KR100677952B1 - 재조합 단백질 생산을 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 단백질을 생산하기 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탄소원 대사 관련 유전자의 프로모터 하에서 재조합 숙주 세포를 유가배양하여 재조합 단백질을 발현하는데 있어서 탄소원 공급량을 제어하여 재조합 숙주 세포의 세포 성장과 그의 단백질 발현량을 극대화할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명이 제공하는 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"과 "임계농도 연속공급방법"에 의한 탄소원 공급방법을 개별적으로 또는 병행하여 재조합 숙주세포를 유가배양하면 세포의 탄소원 대사를 정교하게 조절할 수 있으며, 세포의 스트레스를 경감할 수 있으므로 재조합 단백질 발현량을 극대화할 수 있다.

유가배양, 재조합 단백질, 단백질 가수분해, 한세눌라 폴리모르파

Description

재조합 단백질 생산을 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법{A FERMENTATION STRATEGY FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN IN HOST CELLS}

도 1은 메탄올 자화 효모의 메탄올 대사회로의 일부를 나타낸 개략도이다. 도 1에서 MOX는 메탄올 산화효소(methanol oxidase)이고, CAT는 카탈라제, DHAS는 디히드록시아세톤 합성효소(dihydroxyacetone synthase), DHAK는 디히드록시아세톤 키나제(dihydroxyacetone kinase), FLD는 포름알데히드 탈수소효소(formaldehyde dehydrogenase)이며 FMD는 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase)이다.

도 2는 본 발명에 따른 탄소원 공급량 제어 알고리즘의 일 구현예를 예시한 것이다. 도 2에서 (A)는 세포의 비성장속도에 따라서 탄소원의 공급량을 설정하고 지수적으로 탄소원을 공급하는 제 1모듈; (B)는 탄소원 공급의 최대농도를 제어하도록 구성한 제 2모듈; (C)는 탄소원의 공급빈도를 임의의 매개변수에 의해 제어하는 제 3모듈을 나타낸다(F_i, 초기 탄소원 공급량; F_C, 지수적 탄소원 공급량; F_L, 탄소원 공급량 상한값; k, 임의의 세포성장 상수; DO, 용존산소농도; DO_i, 용존산소 상한농도).

도 3은 도 2의 알고리즘 작동으로 발생하는 출력을 나타낸 그래프이다. 도 3A는 제 1모듈의 실행에 의하여 발생하는 출력을 나타낸 것이고, 도 3B는 제 2 모듈의 실행에 의하여 발생하는 출력을 나타낸 것이며, 도 3C는 제 3모듈의 실행에 의하여 발생하는 출력을 나타낸 것이다(μ₁ ~ μ₅, 세포 비성장속도; F_L, F_L1 ~ F_L4 탄소원 공급량 상한값; DO_{i ,} 용존산소 상한농도; DO_{L ,} 용존산소 하한농도; DO_C, 용존산소 임계농도).

도 4는 본 발명에 따른 탄소원 공급 알고리즘의 3개 모듈을 상호 연동하여 탄소원 공급을 제어할 때 발생하는 탄소원 공급 출력을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 탄소원 공급 알고리즘에 의한 탄소원 공급방법으로 재조합 인간 혈청 알부민을 생산하는 한세눌라 폴리모르파를 유가배양한 결과를 나타낸 그래프이다(●, 알부민 농도; ▲, 세포 농도; 점선, DO).

도 6은 대조구로서 재조합 인간 혈청 알부민을 생산하는 한세눌라 폴리모르파를 지수적 방법(A)과 간헐적 방법(B)으로 탄소원을 공급하여 유가배양한 결과를 나타낸 그래프이다(●, 알부민 농도; ▲, 세포 농도; 점선, DO).

도 7은 도 6의 재조합 인간 혈청 알부민을 생산하는 한세눌라 폴리모르파를 간헐적 탄소원 공급방법으로 유가배양시 필요로 하는 탄소원의 공급량을 결정한 SDS-PAGE 사진이다(래인 1, 분자크기 마커; 래인 2, 50 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 3, 100 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 4, 4 g/L 메탄올; 래인 5, 8 g/L 메탄올; 래인 6, 12 g/L 메탄올; 래인 7, 16 g/L 메탄올).

도 8은 탄소원 공급방법에 따른 재조합 인간 혈청 알부민의 발현을 8% SDS- PAGE를 실시한 후 비교 분석한 결과이다[(A) 본 발명의 알고리즘에 의한 탄소원 공급 방법으로 탄소원을 공급한 결과(래인 1, 분자크기 마커; 래인 2, 50 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 3, 100 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 4, 24 h(24시간 배양 후); 래인 5, 38 h; 래인 6, 48 h; 래인 7, 60 h; 래인 8, 72 h; 래인 9, 82 h; 래인 10, 96 h); (B) 지수적 공급방법으로 탄소원을 공급한 결과(래인 1, 분자크기 마커; 래인 2, 50 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 3, 100 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 4, 12 h; 래인 5, 24 h; 래인 6, 28 h; 래인 7, 32 h; 래인 8, 36 h; 래인 9, 40 h; 래인 10, 44 h; 래인 11, 48 h; 래인 12, 52 h; 래인 13, 54 h; 래인 14, 56 h; 래인 15, 58h); (C) 간헐적 공급방법으로 탄소원을 공급한 결과(래인 1, 분자크기 마커; 래인 2, 50 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 3, 100 ng 표준 인간 혈청 알부민; 래인 4, 13 h; 래인 5, 17 h; 래인 6, 21 h; 래인 7, 25 h; 래인 8, 29 h; 래인 9, 33 h; 래인 10, 37 h; 래인 11, 41 h; 래인 12, 45 h; 래인 13, 49 h; 래인 14, 53 h; 래인 15, 57 h)].

도 9는 도 9는 본 발명의 임계농도 연속공급방법으로 한세눌라 폴리모르파를 유가배양하여 재조합 인간 혈청 알부민을 생산한 결과를 나타낸 그래프이다(실선, 메탄올 공급량; 점선, DO; ▲, 세포 농도; ●, 재조합 알부민 농도).

도 10은 본 발명의 임계농도 연속공급방법으로 한세눌라 폴리모르파를 유가배양하여 재조합 인간 혈청 알부민을 생산한 결과와 알고리즘에 의한 탄소원 공급방법으로 인간 혈청 알부민을 생산한 결과를 8% SDS-PAGE를 실시한 후 비교한 사진이다. 도 10에서 래인 1은 분자크기 마커이고 래인 2는 50 ng 표준 인간 혈청 알 부민, 래인 3은 100 ng 표준 인간 혈청 알부민, 래인 4 내지 8은 임계농도 연속공급방법에 의한 결과(래인 4, 24 h; 래인 5, 48 h; 래인 6, 72 h; 래인 7, 89 h; 래인 8, 96 h)이며, 또한 래인 9 내지 13은 알고리즘에 의한 탄소원 공급방법에 의한 결과(래인 9, 24 h; 래인 10, 48 h; 래인 11, 72 h; 래인 12, 86 h; 래인 13, 96 h)이다.

도 11은 재조합 인간 혈청 알부민을 생산하는 한세눌라 폴리모르파를 유가배양할 때에 알고리즘에 의한 탄소원 공급방법과 임계농도 연속공급방법의 용존산소농도 응답을 비교한 그래프이다[(A) 알고리즘에 의한 탄소원 공급 방법에 응답된 용존산소농도의 진폭; (B) 임계농도 연속공급방법에 대해 응답된 용존산소농도의 진폭).

본 발명은 재조합 단백질을 생산하기 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탄소원 대사 관련 유전자의 프로모터 하에서 재조합 숙주 세포를 유가배양하여 재조합 단백질을 발현하는데 있어서 탄소원 공급량을 제어하여 재조합 숙주 세포의 세포 성장과 그의 단백질 발현량을 극대화할 수 있는 방법에 관한 것이다.

도 1에 예시된 바와 같이 탄소원으로 메탄올을 이용하는 메탄올 자화 효모의 메탄올 대사에서는 메탄올 산화효소에 의한 산화반응에 의하여 포름알데히드와 과산화수소가 생성되며 이 두 화합물이 세포에 심각한 독성을 나타내므로 카탈라제, 포름알데히드 탈수소효소, 그리고 포름산 탈수소효소 등의 활성이 충분히 메탄올 산화효소의 산화반응속도와 대등하여야만 효과적인 세포 성장과 재조합 단백질의 발현을 얻을 수 있다. 카탈라제의 반응속도는 충분히 빠르기 때문에 과산화수소는 용이하게 제거될 수 있으나, 포름알데히드와 포름산은 동화반응과 이화반응 등의 에너지 대사와 연계되어 있으므로 효과적인 대사제어를 위한 대안이 요구된다.

포름알데히드를 효과적으로 제거하는 방법은 이론적으로는 분자 유전학적인 방법에 의하여 포름알데히드 탈수소효소와 디히드록시아세톤 합성 및 인산화효소의 활성을 조절하여 제어할 수 있는데, 디히드록시아세톤 합성 및 인산화효소의 동화는 ATP/ADP 비에 의존하고 있으며 ATP 에너지 레벨은 포름알데히드 탈수소효소에 의하여 조절되고 이 비율에 따라서 동화 및 이화 경로의 방향이 결정되므로 재조합 단백질의 발현과 세포 생리의 상호관계를 고려하여 효과적으로 제어하기 위해서는 매우 정밀하고 엄격한 에너지 대사 및 효소활성 제어가 네트워크적으로 이루어져야 한다(Velkov et al., J. Biosci., 24, 279-286 (1999)).

이와 같이 분자수준에서 세포대사와 목적 단백질의 발현을 제어하는 것은 매우 복잡한 유전자 발현 및 억제기술을 필요로 하여 실제로는 어려움이 따르므로 오히려 발효 공정 제어와 같은 거시적인 측면에서 문제를 해결하는 것이 보다 용이하며 효과적일 수 있다.

재조합 단백질의 효율적인 생산을 위한 재조합 균주의 배양 공정 연구는 세 포의 고농도 생산이 용이하면서 대사산물의 저해가 비교적 낮은 유가배양 시스템에 의해 개발되어 왔으며 재조합 단백질의 생산 수율과 세포 성장을 효과적으로 조절하기 위한 영양원의 공급방법에 관한 많은 연구가 보고되어 있다.

대표적인 방법으로는 탄소원의 공급농도를 임의의 세포성장을 유지하는 농도로 공급하는 "연속적 공급방법"과 재조합 단백질 발현에 필요한 최적 탄소원 농도를 일정하게 유지되도록 공급하거나 세포의 주기적인 탄소원 대사와 대사산물의 즉각적인 소비를 유도하는 "간헐적 공급방법"을 들 수 있다.

연속적 공급의 경우는 세포의 성장을 지속적으로 유지하기 위하여 세포 증식속도에 따라서 탄소원을 지수적으로 공급하여야 하는데, 세포의 탄소원 소비와 세포증식에 알맞도록 탄소원 농도를 정밀하게 공급하기 위한 제어가 실제적으로는 어렵기 때문에 탄소원의 과다공급 또는 미달공급에 의한 대사적 부하(metabolic burden) 또는 대사적 고갈(metabolic drain)을 야기할 수 있다. 또한, 발현하고자 하는 재조합 단백질의 종류에 따라서 세포에 미치는 영향이 다르게 나타날 수 있으므로 각각의 경우에 대한 최적 제어 조건을 결정해야 하는데 단백질의 종류에 따른 탄소원의 최적조건을 구하는 것은 사실상 매우 어렵다.

한편, 간헐적 공급의 경우에는 세포의 탄소원 소비 상태를 효과적으로 반영하는 용존산소농도(dissolved oxygen, DO) 또는 pH 등의 매개변수를 이용하여 복잡한 제어 알고리즘 없이 세포가 일회에 충분히 소비할 수 있는 분량의 탄소원을 첨가한 다음, 매개변수를 관찰하여 공급된 탄소원과 생성된 대사산물의 완전 소비를 확인한 후 다시 탄소원을 공급하는 방법으로서 탄소원의 공급과 대사를 쉽게 제어 할 수 있다는 관점에서 선호되고 있다.

그러나, 간헐적 공급으로 나타나는 탄소원의 주기적이며 반복적인 진동공급(oscillation feeding) 또는 펄스 공급(pulse feeding)은 세포의 반복적인 탄소원 고갈 상태를 발생시켜 세포의 스트레스를 유발할 수 있고 세포가 유사 세포 성장 정지기(pseudo-stationary phase)로 인식하여 세포외로 단백질 가수분해 효소를 유출하거나 세포 자가분해를 일으킬 수 있다. 특히, 메탄올을 탄소원과 에너지원으로 사용하는 메탄올 자화 효모의 경우에는 탄소원의 종류에 따라서 세포벽의 강도가 차이를 보이는데, 메탄올을 탄소원으로 사용하는 경우의 세포벽 강도가 포도당 또는 글리세롤 탄소원의 경우와 비교하여 상대적으로 낮기 때문에 간헐적 공급방법의 경우 세포외 단백질 가수분해효소의 유출이 심화될 수 있다(Giuseppin et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 27, 31-36 (1987)). 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 주기적으로 도입되는 탄소원의 일회 공급농도를 높혀 공급빈도를 낮출 수 있지만, 이 경우에는 용존산소 공급부족과 대사산물의 축적을 야기할 수 있으며 이로 인하여 연속적 공급방법에서의 근본적인 문제점들이 나타날 수도 있다.

유가(fed-batch)배양에 대하여 세포의 탄소원 소비량을 면밀히 조사하여 보면 세포 배양시간이 증가해 갈수록 배양 중반기까지는 세포의 농도가 증가함에 따라 탄소 소비가 왕성하게 증가하지만 배양 중반기 이후에는 세포의 증식 속도가 둔화되면서 탄소원 소비가 감소하므로 배양과정에 따라서 세포의 상태에 알맞도록 탄소원의 공급 농도를 조절하는 것이 필요하다. 그러나 대부분의 간헐적 공급은 임의로 미리 정해진 농도로 일정하게 전체 배양기간 동안 주기적으로 공급하므로 배 양 중반에는 탄소원의 상대적 부족을 보일 수 있으며 배양 후반기에는 탄소원의 과도 공급에 의한 세포의 성장 및 재조합 단백질 발현 저해를 나타낼 수 있다.

많은 연구를 통하여 지금까지 제시되고 있는 탄소원 공급방법과 관련된 대부분의 수학적 모델들은 세포의 생리를 보다 효과적으로 반영하기 위하여 많은 변수를 추가하고 있으며 한 가지 이상의 변수들을 측정 및 제어에 이용하고 있을 뿐만 아니라 제어 로직 역시 매우 복잡해서 실제적인 산업 공정에서는 적용하기 매우 어려운 제어 알고리즘들을 제시하고 있다. 바람직한 탄소원 제어 알고리즘은 효과적인 세포배양과 고효율의 재조합 단백질 생산이 가능한 간결한 로직으로 구성되면서 산업현장에서도 기존의 설비에 충분히 응용할 수 있는 측정과 제어가 용이한 매개변수를 사용해야 한다.

따라서 재조합 숙주 세포의 유가배양시 세포 성장과 재조합 단백질 생산을 효과적으로 제어할 수 있는 탄소원 공급방법이 절실히 요구되며, 나아가 기존의 간헐적 공급 방법에 의하여 야기될 수 있는 발현된 재조합 단백질의 분해현상을 방지하여 고효율, 고농도의 재조합 단백질 생산이 가능하며 산업적으로 용이하게 이용할 수 있는 탄소원 공급방법을 개발하는 것이 필요하다.

본 발명은 일반적으로 실시되고 있는 탄소원의 연속적 및/또는 간헐적 공급의 단점을 보완하여 세포 성장 및 재조합 단백질의 발현이 극대화될 수 있는 탄소원 공급 제어방법을 제공한다.

본 발명은 탄소원 대사 관련 효소의 프로모터 하에 재조합 단백질이 발현되는 재조합 숙주 세포 배양에 있어서 탄소원 공급량을 제어하는 방법을 제공한다.

본 발명은 특정하게 구성된 탄소원 공급량 제어 방법으로 탄소원을 공급함으로써 세포의 최적 탄소원 대사를 구현하여 고농도 배양과 재조합 단백질의 생산을 극대화하는 재조합 숙주 세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명은 재조합 단백질 생산을 위한 재조합 숙주 세포의 배양에 있어서 탄소원 공급량을 제어하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 두 종류의 탄소원 공급방법을 포함한다. 그 하나는 알고리즘에 의하여 탄소원을 공급하는 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"이며, 다른 하나는 상기의 알고리즘에 의하여 탄소원 공급량을 산출하고 이로부터 임계농도를 구하여 연속적으로 공급하는 "임계농도 연속공급방법"이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하기 위해 숙주 세포를 유가배양하는데 있어서, 세포의 비성장속도에 따라서 탄소원의 공급량을 설정하고 지수적으로 탄소원을 공급하는 제 1모듈, 탄소원 공급량 상한값을 제어하는 제 2모듈 및 매개변수에 따른 탄소원 공급빈도를 제어하는 제 3모듈을 포함하여서 되는 전산 제어 장치와 연결된 탄소원 공급 펌프에 의해 탄소원이 공급되며, 상기 전산 제어 장치에서 지수적 탄소원 공급량은 세포의 탄소원 소비상태와 연관된 매개변수들에 의해 설정되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포의 배양방법을 제공한다.

바람직한 양태로, 본 발명은 재조합 숙주 세포 배양에 있어서, 세포의 비성장속도(specific growth rate)에 따른 지수적 탄소원 공급량(F_C) 설정 모듈; 매개변수, 예를 들면 용존산소농도 등에 따른 탄소원 공급빈도 제어 모듈; 및 탄소원 공급량 상한값(F_L) 제어 모듈을 포함하고, 매개변수가 초기에 설정된 값을 벗어나면 탄소원 공급을 중단하는데, 여기에서 매개변수가 초기에 설정된 값을 벗어나고 F_C가 F_L 이하인 경우에는 Fc값으로 탄소원을 공급하며, 매개변수가 초기 매개변수를 벗어나고 F_C가 F_L 이상이면 F_L값으로 탄소원 공급량을 제어하는 방법을 제공한다.

본 발명의 탄소원 공급을 제어하는 알고리즘은 3개의 모듈을 포함하며, 제 1 모듈(도 2A)은 세포의 비성장속도를 설정하고 설정된 세포의 비성장속도에 따라서 탄소원 공급을 지수적으로 공급하도록 구성된 것이고, 제 2모듈(도 2B)은 탄소원 공급을 임의로 설정한 공급농도(상한값) 이하로 제어하도록 구성된 것이며, 제 3모듈(도 2C)은 탄소원의 공급을 임의로 설정된 매개변수의 설정값 범위 내로 제어하며 탄소원의 공급 빈도를 조절하도록 구성된 것이다. 이러한 탄소원 공급 알고리즘의 바람직한 일 예를 도 2에 예시하였으며, 상기 알고리즘으로 구성된 프로그램을 컴퓨터에 탑재하여 구동할 수 있다.

본 발명에 따른 탄소원 공급 제어 알고리즘은 상기 3개의 제어 모듈이 상호 연동하여 최적 조건으로 탄소원을 공급하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 이용하는 재조합 숙주 세포는 유가식(fed batch), 반복 유가식 또는 연속 배양, 바람직하게는 세포의 고농도 배양이 용이하고 대사산물에 의한 저해가 낮으며 재조합 단백질의 생산성을 높일 수 있는 유가식 배양을 통해 배양할 수 있다.

알고리즘에 의한 전산제어로 유가배양하여 재조합 단백질을 생산하기 위해서는 세포의 대사와 재조합 단백질 발현에 관련된 매개변수의 선택이 중요하다. 일반적으로 모델화를 구축하기 위한 변수로는 직접 측정할 수 있는 1차 변수를 이용하거나 1차로 습득된 변수들의 상호 관계로 얻은 2차 변수를 이용하여 지표를 얻을 수 있다. 이와 같이 수집된 지표들을 바탕으로 하는 수식화에는 비구조화(unstructured) 또는 구조화된(structured) 수학적 모델화를 통하여 정량화한다.

수집된 지표들은 목적하는 상태로 재설정하거나 모델에 기초한 최적화 상태로 되돌리기 위하여 출력을 행하게 되는데, 일반적으로 유가배양에서는 공급되는 탄소원의 농도를 조절하여 제어할 수 있다.

보다 바람직한 양태로, 본 발명의 탄소원 공급 알고리즘에 있어서 제 1모듈은 미리 설정된 세포 비성장속도에 따라 탄소원을 지수적으로 공급하는 단계로서 탄소원의 초기 공급량은 다음 수학식 1과 같은 종래에 알려진 일반적인 계산식에 의해 얻어질 수 있다. 수학식 1의 각각의 변수는 회분배양을 통해 얻을 수 있으며, 지수적 탄소원 공급량은 수학식 1로 계산된 Fi로부터 수학식 2에 의해 계산될 수 있다.

상기 식에서, μ는 세포 비성장속도, X₀는 회분배양 후 세포농도, V₀는 배양체적, t는 배양시간, Y_X/S는 세포수득률, S₀는 탄소원 농도, k는 세포 성장 상수, F_i는 초기 탄소원 공급량, F_c는 임계 탄소원 공급량이다.

본 발명에 있어서 세포 성장 상수 k는 1 내지 1.00001, 바람직하게는 1.0001 내지 1.001의 범위에서 설정할 수 있는데, 이는 실제 회분 및 유가배양으로부터 얻은 세포의 비성장속도 결과를 비교하여 세포 비성장속도가 최대 0.2 h^-1을 넘지 않도록, 바람직하게는 0.001 내지 0.05 h^-1의 범위가 되도록 조정된 값이다.

제 2모듈은 제 1모듈에 의하여 공급되는 탄소원 공급량을 그 값의 10 내지 100 % 범위 내, 바람직하게는 50 내지 100 % 범위 내에서 제어하는 단계로, 이 모듈의 기능은 배양 후반기에 세포 농도가 증가함에 따라 일회 탄소원 공급농도가 세포의 균체량에 대하여 과도하게 투여되는 것을 방지할 수 있도록 구성된다. 따라서 탄소원의 최종 공급농도는 제 1모듈에 의하여 출력된 결과에 상응하도록 공급 빈도를 증가시킨다.

제 3모듈은 매개변수에 따라서 제 1모듈과 제 2모듈의 출력이 실시되도록 제 어하는 단계로, 유가배양에서 발생하는 매개변수의 변화가 미리 설정된 매개변수값을 벗어나면 제 1모듈과 제 2모듈의 출력값에 의하여 탄소원이 공급되거나 탄소원이 공급되지 않도록 구성된다. 제 1모듈은 제 3모듈의 실행과 관계없이 탄소원 공급유량을 배양시간에 따라 계속적으로 연산하되 실제적인 탄소원 공급은 제 3모듈에서 제어된다.

제 3모듈에서 매개변수의 상한값은, 용존산소농도를 일예로 할 경우 30 내지 90 %, 바람직하게는 40 내지 80 %가 유지되도록 구성되며, 매개변수의 상한값에 대응하여 출력이 실행된 결과는 출력 중에 매개변수가 상한값 이하로 감소하여도 실행을 정지하지 않고 일 회의 실행을 완료할 때까지 수행하도록 구성된다.

본 발명에 있어서, "매개변수"는 탄소원 소비에 따라서 주기적으로 변화하는 변수들을 의미한다. 본 발명에서 선택되는 매개변수는 세포의 탄소원 소비와 매개되어 있는 용존산소농도(DO), pH, 호흡지수, 또는 탄소원 농도 등이 있으며, 이외에도 측정이 용이한 다른 매개변수들을 이용할 수 있다.

재조합 숙주 세포로서 메탄올 자화 효모를 이용하는 경우에는 메탄올 대사와 관련된 1차 변수 중에서 DO를 지표로 이용하거나 2차적 변수로서 호흡지수(respiratory quotient, RQ) 또는 메탄올 센서를 이용하여 직접 측정하는 메탄올 농도를 이용할 수 있는데, 대부분의 경우는 DO를 지표로 사용한다.

바람직한 양태에서, 본 발명에 따르면 재조합 메탄올 자화 효모의 배양에서 탄소원 공급 제어를 위해, 3 부분의 기본 모듈을 연결하여 DO의 변화에 따른 탄소원의 공급량을 제어하도록 구성한다(도 2). 제 1모듈은 초기에 설정한 세포 비성 장속도에 따라 탄소원을 공급하도록 구성되고 제 2모듈은 탄소원 공급을 임의로 설정한 농도(상한값)를 초과하지 않도록 제어하도록 구성되며 제 3모듈은 DO값에 따라서 탄소원 공급을 제어한다.

본 발명에 있어서, 탄소원 공급 제어 알고리즘은 상기 3개의 제어 모듈이 상호 연동하도록 설계된다. 도 3에는 상기한 각각의 모듈 구동시 시간에 따른 탄소원 공급량 출력을 나타내었고 도 4에는 3개의 모듈이 동시에 상호 연동하여 탄소원 공급량을 제어하는 출력 결과를 나타내었다. 상기 알고리즘에 의하여 발생하는 출력값은 전산제어 시스템과 연결된 탄소원 공급 펌프를 구동하여 탄소원 공급 유량을 제어한다.

본 발명의 탄소원 제어 알고리즘에 의한 배양방법은 재조합 메탄올 자화 효모의 메탄올 대사에 있어 필요한 탄소원 공급량을 대사에 정확하게 상응하도록 공급하여 세포가 대사적 부하나 대사적 고갈상태에 들어가지 못하도록 정교하게 제어함으로써 균체 농도가 배양시간에 따라 지속적으로 증가하고 재조합 단백질의 생산량도 증가하게 된다.

본 발명의 대조구로서 탄소원을 연속적 또는 간헐적으로 공급하면서 알부민 유전자를 포함하는 재조합 한세눌라 폴리모르파를 배양한 경우, 배양 중기 이후에 재조합 알부민의 분해가 일어나고 발현량이 낮아지며 균체량이 배양 후기부터 서서히 감소하는 반면, 본 발명의 탄소원 공급 알고리즘에 의한 탄소원 공급을 제어한 배양에 따르면 알부민의 생산량이 최대 2배 이상 증가하며 세포 농도도 지속적으로 증가한다.

더욱 바람직한 양태로, 본 발명은 상기의 탄소원 공급량을 제어하는 방법으로부터 탄소원을 연속적으로 공급하더라도 세포가 효과적으로 소비할 수 있는 최적화된 탄소원 임계농도로 튜닝하여 탄소원을 연속 공급함으로써 재조합 숙주 세포를 유가배양하는 "임계농도 연속 공급방법"을 제공한다.

본 발명에 따른 임계농도 연속 공급방법은 i) "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"을 이용한 유가배양으로부터 배양 전반에 걸쳐 공급된 탄소원의 양을 배양 시간별 공급량으로 산출하는 단계, ⅱ) 산출된 탄소원 공급량을 임의의 시간 단위로 탄소원의 평균 공급 농도를 구한 다음 시간별로 산출된 임계 농도의 계산상에서 발생하는 편차(잘못 산출된 평균농도)를 상쇄시키는 단계, 및 ⅲ) 보정된 탄소원 공급 농도에 알맞도록 탄소원 공급량을 정하여 공급하는 단계로 이루어진다.

본 발명에 있어서, "튜닝"은 상기한 바와 같이 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"으로 구한 탄소원 공급량을 "임계농도 연속공급 방법"에 적합하게 공급 농도를 다시 결정하는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에 따라 임계농도 연속공급방법으로 탄소원을 공급하면 간헐적인 형태로 공급될 때 발생하는 반복적인 탄소원 고갈을 방지할 수 있으므로 재조합 단백질 분해가 억제되어 발현량이 배양시간에 따라 지속적으로 증가한다.

탄소원을 연속적으로 공급하는 일반적인 방법인 지수적 탄소원 공급방법으로는 정확한 탄소원 공급량을 결정하기 어렵다. 그 이유는 세포가 소비하는 탄소원의 양이 세포의 상태에 따라서 가변적이며, 특히 재조합 단백질을 생산하는 경우 각각의 재조합 단백질에 따라서 세포의 탄소원 소비 상태가 다르기 때문이다. 그 럼에도 불구하고 대부분의 탄소원 공급 알고리즘은 미리 정하여 놓은 세포 비성장속도에 따라서 탄소원을 공급하여 세포의 성장을 인위적으로 알고리즘에 맞추게 되므로 세포에 부하를 초래하는 경직된 제어방법이었다.

따라서 세포의 생육과 재조합 단백질 발현 상태에 맞추어 탄소원을 공급할 수 있는 유연한 알고리즘이 절대적으로 요구되는데, 이러한 점에서 본 발명에서 제공하는 탄소원 공급 알고리즘은 세포가 소비할 수 있는 알맞은 탄소원 공급량을 실시간으로 최적화하여 공급할 수 있으며 얻어진 탄소원 공급량을 튜닝하여 연속적인 방법으로 공급할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"은 도 5에 나타난 바와 같이 배양시간에 따라 세포농도와 재조합 알부민의 발현이 지속적으로 증가하였으며, 발현된 알부민의 분해가 대조구들의 경우 배양 60시간 이전에 심각하게 나타나는데 반하여 배양 60시간까지 분해가 거의 일어나지 않았다.

본 발명의 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"은 종래의 "지수적 공급방법" 또는 "간헐적 공급방법"과 비교하여 재조합 단백질 발현량이 월등히 높고, 생성된 재조합 단백질 분해를 최소화할 수 있는 방법이다.

그러나 배양 후기에 여전히 단백질 가수분해가 관찰되었는데, 이와 같은 현상은 위에서 언급한 바와 같이 탄소원을 DO에 따라서 주기적으로 공급하였기 때문에 세포가 반복적인 기아상태의 경험에 대한 스트레스가 유발되어서 단백질 가수분해 효소나 일부 세포의 자가분해가 발생한 것으로 판단된다.

탄소원 소비에 따라 나타나는 DO 변화로부터 세포의 상태를 예측할 수 있는 데, DO의 진폭은 탄소원 소비후 다음 탄소원 공급 때까지의 영양 기아(starvation)에 머무르는 시간을 의미할 수 있다. 탄소원 공급량을 튜닝하기 전(탄소원 제어 알고리즘에 의한 탄소원 공급방법)과 튜닝한 후(임계농도 연속공급방법)의 DO 변화를 비교하면 튜닝 후의 진폭이 작게 나타나는 것을 볼 수 있는데, 이것은 세포가 영양 기아 상태에 머무르는 시간이 튜닝 전보다 적음을 의미하며 세포는 기아로 인한 스트레스가 경감하므로 재조합 단백질 분해가 최소화될 수 있다.

바람직한 양태로, 본 발명은 단백질의 분해를 최소화하여 발현수율을 향상 시킬 수 있는 진보된 탄소원 공급방법으로서 "임계농도 연속 공급방법"을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 "임계농도 연속공급방법"은 도 9와 10에 나타난 바와 같이 임계농도로 탄소원을 연속적으로 공급하기 때문에 반복적인 탄소원 고갈에 의한 세포의 영양기아에 머무르는 시간을 최소화 할 수 있고, 그 결과 발현된 재조합 단백질의 분해가 나타나지 않으며 배양시간에 따라서 발현량이 지속적으로 증가한다.

탄소원 공급 조절은 단순한 지수적 공급 또는 간헐적 공급의 방법으로 제어하기에는 한계가 있으며, 본 발명에 따른 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"이 효과적이다.

또한, 본 발명의 방법에서 특징으로 하는 탄소원 공급량을 튜닝하는 "임계농도 연속공급방법"을 병행하면 재조합 단백질의 발현을 극대화할 수 있는 유가배양을 이룰 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "재조합 숙주 세포"는 유전자 재조합 기술로 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 탄소원 자화 숙주 세포로 도입되어 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 균주를 의미한다.

본 발명에 따르면, 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 조절하는 탄소원으로는 재조합 숙주 세포에 따라 임의로 포도당과 글리세롤을 포함하는 탄수화물류, 메탄올을 포함하는 탄화수소류 및 탄소원을 제공할 수 있는 유기산류 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 탄소원 공급 제어방법은 상기에서 언급한 탄소원들을 해당 대사계에 따라서 사용할 수 있으므로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모류; 아스퍼질러스(Aspergillus) 등의 곰팡이류; 및 대장균(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus) 등의 박테리아 등을 재조합 숙주 세포로 이용할 수 있다. 또한 그들의 재조합 단백질 발현을 위한 프로모터 역시 해당되는 탄소원 대사계의 프로모터 뿐 만 아니라 숙주로부터 재조합 단백질 발현에 이용 가능한 프로모터들을 이용할 수 있다.

본 발명에서는 재조합 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포로서, 바람직하기로는 메탄올 자화 효모를 이용한다. 메탄올 자화 효모는 탄소원으로서 포도당, 글리세롤 또는 메탄올을 이용하여 단순한 회분식 또는 유가식 배양으로 매우 빠른 세포의 성장속도와 함께 고농도 배양이 용이하고, 매우 강력하고 조절이 정교한 프로모터들을 가지고 있으며 목표 유전자가 염색체상으로 다중 도입될 수 있어서 외래 유전자의 보존성이 높기 때문에 여러 발현시스템과 비교하여 외래 단백질 발현에 매 우 효과적인 발현 시스템으로 알려져 있다(Dijk et al., Enzyme Microb. Technol., 26, 793-800 (2000)).

본 발명에 있어서, 메탄올 자화 효모로는 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카 (Pichia metahanolica), 칸디다 보이디니 (Candida boidinii) 또는 오가테아 미누타 (Ogataea minuta) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 한세눌라 폴리모르파를 사용하였으나 본 발명의 재조합 숙주 세포가 이에 한정되지는 않는다. 재조합 숙주 세포로 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리모르파를 이용하는 경우에는 메탄올 대사와 관련된 1차 변수로서 DO가 세포와 세포의 환경을 이해하는데 효과적이므로 탄소원 대사에 관련된 기초 매개변수로서 DO를 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용한 용어 "재조합 메탄올 자화 효모"란 유전자 재조합 기술로 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 메탄올 자화 효모로 도입되어 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 균주를 의미한다.

메탄올 자화 효모를 이용하여 외래 단백질의 대량 생산을 위해서는 메탄올 대사 관련 유전자 유래의 프로모터가 바람직하다. 상기 프로모터는 매우 강력하고 메탄올 존재 여부에 따라 발현 조절이 가능한 장점이 있다. 메탄올 대사 관련 유전자는 메탄올 산화효소(methanol oxidase, MOX), 포름알데히드 탈수소효소(formaldehyde dehydrogenase, DHAS), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase, FMDH), 카탈라제(catalase, CAT), 디히드록시아세톤 키나제(dihydroxyacetone kinase), 디히드록시아세톤 탈수소효소(dihydroxyacetone dehydrogenase), 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), 알코올 산화효소 1 (alcohol oxidase 1, AOX1) 또는 퍼옥시좀 막 단백질(peroxisomal membrane protein, PMP) 유전자 등이 있으며, 외래 유전자가 상기 프로모터 하에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 특히, 한세눌라 폴리모르파의 경우 MOX, DHAS, FMDH 또는 CAT의 프로모터가 바람직하고 MOX 프로모터가 더 바람직하며, 피키아 파스토리스의 경우는 알코올 산화효소 1의 프로모터를 사용할 수 있다. MOX 프로모터를 이용한 발현 시스템은 저가의 탄소원인 메탄올로 세포 성장과 발현유도를 동시 또는 구분하여 배양에 따라 선택할 수 있으며 전통 효모와 달리 퍼옥시좀이라는 미소체(microbody)의 신생으로 인해 일부 재조합 단백질의 발현율이 기존의 효모 발현 시스템보다 우수한 장점이 있다(Kang H. A. and Gellissen G., Hansenula polymorpha, p.128, In Production of recombinant proteins(G. Gellissen Ed.), Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2005)).

본 발명에서 사용된 용어 "작동가능하도록 연결된"은 발현 조절 서열이 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 의미하며, 프로모터를 포함한 발현 조절 서열의 조절 하에 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되어 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 목적 단백질의 폴리펩타이드가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.

재조합 메탄올 자화 효모에서 발현가능한 외래 유전자로는 혈청 알부민을 포함하는 혈청 유래 단백질류; 인체 부갑상선 호르몬(hPTH), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), 심방 나트륨 배설인자(ANF) 및 인체 성장 호르몬(hGH)을 포함하는 호르몬류; 인터페론α, 인터페론β, 인터페론γ를 포함하는 인터페론류; 상피세포성장인자(hEGF), 콜로니 형성 자극인자들(hGCSF, hGM-CSF, hM-CSF), 전환성장인자(TGF) 및 혈소판 유도 성장인자(PDGF)를 포함하는 사이토카인류; 인터루킨류; 면역용 항체류; 파이타제(phytase)를 포함하는 효소류; B형 간염 항원(HBsAg) 및 C형 간염 표면 단백질 등의 각종 바이러스 항원 단백질의 유전자 등을 예로 들 수 있다.

상기 외래 유전자는 재조합 균주 내에 1 카피수 이상의 발현 카세트가 포함될 수 있으며 상업적 응용시에 2 이상의 복수 카피수가 발현되도록 하여 재조합 단백질의 발현량을 증대시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 구체적 한 예로 MOX 프로모터에 의하여 재조합 알부민을 발현하는 강 등(Kang et al., Biotechnol. Bioengineer., 76,175-185 (2001))에 의해서 제조된 재조합 균주를 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 메탄올 자화 효모는 바람직하게는 발효조에서 배양된다. 본 발명에서 "발효조"란 하나 이상의 용기 및/또는 타워 또는 배관 설비로 이루어지고 pH, 용존산소농도, 교반 속도, 온도 및 주입되는 공기량을 측정하고 조절할 수 있는 장치가 갖추어진 발효장치를 포함하고, 구체적으로 연속 교반 탱크반응기(continuous stirred tank reactor, CSTR), 고정화 세포반응기(immobilized cell reactor), 버블 칼럼 반응기(bubble column reactor), 가스 리프트 발효조(gas lift fermentor) 등일 수 있으며 본 발명에서는 바람직하게는 CSTR이다.

재조합 메탄올 자화효모의 발효조 배양은, 예를 들면 YPG(2 %(w/v) 효모추출물, 2 %(w/v) 박토 펩톤, 2 % 글리세롤) 배지에서 종배양한 균주를 발효조의 배지에 약 5 %의 초기 농도로 접종하고 25 내지 40 ℃의 온도에서, 300 내지 1000 rpm의 교반속도로 배양할 수 있다. pH는 2N 염산 및 30 % 암모니아수로 pH 5.0 내지 6을 유지하는 것이 바람직하다. 발효조의 배지는 YP(4 %(w/v) 효모추출물, 2 %(w/v) 박토 펩톤) 또는 105 mg/L의 이노시톨, 24 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 4.5 g/L의 KH₂PO₄, 2 g/L의 MgSO₄·7H₂O, 2 mg/L의 티아민, 1.2 g/L의 아데닌을 포함하는 기본배지에 미량금속과 비타민을 포함하는 선택배지를 이용할 수 있다. 미량금속은 2 g/L의 FeCl₃·6H₂O, 1.4 g/L의 ZnCl₂, 2 g/L의 CaCl₂, 2 g/L의 Na₂MoO₄·2H₂O, 1.9 g/L의 CuSO₄·5H₂O, 0.5 g/L의 H₃BO₃, 2 g/L의 MnSO₄, 그리고 HCl 10 ㎖/L의 농도로 각 성분을 포함하며, 비타민은 5.4 g/L의 판토텐산(pantothenic acid), 1.4 g/L의 피리독신, 6.1 g/L의 니아신, 0.06 g/L의 비오틴, 그리고 0.04 g/L의 엽산을 포함하고, 선택배지의 성분과 조성은 배양조건에 따라서 조절 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위가 이에 한정되지는 않는다.

실시예 1 탄소원 공급 제어 알고리즘 구성

재조합 숙주 세포로는 한세눌라 폴리모르파를 이용하였으며, 탄소원 대사에 관련된 매개변수로는 DO를 선택하였다.

탄소원을 공급하는 연동 펌프의 작동은 제 3모듈에 의하여 실행되는데, 공급량은 제 1모듈에서 계산된 양으로 공급하되 제 2모듈에서 일회 공급량을 제한하여 공급하도록 하였다.

유가배양에서 발생하는 용존산소농도가 초기에 설정된 용존산소농도 이하이면 탄소원 공급을 중단하고, 용존산소농도가 초기에 설정된 용존산소농도를 초과하고 이때의 Fc가 F_L 이하인 경우에는 탄소원을 계산된 값에 따라서 공급하며, 용존산소농도가 초기 용존산소농도를 초과하고 계산된 Fc가 F_L 이상이면 F_L 값으로 탄소원 공급량을 제어하였다.

제 1모듈의 연산은 제 3모듈의 용존산소농도에 따른 실행과 관계없이 계속적으로 수행하고 탄소원 공급량이 점점 증가하여 일회분의 탄소원 공급량이 과도하게 공급될 우려가 있는 경우에는 제 2모듈에 설정된 공급량의 상한값 제어에 의하여 일회 공급량을 줄이면서 공급 빈도를 증가시켜서 일시적인 높은 농도 공급으로 인한 세포의 대사적 충격을 완화시키도록 구성되었다. 또한 제 1모듈의 탄소원 공급량은 수학식 1에 의하여 초기 탄소원 공급량을 구한 후 수학식 2에 의하여 설정하였으며, 상기 식에서 μ, X₀, V₀, t, Y_{X /S} 및 S₀는 회분 배양하여 얻었다.

k 값은 1 내지 1.0001 범위에서 설정하였는데, 이는 실제 회분 및 유가배양으로부터 얻은 세포 비성장속도 결과를 상호 비교하여 세포 비성장속도가 최대 0.2 h^-1을 넘지 않도록 설정한 값이다. 용존산소 상한농도(DO_i)는 세포 배양전 배양액의 산소 포화농도를 100 %로 하여 70 %로 설정하였다.

실시예 2 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"에 의한 재조합 한세눌라 폴리모르파의 유가배양

재조합 한세눌라 폴리모르파 균주는 MOX 프로모터에 의하여 재조합 알부민을 발현하는 강 등(Kang et at., Biotechnol. Bioeng., 76, 175-185 (2001))에 의해서 제조된 재조합 균주(염색체내에 알부민 유전자 도입수(카피수): 1)를 사용하였다.

발효를 위한 YPG 배지조성은 4 %(w/v) 효모 추출물, 2 %(w/v)의 박토 펩톤, 그리고 2%(w/v) 글리세롤을 사용하였다. 메탄올을 탄소원으로 공급하는 경우에는 별도의 멸균없이 HPLC급의 시약을 사용하였다. 발효조를 이용한 전산제어 배양은 5 L 발효기(Ko-biotech, Korea)와 실시예 1에서 설정된 프로그램을 탑재한 컴퓨터를 이용하여 수행하였다.

재조합 알부민 생산을 위한 한세눌라 폴리모르파의 배양은 다음과 같이 실시되었다: YPG 배지에서 지수성장기(exponential phase)에 동결보관된 글리세롤 동결보존액 0.3 ml를 50 ml의 YPG가 들어있는 500 ml 삼각 플라스크에 접종하여 37 ℃에서 18 내지 20시간 동안 종균 배양하였다.

유가배양을 위한 메탄올의 공급은 유량이 보정된 연동펌프(Watson marlow 101U, USA)를 통하여 회분 배양하여 얻은 세포농도를 기준으로 초기유량 15.5 ml/h 으로 공급하였다. 배양액의 pH는 2 N의 염산 수용액과 30 %의 암모니아 수용액으로 pH 6.0을 유지하였고 배양온도는 37 ℃로 하였다. 산소는 일반 공기로 공급되었으며 필요에 따라 순산소를 임의로 혼합하여 사용하였고 도입량은 1 내지 1.5 vvm 내에서 조절하였다. 발효에 따라서 생성되는 거품은 네오닌 소포제를 첨가하여 제거하였다.

분비 발현된 알부민은 8 %의 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacryl- amide gel electrophoresis)를 실시한 후, 웨스턴 블롯팅 및 실버 염색으로 분석하였다. 발현된 알부민의 양은 인간 혈청 알부민(Sigma, USA)을 표준으로 덴시토미터(Image analysis system, Bio-Rad, Model GS-700)로 정량하였다.

세포 성장은 UV 흡광광도기(Kontron, USA)를 이용하여 흡광도 600 nm에서 탁도를 측정하여 결정하였고, 건조세포 중량 (DCW)은 예비실험에 의하여 얻은 검량선의 방정식 [건조세포 중량(g/L) = OD₆₀₀에서의 탁도 x 0.32]으로 결정하였다. 용존산소농도는 5 L 발효조용 용존산소농도 검침기(Ingold, USA)를 이용하여 측정하였다.

메탄올의 농도는 가스크로마토그라피(HP5890, USA)를 이용하여 분석하였다. 컬럼은 포라팩(Porapack Q 80/100, 6' x 1/8" x 0.085" S.S., Alltech, USA)을 사용하였고 검출기로서 불꽃이온화 검출기를 사용하였다. 온도 프로그램은 주입구 120 ℃, 검출기 200 ℃, 오븐 150 ℃에서 1 분간 유지하고 10 ℃/분으로 램프하여 최종 200 ℃에서 2 분간 유지하도록 프로그램화하여 분석하였다. 캐리어 가스는 질소를 50 ml/분으로 공급하였고 내부 표준시료는 2-프로판올을 사용하였다.

실시예 1의 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"을 이용하여 재조합 한세눌라 폴리모르파를 유가배양한 결과를 도 5에 나타내었다. 동시에 지수적 공급방법(A)과 간헐적 공급방법(B)을 대조구로 실시하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 지수적 공급방법은 세포 비성장속도가 0.1 h^-1 이하로 유지되도록 메탄올을 공급하였으며, 간헐적 공급방법은 회분배양에서 재조합 알부민 발현율이 가장 높게 나타난(도 7) 8 g/L의 농도로 메탄올을 공급하였다. 최적 메탄올 농도는 YP(1 %(w/v) 효모 추출물, 2 %(w/v) 박토 펩톤)배지에 메탄올을 첨가하여 배지 내에서 최종농도가 각각 4 g/L부터 16 g/L로 변화시키면서 37 ℃에서 72 시간 배양한 다음 SDS-PAGE로 재조합 알부민의 농도를 비교하여 결정하였다.

실험결과, 실시예 1의 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"이 대조구인 지수적 또는 간헐적 공급방법보다 재조합 알부민 발현량이 1.5 내지 2배 이상 높게 나타났다.

도 6B에서 보이는 바와 같이 간헐적 방법의 경우, 세포의 성장속도는 배양 초기에 공급되는 탄소원 농도가 지수적 방법(도 6A)보다 상대적으로 높기 때문에 빠르지만, 배양 중반이후 부터는 지수적 방법의 탄소원 공급 농도가 상대적으로 높기 때문에 세포농도가 높게 나타났다. 배양 후기에는 두 경우 모두 세포농도가 감소하는데, 지수적 방법의 경우가 더 심각하게 감소하는 것을 볼 수 있다. 이는 탄소원의 공급량이 세포의 처리용량을 초과하여 세포가 과부하 상태(metabolic burden)에 있음을 보여주는 것으로 판단된다.

도 6의 재조합 알부민 발현량은 분자량 66 kDa인 온전한 알부민만을 분석한 결과인데, 지수적 방법(A)의 경우가 간헐적 방법(B)의 경우보다 발현량이 높은 것을 알 수 있다. 그리고 발현된 알부민의 전체적인 프로파일은 도 8에서 보이는 바와 같이 간헐적인 방법(도 8C)이 배양 중반 이후부터 알부민의 분해가 심각하게 일어났다.

도 6에서는 재조합 알부민의 최대 발현량은 지수적 방법의 경우가 높게 나타났으나 단백질의 분해 산물의 양을 모두 감안할 때에는 간헐적인 방법의 경우의 알부민 발현량이 상대적으로 높음을 알 수 있다.

따라서 배양 초기에는 지수적 방법의 형태로 탄소원을 공급하여 세포를 배양하고 배양 중반 이후부터는 간헐적인 방법의 형태로 탄소원을 공급하여 유가배양을 수행하는 것이 재조합 단백질의 분해를 최소화시키는 것으로 판단되며, 본 발명에 따른 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"이 이들의 장점을 모두 갖는 고유한 탄소원 공급방법임을 확인할 수 있다.

실시예 1에 따른 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"은 도 5에 나타난 바와 같이 배양시간에 따라 세포농도와 재조합 알부민의 발현이 지속적으로 증가하였으며, 발현된 알부민의 분해가 대조구들의 경우 배양 60 시간 이전에 심각하게 나타나는 데에 반하여 배양 60 시간까지 분해가 거의 일어나지 않았다.

실시예 3 "임계농도 연속 공급방법"에 의한 한세눌라 폴리모르파의 유가배양

임계농도 연속 공급방법을 위한 탄소원 공급 농도 튜닝은 다음과 같이 실시되었다: 실시예 1의 알고리즘에 의한 탄소원 공급은 용존산소농도에 따라 비연속적으로 공급되므로 펌프의 작동 시간과 유량으로부터 탄소원이 실제로 도입된 양을 계산할 수 있으며, 시간별(5시간 단위)로 공급 유량을 산출하였다. 이로부터 평균 유량을 얻고 매시간 계산하여 얻은 유량과 비교하여 계산상에서 발생하는 유량값의 편차를 상쇄시켰다. 얻어진 평균 유량을 임계농도 연속공급을 위한 탄소원 공급 량으로 정하였으며, 정해진 메탄올 연속공급유량을 도 9에 실선으로 나타내었다.

임계농도의 연속공급 형태는 임의의 시간 간격으로 탄소원을 계단식으로 상승시키는 방법(step feeding)과 기울기 형태로 상승시키는 방법(ramp feeding)이 있는데, 여기에서는 램프 피딩 형태로 공급되었다.

임계농도 연속공급방법에 의하여 한세눌라 폴리모르파를 유가배양하여 도 9와 도 10에 그 결과를 나타내었다. 본 발명이 제공하는 탄소원 공급방법은 임계농도로 메탄올을 연속적으로 공급하기 때문에 반복적인 탄소원 고갈에 의한 세포의 영양기아에 머무르는 시간을 최소화하여 그 결과, 도 10에서 보이는 바와 같이 발현된 재조합 알부민의 분해가 나타나지 않았으며 발현량이 배양시간에 따라서 지속적으로 증가하였다.

튜닝된 메탄올 임계공급량은 도 9에 나타낸 바와 같이 DO 최저값 (DO의 밑선)의 변화와 유사하게 진행하는 것을 볼 수 있는데, 이것은 메탄올 공급이 세포대사, 생육 및 재조합 단백질 생산에 알맞도록 효율적으로 이루어져서 메탄올 공급량에 대하여 세포의 산소소비 응답이 신속하게 나타나고 있음을 시사한다. 메탄올 공급 유량을 튜닝하기 전(알고리즘에 의한 탄소원 공급)과 튜닝한 후(임계농도 연속 공급)의 DO 레벨 변화로 비교하여 보면 튜닝 전(도 11의 A) DO값의 진폭이 튜닝 후(도 11의 B) 보다 높게 나타나는 것을 볼 수 있다. 본 발명의 임계농도 연속 공급방법은 DO의 진폭이 좁게 나타나 세포가 기아상태에 머무는 시간이 줄어들고, 이는 세포의 스트레스를 경감하여 재조합 단백질 분해를 방지할 수 있었던 것을 간접적으로 시사한다.

특히, 도 9의 배양시간에 따른 메탄올 소비농도에서 보이는 바와 같이 메탄올의 공급량이 배양시간에 따라서 지속적으로 증가하는 것이 아니라 배양시간 60시간 이전까지는 메탄올의 공급 농도가 완만하게 증가하다가 배양시간 60시간 부근에서 급격히 증가한 다음 메탄올 공급 농도가 서서히 감소하는 것을 알 수 있다. 즉, 배양시간에 따라 균체량이 증가하고 이와 동시에 재조합 단백질의 발현량이 증가하지만 실제 메탄올 대사는 감소하고 있으므로 이를 감안하지 않고 메탄올을 균체량에 비례하도록 공급하게 되면 공급과잉에 의한 대사적 부하가 야기될 수 있음을 보여준다.

본 발명이 제공하는 "알고리즘에 의한 탄소원 공급방법"과 "임계농도 연속공급방법"에 의한 탄소원 공급방법을 개별적으로 또는 병행하여 재조합 균주를 유가배양하면 세포의 탄소원 대사를 정교하게 조절할 수 있으며, 세포의 스트레스를 경감할 수 있으므로 재조합 단백질 발현량을 극대화할 수 있다.

Claims (9)

1. 재조합 단백질을 발현하기 위해 숙주 세포를 유가배양하는데 있어서,

   설정된 세포의 비성장속도에 따라서 지수적으로 탄소원을 공급하는 제 1모듈, 탄소원 공급량 상한값을 제어하는 제 2모듈 및 매개변수에 따른 탄소원 공급빈도를 제어하는 제 3모듈을 포함하여서 되는 전산 제어 장치와 연결된 탄소원 공급 펌프에 의해 탄소원이 공급되며, 상기 전산 제어 장치에서 지수적 탄소원 공급량은 세포의 탄소원 소비상태와 연관된 매개변수들에 의해 설정되는 것을 특징으로 하는 단백질을 발현하기 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법.
2. 공급되는 탄소원의 농도로부터 시간 별 평균 유량을 측정하여 임계농도를 산출하고, 산출된 임계농도로 탄소원을 연속적으로 공급하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항에 따른 단백질을 발현하기 위한 재조합 숙주 세포의 배양방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 매개변수가 탄소원 소비에 따라서 주기적으로 변화하는 지표들 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 매개변수가 용존산소농도, pH, 호흡지수 및 탄소원 농도로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포가 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포가 메탄올 자화 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 메탄올 자화 효모가 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카 (Pichia metahanolica), 칸디다 보이디니 (Candida boidinii) 또는 오가테아 미누타 (Ogataea minuta) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포가 탄소원 대사 관련 유전자 유래의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포가 메탄올 산화효소, 포름알데히드 탈수소효소, 포름산 탈수소효소, 카탈라제, 디히드록시아세톤 키나제, 디히드록시아세톤 탈수소효소, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소, 알코올 산화효소 1, 및 퍼옥시좀 막 단백질의 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 유래의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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