KR100683641B1 - Composition comprising okadaic acid for undifferentiated proliferation of embryonic stem cells - Google Patents

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윤병선
김기동
전은경
문재희
류경수
박재여
정혜연
김보나
김명진
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Abstract

A medium composition for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising okadaic acid is provided to control the undifferentiated proliferation of embryonic stem cells without viral infection or animal infection. The medium composition for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprises 0.5-1.5 nM of okadaic acid in the presence of a feeder cell, wherein the embryonic stem cell is derived from human; and the medium composition optionally contains bFGF(basic fibroblast growth factor). The undifferentiated proliferation of embryonic stem cells is induced by culturing the embryonic stem cell in the medium composition.

Description

오카다익산을 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 배지 조성물{Composition Comprising Okadaic Acid For Undifferentiated Proliferation Of Embryonic Stem Cells}Composition Comprising Okadaic Acid For Undifferentiated Proliferation Of Embryonic Stem Cells

도 1은 피더 세포가 없는(feeder-free) 조건에서 배아 줄기세포 배양시 오카다익산(Okadaic acid)이 세포에 미치는 효과를 살펴본 결과이다. A와 B는 1nM의 농도, C는 0.1nM의 농도로 오카다익산을 첨가한 것을 D는 오카다익산을 첨가하지 않은 대조군을 나타낸다.Figure 1 shows the results of the effects of Okadaic acid (Okadaic acid) on the cells in embryonic stem cell culture in feeder-free conditions (feeder-free). A and B are the concentration of 1 nM, C is the addition of the okadiic acid at a concentration of 0.1 nM, D represents a control group without addition of the okadiic acid.

도 2는 피더 세포가 없는 조건에서 배양된 인간 배아 줄기세포 형태를 살펴본 결과이다. A는 피더 세포 위에서의 배아 줄기세포를, B 내지 D는 피더 세포에서의 배아 줄기세포의 형태를 살펴본 결과이다.Figure 2 shows the results of a human embryonic stem cell culture cultured in the absence of feeder cells. A shows the morphology of embryonic stem cells on feeder cells and B to D shows the shape of embryonic stem cells on feeder cells.

도 3은 피더 세포 위에서의 인간 배아 줄기세포 형태를 살펴본 것으로 A는 bFGF를 첨가하지 않은 배아 줄기세포를, B는 bFGF가 없는 조건에서 1nM 오카다익산을 첨가한 배아 줄기세포의 형태를 살펴본 결과이다.FIG. 3 shows the morphology of human embryonic stem cells on feeder cells. A shows the morphology of embryonic stem cells without bFGF, and B shows the morphology of embryonic stem cells with 1 nM okadaic acid added in the absence of bFGF.

도 4는 피더 세포가 없는 조건에서 배양한 배아 줄기세포가 정상적인 핵형을 가지는 것을 살펴본 결과이다.Figure 4 shows the result that the embryonic stem cells cultured in the absence of feeder cells have a normal karyotype.

도 5는 피더 세포가 없는 조건에서 배양한 배아 줄기세포에서 미분화 마커의 발현을 확인한 결과이다.5 shows the results of confirming the expression of undifferentiated markers in embryonic stem cells cultured in the absence of feeder cells.

본 발명은 오카다익산을 포함하는 인간 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 배지 조성물 및 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a medium composition for inducing undifferentiated proliferation of human embryonic stem cells comprising okadiic acid and a method for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising culturing in the medium composition.

인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells: hESCs)는 인간의 몸을 구성하는 모든 기관으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로 1998년 Thomson group (Science 282:1145, 1998) 및 Reubinoff group (Nat Biotechnol 18:399, 2000)등에 의해 확립되었다(Thomson JA et al., Science 1998, 282:1145-1147; Reubinoff B et al., Nat Biotechnol 2000, 18:399-404). 이 후 hESCs은 난치병 등을 치료할 수 있는 세포 치료를 위한 발판으로 작용하였다. hESCs은 마우스 MEF(mouse embryonic fibroblast)를 피더 세포와 공배양 함으로써 증식할 수 있다. 그러나, 마우스 세포의 공배양은 세포 치료에 있어 마우스 바이러스 감염 등 많은 문제점을 가지고 있다. Human embryonic stem cells (hESCs) are cells that have the capacity to differentiate into all the organs of the human body.The 1998 Thomson group (Science 282: 1145, 1998) and the Reubinoff group (Nat Biotechnol 18). : 399, 2000) (Thomson JA et al., Science 1998, 282: 1145-1147; Reubinoff B et al., Nat Biotechnol 2000, 18: 399-404). Subsequently, hESCs acted as a springboard for cell therapy to treat incurable diseases. hESCs can be propagated by coculture with mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with feeder cells. However, coculture of mouse cells has many problems, such as mouse virus infection in cell therapy.

이러한 문제점을 해결하기 위해 최근 인간 세포 기원의 피더 세포와 피더 세포가 없는 배양 조건 (feeder-free)을 확립하고자 많은 연구들이 진행되고 있다(Richards M et al. Nat Biotechnol 2002,20:933-936; Hovatta O et al. Hum Reprod 2003, 18:1404-1409; Amit M et al. Biol Reprod 2003, 68:2150?2156; Richards M et al. STEM CELLS 2003, 21:546-556; Xu C et al. Nat Biotechnol 2001, 19:971-974; Rosler et al. Dev Dyn 2004,229:259-274; Carpenter et al. Dev Dyn 2004,229:243-258; Amit et al. Biol Reprod 2004,70:837-845; Sato N et al. Nat Med 2004,10:55-63; Xu R-H et al. Nat Methods 2005,2:185-190; Xu C et al. STEM CELLS 2005,23:315-323). Hovatta group (Hum Reprod 18:1404, 2003)은 마우스 세포 대신 인간 포어스킨 세포(foreskin cell)과 공배양하여 hESCs을 유지할 수 있다고 보고하였으며 또한 Amit (Biol Reprod 68:2150, 2003)과 Richards (STEM CELLS 21:546,2003)등도 인간 유래의 피더 세포로 미분화된 hESCs의 성장을 유지하였다. Xu group (Nat Biotechnol 18:399, 2000)은 MEF에서 유래한 CM(conditioned media)와 라미닌(laminin), 마트리젤(matrigel)과 같은 매트릭스를 사용하여 피더 세포가 없는 배양 조건(feeder-free)을 확립하였다. Rosler (Dev Dyn 229:259, 2004) 등은 Xu group에서 확립한 CM을 이용하여 1년 이상 feeder-free 상태로 hESCs을 유지하였다. 하지만 이러한 CM은 마우스 유래의 성분이 배지 속에 남아있는 단점이 있다. 2005년 Xu 등은 CM을 사용하지 않고 bFGF 등의 성장 인자 (growth factor)의 조합으로 피더 세포 없는 상태의 배양조건을 확립하였다 (STEM CELLS 23:315, 2005). Sato 등은 Wnt 경로(Wnt pathway)를 활성화시키기 위해 GSK-3-특이적 억제제인 BIO를 사용하여 피더 세포 없는 상태에서 미분화된 마우스 및 인간 배아 줄기세포를 유지하였다 (Nat. Med 10:55, 2004). Xu group은 bFGF와 BMP 안타고니스트인 noggin을 배지내에 첨가하여 미분화된 hESCs을 feeder-free 상태에서 유지하였다 (Nat Methods 2:185, 2005).In order to solve this problem, many studies have recently been conducted to establish feeder-free and feeder cells of human cell origin (Richards M et al. Nat Biotechnol 2002,20: 933-936; Hovatta O et al. Hum Reprod 2003, 18: 1404-1409; Amit M et al. Biol Reprod 2003, 68: 2150-2156; Richards M et al. STEM CELLS 2003, 21: 546-556; Xu C et al. Nat Biotechnol 2001, 19: 971-974; Rosler et al. Dev Dyn 2004,229: 259-274; Carpenter et al. Dev Dyn 2004,229: 243-258; Amit et al. Biol Reprod 2004,70: 837- 845; Sato N et al. Nat Med 2004, 10: 55-63; Xu RH et al. Nat Methods 2005, 2: 185-190; Xu C et al. STEM CELLS 2005, 23: 315-323). The Hovatta group (Hum Reprod 18: 1404, 2003) reported that it could maintain hESCs by co-culture with human forskin cells instead of mouse cells, and also Amit (Biol Reprod 68: 2150, 2003) and Richards (STEM CELLS). 21: 546,2003) also maintained the growth of undifferentiated hESCs into human-derived feeder cells. The Xu group (Nat Biotechnol 18: 399, 2000) uses feeder-free cultures using feeder cells using matrixes such as CM (conditioned media) derived from MEF, laminin and matrigel. Established. Rosler (Dev Dyn 229: 259, 2004) et al. Maintained hESCs in feeder-free state for more than a year using a CM established by the Xu group. However, this CM has the disadvantage that the components derived from the mouse remain in the medium. In 2005, Xu et al. Established a culture condition without feeder cells using a combination of growth factors such as bFGF without using CM (STEM CELLS 23: 315, 2005). Sato et al. Maintained undifferentiated mouse and human embryonic stem cells in the absence of feeder cells using BIO, a GSK-3-specific inhibitor, to activate the Wnt pathway (Nat. Med 10:55, 2004 ). The Xu group added bFGF and BMP antagonist noggin in the medium to maintain undifferentiated hESCs in a feeder-free state (Nat Methods 2: 185, 2005).

이런 배경하에, 본 발명자는 피더 세포 없는(feeder-free) 조건에서도 오카다익산이 포함된 배지에서는 배아 줄기세포가 미분화 증식을 유지하며, 이 때 배아 줄기세포는 줄기세포 마커를 정상적으로 발현하고 정상적 핵형(karyotype)을 가진다는 것과 오카다익산이 bFGF를 대체하는 효과가 있다는 것을 확인하여 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 조건을 확립하고 본 발명을 완성하였다. Under these backgrounds, the inventors have found that embryonic stem cells maintain undifferentiated proliferation in medium containing okadaic acid even under feeder-free conditions, where embryonic stem cells normally express stem cell markers and have a normal karyotype. karyotype) and confirmed that the okadaic acid has an effect of replacing the bFGF to establish the conditions for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells, and completed the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 오카다익산을 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 배지 조성물을 제공하기 위함이다.One object of the present invention is to provide a medium composition for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising okadiic acid.

본 발명의 또 다른 목적은 오카다익산을 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 방법을 제공하기 위함이다.Still another object of the present invention is to provide a method for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising culturing in a medium composition comprising okadiic acid.

배아 줄기세포의 배양 과정에서 분화를 유도하기 전까지 세포를 미분화 상태로 유지 및 증식시키는 것은 줄기세포 연구와 이의 이용에 있어서 매우 중요한 기술적 과제이다. 본 발명자는 오카다익산(okadaic acid)이 배아 줄기세포 미분화 증식을 유도할 수 있다는 것을 밝혔다.Maintaining and propagating cells in undifferentiated state until induction of differentiation in embryonic stem cell culture is a very important technical task in stem cell research and its use. The inventors found that okadaic acid can induce embryonic stem cell undifferentiated proliferation.

하나의 양태로서 본 발명은 오카다익산을 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 배지 조성물에 관한 것이다.In one embodiment, the present invention relates to a medium composition for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising okadiic acid.

본 발명에서 용어, “배아 줄기세포(embryonic stem cell)”는 동물의 배로부터 획득한 전분화 능력을 유지하면서 증식하는 잠재력을 가지고 있는 세포를 의미한다. As used herein, the term "embryonic stem cell" refers to a cell having the potential to proliferate while maintaining the pluripotency obtained from the embryo of the animal.

본 발명의 배아 줄기세포는 인간(human), 원숭이(monkey), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheep), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rats) 등의 모든 동물 유래의 배아 줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 배아 줄기세포이다. Embryonic stem cells of the present invention are humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice And embryonic stem cells derived from all animals such as rabbits, but are preferably embryonic stem cells derived from mammals, more preferably humans.

본 발명에서 용어, “증식(proliferation)”이란 세포 수의 증가를 의미하고 "성장(growth)"과 동일한 의미로 사용된다. As used herein, the term "proliferation" means an increase in the number of cells and is used in the same sense as "growth".

본 발명에서 용어, “미분화 증식(undifferentiated proliferation)"이란 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는, 즉, 전분화능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 당업자는 분화되지 않은 상태와 분화된 상태를 일반적인 방법으로 확연하게 구별할 수 있다. 예들 들어, 분화되지 않은 세포는 높은 (핵 비율/세포질 비율) 값을 가지고 인이 현저하게 보이는(prominent nucleoli) 특징을 가진다.As used herein, the term “undifferentiated proliferation” refers to the proliferation of stem cells into cells having the same properties as the original cells, that is, having pluripotency without being differentiated into specific cells. The undifferentiated state and the differentiated state can be distinguished in the usual way, for example, undifferentiated cells are characterized by high (nucleus ratio / cytoplasmic ratio) values and prominent nucleoli.

발명자는 오카다익산(okadaic acid)을 배지에 포함시켜 배아 줄기세포를 배 양시, 세포는 피더 세포 없는 조건에도 미분화(undifferentiated) 상태를 유지하며 증식하는 것을 확인하였다.The inventors confirmed that when the embryonic stem cells were cultured by incorporating okadaic acid into the medium, the cells proliferated while maintaining an undifferentiated state even under conditions without feeder cells.

오카다익산은 단백질 포스파타제 2A(protein phosphatase: PP2A) 억제제로 c-myc의 분해를 억제하여 안정성을 증가시킨다고 보고되었으나(Yeh E et al. Nat Cell Biol 2004,6:308-318), 줄기세포의 분화와 증식 관련하여 알려진 바는 없다. 본 발명의 구체적인 실시에 의하면, 배아 줄기세포를 오카다익산을 포함하는 배지에서 배양시키면 15 계대 이상에도 배아 줄기세포는 미분화 상태를 유지한 채 증식하였다. 이 때 세포에서 미분화 ES 마커인 nanog, oct-4, rex1, Tert 등의 유전자가 모두 발현되었으며 정상적인 핵형(karyotype)을 가졌다. 이를 통하여, 오카다익산은 피더 세포 없는 조건에서 배아 줄기세포를 안정적으로 미분화 증식시키는 것을 알 수 있다.Okadaic acid is a protein phosphatase (PP2A) inhibitor that has been reported to increase stability by inhibiting c-myc degradation (Yeh E et al. Nat Cell Biol 2004, 6: 308-318). Nothing is known about growth. According to a specific embodiment of the present invention, when embryonic stem cells were cultured in a medium containing okadaic acid, embryonic stem cells proliferated in an undifferentiated state even in 15 passages or more. At this time, all the genes, such as nanog, oct-4, rex1, Tert, etc., which are undifferentiated ES markers, were expressed in cells and had a normal karyotype. Through this, it can be seen that okadiic acid stably undifferentiates and propagates embryonic stem cells in a feeder cell-free condition.

또한, 오카다익산은 줄기세포 배양에서 증식을 조절하는 성장 인자로 일반적으로 사용하는 bFGF의 기능을 대체한다. 따라서, 오카다익산을 피더 세포, 매트릭스 등을 사용하는 기존의 배아 줄기세포 배양법에서도 bFGF 등의 통상적으로 사용되는 분화 제어 물질을 대체하여 사용하거나 이들과 병용하여 사용될 수 있다. Okadaic acid also replaces the function of bFGF commonly used as a growth factor to regulate proliferation in stem cell culture. Therefore, in the existing embryonic stem cell culture method using the feeder cell, the matrix and the like can be used in place of or in combination with a differentiation control material commonly used such as bFGF.

본 발명에서 용어, “배지(culture media)"는 인 비트로에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원 소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다. As used herein, the term "culture media" refers to a medium capable of supporting stem cell growth and survival in vitro, and includes all conventional media used in the art suitable for culturing stem cells. The medium and culture conditions may be selected according to the type of cell The medium used for the culture is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source and a trace element component. Such cell culture minimal media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, F-12, α Minimal Essential Medium (αMEM). , GMEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, etc. Also, the medium may be penicillin, streptomycin, gentamicin. Of it may comprise an antibiotic.

오카다익산을 이용하여 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하고자 하는 본 발명의 목적상, 배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이, 배아 줄기세포 배지에 오카다익산을 포함하여 사용할 수 있다. 이 때, 오카다익산을 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 분화 제어 물질과의 함께 사용하는 등 다양한 응용이 가능하다.For the purpose of the present invention to induce undifferentiated proliferation of embryonic stem cells using okadiic acid, the okadiic acid may be included in the embryonic stem cell medium without particular limitation on the type and culture method of the medium. At this time, a variety of applications are possible, such as using okadiic acid alone or in combination with one or more differentiation control substances known in the art.

본 발명의 오카다익산은 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 해야 한다. 본 발명에서 용어, “유효 농도”는 오카다익산이 미분화 증식을 유도할 수 있는 충분한 양을 의미하며, 유효 농도 이하에서는 활성을 나타내지 않고 유효 농도 이상에서는 세포에 독성을 나타내게 되므로 유효 농도 내에서 오카다익산을 사용하도록 한다. 배아 줄기세포의 기원, 배지의 종류와 배지에 포함되는 성분, 동시 사용되는 분화 제어 물질 등 당 분야에서 잘 알려진 요소에 따라 오카다익산의 유효 농도는 영향을 받을 수 있다. 예들 들어, 인간 배아 줄기 세포에서 분화 제어 물질로 오카다익산을 단독으로 사용할 경우, 유효 농도는 0.5 내지 1.5nM이다. Okadiic acid of the present invention should be included in the medium at an effective concentration. As used herein, the term “effective concentration” means an amount sufficient to induce undifferentiated proliferation of okadaic acid, and does not exhibit activity below the effective concentration and is toxic to cells above the effective concentration. To use. Effective concentrations of the okadaic acid may be affected by factors well known in the art, such as the origin of embryonic stem cells, the type of medium and components contained in the medium, and the differentiation control substances used simultaneously. For example, when the okadiic acid is used alone as a differentiation control substance in human embryonic stem cells, the effective concentration is 0.5 to 1.5 nM.

또 다른 양태로서 본 발명은 오카다익산을 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 방법에 관한 것이다.In still another aspect, the present invention relates to a method for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising culturing in a medium composition comprising okadiic acid.

오카다익산을 포함하는 배지 조성물에서 배아 줄기세포를 증식시킴으로써, 배아 줄기세포의 배양에서 분화를 원하는 시점까지 세포의 자발적인 분화를 막고 미분화 상태로 유지가 가능하다.By propagating embryonic stem cells in a medium composition comprising okadaic acid, spontaneous differentiation of cells can be prevented and maintained in an undifferentiated state until the desired time of differentiation in culture of embryonic stem cells.

배아 줄기세포는 일반적인 방법으로 획득할 수 있다. 예들 들어 인간 배아 줄기세포는 Thomson 이 기술한 방법으로 획득할 수 있다(US Pat No.5843780; Science 282; 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 획득한 배아 줄기세포를 본 발명의 오카다익산을 포함하는 배지 조성물에서 배양함으로써, 바이러스성 감염, 동물원성 감염에 의한 오염 등의 우려 없이 배아 줄기세포의 미분화 증식을 조절 및 제어할 수 있으므로 바람직하다.Embryonic stem cells can be obtained by a general method. For example, human embryonic stem cells can be obtained by the method described by Thomson (US Pat No. 5843780; Science 282; 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Natl Acad.Sci. USA 92: 7844, 1995). By culturing the obtained embryonic stem cells in the medium composition containing the okadiic acid of the present invention, it is preferable because the undifferentiated proliferation of embryonic stem cells can be controlled and controlled without fear of contamination by viral infection, zoological infection and the like.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. only. The following examples are only for illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1.  One. hESCshESCs 배양 culture

인간 배아 줄기세포 (HSF-6: University of California, San Francisco)13.5일령 CF1 마우스 (ORIENT) 태아 (mouse fetus)를 피더 세포(feeder cell)로 사용하여 배양하였다. 피더 세포는 10% FBS (HyClone), 0.1 mM β-머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산이 포함되어 있는 DMEM (high glucose, Invitrogen)에서 배양 한 후 유사분열(mitosis)을 중지시키기 위해 10 ㎍/ml의 mitomycin C (sigma)을 1시간 30분 처리하였다. 그 후, 0.1% 젤라틴(gelatin)으로 코팅된 4-웰 배지 디쉬에 6.1 x 104 의 농도로 mitomycin C을 처리한 피더 세포를 씨딩(seeding)하였다. 피더 세포를 씨딩한 다음날 인간 배아 줄기세포를 씨딩하였으며 5-7일 간격으로 기계적(mechanical) 방식으로 계대배양 하였다. Human embryonic stem cells (HSF-6: University of California, San Francisco) 13.5 day CF1 mouse (ORIENT) fetuses were used as feeder cells and cultured. Feeder cells were cultured in DMEM (high glucose, Invitrogen) containing 10% FBS (HyClone), 0.1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acids and then 10 μg / to stop mitosis. ml of mitomycin C (sigma) was treated for 1 hour 30 minutes. Thereafter, feeder cells treated with mitomycin C at a concentration of 6.1 × 10 4 were seeded into 4-well medium dishes coated with 0.1% gelatin. Human embryonic stem cells were seeded the next day after seeding of the feeder cells and passaged in a mechanical manner at intervals of 5-7 days.

인간 배아 줄기세포는 20% knockout serum replacement (SR) (Gibco/BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1 mM β-머팝토에탄올, 1% 비필수 아미노산(Gibco/BRL), 100 U/ml 페니실린 G, 100 g/ml 스트렙토마이신, 및 4 ng/ml hr-bFGF(human recombinant basic fibroblast growth factor; Invitrogen)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 (DMEM/F12, without pyruvate)에서 배양 하였다. 도 2A는 CF1 마우스 피더 세포 위에 있는 인간 배아 줄기세포를 보여준다. Human embryonic stem cells contain 20% knockout serum replacement (SR) (Gibco / BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1 mM β-merpoptoethanol, 1% non-essential amino acids (Gibco / BRL), 100 U / ml penicillin G , 100 g / ml streptomycin, and 4 ng / ml hr-bFGF (human recombinant basic fibroblast growth factor; Invitrogen) added to Dulbecco's modified Eagle's medium / F12 (DMEM / F12, without pyruvate). 2A shows human embryonic stem cells on CF1 mouse feeder cells.

실시예Example 2. 인간 배아 줄기세포에  2. Human Embryonic Stem Cells 오카다익산의Okadaic 효과 effect

피더 세포 위에 있는 배아 줄기세포에서 오카다익산의 효과를 살펴보기 위하 여 다양한 농도 (0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM)로 오카다익산을 인간 배아 줄기세포 배양액에 첨가하였다. 10, 100 nM에서는 배양액에 첨가한 다음 날 (24 시간 후) 배아 줄기세포와 피더 세포가 라이세스(lysis)되면서 오카다익산에 독성(toxicity)을 보였으며 1nM 이하에서는 여러 번 계대배양을 한 후에도 오카다익산에 독성을 보이지 않고 오카다익산을 처리하지 않은 대조군과 비슷한 미분화의 배아 줄기세포 형태를 보였다.To examine the effects of okadiic acid on embryonic stem cells on feeder cells, okadiic acid was added to human embryonic stem cell culture at various concentrations (0.01, 0.1, 1, 10, 100 nM). At 10 and 100 nM, embryonic stem cells and feeder cells were lysed on the following day (24 hours) after addition to the culture medium, and showed toxicity to okadaic acid and below 1 nM even after multiple passages. It showed no toxicity to Iksan and showed undifferentiated embryonic stem cell morphology similar to the control without Okadaic acid.

실시예Example 3.  3. 피더Feeder 세포가 없는( Without cells ( feederfeeder -free) 조건에서 -free) under conditions 오카다익산이Okada Iksan 인간 배아 줄기세포에 미치는 효과 Effects on Human Embryonic Stem Cells

피더 세포가 없는 배양 조건에서 인간 배아 줄기세포에 미치는 오카다익산의 효과를 살펴보았다. 0.01, 0.1, 1nM의 농도의 오카다익산을 CM을 사용하지 않은 인간 배아 줄기세포 배양액에 첨가하고 효과를 살펴보았다. 선행 연구자들이feeder-free에서 일반적으로 사용한 라미닌(laminin)이나 매트리젤(matrigel) 등의 매트릭스를 처리하지 않은 조건에서, 4-웰 배양 디쉬에 상온에서 30분 동안 0.1% 젤라틴(gelatin) 코팅을 한 후, 피더 세포 위에 있는 배아 줄기세포를 기계적( mechanical) 방법으로 작은 조각으로 자른 후 0.01, 0.1, 1nM의 농도가 첨가된 배양액에 씨딩하였다. We examined the effects of okadaic acid on human embryonic stem cells in culture without feeder cells. Okadaic acid at concentrations of 0.01, 0.1, and 1 nM was added to human embryonic stem cell cultures without using CM. In a four-well culture dish, 0.1% gelatin coating was performed at room temperature for 30 minutes under conditions that previous researchers did not process the laminin or matrigel matrix commonly used in feeder-free. After that, embryonic stem cells on the feeder cells were cut into small pieces by mechanical methods and seeded in a culture medium to which concentrations of 0.01, 0.1, and 1 nM were added.

그 결과, 0.01, 0.1 nM (도 1C)에서는 오카다익산을 처리하지 않은 대조군 (도 1D)과 유사하게 분화되는 형태를 보였으며 3 계대(passage) 이상에서는 인간 배아 줄기세포가 모두 분화되어 미분화된 배아 줄기세포를 관찰할 수 없었다. 그러 나 1nM을 첨가한 그룹에서는 미분화된 인간 배아 줄기세포의 형태 (도 2B-D)를 유지하였으며 0.01, 0.1 nM에서 나타나는 결과처럼 분화되는 경향은 보이지 않았다. 또한 피더 세포 위에 있는 배아 줄기세포에서 나타나는 세포질에 비해 핵의 비율이 높은 배아 줄기세포의 성격도 관찰할 수 있었다 (도 2D). As a result, at 0.01 and 0.1 nM (FIG. 1C), the cells were differentiated similarly to the control group not treated with okadaic acid (FIG. 1D), and human embryonic stem cells were differentiated and differentiated into embryos at three or more passages. Stem cells could not be observed. However, in the group to which 1 nM was added, the morphology of undifferentiated human embryonic stem cells (Fig. 2B-D) was maintained, and there was no tendency to differentiate as shown in 0.01 and 0.1 nM. In addition, the nature of embryonic stem cells with a higher percentage of nuclei compared to the cytoplasm of embryonic stem cells on feeder cells was also observed (FIG. 2D).

실시예Example 4.  4. 피더Feeder 세포위에On the cell 있는 배아 줄기세포 ( Embryonic stem cells ( bFGFbFGF 가 없는 배양액)에서 오카다익In the medium without) 산의Mountain 효과 effect

bFGF는 인간 배아 줄기세포에 4 ng/ml의 농도로 배양액에 첨가하며 미분화 배아 줄기세포의 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. bFGF 없는 조건에서 오카다익산 1nM을 배양액에 첨가하여 배아 줄기세포의 증식 및 분화 여부를 보았다. 피더 세포위에 있는 배아 줄기세포에 bFGF가 없는 조건에서는 2 계대 이상에서 모두 분화되는 경향을 보였으며(도 3A), bFGF가 없는 조건하에 오카다익산 1nM을 첨가한 그룹에서는 미분화 상태인 인간 배아 줄기세포를 관찰할 수 있었다(도 3B). 오카다익산이 bFGF를 대체하는 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. bFGF is added to human embryonic stem cells at a concentration of 4 ng / ml and is known to affect the proliferation of undifferentiated embryonic stem cells. In the absence of bFGF, 1 nM of okadaic acid was added to the cultures to examine the proliferation and differentiation of embryonic stem cells. In the absence of bFGF, embryonic stem cells on feeder cells tended to differentiate in more than two passages (Fig. 3A), and in the group to which 1nM of okadiic acid was added under the absence of bFGF, undifferentiated human embryonic stem cells Observation was possible (FIG. 3B). Okadaic acid was confirmed to have an effect of replacing bFGF.

실시예Example 5.  5. 피더Feeder 세포가 없는( Without cells ( FeederFeeder -- freefree ) 조건에서 인간 배아 줄기세포의 Condition of human embryonic stem cells ESES 마커Marker 및 핵형 확인 And karyotyping

피더 세포가 없는 조건에서 자란 인간 배아 줄기세포가 정상적인 ES 마커가 발현하는지의 유무를 RT-PCR로 살펴보았다. 총-RNA(total RNA)는 Trizol reagent (Invitrogen)를 사용하여 실시하였다. 역전사(Reverse-transcription: RT)는 총- RNA 의 500 ng, oligo d(T)12-18 primer (Invitrogen), AMV reverse transcriptase (Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 cDNA를 만들었다. RT-PCR은 cDNA 1㎕, 각각의 프라이머 10 pmol, 그리고 PCR premix (1U Tag DNA polymerase, 250 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl and 1.5 mM MgCl2 Bioneer, Korea)을 사용하여 실시하였다.It was examined by RT-PCR whether human embryonic stem cells grown in the absence of feeder cells express normal ES markers. Total RNA was performed using Trizol reagent (Invitrogen). Reverse-transcription (RT) was used to generate cDNA using 500 ng of total RNA, oligo d (T) 12-18 primer (Invitrogen), and AMV reverse transcriptase (Roche Molecular Biochemicals). RT-PCR was performed using 1 μl cDNA, 10 pmol of each primer, and PCR premix (1U Tag DNA polymerase, 250 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl and 1.5 mM MgCl 2 Bioneer, Korea) .

사용된 프라이머는 미분화 ES 마커인 nanog(서열번호 1과 2), oct-4(서열번호 3과 4), rex1(서열번호 5와 6) 및 ES에서 발현되는 hTert(서열번호 7과 8) 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하였다. β-actin을 음성 대조구로 사용하였다. 사용된 cDNA는 양성 대조구로 피더 세포 위에서 자란 인간 배아 줄기세포를 사용하였으며 피더 세포가 없는 조건에서 자란 배아 줄기세포를 5, 10, 15 계대의 샘플을 사용하였다. 도 5의 RT-PCR 결과에서 피더 세포가 없는 조건에서 자란 인간 배아 줄기세포는 양성 대조구와 같이 ES 마커인 nanog, oct-4, rex1 및 ES에서 발현되는 hTert가 모두 발현되는 것을 확인하였다. 핵형은 (주) 삼광에 의뢰하였으며 피더 세포가 없는 조건에서 15 계대에서 확인한 결과 정상적인 핵형을 확인하였다. 피더 세포가 없는 조건에서 자란 인간 배아 줄기세포는 피더 세포 위에서 자란 인간 배아 줄기세포와 같이 정상적인 형태와 동일한 유전자 발현 및 핵형을 보였다(도 4).Primers used were the undifferentiated ES markers nanog (SEQ ID NOs: 1 and 2), oct-4 (SEQ ID NOs: 3 and 4), rex1 (SEQ ID NOs: 5 and 6), and the hTert (SEQ ID NOs: 7 and 8) genes expressed in ES A primer specific for the was used. β-actin was used as a negative control. The cDNA used was human embryonic stem cells grown on feeder cells as a positive control, and embryonic stem cells grown in the absence of feeder cells were used for 5, 10 and 15 passages. In the RT-PCR results of FIG. 5, it was confirmed that human embryonic stem cells grown in the absence of feeder cells expressed all hTert expressed in the ES markers nanog, oct-4, rex1, and ES like the positive control. The karyotype was commissioned by Samkwang Co., Ltd., and the normal karyotype was confirmed at 15 passages in the absence of feeder cells. Human embryonic stem cells grown in the absence of feeder cells showed the same gene expression and karyotype as normal human embryonic stem cells grown on feeder cells (FIG. 4).

본 발명의 오카다익산을 포함하는 배지 조성물을 이용하여 인간 배아 줄기세포의 미분화 증식을 바이러스성 감염, 동물원성 감염에 의한 오염 등의 우려 없이 배아 줄기세포의 미분화 증식을 조절 및 제어할 수 있다.By using the medium composition comprising the okadiic acid of the present invention, the undifferentiated proliferation of human embryonic stem cells can be controlled and controlled by the undifferentiated proliferation of embryonic stem cells without fear of viral infection, contamination by zoological infection, and the like.

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Claims (10)

피더세포 존재 하에 0.5 내지 1.5nM의 오카다익산(Okadaic acid)을 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 배지 조성물.A medium composition for inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells containing 0.5 to 1.5 nM of Okadaic acid in the presence of feeder cells. 제1항에 있어서, 배아 줄기세포가 인간 유래인 조성물.The composition of claim 1, wherein the embryonic stem cells are derived from humans. 삭제delete 제1항의 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는 배아 줄기세포의 미분화 증식을 유도하는 방법.A method of inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising culturing in the medium composition of claim 1. 제4항에 있어서, 배아 줄기세포가 인간 유래인 방법.The method of claim 4, wherein the embryonic stem cells are human derived. 삭제delete 제1항에 있어서, bFGF를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.The medium composition of claim 1, wherein the medium composition does not comprise bFGF. 제1항에 있어서, bFGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.The medium composition of claim 1 comprising bFGF. 제7항 또는 제8항의 배지조성물에서 배양하는 단계를 포함하는 배아 줄기세포의 미분화증식을 유도하는 방법.A method of inducing undifferentiated proliferation of embryonic stem cells comprising culturing in the medium composition of claim 7 or 8. 제9항에 있어서, 배아 줄기세포가 인간 유래인 방법. The method of claim 9, wherein the embryonic stem cells are human derived.
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