KR100671005B1 - Biomarker proteins for diagnosing the exposure to PAH - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환경 유해 물질인 PAH(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons)에 노출되었을 때 바이오마커로 사용 될 수 있는 단백질 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 정상인의 혈액에는 없으나 PAH벤젠에 노출된 사람의 혈액에는 존재하거나 정상인의 혈액에서 보다 PAH에 노출된 사람의 혈액에서 더 많이 발현되는 바이오 마커 단백질과 이를 이용한 PAH 노출 여부 진단키트에 관한 것이다.The present invention relates to the development of a protein that can be used as a biomarker when exposed to environmentally hazardous polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), more specifically in the blood of humans exposed to PAHbenzene, but not in normal blood The present invention relates to a biomarker protein that is expressed more in the blood of humans exposed to PAH than in normal human blood and a diagnostic kit for PAH exposure using the same.
본 발명에 따르면, 얻기 간편한 소량의 혈액으로부터 작업자의 PAH 노출 정도를 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 이렇게 측정된 오염 정도로 PAH 노출자의 생리적인 상태를 파악 할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 immunoassay 키트 (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 난분해성 오염물질 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에 이용될 수도 있다.According to the present invention, not only the level of PAH exposure of the operator can be measured from a small amount of blood, which is easy to obtain, but also the physiological state of the PAH exposed person can be grasped to the degree of contamination. In addition, monoclonal antibodies prepared on the basis of the biomarker protein of the present invention can be used in immunoassay kits (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor), and also exhibit higher specificity and sensitivity. It can also be used for the development of protein chips having various hardly degradable contaminant detection spectra through the development of antibodies.
Description
도 1은 정상인에서 발현되는 혈장 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,1 is a 2-D electrophoresis image showing plasma proteins expressed in normal persons,
도 2는 PAH 노출자에서 새롭게 발현되는 혈장 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이고,2 is a 2-D electrophoresis image showing plasma proteins newly expressed in PAH exposed,
도 3는 PAH 노출자에서 발현이 증가된 혈장 단백질을 나타내는 2-D 전기영동 이미지이다.3 is a 2-D electrophoresis image showing increased plasma protein expression in PAH exposed.
도 4는 PAH 노출자에서 발현이 증가된 스팟들의 볼륨강도(volume intensity)를 비교한 그래프이다.Figure 4 is a graph comparing the volume intensity (volume intensity) of the spots with increased expression in PAH exposed.
도 5는 스팟 4981의 MALDI-TOF 질량분석 결과를 ProFound 서치 프로그램을 이용하여 단백질 동정한 결과이다.5 is a result of protein identification using MALDI-TOF mass spectrometry of spot 4981 using the ProFound search program.
도 6a은 스팟 86의 ESI-Q-TOF 질량분석 결과를 MASCOT 서치 프로그램을 이용하여 단백질 동정한 결과이고, 도 6b 내지 6c는 서열번호 3 및 4 펩타이드의 MS/MS fragmentation 스펙트럼이다.Figure 6a is the result of protein identification using the MASCOT search program ESI-Q-TOF mass spectrometry of the
도 7a은 스팟 314의 ESI-Q-TOF 질량분석 결과를 MASCOT 서치 프로그램을 이용하여 단백질 동정한 결과이고, 도 7b 내지 7d는 서열번호 5 내지 7 펩타이드의 MS/MS fragmentation 스펙트럼이다.7A shows the results of protein identification using the MASCOT search program of ESI-Q-TOF mass spectrometry of
도 8a은 스팟 355의 ESI-Q-TOF 질량분석 결과를 MASCOT 서치 프로그램을 이용하여 단백질 동정한 결과이고, 도 8b 내지 8c는 서열번호 8 및 9 펩타이드의 MS/MS fragmentation 스펙트럼이다.FIG. 8A shows the results of protein identification of the ESI-Q-TOF mass spectrometry of
도 9a은 스팟 540의 ESI-Q-TOF 질량분석 결과를 MASCOT 서치 프로그램을 이용하여 단백질 동정한 결과이고, 도 9b 내지 9d는 서열번호 10 내지 12 펩타이드의 MS/MS fragmentation 스펙트럼이다.9A shows the results of protein identification using the MASCOT search program for ESI-Q-TOF mass spectrometry of
도 10은 스팟 611의 MALDI-TOF 질량분석 결과를 ProFound 서치 프로그램을 이용하여 단백질 동정한 결과이다.10 is a result of protein identification using MALDI-TOF mass spectrometry of Spot 611 using the ProFound search program.
도 11은 Fibrinogen 항체로 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다.FIG. 11 is a photograph and a graph showing the result of Western blotting with Fibrinogen antibody. FIG.
도 12는 TCR β 항체로 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행한 결과를 나타낸 사진과 그래프이다.12 is a photograph and a graph showing the result of Western blotting with TCR β antibody.
본 발명은 환경 유해 물질인 PAH에 노출되었을 때 바이오마커로 사용 될 수 있는 단백질 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 정상인의 혈액에는 없으나 PAH벤젠에 노출된 사람의 혈액에는 존재하거나 정상인의 혈액에서 보다 PAH에 노출된 사람의 혈액에서 더 많이 발현되는 바이오 마커 단백질과 이를 이용한 PAH 노출 여 부 진단키트에 관한 것이다.The present invention relates to the development of a protein that can be used as a biomarker when exposed to PAH, an environmentally harmful substance. More specifically, the present invention does not exist in the blood of normal people but exists in the blood of humans exposed to PAHbenzene or in the blood of normal people. The present invention relates to a biomarker protein that is expressed more in the blood of a person exposed to PAH and a diagnostic kit for PAH exposure using the same.
다환 방향족 탄화수소(Polycyclic Aromatic Hyddrocarbons, PHA)란 2개 이상의 벤젠 링을 가지는 방향족 탄화수소로, 벤젠고리가 2개 내지 4개인 물질은 기체나 고체에 흡착된 형태로, 5개 이상인 물질은 주로 고체에 흡착된 형태로 자연계에 존재한다. 극성이 없고 지방에 용해되는 성질을 가진 물질로서 피부, 폐 또는 소화관을 통하여 흡수될 수 있는 물질이다.(Willams,1985) 이는 천연유기물이나 합성유기물의 불완전 연소나 열분해에 의하여 생산되는데(Peterson, 1991) 일반적으로 PAH는 자동차 배기가스 정유공장 등에서 발생하고 코크스, 콜탈피치, 크레오소오트, 중유 등이 고온에서 취급될 때 방생한다. 구성성분의 종류는 200여 가지가 알려져 있는데 (백남원과 윤충식, 1993) 대표적인 PAH종류는 pyrene, benzo(a)pyrene, benzo(a)anthracene, chrysen등 17종이 있다.Polycyclic Aromatic Hyddrocarbons (PHAs) are aromatic hydrocarbons with two or more benzene rings, in which two or four benzene rings are adsorbed on gas or solid, and five or more substances are mainly adsorbed on solid. Exist in nature in the form of It is a non-polar, fat-soluble substance that can be absorbed through the skin, lungs, or digestive tract (Willams, 1985). It is produced by incomplete combustion or pyrolysis of natural or synthetic organics (Peterson, 1991). PAHs are generally generated in automobile exhaust gas refineries, and occur when coke, coaltal pitch, creosote and heavy oil are handled at high temperatures. There are about 200 kinds of ingredients (Nam Paik and Yoon Chong-sik, 1993). There are 17 types of PAH, including pyrene, benzo (a) pyrene, benzo (a) anthracene, and chrysen.
PHA는 직업적으로 코크스 제조, 일차 알미늄 생산, 목재처리, 도로포장, 지붕 도료처리 작업 등을 하는 자에서 많이 노출되고(Brandt & Molyneux, 1985) 기타 의약품이나 음식물을 통하여도 노출되는데, 일반인들에 있어서는 식사나 흡연이 PAH 흡입의 주원인이 되고 있다. PAH는 피부, 폐 또는 소화관을 통해서 흡수되어 모든 조직으로 분포되는데 특히 지방농도가 놓은 기관으로 집중되어 조직에 독성을 일으키고 신장, 간에 변성변화(degenerative change)가 관찰되며 특히 흉선(thymus)과 비장(spleen)에서는 PAH에 의한 영향이 예민하게 나타난다. 그리고 PAH가 포함되어 있는 탈(tar)을 피부에 도포하는 경우 유두종(papilloma)과 피부암을 국소적으로 일으킬 수 있으며(Nick et al., 1988) 폐와 신장 조직에는 DNA 체계 에 장해를 유발할 수도 있다.(Storer et al., 1984) 특히 코크스 생산 현장에서 PAH에 노출되는 경우 근로자들에게 폐암과 피부암을 일으킨다는 사실이 역학적인 연구결과로 알려져 있으며(Lioyd et al., 1970) 이에 관여하는 중요한 인자는 콜탈 흄(fume)인데 동물 실험 결과 이 속에 발암성이 있는 PAH를 많이 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. (International Agency for Research on Cancer(IARC), 1984). 또한 PAH가 발생되는 알루미늄 생산 공장에서도 폐암과 방광암을 일으킨다는 것이 보고된 바 있다.(Gibbs, 1985).PHA is highly exposed to those who specialize in the manufacture of coke, primary aluminum production, wood treatment, pavement and roofing (Brandt & Molyneux, 1985), as well as other medicines and foods. Eating and smoking are the main causes of PAH inhalation. PAH is absorbed through the skin, lungs, or digestive tract and is distributed to all tissues. In particular, PAHs are concentrated in organs with fat concentrations, causing toxicity to the tissues, and degenerative changes are observed in the kidneys and liver, especially in the thymus and spleen. spleen), the effect of PAH is sensitive. In addition, application of tar containing PAH to the skin can cause papilloma and skin cancer locally (Nick et al., 1988) and can cause damage to the DNA system in lung and kidney tissues. (Storer et al., 1984) Epidemiological studies have shown that lung and skin cancers occur in workers, especially when exposed to PAH at coke production sites (Lioyd et al., 1970). Coltal fume is known to contain a lot of carcinogenic PAH in animal experiments. (International Agency for Research on Cancer (IARC), 1984). It has also been reported that aluminum production plants that produce PAH cause lung cancer and bladder cancer (Gibbs, 1985).
PAH는 대부분 호흡기를 통하여 인체에 흡입되기 때문에 이로 인한 건강문제를 예방하기 위하여 호흡기조치가 가장 이상적인 것으로 생각되어 왔으므로 지금에 와서도 대부분의 나라에서 호흡기만을 보호하는 조치를 취하고 있는 실정이다. 그러나 많은 화학물질들이 독성작용을 일으킬 정도로 피부를 통하여 흡수될 수 있다는 증거가 늘어나고 있고 공기중 농도가 법적 허용기준치 이내임에도 불구하고 피부 흡수를 통하여 총 흡입량이 증가되어 문제가 일어날 수 있다고 알려져 있다.(Grandjean, 1990). 특히 산업장에서 PAH에 의한 근로자들의 피부오염은 오염된 표면과 접촉하므로써 일어날 수도 있다.(Kandus et al., 1972). 그리고 PAH환경의 평가는 PAH성분 전체의 측정보다는 pyrene의 상관성이 매우 높고(r=0.94)(Tjoe et al., 1993) pyrene이 하루 총 PAH흡수량 중에 가장 많은 양(23%)이 흡수되며(Vaessen et al., 1986) 다른 PAH 성분과도 가장 상관성이 높기 때문에 pyrene을 PAH 환경오염의 대표항목으로 하고 있다.Since PAH is mostly inhaled through the respiratory tract, respiratory measures have been considered the most ideal to prevent the health problems caused by this. Therefore, even now, most countries take measures to protect only the respiratory system. However, there is increasing evidence that many chemicals can be absorbed through the skin to the extent that it is toxic, and even though the concentration in the air is within legal limits, it is known that problems can arise due to increased total intake through skin absorption. Grandjean, 1990). Skin contamination of workers with PAH, especially in industrial settings, can also be caused by contact with contaminated surfaces (Kandus et al., 1972). The evaluation of PAH environment showed that pyrene correlation was much higher than that of all PAH components (r = 0.94) (Tjoe et al., 1993), and pyrene absorbed the largest amount (23%) of total PAH absorption per day (Vaessen et al., 1986) pyrene is the representative item of PAH environmental pollution because it has the highest correlation with other PAH components.
종래 PAH 노출의 진단에는 직력과 임상증상에 의해 이루어졌다. 임상검사는 혈액내 존재하는 PAH의 양, 혈구세포의 cormet 분석등과 같은 혈액검사, 염색체 이상 등이 이용되었다. 또한 소변으로 배설되는 pyrene의 주된 대사물질인 1-OHP 양을 측정하기도 하였다. 그러나, 현재로서는 벤젠 측정 방법이 제한되어있고 일부 실험실에서의 측정치는 신뢰롭지 못하다.Diagnosis of conventional PAH exposure was based on job history and clinical symptoms. Clinical tests included blood tests such as the amount of PAH in the blood, cormet analysis of blood cells, and chromosomal abnormalities. We also measured the amount of 1-OHP, the major metabolite of pyrene excreted in the urine. However, benzene measurement methods are currently limited and measurements in some laboratories are unreliable.
현재까지의 작업장 오염물질의 검사방법은 고가의 분석기기 (GC/MASS, NMR 등)를 사용하여 고비용의 장시간을 요하는 검사방법이 주로 사용되어왔다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 다수의 검체를 30분 이내의 단시간에 검출할 수 있는 항원항체 반응을 이용한 immunoassy 방법이 현재 개발되고 있다. 현재 시판되고 있는 immunoassy 법은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량 하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법이 응용되고 있다.Until now, the inspection method of workplace contaminants has been mainly used for expensive long time using expensive analyzer (GC / MASS, NMR, etc.). In order to overcome this drawback, an immunoassy method using an antigen-antibody reaction that can detect a large number of samples in a short time within 30 minutes is currently being developed. Currently commercially available immunoassy methods include enzyme immunoassay (ELISA, Coated tube), magnetic particle binding to antibody-bound magnetic particles in the tube, and then reacting antigen-tracer and non-degradable contaminants competitively to induce enzymatic reaction. Method and latex particle method using antibody-bound latex particles have been applied.
작업장의 오염검사와는 달리 다양한 난분해성물질로 오염된 작업자에 대한 오염량의 측정은 일반적으로 바이오마커에 의하여 측정되는데 인체의 조직이나 세포 또는 체액을 시료로 사용하여 생화학적, 유전적, 면역학적으로 검출할 수 있는 표지자를 선택한다. 일반적으로 난분해성 오염물질에 관한 바이오마커는 Cholinesterase inhibitor (혈액에서 제초제 등에 의한 활성억제도를 측정), cytochrome P-450 (aryl hydrocarbon hydroxylase 활성측정), Hepatic porphyrin pattern (hexachlorobenzene, PCBs, TCDD, TCDF에 의하여 발생한 porphyrin을 혈액 및 뇨에서 측정), aminolevulininc acid dihydratase (혈액에서 hemoglobin 합성에 관여), retinol (PCBs, TCDD에 의하여 retinol 감소), oxidative damage (독성물질에 의하여 free radical 생성), DNA damage (유전자 변형) 등이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 바이오마커들은 다른 질병 표지자와의 연관성이 높아 직접적인 유해물질 노출 위험도를 판정하기가 어려운 상태이다.Unlike the contamination test in the workplace, the measurement of the contamination level for workers contaminated with various hardly decomposable substances is generally measured by biomarkers. Biochemical, genetic, and immunological tests using tissues, cells, or body fluids in humans as samples Select a marker that can be detected. In general, biomarkers for hardly degradable contaminants include Cholinesterase inhibitor (measurement of activity inhibition by herbicides, etc.), cytochrome P-450 (measurement of aryl hydrocarbon hydroxylase activity), and hepatic porphyrin pattern (hexachlorobenzene, PCBs, TCDD, TCDF). Measured porphyrin in blood and urine), aminolevulininc acid dihydratase (involved in hemoglobin synthesis in the blood), retinol (retinol reduction by PCBs, TCDD), oxidative damage (free radical formation by toxic substances), DNA damage (genes) Strain) and the like. However, these biomarkers have high association with other disease markers, making it difficult to determine the risk of direct exposure to hazardous substances.
이와 같은 유해물질의 검출방법은 대부분 특이도와 민감도가 낮고, 단일 마커를 대상으로 하고 있기 때문에, 매우 다양한 환경 유해물질에 대한 종합적인 판단이 불가능한 상태이다. 따라서, 기존의 바이오마커보다 높은 신뢰도를 가지는 신규 바이오마커를 탐색하고 이를 높은 민감도로 검출해 낼 수 있는 단일클론항체와 같은 probe의 개발이 매우 절실한 상황이다.Since most of the detection methods of such harmful substances have low specificity and sensitivity and target a single marker, comprehensive determination of a wide variety of environmental harmful substances is impossible. Therefore, it is very urgent to develop a probe such as a monoclonal antibody that can detect a new biomarker having higher reliability than the existing biomarker and detect it with high sensitivity.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 2차원 전기영동기술을 이용하여 정상인의 혈액에서 보다 PAH에 노출된 사람의 혈액에서 더 많이 발현하는 신규의 바이오 마커 단백질들을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have diligently researched to overcome the problems of the prior arts. As a result, two-dimensional electrophoresis technique is used to produce new biomarker proteins that are expressed more in the blood of humans exposed to PAH than in normal human blood. After confirming, the present invention was completed.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 PAH 노출 여부를 효과적으로 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편을 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention is to provide a new biomarker protein or immunogenic fragment thereof that can effectively diagnose the presence or absence of PAH exposure.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 마커 단백질에 대한 항체 및 이를 이용한 진단키트를 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide an antibody and a diagnostic kit using the biomarker protein.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 정상인의 혈액에는 없으나 PAH에 노출된 사람의 혈액에 존재하는 것을 특징으로 하는 다음으로 구성된 군에서 선택된 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편을 제공한다:In order to achieve the object of the present invention, there is provided a biomarker protein or immunogenic fragment thereof selected from the group consisting of:
서열번호 1 및 2의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 포함하는 약 18 kDa의 분자량 및 약 5.9의 pI를 갖는 추정상 용량성 칼슘 엔트리 채널 (putative capacitative calcium entry channel).Putative capacitative calcium entry channel having a molecular weight of about 18 kDa and a pi of about 5.9 comprising the trypsin digested peptide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2.
또한, 본 발명은 정상인의 혈액에서 보다 PAH에 노출된 사람의 혈액에서 더 많이 발현되는 것을 특징으로 하는 다음으로 구성된 군에서 선택된 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편을 제공한다:The present invention also provides a biomarker protein or immunogenic fragment thereof selected from the group consisting of: expressed more in the blood of a person exposed to PAH than in the blood of a normal person:
서열번호 3 및 4의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 포함하는 약 55 kDa의 분자량 및 약 5.3의 pI를 갖는 피브리노겐 감마 A 체인 전구체 (Fibrinogen gamma_A chain precursor);Fibrinogen gamma_A chain precursor having a molecular weight of about 55 kDa and a pi of about 5.3 comprising a trypsin digested peptide sequence of SEQ ID NOs: 3 and 4;
서열번호 5, 6 및 7의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 포함하는 약 83 kDa의 분자량 및 약 5.4의 pI를 갖는 헤모펙신 전구체 (Hemopexin precursor);Hemopexin precursor having a molecular weight of about 83 kDa and a pi of about 5.4, including trypsin digested peptide sequences of SEQ ID NOs: 5, 6, and 7;
서열번호 8 및 9의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 포함하는 약 52 kDa의 분자량 및 약 5.5의 pI를 갖는 피브리노겐 감마 A 체인 전구체 (Fibrinogen gamma_A chain precursor);Fibrinogen gamma A chain precursor having a molecular weight of about 52 kDa and a pi of about 5.5 comprising a trypsin digested peptide sequence of SEQ ID NOs: 8 and 9;
서열번호 10, 11 및 12의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 포함하는 약 59 kDa의 분자량 및 약 5.7의 pI를 갖는 알부민 전구체 (Albumin precursor); 및Albumin precursors having a molecular weight of about 59 kDa and a pi of about 5.7, including trypsin digested peptide sequences of SEQ ID NOs: 10, 11, and 12; And
서열번호 13의 트립신 분해된 펩타이드 서열을 포함하는 약 22 kDa의 분자량 및 약 5.4의 pI를 갖는 T-세포 리셉터 베타 체인 C 영역 (T-cell receptor beta chain C region).T-cell receptor beta chain C region having a molecular weight of about 22 kDa and a pi of about 5.4 comprising a trypsin digested peptide sequence of SEQ ID NO: 13.
본 발명에서, 상기 트립신 분해된 펩타이드란 MALDI-TOF의 PMF(peptide mass fingerprinting) 또는 MS/MS 분석을 위해 트립신(trypsin)으로 분해된 단백질의 펩타이드를 의미한다. 또한, 상기 분자량과 pI는 2차원 전기영동(Two-dimensional electrophoresis)상에서 확인된 값으로서 일반적으로 허용되는 실험상의 오차범위를 포함한다. 또한, 본 발명에서 정상인의 혈액에서 없다는 것은 일반적인 2차원 전기영동으로 해상 불가능한 범위의 낮은 농도를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.In the present invention, the trypsin digested peptide means a peptide of protein digested with trypsin for peptide mass fingerprinting (PMF) or MS / MS analysis of MALDI-TOF. In addition, the molecular weight and pI are the values identified on two-dimensional electrophoresis and include generally accepted experimental error ranges. In addition, in the present invention, the absence of blood in a normal person should be interpreted as including a low concentration in a range that cannot be resolved by general two-dimensional electrophoresis.
본 발명에서, 면역원성(antigenic) 단편이란 외부숙주에서 반응성(reactive) 항체의 생산을 허용하는 해당 단백질의 일부를 의미한다.In the present invention, an immunogenic fragment refers to a portion of a protein of interest that allows production of reactive antibodies in an external host.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides an antibody that specifically binds to the biomarker protein of the present invention or an immunogenic fragment thereof.
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody capable of more specifically binding to an antigen. Polyclonal antibodies can be prepared by injecting a biomarker protein or fragment thereof as an immunogen into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits. Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection and are usually administered with an adjuvant to increase antigenicity. Serum is periodically collected from external hosts to collect serum that shows improved titers and specificity for antigen or to separate and purify antibodies therefrom.
모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495))에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 약 20 ㎍을 얻어서 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화 시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 이 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 엘라지져(ELISA)방법을 사용하여 모노클노날 항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한후 항체를 분리정제하거나 쥐의 복강에 주입한후 복수를 채취한다.Monoclonal antibodies can be prepared by techniques of generation of immortalized cell lines by fusions known to those skilled in the art (Koeher and Milstein (1975) Nature, 256: 495). The manufacturing method is briefly described as follows. First, about 20 µg of pure protein is immunized to mice or a peptide is synthesized and combined with bovine serum albumin to immunize mice. The antigen-producing B lymphocytes isolated from mice are then fused with myeloma in humans or mice to produce immortalized hybridomas, which are monoclonal with the hybridoma cells using an indirect ELISA method. Check whether the antibody is produced and select the positive clone and incubate the antibody. After separation or purification of the antibody or injection into the abdominal cavity of rats, the ascites are collected.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편을 항원으로 선택하는 단계, 상기 항원을 숙주에 주입하여 이에 대한 항체를 키우는 단계 및 상기 항체를 수거하는 단계를 포함하는, 인간의 PAH 노출 여부를 구별하는 항체의 제조방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention is to select a biomarker protein or immunogenic fragment thereof of the present invention as an antigen, injecting the antigen into the host to raise the antibody against it and collecting the antibody Provided is a method of producing an antibody that distinguishes human exposure to PAH, comprising the step.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간의 조직 또는 체액에서 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 인간의 PAH 노출 여부에 대한 진단 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a diagnostic method for human PAH exposure comprising the step of detecting the presence of the biomarker protein or immunogenic fragment thereof of the present invention in human tissue or body fluids to provide.
본 발명의 진단 방법에서, 상기 체액은 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 하며, 또한 상기 검출 단계는 인간의 조직 또는 체액으로부터 이차원(2-D) 전기영동으로 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 직접 검출하거나, 인간의 조직 또는 체액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오 마커 단 백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 항원항체반응으로서 현재 널리 알려진 immunoassay 법은 효소면역측정법 (ELISA, Coated tube), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량 하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법 등이 있다.In the diagnostic method of the present invention, the bodily fluid is blood or urine, and wherein the detecting step is performed by two-dimensional (2-D) electrophoresis from human tissue or bodily fluid to detect the presence of a biomarker protein or an immunogenic fragment thereof. Direct detection or contacting human tissues or body fluids with the antibodies of the invention to indirectly confirm the presence of the biomarker protein or immunogenic fragment thereof via an antigenic antibody reaction. Currently known immunoassay as an antigen antibody reaction, enzyme immunoassay (ELISA, Coated tube), antibody-bound magnetic particles are bound to a tube, and then antigen-tracer and refractory contaminants are reacted competitively to induce enzymatic reaction. Magnetic particle method, latex particle method using antibody bound latex particle.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간의 PAH 노출 여부에 대한 진단 키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a diagnostic kit for human exposure to PAH, comprising the antibody of the present invention.
본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes)등에 의해 표지화될 수 있다.Diagnostic kits of the present invention are prepared by conventional methods known to those skilled in the art, and typically include lyophilized antibodies, buffers, stabilizers, inactive proteins and the like. The antibody can be labeled by radionuclides, fluorescors, enzymes and the like.
본 발명의 단일클론항체의 응용성은 immunoassay 키트 (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 난분해성 오염물질 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에도 필수적인 기술일 것이다. 차세대 진단키트인 단백질 칩은 PAH오염에 관한 역학조사 분야, 식품 및 농축산물 검역, 공산품 검역, 작업환경 및 생활환경 등의 대규모 검사 분야에 폭넓게 이용될 수 있다.Applicability of the monoclonal antibody of the present invention can be used in a variety of immunoassay kits (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor), as well as through the development of antibodies showing higher specificity and sensitivity It is also an essential technology for the development of protein chips with a spectrum of difficult to detect contaminants. Protein chips, the next generation diagnostic kits, can be widely used in epidemiological investigations on PAH contamination, food and agricultural product quarantine, industrial product quarantine, work environment and living environment.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only intended to illustrate the invention, so the scope of the invention is not to be construed as limited by these examples.
실시예 1: 시료준비 (Sample preparation)Example 1: Sample preparation
건강한 정상 남자 (20~50대 33명) 들과 작업장 (자동차 검사소) 에서 다년간 PAH에 노출된 남성 작업자 (20~50대 48명) 들에게서 항 응고인자인 EDTA를 미리 첨가한 혈액 수거용 튜브에 혈액을 각각 5 ㎖씩 채혈한다. Ficoll을 총 혈액 부피의 1/10을 첨가한 후 4℃, 2,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈액으로부터 혈장을 분리한다. 인산완충용액 (Phosphate-Bufferd Saline)으로 혈장을 1/10로 희석하고, 이 희석된 혈장 400 ㎕에 동량의 시료 완충액을 첨가하여 잘 섞은 후, 분자량 3 kDa 이하를 제거하는 컬럼 [Molecular cut-off column (Amicon, Millipore Corp., USA)]을 사용하여 혈장에 존재하는 염과 지질을 제거한다. 시료 완충액의 조성은 다음과 같다: 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT, 0.5 % Phamalyte, 1 mM EDTA, protease inhibitor cocktail. 혈장과 시료 완충액 800 ㎕가 들어있는 column을 원심분리기 (Union-55R centrifuge, 한일과학, Korea)에 넣고 12℃, 3,500 rpm에서 약 50분가량 돌리면 column 하층부로 분자량 3 kDa 이하의 단백질과 염 및 지질들이 빠지고 상층부에 염과 지질이 제거된 혈장만이 남게 된다. 하층부의 용액을 제거하고 상층부에 다시 시료 완충액 400 ㎕을 넣고 잘 섞은 후 위와 같이 실시한다. 이와 같은 방법을 4회 반복하여 시료의 urea 농도가 8 M에 이르게 한다. 처리가 끝난 시료는 단백질 정량을 하여 -80℃ 냉동고에 보관한다.Blood in a blood collection tube pre-added with anticoagulant EDTA from healthy normal men (33 in their 20s to 50s) and male workers (48 in their 20s to 50s) who had been exposed to PAH for many years in the workplace (automobile inspection). Collect 5 ml of each. Ficoll is separated from blood by centrifugation at 4 ° C., 2,000 rpm for 15 minutes after adding 1/10 of the total blood volume. Dilute the plasma by 1/10 with Phosphate-Buffered Saline, add the same amount of sample buffer to 400 μl of the diluted plasma, mix well, and remove the molecular weight below 3 kDa. [Molecular cut-off column (Amicon, Millipore Corp., USA)] to remove salts and lipids present in plasma. The composition of the sample buffer is as follows: 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT, 0.5% Phamalyte, 1 mM EDTA, protease inhibitor cocktail. Put a column containing 800 µl of plasma and sample buffer into a centrifuge (Union-55R centrifuge, Hanil Science, Korea) and turn it for about 50 minutes at 12 ° C and 3,500 rpm. Only the plasma is removed and salt and lipids are removed from the upper layer. Remove the lower layer solution, add 400 μl of sample buffer to the upper layer and mix well. Repeat this method four times until the urea concentration in the sample reaches 8 M. Treated samples are quantified and stored in a -80 ° C freezer.
실시예 2: 이차원 전기영동 (Two-Dimensional Electrophoresis)Example 2: Two-Dimensional Electrophoresis
가. 일차원 전기영동(Isoelectroforcusing, IEF): end. Isoelectroforcusing (IEF):
시료 완충액으로 처리된 혈장 단백질 40 ㎍을 일차원 전기영동을 실시한다. 혈장 시료 약 6~8 ㎕ (단백질 40 ㎍)에 총 부피가 450 ㎕가 되게 rehydration 완충액 (8 M urea, 2% CHAPS, 13 mM DTT, 1 % Phamalyte)을 섞어 일차원 전기영동을 할 수 있는 24 ㎝ strip holder에 넣은 뒤 pH 4-7 범위의 Drystrip (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 strip holder에 장착한다. 20℃에서 10시간 가량 strip을 rehydration 완충액으로 불려준 뒤 다음과 같은 조건으로 일차원 전기영동을 수행한다: 200 V 30 분, 500 V ~ 8,000 V 45 분, 8,000 V 18 시간 : 총 146 kVh. 일차원 전기영동은 IPGphore (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 수행했다.One-dimensional electrophoresis is performed on 40 µg of plasma protein treated with sample buffer. 24 cm for one-dimensional electrophoresis by mixing rehydration buffer (8 M urea, 2% CHAPS, 13 mM DTT, 1% Phamalyte) with approximately 6-8 μl of plasma sample (40 μg of protein) to a total volume of 450 μl. Place it in the strip holder and mount a Drystrip (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) in the pH 4-7 range to the strip holder. The strip was soaked in rehydration buffer for 10 hours at 20 ° C and subjected to one-dimensional electrophoresis under the following conditions: 200
나. 이차원 전기영동 (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE):I. Two-Dimensional Electrophoresis (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE):
일차원 전기영동이 끝난 strip을 이차원 전기영동을 하기 위해 일차원 전기영동이 끝난 strip을 cap tube에 넣고 일차 평형화 용액 [6 M urea, 50 mM Tris·cl (pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT] 10 ㎖에 10분간 반응시킨 후 버리고, 다시 이차 평형화 용액 [6 M urea, 50 mM Tris·cl (pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA] 10 ㎖을 넣고 10분간 재 반응한다. 11~16%로 만들어진 Polyacylamide 젤(25ㅧ30 ㎝) 위에 반응이 끝난 strip을 장착하고 0.5% 아가로우즈로 sealing한다. 이차원 전기영동은 Ettan Dalt (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 전기영동 완충액 (24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고 전기영동을 실시한다. 전기영동 조건은 다음과 같다: 70 V 1시간, 170 V 2 시간, 430 V 5시간.In order to perform two-dimensional electrophoresis of strips with one-dimensional electrophoresis, place the strips with one-dimensional electrophoresis in a cap tube, and the first equilibration solution [6 M urea, 50 mM Tris · cl (pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT] in 10 ml of the solution for 10 minutes and then discard. Then, add 10 ml of the second equilibration solution [6 M urea, 50 mM Tris-cl (pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS, 1.5% IAA]. React for a minute. The reaction strip is mounted on 11 ~ 16% polyacylamide gel (25 로 30 ㎝) and sealed with 0.5% agarose. Two-dimensional electrophoresis is performed by adding electrophoresis buffer (24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS) to Ettan Dalt (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). The electrophoretic conditions are as follows: 70
다. 염색(Staining): All. Staining:
이차원 전기영동이 끝난 뒤 젤을 가시화 시키기 위해 silver 염색을 한다. silver 염색과정은 다음과 같다. 50% methanol, 12% acetic acid로 이루어진 용액에 3시간 가량 반응시켜 고정화(Fixation)하고, 50% ethanol로 20분간 3회 세척(Washing)하고, 0.2% Sodium thiosulfate 용액으로 1분간 반응시켜 민감화(Sensitizing)하고, D.W.로 세척(Washing)하고, 0.1% Silver nitrate, 0.075% formaldehyde (37%) 용액으로 20분간 반응화(Improving)하고, D.W.로 다시 세척(Washing)하고, 미리 차게 만든 6% Sodium carbonate, 0.075% formaldehyde (37%) 용액으로 7분간 반응시켜 가시화(Developing)한다. 반응의 정지는 50% methanol, 12% acetic acid 용액으로 한다.After two-dimensional electrophoresis, silver stain is used to visualize the gel. The silver dyeing process is as follows. Fix by reacting with a solution of 50% methanol and 12% acetic acid for about 3 hours, rinsing three times with 50% ethanol for 20 minutes, and sensitizing by reacting with 0.2% sodium thiosulfate solution for 1 minute. , Wash with DW, react with 20% with 0.1% Silver nitrate, 0.075% formaldehyde (37%) solution, wash with DW, pre-cold 6% Sodium carbonate , Visualize by reacting with 0.075% formaldehyde (37%) solution for 7 minutes. Stop the reaction with 50% methanol, 12% acetic acid solution.
라. 이미지 분석 (Image Analysis): la. Image Analysis:
실험한 젤들을 분석하기 위해 먼저 ImageScanner (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 스캔(Scanning)한다. 단백질 발현이 차이나는 점들을 분석하기 위해 이차원 전기영동 분석 전용 프로그램인 ImageMaster (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 분석을 수행했다.In order to analyze the gels tested, they are first scanned with ImageScanner (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). To analyze differences in protein expression, the analysis was performed with ImageMaster (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), a program dedicated to two-dimensional electrophoresis analysis.
실시예 3: 질량분석 (Mass Analysis)Example 3: Mass Analysis
가. MALDI-TOF/MS:end. MALDI-TOF / MS:
이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려낸다. 먼저 silver를 없애기 위해 30 mM Potassium Ferricyanide와 100 mM Sodium Thiosulfate 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 ㎕을 젤 조각에 10분간 처리한다. 이후에 400 ㎕의 물로 3번 세척한다. 다시 200 mM ammonium bicarbonate로 반응한 뒤 물로 세척한다. Acetonitrile을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시킨다. 이 젤을 진공 원심분리기 (Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앤다. 단백질을 펩타이드 (peptide)로 자르기 위해 10 ng/㎕ 의 trypsin을 37℃에서 16시간 반응한다. 젤로부터 펩타이드를 얻기 위해 50% acetonitrile과 5% trifluoroacetic acid (TFA) 용액을 20 ㎕ 처리하여 반응시킨다. 효과적인 회수를 위해 이 과정을 3회 반복하여 펩타이드 추출용액을 모은다. 얻어진 용액은 다시 진공 원심분리기에 넣어 완전히 말린 후, 0.1% TFA 2 ㎕로 추출된 펩타이드로 녹여 놓는다. 질량분석기 (Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)에 시료를 넣기 위해 아래와 같은 과정을 실시한다. Matrix로 사용되는 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)를 nitrocellulose, isopropyl alcohol과 각각 2:1:1로 섞는다. 0.1% TFA에 녹여 놓은 시료 (2 ㎕)와 위 혼합액을 1:1로 섞어 분석용 판에 올린다. 용액이 완전히 마른 뒤 염을 제거한기 위해 5% formic acid 5 ㎕를 분석용판 (plate)에 떨어뜨린 뒤 5초 후에 제거한다. 다시 물로 formic acid를 제거하기 위해 5 ㎕를 분석용판에 떨어뜨린다. 물이 마른 후에 질량분석기에 판을 넣어 분석을 실시한다. Voyager DE-STR Mass spectrometer (Framingham, MA, USA)를 사용했다. Internal mass calibration은 trypsin autodigestion 생성물 (842.5099 Da 과 2211.1046 Da)로 수행하였다. 얻어진 펩타이드의 질량 결과를 search program MS-Fit(http://prospector.ucsf.edu/msfit) 및 ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)을 사용하여 NCBInr 데이터베이스에서 펩타이드의 동정을 수행하였다.In order to identify the spots found in the image analysis program, spots are cut out from the gel after two-dimensional electrophoresis. First, 100 μl of a destaining solution mixed with 30 mM Potassium Ferricyanide and 100 mM Sodium Thiosulfate solution in a 1: 1 ratio is applied to the gel pieces for 10 minutes. Then wash three times with 400 μl of water. Reaction with 200 mM ammonium bicarbonate again and washing with water. Add Acetonitrile to dehydrate the gel until it turns white. The gel is placed in a speed vacuum centrifuge to completely remove the solution from the gel. To cut proteins into peptides, 10 ng / μl of trypsin is reacted at 37 ° C. for 16 hours. To obtain the peptide from the gel, react with 20 µl of 50% acetonitrile and 5% trifluoroacetic acid (TFA) solution. Repeat this procedure three times to collect the peptide extract for effective recovery. The obtained solution is again put in a vacuum centrifuge and completely dried, and then dissolved with peptide extracted with 2 μl of 0.1% TFA. To insert the sample into the Mass-Assisted Laser Desorption / ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS): Α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) used as matrix is mixed with nitrocellulose and isopropyl alcohol in a 2: 1: 1 ratio. Mix the sample (2 μl) dissolved in 0.1% TFA with the above mixture in a 1: 1 mixture and place it on the assay plate. After the solution is completely dry, 5 µl of 5% formic acid is added to the assay plate to remove salts, and then removed after 5 seconds. 5 μl is added to the assay plate to remove formic acid with water again. After the water has dried, place the plate in the mass spectrometer for analysis. Voyager DE-STR Mass spectrometer (Framingham, MA, USA) was used. Internal mass calibration was performed with trypsin autodigestion products (842.5099 Da and 2211.1046 Da). Mass results of the obtained peptides were obtained from the NCBInr database using search programs MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu/msfit) and ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). Identification was carried out.
나.ESI-Q-TOF/MS/MS:B.ESI-Q-TOF / MS / MS:
이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 이차원 전기영동이 끝난 젤로부터 점(spot)들을 오려낸다. 먼저 silver를 없애기 위해 30 mM Potassium Ferricyanide와 100 mM Sodium Thiosulfate 용액이 1:1로 섞인 탈염색 용액 100 ㎕을 젤 조각에 5분간 처리한다. 이후에 400 ㎕의 물로 3번 세척한다. 다시 200 mM ammonium bicarbonate로 반응한 뒤 물로 세척한다. Acetonitrile을 넣어 젤이 하얗게 변할 때까지 탈수시킨다. 이 젤을 진공 원심분리기 (Speed vacuum centrifuge)에 넣어서 젤로부터 용액을 완전히 없앤다. 건조된 젤 조각은 0.2 ㎍의 trypsin(promega)이 들어있는 50 mM의 ammonium bicarbonate 20 ㎕로 얼음(ice)상에서 45분간 함수시킨다. 반응용액을 제거 후 50 mM의 ammonium bicarbonate 30 ㎕를 넣은 후 37℃로 밤새 반응시킨다. 그 펩타이드 용액은 C18 nano column(home made)를 이용하여 염분을 제거한다. Custom-made chromatographic columns은 질량분석 이전에 펩타이드 염분제거와 농축용으로 사용된다. Poros reverse R2 material(20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems)의 100-300 nL로 구성된 column은 단단히 조여진 GELoader tip(Eppendorp, hamburg, Germany)에 팩킹되어 있다. 10 mL syringe는 공기압으로 column을 통해 물질을 통과 시킨다. 펩타이드 용액 30 ㎕는 5% formic acid 용액 내에서 희석되어 column안으로 이동된다. 그리고 30 ㎕는 5% formic acid 용액으로 세척된다. MS/MS분석을 위해 펩타이드는 borosilicate nanoelectrospray needle(Micromass, Manchester, UK)에 50% methnol/49% H20/1% formic acid와 섞여 용출된다. MS/MS는 Q-TOF2 mass spectrometer(Micromass, Mancheser, UK)상에서 nano-ESI로 수행되어진다. 그 소스(source)온도는 80℃이다. 1 kV의 전압는 안정된 flow rate(10-30 nL/min)를 생성하기위해 0-5 psi의 nitrogen back-pressure와 혼합되어진 이온 소스(ion source)에서 borosilicate nanoelectrospray needles(EconoTipTM, New Objective, USA)에 적용되어진다. 그 원뿔(cone) 전류는 40 V이다. Quardrupole analyser는 hexapole collision cell에서 분절화를 하기위해 전구 이온(precursor ion)을 선택하는데 사용된다. 충돌가스(collision gas)는 6-7 x 10-5 mbar의 아르곤(Ar)이며 출동 에너지(collision energy)는 20-30 V이다. 생성 이온은 반사기(reflector)와 작은 통로판 검사기(micro channel plate detector) 그리고 time-to-digital 변환기에 맞추어지는 TOF 분석기를 이용하여 분석된다. 그 자료는 Mass Lynx Widows NT PC system을 이용하여 진행된다. 단백질을 동정하기 위해 모든 MS/MS 스펙트럼은 MASCOT search program(www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBInr 데이터베이스에서 단백질 서열을 조사하였다.In order to identify the spots found in the image analysis program, spots are cut out from the gel after two-dimensional electrophoresis. First, 100 μl of a destaining solution containing a 1: 1 mixture of 30 mM Potassium Ferricyanide and 100 mM Sodium Thiosulfate solution is applied to the gel slices for 5 minutes. Then wash three times with 400 μl of water. Reaction with 200 mM ammonium bicarbonate again and washing with water. Add Acetonitrile to dehydrate the gel until it turns white. The gel is placed in a speed vacuum centrifuge to completely remove the solution from the gel. The dried gel pieces were incubated for 45 minutes on ice with 20 μl of 50 mM ammonium bicarbonate containing 0.2 μg of trypsin (promega). After removing the reaction solution, 30 μl of 50 mM ammonium bicarbonate was added and reacted at 37 ° C. overnight. The peptide solution is desalted using a C18 nano column (home made). Custom-made chromatographic columns are used for peptide desalination and concentration prior to mass spectrometry. A column consisting of 100-300 nL of Poros reverse R2 material (20-30 um bead size, PerSeptive Biosystems) is packed in a tightly tightened GELoader tip (Eppendorp, hamburg, Germany). A 10 mL syringe passes the material through the column under air pressure. 30 μl of the peptide solution is diluted in 5% formic acid solution and transferred into the column. And 30 μl is washed with 5% formic acid solution. For MS / MS analysis, peptides are eluted with 50% methnol / 49
실시예 4: 웨스턴 브로팅 (Western blotting)Example 4: Western blotting
가. SDS-PAGE 전기영동:end. SDS-PAGE Electrophoresis:
시료 완충액으로 희석된 혈장 단백질 40 ㎍을 12.5% SDS-PAGE 전기영동을 실시한다. 혈장 시료 5 ∼ 8 ㎕(단백질 40 ㎍)에 SDS-PAGE loading 완충액 (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) 5 ㎕를 섞어 mini gel (6 x 8 ㎝)에서 분자량별(Stacking gel상에서는 90 V로 내리고 separating gel상에서는 120 V로 내린다.)로 분리한다. 이때 사용한 running 완충액의 조성은 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS (pH 8.3)이다.40 μg of plasma protein diluted with sample buffer is subjected to 12.5% SDS-PAGE electrophoresis. Add 5 μl of SDS-PAGE loading buffer (60 mM Tris-Cl, 2% SDS, 25% Glycerol, 14.4 mM 2-Mercaptoethnol, 0.1% Bromophenol Blue, pH 6.8) to 5-8 μl of plasma sample (40 μg of protein). Separate by mini gel (6 x 8 cm) by molecular weight (down to 90 V on a stacking gel and down to 120 V on a separating gel). The composition of the running buffer used was 0.025 M Tris-Cl, 0.192 M Glycine, 1% SDS (pH 8.3).
나. Blotting: I. Blotting:
SDS-PAGE가 끝난 뒤 gel의 단백질을 Semi-dry 형태의 transfer kit (Bio-rad)을 이용하여 NitroCellulose 막으로 transfer시킨다. 100mA에서 30분, 150 mA에서 30분동안 실시한다.After the SDS-PAGE, the gel protein is transferred to the NitroCellulose membrane using a semi-dry transfer kit (Bio-rad). 30 min at 100 mA and 30 min at 150 mA.
다. 항체반응: All. Antibody reactions:
Fibrinogen과 T cell receptor beta(TCR beta)을 대상으로 하여 실시하였다. membrane을 5% w/v nonfat dry milk로 Fibrinogen는 4℃에서 16시간 동안 blocking시켰고 TCR-β는 실온에서 1시간 동안 blocking시켰다. 일차 항체로는, Fibrinogen antibody (F4200-05, Unitied States biological)와 TCR-β antibody (sc-5277, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다. Fibrinogen는 polyclonal antibody이며 TCR-β는 monoclonal antibody이다. Fibrinogen는 실온에서 1시간 반응시켰고 TCR-β는 4℃에서 overnight로 반응시켰다. 각각의 일차항체의 희석농도는 Fibrinogen는 1/1000, TCR-β는 1/800으로 하였다. TBS/T(0.1%)(Tris-buffered saline-tween 20)로 washing한 후에 이차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 이차항체는 Fibrinogen는 goat anti-rabbit IgG, TCR-β는 goat anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였고 희석농도는 전자는 1/5000, 후자는 1/2500이였다. 이차항체 반응 후에 TBS/T로 washing하고 난 뒤, ECL (Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)로 가시화 시켰다.Fibrinogen and T cell receptor beta (TCR beta) were performed. Membrane was blocked with 5% w / v nonfat dry milk for 15 hours at 4 ° C for fibrinogen and 1 hour at room temperature for TCR-β. As primary antibodies, Fibrinogen antibody (F4200-05, Unitied States biological) and TCR-β antibody (sc-5277, Santa Cruz Biotechnology) were used. Fibrinogen is a polyclonal antibody and TCR-β is a monoclonal antibody. Fibrinogen was reacted at room temperature for 1 hour and TCR-β was reacted overnight at 4 ° C. The dilution concentration of each primary antibody was 1/1000 for Fibrinogen and 1/800 for TCR-β. After washing with TBS / T (0.1%) (Tris-buffered saline-tween 20), the mixture was reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour. Fibrinogen was used as anti-rabbit IgG for TBR-β and goat anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology) for TCR-β. The dilution was 1/5000 for the former and 1/2500 for the latter. After the secondary antibody reaction was washed with TBS / T, and then visualized by ECL (Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden).
상기와 같이 이차원 전기영동실험을 수행한 결과, 다음과 같이 PAH에 노출된 사람에서 새롭게 발현되거나 발현양이 증가하는 단백질들이 동정되었다.As a result of performing the two-dimensional electrophoresis experiment as described above, proteins newly expressed or increased in expression in humans exposed to PAH were identified as follows.
1. 새롭게 발현되는 단백질 1.Newly Expressed Protein
정상인 33명과 PAH에 노출된 작업자 48명을 대상으로 이차원 전기영동을 수행한 결과 PAH에 의해 새로이 발현되는 1개 단백질을 찾아내었다(도 2). 상기 새로이 발현된 1개의 점(4981)을 MALDI-TOF/MS 분석하고 그 질량스펙트럼을 NCBInr에 대해 ProFound 서치를 수행한 결과 trypsin-digested peptide 서열이 2개 (서열번호 1 및 2) 일치하여 'putative capacitative calcium entry channel' (NCBI Accession No. CAC06090)로 동정되었으며 (도 5), 그 결과를 표 1에 요약하였다.Two-dimensional electrophoresis was performed on 33 healthy subjects and 48 workers exposed to PAH, and found one protein newly expressed by PAH (FIG. 2). One newly expressed point (4981) was analyzed by MALDI-TOF / MS, and the mass spectrum of the ProFound search was performed on NCBInr. As a result, two trypsin-digested peptide sequences (SEQ ID NOs: 1 and 2) matched 'putative'. capacitative calcium entry channel '(NCBI Accession No. CAC06090) (FIG. 5) and the results are summarized in Table 1.
[표 1]TABLE 1
PAH 노출에 새롭게 발현된 단백질 동정Identifying Newly Expressed Proteins in PAH Exposure
2. 발현 양이 증가한 단백질2. Proteins with Increased Expression
정상인 33명과 PAH에 노출된 작업자 48명을 대상으로 이차원 전기영동을 수행한 결과 PAH에 의해 정상인 보다 300% 이상 발현이 증가된 단백질 5개를 찾았다(도 3). 5개의 점들의 평균화된 볼륨강도(volume intensity)를 비교한 그래프를 도 4에 도시하였고, 그 volume 증가배수를 표 2에 나타내었다.Two-dimensional electrophoresis was performed on 33 healthy subjects and 48 workers exposed to PAH. As a result, 5 proteins with increased expression of 300% or more were found by PAH (FIG. 3). A graph comparing the averaged volume intensity of the five points is shown in FIG. 4, and the volume increase times are shown in Table 2.
[표 2]TABLE 2
발현양이 증가한 점들의 Volume 증가배수Volume increase multiple of points with increased expression
상기 발현양이 증가된 5개 점들에 대해 MALDI-TOF/MS와 ESI-MS/MS를 수행한 결과 5개 단백질을 아래 표 4와 같이 동정하였다.As a result of performing MALDI-TOF / MS and ESI-MS / MS on the five points with the increased expression amount, five proteins were identified as shown in Table 4 below.
상기 발현이 증가된 5개 점(86, 314, 355, 540, 611)을 ESI-MS/MS와 MALDI-TOF/MS 분석하고 그 질량스펙트럼을 NCBInr에 대해 MASCOT과 ProFound 서치를 수행한 결과 trypsin-digested peptide 서열이 2개 (서열번호 3 및 4) 일치하여 'Fibrinogen gamma_A chain precursor' (NCBI Accession No. FGHUG)로 동정되었으며 (도 6a 내지 6c), 3개 (서열번호 5, 6 및 7) 일치하여 'Hemopexin precursor' (NCBI Accession No. AAA52704)로 동정되었으며 (도 7a 내지 7d), 2개 (서열번호 8 및 9) 일치하여 'Fibrinogen gamma_A chain precursor' (NCBI Accession No. FGHUG)로 동정되었으며 (도 8a 내지 8c), 3개 (서열번호 10, 11 및 12) 일치하여 'Albumin precursor' (NCBI Accession No. 1BKE)로 동정되었으며 (도 9a 내지 9d), 1개 (서열번호 13) 일치하여 'T-cell receptor beta chain C region' (NCBI Accession No. P01850)으로 동정되었다 (도 10). 그 결과를 표 3에 요약하였다.Five points (86, 314, 355, 540, 611) with increased expression were analyzed by ESI-MS / MS and MALDI-TOF / MS, and the mass spectra were performed by MASCOT and ProFound search for NCBInr. 2 digested peptide sequences (SEQ ID NOS: 3 and 4) were identified as 'Fibrinogen gamma_A chain precursor' (NCBI Accession No. FGHUG) (FIGS. 6A-6C) and 3 matched (SEQ ID NOs: 5, 6, and 7) Was identified as 'Hemopexin precursor' (NCBI Accession No. AAA52704) (Figs. 7a to 7d), two (SEQ ID NOs: 8 and 9) matched to 'Fibrinogen gamma_A chain precursor' (NCBI Accession No. FGHUG) ( 8a to 8c), three (SEQ ID NOs: 10, 11 and 12) matched to 'Albumin precursor' (NCBI Accession No. 1BKE) (FIGS. 9A to 9D), one (SEQ ID NO: 13) to match ' T-cell receptor beta chain C region '(NCBI Accession No. P01850) was identified (FIG. 10). The results are summarized in Table 3.
[표 3]TABLE 3
PAH 노출에 발현양이 증가된 단백질 동정Protein Identification with Increased Expression in PAH Exposure
3. 웨스턴 블로팅 결과3. Western blotting results
상기 동정된 바이오바커 단백질들 중 그 항체를 상업적으로 구할 수 있는 Fibrinogen과 TCR β에 대하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 도 11에서 Fibrinogen antibody를 가지고 실험한 결과 2-DE gel상에서 PAH 비노출자에 비해 5배까지 Fibrinogen gamma chain만이 유의적으로 증가함과 같이 western blotting의 결과에서는 47 kDa에서 매우 유의적인 발현양의 차이를 관찰할 수 있었다 (P<0.005). 따라서 이는 PAH 노출평가의 대한 하나의 marker probe로 사용 가능하다고 사료된다. 도 11의 A 에서 beta chain(56 kDa) 과 gamma chain(47 kDa)을 나타내며 B에서는 beta chain과 gamma chain의 density를 나타낸 그래프이다. (*p＜ 0.005). Western blotting was performed on Fibrinogen and TCR β, which are commercially available antibodies among the identified biobarker proteins. As shown in FIG. 11, only fibrinogen gamma chains were significantly increased up to 5 times as compared to PAH non-exposed on 2-DE gel. As a result of western blotting, a significant difference in expression was observed at 47 kDa. Observation was possible (P <0.005). Therefore, it can be used as a marker probe for PAH exposure assessment. In FIG. 11A, a beta chain (56 kDa) and a gamma chain (47 kDa) are represented, and in B, a graph showing the density of the beta chain and the gamma chain. (* p <0.005).
도 12에서 TCR β antibody를 가지고 실험한 결과 PAH 노출자에서는 비노출자(각기 다른 3명의 사람들)와 달리 21 kDa의 band가 모두 발현양이 늘어남을 western blotting을 통해 알 수 있었다. 2-DE gel 상에서는 PAH 비노출자에 비해 3배 증가함을 보였고 western blotting에서는 P값이 0.005이하로 매우 유의적이었다. 도 12의 A에서 N 1∼3은 각기 다른 비노출자, P 1∼3은 PAH 노출자를 나타내며, B 그래프에서 21 kDa band의 density를 나타낸다 (*p＜ 0.005).As a result of experiments with TCR β antibody in FIG. 12, unlike the non-exposed persons (three different people), the expression levels of all 21 kDa bands were increased by western blotting. On the 2-DE gel, PAH showed a threefold increase compared to the non-PAH exposed group, and P value was less than 0.005 in western blotting. In Fig. 12A,
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 결과로 얻어진 PAH에 의해 새롭게 발현되는 단백질 1개와 양이 증가하는 단백질 5개는 PAH 노출에 대한 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오 마커 단백질은 얻기 간편한 소량의 혈액으로부터 작업자에 대한 PAH 오염정도를 측정할 수 있으며, 이렇게 측정된 오염 정도로 PAH 노출자의 생리적인 상태를 파악 할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 immunoassay 키트 (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 난분해성 오염물질 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에 이용될 수도 있다. 차세대 진단키트인 단백질 칩은 PAH오염에 관한 역학조사 분야, 식품 및 농축산물 검역, 공산품 검역, 작업환경 및 생활환경 등의 대규모 검사 분야에 폭넓게 이용될 수 있다.As described above, one protein newly expressed by the PAH obtained as a result of the present invention and five proteins of increasing amount may be used as biomarkers for PAH exposure. Biomarker protein of the present invention can measure the degree of PAH contamination for the operator from a small amount of easy to obtain blood, it is possible to grasp the physiological state of the PAH exposed to the degree of contamination thus measured. In addition, monoclonal antibodies prepared on the basis of the biomarker protein of the present invention can be used in immunoassay kits (ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor), and also exhibit higher specificity and sensitivity. It can also be used for the development of protein chips having various hardly degradable contaminant detection spectra through the development of antibodies. Protein chips, the next generation diagnostic kits, can be widely used in epidemiological investigations on PAH contamination, food and agricultural product quarantine, industrial product quarantine, work environment and living environment.
<110> KOREA CHUNGANG EDUCATION FOUNDATION <120> Biomarker proteins for diagnosing the exposure to PAH <130> PN053218 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> Trypsin-digested peptide of putative capacitative calcium entry channel (CAC06090) <400> 1 Val Thr Leu Gly Asp Asn Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> Trypsin-digested peptide of putative capacitative calcium entry channel (CAC06090) <400> 2 Trp Asp Pro Ser Asp Pro Gln Ile Ile Ser Glu Gly Leu Tyr Ala Ile 1 5 10 15 Ala Val Val Leu Ser Phe Ser Arg 20 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 3 Ala Ile Gln Leu Thr Tyr Asn Pro Asp Glu Ser Ser Lys Pro Asn Met 1 5 10 15 Ile Asp Ala Ala Thr Leu Lys 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 4 Glu Gly Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr Thr Glu Phe Trp Leu 1 5 10 15 Gly Asn Glu Lys 20 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Trypsin-digested peptide of Hemopexin precursor (AAA52704) <400> 5 Asn Phe Pro Ser Pro Val Asp Ala Ala Phe Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Trypsin-digested peptide of Hemopexin precursor (AAA52704) <400> 6 Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Gly Ile Pro Ser Pro Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 Val Glu Cys His Arg 20 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Trypsin-digested peptide of Hemopexin precursor (AAA52704) <400> 7 Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Asn Gln Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 8 Phe Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr Cys Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Gln Thr Lys 20 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 9 Tyr Leu Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn Gln Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Trypsin-digested peptide of Albumin precursor (1BKE) <400> 10 Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Trypsin-digested peptide of Albumin precursor (1BKE) <400> 11 Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Trypsin-digested peptide of Albumin precursor (1BKE) <400> 12 Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Trypsin-digested peptide of T-cell receptor beta chain C region (P01850) <400> 13 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 20 25 <110> KOREA CHUNGANG EDUCATION FOUNDATION <120> Biomarker proteins for diagnosing the exposure to PAH <130> PN053218 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (8) <223> Trypsin-digested peptide of putative capacitative calcium entry channel (CAC06090) <400> 1 Val Thr Leu Gly Asp Asn Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (8) <223> Trypsin-digested peptide of putative capacitative calcium entry channel (CAC06090) <400> 2 Trp Asp Pro Ser Asp Pro Gln Ile Ile Ser Glu Gly Leu Tyr Ala Ile 1 5 10 15 Ala Val Val Leu Ser Phe Ser Arg 20 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (23) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 3 Ala Ile Gln Leu Thr Tyr Asn Pro Asp Glu Ser Ser Lys Pro Asn Met 1 5 10 15 Ile Asp Ala Ala Thr Leu Lys 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (20) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 4 Glu Gly Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr Thr Glu Phe Trp Leu 1 5 10 15 Gly Asn Glu Lys 20 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (11) Trypsin-digested peptide of Hemopexin precursor (AAA52704) <400> 5 Asn Phe Pro Ser Pro Val Asp Ala Ala Phe Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (21) Trypsin-digested peptide of Hemopexin precursor (AAA52704) <400> 6 Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Gly Ile Pro Ser Pro Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 Val Glu Cys His Arg 20 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (11) Trypsin-digested peptide of Hemopexin precursor (AAA52704) <400> 7 Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Asn Gln Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (21) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 8 Phe Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr Cys Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Gln Thr Lys 20 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (12) <223> Trypsin-digested peptide of Fibrinogen gamma_A chain precursor (FGHUG) <400> 9 Tyr Leu Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn Gln Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (10) <223> Trypsin-digested peptide of Albumin precursor (1BKE) <400> 10 Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (13) <223> Trypsin-digested peptide of Albumin precursor (1BKE) <400> 11 Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (13) <223> Trypsin-digested peptide of Albumin precursor (1BKE) <400> 12 Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (27) <223> Trypsin-digested peptide of T-cell receptor beta chain C region (P01850) <400> 13 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys 20 25
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