물인 미강 및/또는 쌀눈 그리고 유산균을 이용하여 GABA를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 미강, 쌀눈, 미강과 쌀눈의 혼합물, 미강 추출물, 쌀눈 추출물, 그리고 미강과 쌀눈의 혼합추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 천연성분을 포함하는 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 배지에 MSG (monosodium glutamate)를 첨가하고 유산균을 상기 배지에 접종시키는 단계; 및 (c) 상기 유산균을 배양하여 유산균이 보유하고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제에 의해 MSG를 GABA로 전환시켜 GABA를 생산하는 단계를 포함하는 유산균에 의한 GABA (γ-Aminobutyric acid)의 제조방법을 제공한다.
GABA, 미강, 쌀눈, 유산균, 배양, 발효
Description
도 1은 본 발명의 방법 중 고체 배양법에 따라 GABA를 제조하는 과정의 일 실시예를 보여주는 개략도.
도 2는 본 발명의 방법 중 액체 배양법에 따라 GABA를 제조하는 과정의 일 실시예를 보여주는 개략도.
본 발명은 GABA의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 쌀도정 부산물인 미강 및/또는 쌀눈 그리고 유산균을 이용하여 GABA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
GABA (γ-Aminobutyric acid)는 비단백태 아미노산으로 동물의 경우 중추신경계의 주된 억제성 신경전달물질 (Inhibitory Neurotransmitter)로서 잘 알려져 있다. GABA는 많은 생리학적 메카니즘에 관여하여 동물의 경우 뇌의 혈류를 활발하게 하고, 산소공급량을 증가시켜 뇌세포의 대사기능을 항진시키는 것으로 알려져 있으며, 프로락틴 (prolactin)의 분비와 성장호르몬의 분비 조절에도 관여하며 혈압강하 및 통증완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 관심이 높은 물질이다.
GABA가 고혈압 및 치매의 예방 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지면서 의약품으로서 뿐만 아니라 최근에는 기능성 식품소재로서의 관심이 고조되고 있다. 이와 같은 관심에 따라 각종 소재에 자연적으로 GABA의 함량을 증가시키는 연구가 활발히 진행되고 있어, 녹차의 생잎을 N2 가스에 6-8시간 동안 방치하거나 쌀배아 및 현미를 일정한 온도의 물에 침지하는 방법을 통하여 GABA의 함량이 증가된 녹차 및 GABA-함유 쌀배아 및 발아현미를 생산하고 있다.
그러나, 이러한 방법에 의하여 제조된 제품에서의 GABA 함량은 제품의 무게기준으로 최고 0.5%(w/w)를 넘지 못하는 문제점과 제품의 형태가 모두 불용성 형태로, GABA를 이용한 제품 개발에 한계점을 나타낸다. 이러한 문제의 해결을 위하여, 최근 일본에서는 유산균을 이용하여 기질 중에 첨가된 MSG (모노소듐글루타메이트)를 탈탄산효소를 이용하여 GABA로 전환시킨 후 배양액 중 축적되어있는 GABA만을 회수 농축한 제품이 개발되었다. 이렇게 유산균을 이용하여 생산된 GABA는 발효 후 공정에 따라 고농도의 제품 생산이 가능하며, 완전 용해되는 제품의 생산이 가능한 장점이 있다. 이에 본 연구진들은 김치로부터 GABA의 생산이 가능한 유산균주를 성공적으로 스크리닝한 바 있다 (참조: 특허출원 제2003-5828호).
본 발명자들은 유산균을 이용한 효율적인 GABA 생산 시스템을 구축하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 쌀의 도정시 생산되는 부산물인 미강 및/또는 쌀눈을 이용하여 유산균을 배양하는 경우에는 GABA-고함량 산물을 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 미강 및/또는 쌀눈 그리고 유산균을 이용한 GABA (γ-Aminobutyric acid)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 GABA-고함유 분말의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 GABA-고함유 용액의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유산균에 의한 GABA (γ-Aminobutyric acid)의 제조방법을 제공한다: (a) 미강, 쌀눈, 미강과 쌀눈의 혼합물, 미강 추출물, 쌀눈 추출물, 그리고 미강과 쌀눈의 혼합추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 천연성분을 포함하는 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 배지에 MSG (monosodium glutamate)를 첨가하고 유산균을 상기 배지에 접종시키는 단계; 및 (c) 상기 유산균을 배양하여 유산균이 보유하고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제에 의해 MSG를 GABA로 전환시켜 GABA를 생산하는 단계.
본 발명자들은 유산균 (Lactic acid bacteria)을 이용한 효율적인 GABA 생산 시스템을 구축하기 위하여 다양한 배지 조성 실험을 실시하였고, 그 결과 쌀의 도정시 생산되는 부산물인 미강 및/또는 쌀눈을 이용하여 유산균을 배양하는 경우에는 GABA-고함량 배양액을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 미강 (또는 쌀눈)으로부터 유래되는 우수한 영양소를 다량으로 포함하는 배양액을 얻을 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 이용되는 배지에서 필수 성분으로 포함되는 미강은 기름을 생산하는데 일부 사용되기도 하지만 대부분이 사료용으로 이용되고 있으며, 쌀눈의 경우에도 생식 첨가용 외에는 그 용도가 전무한 상태이다.
본 발명의 방법에서 MSG (monosodium glutamate) 기질을 GABA로 전환하는 데에는 글루타메이트 디카르복실라아제 (glutamate decarboxylase)가 관여하며, 이 효소는 유산균에서 발현된다. 본 발명에 이용되는 유산균은 글루타메이트 디카르복실라아제를 발현하는 한 제한은 없으며, 바람직하게는 락토바실러스 속 균주이고, 가장 바람직하게는 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) 및 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)이다.
본 발명에서 이용되는 배지는 기본적으로 미강, 쌀눈, 미강과 쌀눈의 혼합 물, 미강 추출물, 쌀눈 추출물, 그리고 미강과 쌀눈의 혼합추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 천연성분을 포함하는 배지이다.
본 발명에 있어서, 쌀도정 부산물의 품질은 최종 GABA 제품의 수율을 결정하는데 중요한 역할을 하므로 미강 및 쌀눈이 동일한 품질을 유지할 수 있도록 동일한 농협의 도정공장에서 지속적으로 원료를 공급받는 것이 유리하나 일반적인 도정 공정에서 나오는 미강과 쌀눈을 사용할 경우에도 GABA의 생산수율에 약간의 차이가 존재할 뿐 발효 자체에는 큰 문제가 되지 않는다.
미강 및 쌀눈은 배지의 성분으로 이용하기 전에 세척하는 것이 바람직하며, 이는 표면에 잔류하는 농약을 제거하기 위한 것이다. 대부분의 잔류농약은 왕겨의 제거 공정에서 대부분이 제거되며, 수용성 농약의 제한적인 사용을 허용하는 지역의 미강 및 쌀눈에서는 잔류농약이 거의 검출되지 않으나, 최종 제품의 안정성을 위하여 세척공정을 거치는 것이 바람직하다. 세척공정은 30℃ 이하의 냉수를 사용하는 것이 바람직하며, 수용성 영양성분의 유출을 방지하기 위하여 가능한 30분이내의 짧은 시간에 처리하는 것이 유리하다. 세척수의 온도가 30℃를 넘고 세척에 소요되는 시간이 30분을 넘을 경우 미강과 쌀눈의 영양성분이 손실될 수 있다.
한편, 본 발명의 방법은 크게 고체 배양과 액체 배양으로 구분할 수 있다.
우선, 고체 배양의 경우에서, 천연성분 즉 쌀 도정으로부터 얻은 미강 및/또는 쌀눈 배지 성분에, 필요한 경우에는 탄소원, 질소원, 미량원소 및/또는 계면활성제를 첨가하고, 이어 MSG와 물을 첨가한다. 물의 첨가는 첨가된 각종 성분의 혼합을 용이하게 하는데 물 첨가 후 최종 수분 함량이 10-40%가 되도록 하는 것이 바람직하다. 수분이 낮을 경우는 첨가된 성분이 골고루 혼합되기가 어렵고 수분이 너무 높은 경우에는 최종 제품의 건조에 많은 비용이 요구된다.
한편, 고체 배양의 경우에는 미강 및/또는 쌀눈을 그대로 이용하게 되지만, 액체 배양의 경우에는 미강 및/또는 쌀눈의 추출물을 이용하게 된다.
추출물을 얻은 과정은 당업계에 공지된 다양한 추출용매를 이용하여 실시할 수 있다. 이용 가능한 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트 및 (h) 1,3-부틸렌글리콜를 포함하나, 최종 산물의 안전성 및 유산균 배양을 고려하면, 물이 가장 바람직하며, 물을 이용하는 경우에도 본 발명에 적합한 추출물을 충분히 수득할 수 있다.
물을 이용하여 미강 및/또는 쌀눈의 추출물을 제조하는 경우, 물의 사용량은 2-20배, 바람직하게는 5-15배이다. 물의 양이 너무 적을 경우 추출효율이 떨어지는 단점이 있고 반대로 물의 양이 너무 많은 경우는 추출 후 유효성분의 농도가 낮아 발효원으로 사용될 경우 GABA 전환율이 낮은 문제점이 발생할 수 있다. 영양성분의 추출온도는 40℃-70℃가 적합한데, 온도가 낮을 경우 수용성 영양 성분의 추출시간이 오래 걸리고 온도가 70℃ 이상일 경우 미강 또는 쌀눈의 전분질이 호화되어 유용성분의 분리에 어려움이 따른다. 추출시간은 3-24시간이 적합하며, 바람직하게는 30-100 rpm의 속도로 교반하면서 6-18시간 동안 추출한다. 추출시간이 부족한 경우 영양성분의 농도가 부족하며, 추출시간이 너무 길 경우에는 공정상 에 많은 부담이 올 수 있다. 추출이 끝난 쌀도정 부산물은 원심분리를 이용하여 상등액을 얻은 후 GABA 생산을 위한 배지의 영양성분으로 첨가한다. 이때 고형분의 제거는 배양 후에 진행할 수도 있으며 최종제품의 용해도가 문제가 되지 않을 경우 그대로 건조하여 제품화가 가능하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는 탄소원 및 질소원을 포함하고, 가장 바람직하게는 탄소원, 질소원 및 미량원소 (또는 계면활성제)를 포함한다.
본 발명의 배지에서 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스, 아라비노오스 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는, 수크로스, 프럭토스, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이고, 보다 바람직하게는 수크로스, 프럭토스 및 글루코스이며, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 탄소원의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 1-20 중량%이고, 보다 바람직하게는 2-10 중량%이며, 가장 바람직하게는 3-6 중량%이다.
본 발명의 배지에서 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모추출물, 소이톤 (soytone), 펩톤, 비프추출물 (beef extract), 트립톤, 카시톤 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 효모추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이이고, 보다 바람직하게는 효모추출물 및 소이톤이고, 가장 바람직하게는 효모추출물이다. 질소원의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 1-20 중량%이고, 보다 바람직하게는 1-10 중량%이며, 가장 바람직하게는 2-4 중량%이다.
본 발명의 배지에서 미량원소로 이용 가능한 것은, 마그네슘 설페이트, 소듐아세테이트, 망가닉 설페이트, 페릭 설페이트, 칼슘 클로라이드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 미량원소의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 0.001-1 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.01-1 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.03-0.3 중량%이다.
본 발명의 배지의 특징 중 하나는 계면활성제를 미량성분으로서 이용할 수 있다는 것이다. 이러한 계면활성제를 이용하는 경우에는 배지에서 상기 미량원소의 필요성을 제거할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 배지에 이용되는 계면활성제는 폴리알코올 지방산 (예컨대, 모노스테아리신글리세신), 폴리에틸렌글리콜 지방산 (예컨대, 스테아린산 폴리옥실), 폴리옥시에틸렌 알코올 (예컨대, 라울마크로골), 소르비탄 지방산 (예컨대, 올레인산소르비탄), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 (예컨대, 폴리솔베이트) 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비이온성 계면활성제이며, 보다 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산이고, 가장 바람직하게는 폴리솔베이트이다. 비이온성 계면활성제를 첨가하여 배지를 조성하는 경우에는 상기 미량원소가 첨가되지 않아도 유산균의 배양이 정상적으로 이루어질 수 있다. 미량성분으로서의 비이온성 계면활성제의 사용량은 바람직하게는, 상기 천연성분의 0.01-1 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.01-1 중량%이며, 가장 바람직하게는 0.05-0.3 중량%이다.
본 발명의 방법의 단계 (b)에서 MSG의 첨가량은 바람직하게는 천연성분의 1- 30 중량%이며, 보다 바람직하게는 1-20 중량%이고, 가장 바람직하게는 1-15 중량%이다. MSG의 양이 너무 많을 경우 GABA로 전환되지 않는 MSG가 최종제품에 잔류하여 제품의 풍미에 영향을 줄 수 있고, MSG의 양이 너무 적은 경우는 최종제품의 GABA 함량이 낮아지게 되는 문제점이 있다.
모든 성분 (배지성분 및 MSG)이 혼합된 쌀 도정 부산물은 이어 살균 처리하는 것이 바람직하다. 이때의 온도는 영양소 파괴를 최소화하기 위하여 60-121℃의 온도에서 15-30분간 진행하는 것이 바람직하며, 온도가 너무 낮거나 시간이 짧으면 살균효과가 감소하고, 온도가 너무 높거나 살균 시간이 길면 영양소의 파괴가 심해진다.
살균이 종료된 쌀도정 부산물-함유 배지에 유산균을 접종하게 되는데 이때 접종량은 접종 후의 초기 균수가 105-108 cfu/g 또는 105-108 cfu/㎖이 되게 하는 것이 바람직한데, 그 이하의 균수에서는 GABA의 생산을 위한 배양시간이 길어지며 그 이상의 균을 접종하기 위해서는 종균의 생산에 부담이 된다. 접종이 끝난 쌀도정부산물-함유 배지는 골고루 혼합되어 20-35℃에서 발효를 진행시키는데 그 이하의 온도에서는 발효가 쉽게 일어나지 않으며, 그 이상의 온도에서는 열에 약한 유산균이 사멸하여 GABA를 생산할 수 없다. 유산균을 배양하는 시간은 48-90시간이 바람직하고, 보다 바람직하게는 48-80시간이고, 가장 바람직하게는 48-72시간이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 상술한 본 발명의 방법에 따 라 수득한 GABA-함유 유산균 배양액으로부터 불용성 성분을 제거하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 불용성 성분이 제거된 배양액에 부형제를 혼합하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 결과물을 건조하는 단계를 포함하는 GABA-고함유 분말의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 상술한 본 발명의 방법에 따라 수득한 GABA-함유 유산균 배양액으로부터 불용성 성분을 제거하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 불용성 성분이 제거된 배양액을 농축하는 단계를 포함하는 GABA-고함유 용액의 제조방법을 제공한다.
상술한 본 발명의 GABA 제조방법에 따라 제조된 GABA-함유 배양액은 여과 공정을 거쳐 불용성 성분이 제거된다. 이어, 최종제품의 GABA 함량에 따라 부형제를 첨가한 후 건조 공정을 거치면 GABA-고함유 쌀도정 부산물 건조물 (분말)이 된다. 부형제로는 말토덱스트린, 탈지분유, 가용성전분, 락토오스, 카제인 등이 주로 사용되며, 동결건조, 분무건조, 감압건조 및 열풍건조에 의하여 건조가 가능하다.
만일, 최종 제품을 용액상으로 얻고자 하는 경우에는, 불용성 성분이 제거된 배양액을 농축한다. 농축은 당업계에 공지된 다양한 농축방법을 통해 실시할 수 있으며, 감압 증발기 (vacuum evaporator)를 이용하면 쉽게 실시할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득한 쌀도정 부산물 발효 추출물 (미강 발효추출물 및 쌀눈 발효 추출물)은 기존에 개발된 GABA-함유 제품에 비하여 GABA 함량이 월등 하게 높을 뿐만 아니라 최종적으로 적용되는 식품에 따라 용해성 및 비용해성 소재로 모두 이용될 수 있다. 종래에 개발된 GABA-함유 제품들이 GABA 함량이 낮고 고체상태의 불용성 제품이 대부분이기 때문에 그 사용에 제한을 받아온 것과 비교한다면, 본 발명에 의해 개발된 GABA-함유 제품이 많은 장점을 갖고 있음을 이해할 수 있다.
또한, 많은 영양성분을 갖고 있으면서도 그 용도를 찾지 못해 부가가치를 올리지 못하는 쌀도정 부산물을 이용하여 미강 및 쌀눈이 함유한 영양성분을 최대한 활용하면서 최근에 그 기능성을 인정받고 있는 고급 건강식품 소재인 고가의 GABA를 유산균을 이용하여 생산한다는 의미를 본 발명은 갖는다. 더불어, 국산 농산물을 이용하여 국내에 수입되는 GABA를 대체할 수 있을 뿐만 아니라 나아가서는 수출이 가능한 기능성 소재를 생산한다는 의미를 갖는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 고체 배양을 이용한 GABA-고함유 미강의 제조
농협 직영 도정 공장으로부터 구입한 미강 1 kg을 3 L의 물에 세척한 후, 수크로스 50 g, 효모 추출액 20 g 및 폴리솔베이트 폴리솔베이트 1 g 을 넣은 후 미 강 무게의 1-30%의 MSG (모노소듐글루타메이트)를 첨가한 후 물을 첨가하여 총 수분 함량이 30%가 되도록 하여 70℃에서 25분간 살균하였다. 살균이 끝난 미강 원료 배지의 온도를 30℃까지 식힌 후 18시간 동안 MRS 브로스 (deMan Rogosa Sharpe broth)에서 배양한 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei B2-16, 종균협회) 및 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis B3-18, (주)바이오벤)를 초기 균 농도가 108 cfu/㎖ 되도록 접종한 후, 무균백내에서 골고루 혼합하고 30℃ 배양기에서 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 미강 반죽물을 40℃ 오븐에서 건조시킨 후 미강 중의 GABA함량을 측정하였다. GABA의 함량은 역상 HPLC를 사용하여 변형된 Ibolya 등의 방법 (Ibolya Molnar-Perl and Aniko Vasanits, Journal of chromatography A, 835:73-91(1999))을 사용하여 실시예 8에 따라 측정하였다.
표 1 에서 보듯이, 최종 제품의 GABA 함량은 첨가해 준 MSG의 양에 비례하여 증가하였으나, 20% 이상의 첨가량부터는 더 이상의 GABA 함량의 증가는 보이지 않았다. 이는 첨가해준 유산균이 미강을 이용하여 성장하면서 생산하는 탈탄산 효소의 양에 한계치가 있음을 의미하며 30%를 첨가한 경우 오히려 생산량이 감소하는 것을 알 수 있었는데, 높은 기질량에 의하여 발효가 억제 받는 현상을 나타낸 것으로 판단된다. 발효를 위한 배양 시간에 따른 GABA의 생성량은 48시간 이후에는 큰 차이를 나타내지 않았으나, 24시간의 경우에는 절반 이하로 나타나 유산균의 생육이 일어난 이후에 GABA의 생산이 시작되는 것을 알 수 있었다.
접종한 균주의 종류에 따라 GABA의 생성량은 큰 차이를 나타내지 않았으나 낮은 농도의 MSG를 첨가한 경우에는 락토바실러스 사케이의 GABA 생산량이 높았으며 MSG의 첨가량이 증가할수록 락토바실러스 브레비스의 전환률이 높음을 알 수 있었다. 이는 유산균의 종의 차이에서 오는 탈탄산효소의 생산능력에 기인하는 것으로 판단된다.
실시예 2: 미강 추출물을 이용한 GABA 고함유 분말의 제조
농협 직영 도정 공장(RPC)으로부터 구입한 미강 1 kg을 각각 3 L의 냉수에 세척한 후 10 L의 물에 침지하여 30 rpm으로 교반하면서 60℃에서 12시간 동안 추출하였다. 추출이 끝난 미강 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거한 후 수크로오스 3%, 효모추출물 2% 및 폴리솔베이트 0.1%를 첨가하고 MSG 농도를 달리하여 첨가한 후 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 미강 추출액 배지에 MRS 배지에서 12시간 배양한 락토바실러스 사케이 배양액을 50 ㎖ 접종하여 초기 균 농도를 107 cfu/㎖가 되도록 조절한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 발효액을 80℃에서 20분간 살균한 후 막분리기를 이용하여 균체 및 불용성 고형분을 제거한 후 말토덱스트린을 첨가하여 최종 고형분 함량을 20%로 조절한 후 분무건조하여 GABA 함량이 다양한 미강발효 추출물을 제조하였다. 실험 결과는 표2에 나타나 있다.
표 2에서 보듯이, 배양시간이 48시간보다 적은 경우에는 GABA의 생산량이 충 분하지 않은 것을 알 수 있었으며, 72시간 이후에도 GABA 함량의 증가는 보이지 않아 48시간-72시간의 배양이 미강을 이용한 GABA의 생산에 적당한 것을 알 수 있었다. 또한, 첨가해준 MSG의 양에 따라 최종 제품의 GABA 함량이 증가하는 것을 알 수 있으나, 15% 이상의 MSG 첨가량에서는 GABA 생성량의 증가율이 떨어졌고, 20% 이상의 MSG를 첨가한 경우에는 더 이상의 GABA 함량의 증가가 보이지 않았으며 MSG 농도에 따르는 발효 저해현상에 의하여 오히려 GABA의 함량이 감소하는 결과를 나타내었다. 따라서 MSG의 잔류량을 최소화하고 GABA의 생산량을 늘리기 위한 MSG의 최고 첨가량은 15%임을 알 수 있었다.
| 접종균 | 배양시간 (hr) | MSG 첨가량 (%, w/w) | GABA 함량 (%, w/w) |
| 락토바실러스 사케이 | 24 | 1 | 0.13 |
| 10 | 1.22 | ||
| 20 | 1.18 | ||
| 30 | 0.81 | ||
| 48 | 1 | 0.32 | |
| 10 | 2.44 | ||
| 20 | 2.65 | ||
| 30 | 1.37 | ||
| 72 | 1 | 0.35 | |
| 10 | 2.58 | ||
| 20 | 2.61 | ||
| 30 | 1.52 | ||
| 락토바실러스 브레비스 | 24 | 1 | 0.11 |
| 10 | 1.19 | ||
| 20 | 1.28 | ||
| 30 | 0.84 | ||
| 48 | 1 | 0.29 | |
| 10 | 2.25 | ||
| 20 | 2.44 | ||
| 30 | 1.31 | ||
| 72 | 1 | 0.25 | |
| 10 | 2.11 | ||
| 20 | 2.50 | ||
| 30 | 1.42 |
| 배양시간 (hr) | MSG 첨가량 (%, w/w) | GABA 함량 (%, w/w) |
| 12 | 1 | 0.1 |
| 5 | 0.3 | |
| 10 | 1.1 | |
| 15 | 0.9 | |
| 20 | 0.8 | |
| 24 | 1 | 0.5 |
| 5 | 3.3 | |
| 10 | 10.1 | |
| 15 | 9.9 | |
| 20 | 8.8 | |
| 48 | 1 | 1.7 |
| 5 | 9.5 | |
| 10 | 18.1 | |
| 15 | 17.9 | |
| 20 | 12.8 | |
| 72 | 1 | 1.8 |
| 5 | 9.6 | |
| 10 | 18.2 | |
| 15 | 18.8 | |
| 20 | 13.5 | |
| 96 | 1 | 1.7 |
| 5 | 9.6 | |
| 10 | 18.2 | |
| 15 | 18.3 | |
| 20 | 12.5 |
실시예 3: 쌀눈 추출물을 이용한 GABA 고함유 분말의 제조
농협 직영 도정 공장으로부터 구입한 쌀눈 10 kg을 각각 50 L의 냉수에 세척한 후 80 L의 물에 침지하여 30 rpm으로 교반하면서 55℃에서 18시간 추출하였다. 추출이 끝난 쌀눈 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거한 후 삼각 플라스크에 1 L씩 옮겨 담은 후 수크로오스, 소이톤 및 폴리솔베이트를 각각 탄소원, 질소원 및 미량원소로 선정하여 각각 3%, 2% 및 0.1% 농도가 되도록 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우로 분리한 후 7%의 MSG를 첨가하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 쌀눈 추출액 배지에 MRS 배지에서 16시간 배양한 락토바실러스 사케이 배양액을 1000 ㎖ 접종하여 초기 균 농도를 108 cfu/㎖가 되도록 조절한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 발효액을 80℃에서 20분간 살균한 후 막분리기를 이용하여 균체 및 불용성 고형분을 제거한 후 말토덱스트린을 첨가하여 최종 고형분 함량을 20%로 조절한 후 분무건조하여 GABA 함량이 다양한 쌀눈 발효 추출물을 제조하였다. 실험 결과는 표 3에 나타나 있다.
| 탄소원 | 질소원 | 미량원소 | GABA함량 (%,w/w) |
| O | O | O | 15.3 |
| O | O | X | 12.5 |
| O | X | O | 7.8 |
| O | X | X | 5.3 |
| X | O | O | 3.9 |
| X | O | X | 2.4 |
| X | X | O | 1.9 |
| X | X | X | 1.1 |
표 3에서 보듯이, 쌀눈 추출액에 탄소원, 질소원 및 미량원소를 첨가한 경우에는 높은 GABA 함량을 갖는 쌀눈 추출물의 제조가 가능하였으나, 세가지 중 한가지가 빠진 경우에는 GABA 함량이 낮아지는 것을 알 수 있었다. 특히 탄소원의 보충이 이루어지지 않은 경우 GABA 생산량은 급격히 감소하였으며 질소원이 빠진 경우에도 50%에 가까운 양이 감소되는 것을 알 수 있었다. 따라서 미강 및 쌀눈을 이용하여 GABA를 생산할 경우 적당한 양의 탄소원, 질소원 및 미량성분의 보충이 필요하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: 미강 및 쌀눈 영양성분 첨가에 따르는 GABA 함량의 변화
농협 직영 도정 공장으로부터 구입한 쌀눈과 미강 500 g씩을 각각 2 L의 냉수에 세척한 후 5 L의 물에 넣어 60℃에서 12시간 동안 추출하였다. 추출한 미강 및 쌀눈 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거하고, 삼각 플라스크에 1 L씩 옮겨 담은 후 수크로오스 3%, 효모추출물1% 및 소듐 아세테이트 0.1%를 첨가한 후 10%의 MSG를 첨가하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 또 다른 삼각플라스크에는 미강 및 쌀눈 추출물을 사용하지 않고 증류수 1 L를 채운 후 수크로오스 3%, 효모추출물1% 및 소듐 아세테이트 0.1%를 첨가하고 10%의 MSG를 첨가한 다음, 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 각각의 삼각플라스크에 MRS 배지에서 12시간 배양한 락토바실러스 사케이 배양액을 접종하여 초기 균 농도를 108 cfu/㎖가 되도록 조절한 후 70시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 종료된 쌀눈 및 미강 발효액 및 쌀부산물 추출액 대신 증류수를 사용하여 만든 배양액의 GABA 함량을 측정한 결과는 표 4와 같다.
| 배지 조성 | 최종 세포수 (cfu/㎖) | 발효 후 pH | GABA 농도 (mM) |
| 미강추출물, 수크로오스, 효모추출물, 소듐 아세테이트, MSG | 2.7×109 | 6.55 | 544 |
| 쌀눈추출물, 수크로오스, 효모추출물, 소듐 아세테이트, MSG | 2.5×109 | 6.48 | 529 |
| 증류수, 수크로오스, 효모추출물, 소듐 아세테이트, MSG | |||
| 6.4×108 | 4.87 | 10 |
표 4에서 보는 바와 같이 쌀부산물인 미강 및 쌀눈 추출물을 이용한 경우와는 달리 증류수에 기타 배지성분들을 첨가하여 유산균을 배양한 결과, 미생물의 생 육은 어느 정도 진행이 되었으나 첨가한 MSG는 거의 GABA로 전환되지 않았다. 이결과는, 배지에 첨가되는 쌀 부산물이 발효시 MSG를 GABA로 전환시키기 위한 효소의 생산에 필수 성분을 함유하고 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 미강 및 쌀눈 영양성분 추출온도에 따르는 GABA 함량의 변화
농협 직영 도정 공장으로부터 구입한 쌀눈과 미강 1 kg을 각각 4 L의 냉수에 세척한 후 10 L의 물에 넣어 추출온도를 변화시켜가면서 12시간 추출하였다. 각 조건에서 추출한 미강 및 쌀눈 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거한 후, 삼각 플라스크에 1 L씩 옮겨 담은 후 수크로오스 2%, 효모추출물1% 및 마그네슘 설페이트 0.05%를 첨가한 후 10%의 MSG를 첨가하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 쌀눈 및 미강 추출액 배지에 MRS 배지에서 12시간 배양한 락토바실러스 브레비스 배양액을 접종하여 초기 균 농도를 108 cfu/㎖가 되도록 조절한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 종료된 쌀눈 및 미강 발효액의 GABA 함량을 측정하였다. 측정 결과는 표 5에 나타나 있다.
표 5에서 쌀눈이나 미강 모두 GABA 생산량은 비슷한 결과를 나타내었는데 추출후 고형분 함량이 높을 경우 GABA의 생성량도 높았으며 GABA의 생성량이 높은 경우 발효액의 최종 pH가 상승하는 결과를 알 수 있었다. 이는 쌀눈이나 미강으로부터 많은 영양성분이 추출될 경우 GABA의 생성에 유리한 조건이 됨을 의미하며 GABA의 생성시 배지 중의 H+ 이온을 소비하기 때문에 pH가 상승한다는 연구결과들과 일치한다.
온도가 낮은 경우에는 추출효율이 떨어지며 또한 90℃에서는 추출물의 고형분 함량이 낮을 뿐만 아니라 GABA의 생성량도 낮은 것을 알 수 있었는데, 이는 미강이나 쌀눈에 함유되어 있는 전분질이 호화되면서 불용성 성분의 제거 공정에서 효율이 낮아졌기 때문으로 판단된다. 따라서, GABA를 생성하기 위한 미강 및 쌀눈의 추출 온도는 40-70℃가 적당한 것으로 판단된다. 또한 배양액 중의 미생물 수는 GABA 생성량과 큰 관계가 없었으나 추출 고형분 함량이 높을 경우 증가하는 경향을 나타내었다.
| 원료 | 추출온도(℃) | 추출물 고형분(%) | 최종 세포수 (cfu/㎖) | 발효 후 pH | GABA 농도 (mM) |
| 쌀눈 | 10 | 1.13 | 2.0×109 | 5.18 | 218 |
| 40 | 2.25 | 1.5×109 | 6.32 | 444 | |
| 70 | 3.12 | 2.3×109 | 6.66 | 500 | |
| 90 | 2.28 | 2.2×109 | 5.77 | 383 | |
| 미강 | 10 | 1.33 | 2.4×109 | 4.98 | 250 |
| 40 | 2.65 | 2.5×109 | 6.19 | 480 | |
| 70 | 4.00 | 2.8×109 | 6.75 | 550 | |
| 90 | 1.23 | 2.5×109 | 5.55 | 400 |
실시예 6: 미강 및 쌀눈 영양성분 추출농도에 따르는 GABA함량의 변화
쌀눈과 미강 5 kg을 각각 20 L의 냉수에 세척한 후 물의 양을 변화시켜가면서 60℃로 12시간 동안 추출하였다. 각 조건에서 추출한 미강 및 쌀눈 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거한 후 수크로오스 4%, 효모추출물 2% 및 폴리솔베이트0.1% 첨가한 후 10%의 MSG를 첨가하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 쌀눈 및 미강 추출액 배지에 MRS 배지에서 18시간 배양한 락토바실러 스 브레비스 배양액을 접종하여 초기 균 농도를 107 cfu /㎖가 되도록 조절한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 발효액을 80℃에서 20분간 살균한 후 막분리기를 이용하여 균체 및 불용성 고형분을 제거한 후 GABA 함량을 측정하였고, 그 결과는 표 6에 기재되어 있다.
미강 및 쌀눈 추출액을 이용하여 GABA를 생산할 경우 추출온도에 따라 추출액의 고형분 함량이 높으면 충분한 양의 영양성분이 공급되어 GABA의 생성량이 높은 결과를 보였으나, 물의 양을 적게 사용하여 추출한 경우에는 오히려 GABA 함량이 낮아지는 결과를 나타내었다. 이는 발효액의 점도 및 초기 영양분의 과다에 의한 발효 억제 현상 때문에 기인한 것으로 판단된다. 다만, 발효가 완료된 시점에서 유산균의 수는 높았으나 이 또한 GABA 생성량과 비례하는 결과를 나타내지는 않았다.
따라서 미강 및 쌀눈을 이용하여 GABA를 생산하는 경우 가장 바람직한 추출물의 농도는 5배-15배의 물을 사용하는 것을 알 수 있었다.
| 원료 | 가수량 (배수) | 발효 후 pH | 최종 세포수 (cfu/㎖) | GABA (mM) |
| 쌀눈 | 1 | 5.18 | 3.2×109 | 218 |
| 5 | 6.22 | 2.5×109 | 444 | |
| 10 | 6.66 | 2.3×109 | 489 | |
| 15 | 6.17 | 1.8×109 | 483 | |
| 20 | 4.33 | 3.4×108 | 256 | |
| 미강 | 1 | 5.03 | 3.2×109 | 218 |
| 5 | 6.33 | 2.5×109 | 444 | |
| 10 | 6.56 | 2.3×109 | 489 | |
| 15 | 6.47 | 1.8×109 | 483 | |
| 20 | 4.11 | 4.9×108 | 256 |
실시예 7: 선식용 미강 및 쌀눈 혼합물 추출액을 이용한 GABA-함유 소재의 제조
쌀눈과 미강을 5 kg씩 혼합한 후 세척하고 50 L의 물을 첨가하고 60℃에서 15시간 추출하였다. 추출이 끝난 미강과 쌀눈 혼합 추출액을 원심분리하여 고형분을 제거한 후 수크로오스 2%, 효모추출물 2% 및 폴리소르베이트 0.05%를 첨가한 후 10%의 MSG를 첨가하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 쌀눈 및 미강 혼합 추출액 배지에 MRS 배지에서 18시간 배양한 락토바실러스 브레비스 배양액을 접종하여 초기 균 농도를 107 cfu/㎖가 되도록 조절한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 발효액을 80℃에서 20분간 살균한 후 막분리기를 이용하여 균체 및 불용성 고형분을 제거한 후 말토덱스트린을 첨가하여 최종 고형분 함량을 20%로 조절한 후 분무건조하여 GABA 함량이 다양한 분말형태의 미강 및 쌀눈 혼합 발효 추출물을 제조하였다.
실시예 8: 미강 원료의 GABA-고 함유 용액의 제조
음료에 혼합하기 위한 GABA 고함유 미강추출물 용액을 만들기 위하여, 미강 3 kg을 33 L 물에 넣어 65℃에서 18시간 추출하였다. 추출이 끝난 후, 원심분리하여 고형분을 제거한 후 수크로오스 3%, 효모추출물 1.5% 및 폴리솔베이트 0.1%를 첨가한 후 9%의 MSG를 첨가하여 121℃에서 15분간 살균하였다. 살균이 끝난 미강 추출액 배지에 MRS 배지에서 12시간 배양한 락토바실러스 사케이 배양액을 접종하 여 초기 균 농도를 108 cfu/㎖가 되도록 조절한 후 72시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 발효액을 80℃에서 20분간 살균한 후 막분리기를 이용하여 균체 및 불용성 고형분을 제거한 후 감압 증발기 (vacuum evaporator)를 이용하여 15 torr, 60℃의 조건에서 10배 농축하여 GABA 농도가 25% 이상인 용액을 제조하였다.
실시예 9: 역상 HPLC를 이용한 GABA의 정량 분석
본 실시예에서 GABA의 정량적 분석은 다음과 같이 역상 HPLC (HPLC Waters)를 이용하여 측정하였다: 역상 HPLC를 이용한 분석 조건은 Ibolya 등이 보고한 것을 참조로 하여 확립하였다. 우선, 시료를 8000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 멤브레인 필터로 여과하고 적당한 농도로 3차 증류수에 희석하였다. 이렇게 준비된 시료를 o-프탈디알데히드 (o-phthaldialdehyde: OPA)를 이용한 프리-컬럼 반응의 유도체화 과정 후 역상 HPLC를 수행하였다. OPA 용액 (pH 9.3)은 5.0 ㎖의 메탄올성 OPA, 20 ㎖ 보레이트 완충액 (pH 9.9) 및 50 ㎕ 2-머르캅토에탄올을 혼합하여 제조하였다. 메탄올성 OPA는 2.56 g의 OPA를 50 ㎖의 메탄올에 용해하여 제조하였고, 보레이트 완충액은 0.2 M 보르산 및 0.2 M 수산화 나트륨을 50:50(v/v)을 혼합한 후 0.2 M 포타슘 클로라이드를 넣어 사용하였다. OPA 용액은 2시간 지나서 사용하고 제조한 후 일주일정도 까지는 안정하였다. 제조한 OPA 용액 380 ㎕와 120 ㎕의 시료를 잘 혼합한 후 8분 정도 상온에서 반응시켰다. 너무 오랜 시간 상온에서 방치하면 유도체의 불안정성 때문에 역상 HPLC의 피크 모 양이나 면적값이 다르게 나올 수 있으므로 상온에서 1-2시간 이상 방치하지 않고 역상 HPLC를 수행하였고, 유도체화된 시료 20 ㎕를 컬럼에 주입하였다.
HPLC 컬럼으로는 XTerra 컬럼 (Waters, : RP18 5 m, 4.6 mm 150 mm)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.05 M 소듐 아세테이트 (pH 7.2)을 용매 A로, 그리고 0.1 M 소듐 아세테이트, 아세토니트릴 (HPLC 등급) 및 메탄올 (HPLC 등급)이 각각 46:44:10(v/v)으로 혼합된 것 (pH 7.2)을 용매 B로 사용하였다. 이동상의 농도 구배는 용매 A를 100%로 하여 분석을 시작해서 30분 경과 후에는 용매 B가 100%가 되고, 40분 경과 후까지 용매 B가 100%, 45분 경과 후까지는 다시 용매 A가 100%가 되게 하였으며, 60분 후까지 용매 A가 100%가 되도록 조절하였다. 이동상의 유속은 1 ㎖/min로 고정하였고, 358 ㎚의 U.V. 검출기로 GABA를 검출하였다. 이런 조건에서 GABA와 글루타메이트의 보유 시간은 각각 21.01 및 9.89 분이었고, 검출 한계농도는 0.1 mM이었다. 또한, GABA의 농도가 10 mM이 넘으면 검출기의 검출 상한선을 넘으므로 이에 맞게 희석하여 측정하였다.
이상에서 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명은 미강 및/또는 쌀눈 그리고 유산균을 이용한 GABA (γ-Aminobutyric acid)의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 GABA-고함유 분말 및 용액의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 수득한 쌀도정 부산물 발효 추출물 (미강 발효추출물 및 쌀눈 발효 추출물)은 기존에 개발된 GABA-함유 제품에 비하여 GABA 함량이 월등하게 높을 뿐만 아니라 최종적으로 적용되는 식품에 따라 용해성 및 비용해성 소재로 모두 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 많은 영양성분을 갖고 있으면서도 그 용도를 찾지 못해 부가가치를 올리지 못하는 쌀도정 부산물을 이용하여 미강 및 쌀눈이 함유한 영양성분을 최대한 활용하면서 최근에 그 기능성을 인정받고 있는 고급 건강식품 소재인 고가의 GABA를 대량으로 생산할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- (ⅰ) 미강, 쌀눈, 미강과 쌀눈의 혼합물, 미강 추출물, 쌀눈 추출물, 그리고 미강과 쌀눈의 혼합추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 배지를 제조하는 단계;(ⅱ) 상기 (ⅰ)의 단계로 제조된 배지에 MSG (monosodium glutamate)를 첨가하고, 유산균 락토바실러스 사케이를 상기 배지에 접종시키는 단계; 및(ⅲ) 상기 (ⅱ)의 단계로 접종된 유산균을 배양하여 유산균이 보유하고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제에 의해 MSG를 GABA로 전환시켜 GABA를 생산하는 단계로 이루어진 유산균 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei)에 의한 GABA (γ-Aminobutyric acid)의 제조방법.
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- 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스, 아라비노오스 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 질소원은 효모추출물, 소이톤 (soytone), 펩톤, 비프추출물 (beef extract), 트립톤, 카시톤 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 미량원소는 마그네슘 설페이트, 소듐아세테이트, 망가닉 설페이트, 페릭 설페이트, 칼슘 클로라이드 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리알코올 지방산, 폴리에틸렌글리콜 지방산, 폴리옥시에틸렌 알코올, 소르비탄 지방산, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 MSG의 첨가량은 상기 천연성분배지의 1-15 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 배양은 48-72시간 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (ⅰ) 상기 제 1 항, 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따라 수득한 GABA-함유 유산균 배양액으로부터 불용성 성분을 제거하는 단계; 및(ⅱ) 상기 (ⅰ)의 단계로부터 제조된 불용성 성분이 제거된 배양액에 부형제를 혼합하는 단계; 및(ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 단계로부터 제조된 부형제가 혼합된 배양액을 건조하는 단계로 이루어진 GABA-고함유 분말의 제조방법.
- (ⅰ) 상기 제 1 항, 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따라 수득한 GABA-함유 유산균 배양액으로부터 불용성 성분을 제거하는 단계; 및(ⅱ) 상기 (ⅰ)의 단계로부터 제조된 불용성 성분이 제거된 배양액을 농축하는 단계로 이루어진 GABA-고함유 용액의 제조방법.
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