KR100663985B1 - Water Soluble Metal Sulfide Quantum Dot Nanocrystal Complex - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중전기산화환원전위를 지닌 나노결정체의 합성 및 생체물질표지원으로서의 바이오-나노중합체에 관한 것으로, CdS, PbS 또는 ZnS와 같은 메탈설파이드(MS) 나노결정이 인산수용액(PBS) 상태에서 항체 또는 DNA와 결합되어 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체를 이루는 것과, (A)다중항체가 코팅된 마그네틱 비드를 도입하여; (B)여기에 항원을 인큐베이션 시키고; (C)상기 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체를 인큐베이션 시킨후; (D)상기 수용성 MS QD 나노결정 복합체를 질산 수용액에 용해시켜 스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압(Square wave anodic stripping voltammetric:SWASV)법으로 전기화학적 분석을 수행한 뒤; (E) 여기서 획득된 아날로그 신호를 바코드 출력으로 전환하기 위해 디지털 신호처리 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 마그네틱 비드에 의한 멀티(Multi)-타겟 단백질의 전기적 코딩방법에 의하는 경우, QD-나노입자를 신호발생원으로 하여 다중 단백질 분석물질을 전기분석에 의해 한번에 동시측정 할 수 있고, 바코드 모바일 시스템에 결함시킴으로써 질병원의 예측 및 분석을 현저하게 신속하고 간편하게 진행시켜 디지털 모바일화된 소형의료센서 시스템을 구현시킬 수 있다.The present invention relates to the synthesis of nanocrystals with multiple electro-redox potentials and to bio-nanopolymers as a biomaterial table support, wherein metal sulfide (MS) nanocrystals such as CdS, PbS, or ZnS are phosphate solution (PBS). Combining with an antibody or DNA to form a water soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex, and (A) introducing magnetic beads coated with a polyantibody; (B) incubating the antigen here; (C) incubating the water soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex; (D) dissolving the water-soluble MS QD nanocrystal complex in an aqueous solution of nitric acid and performing electrochemical analysis by Square wave anodic stripping voltammetric (SWASV) method; (E) QD-nanoparticles are obtained by the method of electrical coding of multi-target proteins by magnetic beads, characterized in that a digital signal processing step is performed to convert the obtained analog signal into a barcode output. As a signal source, multiple protein analytes can be simultaneously measured by electrical analysis, and defects in barcode mobile systems make it possible to predict and analyze disease agents remarkably quickly and easily, thereby implementing a digital mobile small medical sensor system. You can.

나노결정, 스트리핑 센서, 퀀텀닷, 모바일 의료통신Nanocrystal, stripping sensor, quantum dot, mobile medical communication

Description

수용성 메탈설파이드 퀀텀닷 나노결정 복합체{Water Soluble Metal Sulfide Quantum Dot Nanocrystal Complex}Water Soluble Metal Sulfide Quantum Dot Nanocrystal Complex

도 1은 메탈설파이드(MS)-퀀텀닷(QD) 나노결정 표지입자의 제조과정을 나타내는 절차도이다.Figure 1 is a procedure showing the manufacturing process of metal sulfide (MS) -quantum dot (QD) nanocrystalline labeling particles.

도 2는 MS-QD-항체(Ab) 중합체 (상위) 및 MS-QD-DNA 중합체(하위)의 제조과정을 나타내는 절차도이다.Figure 2 is a flow chart showing the preparation of the MS-QD-antibody (Ab) polymer (parent) and the MS-QD-DNA polymer (child).

도 3은 마그네틱 비드에 의한 멀티(Multi)-타겟 단백질의 전기적 코딩방법 과정을 나타내는 절차도이다.Figure 3 is a procedure showing the process of the electrical coding method of the multi-target protein by magnetic beads.

도 4는 마그네틱 비드에 의한 멀티(Multi)-타겟 DNA의 전기적 코딩방법 과정을 나타내는 절차도이다.Figure 4 is a procedure showing the process of the electrical coding method of multi-target DNA by magnetic beads.

도 5는 동시분석된3종 MS-QD중합체에 기반한 면역스트리핑 전류피크 및 전환된 관련 바코드 신호를 나타내는 그래프 및 바코드이다. FIG. 5 is a graph and barcode showing immunostriping current peaks and converted related barcode signals based on three analyzed MS-QD polymers.

도 6은 3 종 항원타겟물질의 농도별 증가시 얻어진 음전극 스트리핑 신호를 나타내는 그래프이다.Figure 6 is a graph showing the negative electrode stripping signal obtained by increasing the concentration of three antigen targets.

도 7은 3종 항원의 (a)디지타이즈된 전류신호, (b)노말라이즈된 전류신호를 나타내는 그래프이다.7 is a graph showing (a) digitized current signals and (b) normalized current signals of three antigens.

본 발명은 다중전기산화환원전위를 지닌 나노결정체의 합성 및 생체물질표지원으로서의 바이오-나노중합체에 관한 것으로, CdS, PbS 또는 ZnS와 같은 메탈설파이드(MS) 나노결정이 인산수용액(PBS) 상태에서 항체 또는 DNA와 결합되어 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체를 제조하는 것이다. The present invention relates to the synthesis of nanocrystals with multiple electro-redox potentials and to bio-nanopolymers as a biomaterial table support, wherein metal sulfide (MS) nanocrystals such as CdS, PbS, or ZnS are phosphate solution (PBS). It is combined with an antibody or DNA to prepare a water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex.

최근까지 수많은 DNA 분석장치들은 생물학적 표본분석에 있어 빠르고 간편하며 비용이 적다는 장점과 더불어 거대 게놈 및 병원균 정보를 얻기위한 인간게놈 프로젝트 연구의 요구에 부흥하여 오랫동안 유래 되어져 왔다. 기존의 게놈 어레이나 칩등이 DNA나 RNA 등의 분석에 유력한 전망을 나타내고 있으나, 그러한 도구들은 실용적인 측면에서 궁극적인 한계에 직면해 있다. 유전분석으로서는 실증적인 인간의 질병상태 진단에 대한 응용성이 약하다는 점이다. 왜냐하면 게놈 서열은 미래의 정보를 예측하게는 하나 실질적인 생물학적 기능성에 대한 정보를 제공할 수는 없기 때문이다. 이와는 대조적으로 프로테오믹 센싱장치는 서로 상이한 세포 타입의 복잡한 기능들과 다양한 질병상태의 진단에 대해 선택적으로 그 응용성을 넓힐 수 있다. 그러한 장치를 구현 하기 위해서는 기존의 연구실 기반의 단백질 진단을 보다 현실적이고 사용자위주의 값싸고 간편할뿐만 아니라 그 기능에 있어 기존의 규모가 큰 연구용 기기에 못지 않은 민감도, 선택성, 재현성 등이 필수 불가결 하다. 사용자로 하여금 고신뢰도(High-fidelity)를 갖게하는 면역에세이(immunoassay) 단백질 진단 시스템은 신장질환, 당뇨병, 심장질환. 고혈압 등의 임 상응용에 있어 인간질병의 조기진단에 가장 획기적인 도구이다. 면역센서가 그가운데 대표적인 예인데, 환자 질병의 조기진단뿐만 아니라 나아가서는 여러 단백질 복합분석물에 대한 스크리닝(screening) 에 이르기까지 광범위하고 신속하고 간편하며 효율적인 면역분석을 제공한다. 이에 대하여 대부분의 연구들은 다중색채(multicolor) 형광 분석법에 의한 다중 분석물질 면역법(multi-analyte immunoassays)에 집중되었다. 그러나 그러한 광학법 기반의 면역분석법들은 대개 유기 염색(dye) 형광 표지물질을 사용하는데, 표지물질로서의 형광물질자체는 광학적으로 민감도는 높을지라도 안정도가 낮고 (photo bleaching), 이로 인해 광학적으로 협소한 익사이테이션(excitation) 과 에미션 밴드(emission band) 범위 및 단일물질 분석에만 국한되어 실용적 분석시 많은 한계에 직면해 있는 실정이다. 또한 형광물질은 생물분자표면과 반응하여 생물학적 기능성에 손실을 입히는 단점을 나타낸다. Until recently, many DNA analyzers have been derived for a long time, in response to the needs of human genome projects to obtain large genome and pathogen information, along with the advantages of fast, simple and inexpensive biological analysis. Although existing genomic arrays and chips show promising prospects for DNA and RNA analysis, such tools face ultimate limitations in practical terms. Genetic analysis is weak in the application of empirical human disease status. Because genomic sequences predict future information, they cannot provide information about the actual biological functionality. In contrast, proteomic sensing devices can selectively expand their applicability to the complex functions of different cell types and the diagnosis of various disease states. Implementing such a device is not only more realistic, inexpensive, and simpler for laboratory-based protein diagnostics, but also more sensitive, selectable, and reproducible than traditional large-scale research instruments. . Immunoassay protein diagnostic systems that give users high-fidelity include kidney disease, diabetes and heart disease. It is the most innovative tool for early diagnosis of human disease in the treatment of high blood pressure. Immunosensors are a prime example of this, providing a broad, rapid, simple and efficient immunoassay, from early diagnosis of patient disease as well as screening for multiple protein complex analytes. Most studies have focused on multi-analyte immunoassays by multicolor fluorescence assays. However, such optical-based immunoassays usually use organic fluorescent dyes, and the fluorescent material itself as a label has low photobleaching even though its optical sensitivity is high. There are many limitations in practical analysis, limited to the range of excitation and emission bands and single substance analysis. In addition, the fluorescent material has a disadvantage in that it reacts with the surface of the biomolecule, causing a loss of biological functionality.

DNA나 단백질분석에 있어 최근동향을 보면, 반도체 퀀텀닷 나노입자(semiconductor quantum dot(QD) nanoparticle)는 생물분자들과 중합되어 포스트(post)-게놈시대에 접어들어 프로테오믹 기능성 기반의 의학연구에 있어 괄목할 만한 프론티어 역할을 하고있다. QD는 대부분의 생물분자들의 크기범위와 흡사하여 다양한 QD-바이오중합체(bioconjugates)가 제조 가능하며, 이는 많은 나노-생물중합 응용분야에서 잠재적으로 사용될 수 있고, 특별히 광학 또는 분자수준 이미징과 프로파일링 (profiling) 등에만 한정적으로 적용되어 왔다. 그러나, 실용적인 측면에서 종래 QD의 생물학적 응용성은 그 한계가 있다. QD 자체가 형광표지물질에 비해 물리적으로는 안정하더라도 수용성화 등의 표면화학적 가공의 제약과 더불어 현재까지 시중에 나와있는 QD들은 그 제약을 제대로 극복하지 못한 수준이다. 이러한 나노물질들과 생체물질과의 성공적인 통합(integration) 이야말로 분자수준의 생의학 분야를 실로 혁신적인 전기로 끌어올리도록 할 것이다.Recent trends in DNA and protein analysis suggest that semiconducting quantum dot (QD) nanoparticles are polymerized with biomolecules and enter the post-genomic era, proteomic-based medical research. It is a remarkable frontier. QDs are similar to the size ranges of most biomolecules and can produce a variety of QD-bioconjugates, which can potentially be used in many nano-biopolymerization applications, especially optical or molecular level imaging and profiling ( profiling). In practical terms, however, the biological applicability of conventional QDs is limited. Although QD itself is more physically stable than fluorescent labels, QDs on the market have not overcome the limitations in addition to the limitations of surface chemical processing such as water solubilization. The successful integration of these nanomaterials with biomaterials will actually push the molecular biomedical field to revolutionary electricity.

가장 최근에 골드만(Goldman)과 그의 연구진이 선보인 QD-베이스 멀티복합(based multiplexed) 독성인자 면역분석법은 광학적으로 다중 독성분석물질의 피크를 얻었기 때문에, 중첩된 QD 피크 결과치를 통계적 데이터조작법(deconvoluted superposition)을 통해 개개의 독립된 피크로 분리해야 하는 번거로운 공정을 겪었다. The most recent QD-based multiplexed toxic factor immunoassay, presented by Goldman and his team, optically obtained peaks of multiple toxic analytes, so the overlapping QD peak results were deconvoluted. superposition) has been a cumbersome process to separate into individual independent peaks.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 서로 다른 광범위한 특정 신호영역에서 고해상도 분석능을 갖는QD의 개발 및 그 응용을 통해, 새로운 전기화학적 면역센서 시스템을 제조하고자 하였다. The present invention has been made to solve the above problems, to develop a new electrochemical immunosensor system through the development and application of a QD having a high resolution analysis ability in a wide range of different specific signal region.

본 발명은 종래의 QD-바이오 공중합체가 가지고 있는 표면 화학적 가공의 제약을 극복하고자 원팟(One pot) 합성법에 의해 크기와 모양 조절이 가능한 고순도(high quality) 단분산(monodispersive) 나노결정입자를 제조하였고, 이러한 새로운 나노입자를 통해 실질적으로 높은 수용성과 화학적 안정성을 도모하는 것과 더불어, 생체분자 조작에 있어 나노입자의 표면을 캡핑(capping) 및 패시베이팅 (passivating) 리간드 처리를 하여 크기조절이 자유자재로 가능하도록함으로써 더욱 강화된 생물호환성 (biocompatible propertie)을 나타내고자 함이다. The present invention provides high-quality monodisperse nanocrystalline particles whose size and shape can be controlled by one pot synthesis to overcome the limitations of surface chemical processing of conventional QD-bio copolymers. These new nanoparticles provide substantially high water solubility and chemical stability, and freely control the size of the nanoparticles by capping and passivating ligands in the biomolecule manipulation. It is intended to show enhanced biocompatible propertie by enabling materials.                         

또한, 본 발명은 종래의 광학적 분석법이 아닌 스트리핑 전압법(Stripping voltammetry)과 같은 전기화학적 기술을 적용시킴으로써 다양한 산화/환원 전압을 갖는 QD 표지들에 기반한 다중 생체물질의 동시측정법을 진단시스템을 구현하고자 하였다. 본 발명에 따른 수용성 단분산(monodispersed) 나노결정(nanocrystalline) 합성 방법에 의하여 공기중에서도 안정하고 합성조건이 다른 방법에 비해 상당히 간편하며, 고순도 나노입자크기의 촉매적 조절 또는 확대로써 센서신호의 민감도를 월등히 상승시키고자 하였다. 즉, 본 발명에 따른 나노입자는 여러 단백질 표적물질에 대해 특정한 전압 서명(voltammetric signature)으로 복합(multiplexed) 전기신호를 나타내고, 각각의 QD 표지물질은 개개의 입자가 전기적으로 조율된(tuned) 특정 전압 범위에서 선택적인 신호피크를 나타내도록 하는 것을 본 발명의 목적으로 하였다. In addition, the present invention is intended to implement a diagnostic system for the simultaneous measurement of multiple biomaterials based on QD labels having various oxidation / reduction voltages by applying electrochemical techniques such as stripping voltammetry rather than conventional optical analysis. It was. The water-soluble monodispersed nanocrystalline synthesis method according to the present invention is stable in air, and the synthesis conditions are considerably simpler than other methods, and the sensitivity of the sensor signal is improved by catalytic control or expansion of high purity nanoparticle size. It was going to rise significantly. In other words, the nanoparticles according to the present invention exhibit multiplexed electrical signals with specific voltage signatures for different protein targets, and each QD marker has a specific characteristic in which individual particles are electrically tuned. It was an object of the present invention to show selective signal peaks in the voltage range.

본 발명의 궁극적인 목표는 종래의 유기 염색(dye)신호발생원의 단점을 극복하여 물리적으로 보다 안정적이고 기능적이며, 새로운 의료진단장치를 개발함으로써 질병의 조기분석 및 진단에 있어 단일 분석물질에 그치지 않고 여러 복합물질을 동시 측정하여 보다 광범위한 정보와 기능성을 제공하도록 하는 것이다.The ultimate goal of the present invention is to overcome the shortcomings of conventional organic dye signal sources, and to develop physically more stable, functional and new medical diagnostic devices, not just a single analyte for early analysis and diagnosis of diseases. Simultaneous measurement of multiple composites provides a wider range of information and functionality.

본 발명은 여러개의 서로 다른 반도체 퀀텀닷(Quantum Dot:QD) 나노결정입자들을 이용한 다중전기산화환원전위를 지닌 나노결정체 및 생체물질표지원으로서의 바이오-나노중합체에 관한 것으로, 손쉬운 단백질 정량 및 정성분석의 도구로 사용되는 메탈설파이드 QD 복합체와 이를 제조하는 방법 및 상기 복합체를 이용한 마그 네틱 비드에 의한 멀티(Multi)-타겟 단백질의 전기적 코딩방법에 관한 것이다.The present invention relates to nanocrystals having multiple electro-redox potentials using several different semiconductor quantum dot (QD) nanocrystal particles and to bio-nanopolymers as a biomaterial table support. Easy protein quantification and qualitative analysis The present invention relates to a metalsulfide QD complex used as a tool of the present invention, a method for preparing the same, and a method for electrically encoding a multi-target protein by magnetic beads using the complex.

본 발명의 발명자는 나노결정체를 신호발생표지로 이용하여 정량 분석이 가능 하도록, 여러가지 다중 인체 질병원인 DNA 또는 단백질을 동시에 분석할 수 있는 전기화학적 센서 시스템을 개발하였고, 이를 메디컬 진단 장치로 이용하고자 여기에 디지털 정보처리기술을 통합하였다. 본 발명에서 사용된 중심물질인 고순도(high-quality) 메탈설파이드(metal sulfide:MS) 나노결정(nanocrystals)은 원팟(one-pot) 유기금속합성법을 토대로 제조되었다. 이러한 나노결정 물질들은 인체의 질병징후를 나타내는 원인단백질을 탐지하는 특이항체들에 공유결합을 형성하며 전기화학적 분석에 신호발생원으로서 사용되며, 여러 종류의 단백질에 대해 전기화학적 산화환원에 의한 다양한 표지 및 인식능력을 부여한다.The inventor of the present invention has developed an electrochemical sensor system capable of simultaneously analyzing DNA or proteins, which are various multiple human disease sources, to enable quantitative analysis using nanocrystals as signaling markers. Integrate digital information processing technology into High-quality metal sulfide (MS) nanocrystals, which are the core materials used in the present invention, were prepared based on the one-pot organometallic synthesis method. These nanocrystalline materials form covalent bonds to specific antibodies that detect the causative proteins of human disease, and are used as signal sources in electrochemical analysis, and various labels by electrochemical redox for various proteins and Gives awareness

본 발명에서는 자기입자(magnetic microparticles)에 기반한 나노스케일의 선택적 면역분석법을 사용하였으며, 실제로 소변에서 주로 검출되는 β₂-마이크로글로불린, 미오글로빈, 인체혈청알부민 등 통상적으로 신장 및 심장질환의 조기질환징후 결정에 널리 이용되는 지표분석물질들을 실험에 도입하였다. 소변 내 단백질 농도의 증가는 당뇨병이나 고혈압에 있어 보다 치밀하고 강화된 치유법에 대한 필요성을 지적해줄 뿐만 아니라 비 당뇨 환자 개개인에 있어서의 동맥경화까지도 추정이 가능한 것이다. 이로써 본 발명에서는 그러한 탁월한 생물학적 기능성을 갖춘 나노표지물질을 기반으로하여 인체의 질병(당뇨병, 신장병, 심장질환 등)을 전기화학적으로 조기진단할 수 있는 메디컬 나노-바이오테크놀로지(Medical Nano- biotechnological)분석시스템을 개발하였고, 바코드리더(Barcode reader)와 같은 기능적으로 시각화된 임상출력신호법을 적용하여 복잡한 의학생물학적 신호를 디지털 시그널 프로세싱(Digital Signal Processing:DSP) 기술에 의해 보다 간편하게 전환시켰으며, 이는 GSM(Global System for Mobile), bluetooth 또는 CDMA(the Code Division Multiple Access) 등의 첨단 무선 모바일 IT(information technology) 기술과 RFID 또는 유비쿼터스 시스템(Ubiquitous systems)과 결합하여 조기질병진단방식에 혁신적 전기를 구축할 수 있는 것이다.In the present invention, the nanoscale selective immunoassay based on magnetic microparticles was used, and in general, early disease symptoms determination of kidney and heart diseases such as β ₂ -microglobulin, myoglobin, human serum albumin, which are mainly detected in urine Surface analytes widely used in the experiments were introduced into the experiment. Increasing protein levels in urine not only points to the need for more sophisticated and enhanced healing in diabetes and hypertension, but also to predict atherosclerosis in individual non-diabetic patients. Thus, in the present invention, the medical nano-biotechnological analysis capable of electrochemically early diagnosis of human diseases (diabetes, kidney disease, heart disease, etc.) based on the nanomarker having such excellent biological function. The system was developed and applied to functionally visualized clinical output signaling methods, such as a barcode reader, to more easily convert complex medical and biological signals by digital signal processing (DSP) technology. Advanced wireless mobile information technology (IT) technologies, such as Global System for Mobile, Bluetooth, or the Code Division Multiple Access (CDMA), and RFID or ubiquitous systems to create innovative electricity for early disease diagnosis. It can be.

이와 같이 본 발명은 인체 질병을 전기화학적으로 조기진단 하기 위하여 나노표지물질을 이용하였고, 구체적으로는 CdS, PbS 또는 ZnS와 같은 메탈설파이드(MS) 나노결정을 인산수용액(PBS) 상태에서 항체 또는 DNA와 결합시켜 수용성을 가지는 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체를 제조하였다. 본 발명은 나노결정으로써 메탈설파이드를 이용하였고 이를 항체 또는 DNA와 같은 단백질과 결합시킨 것을 특징으로 하는 것이다. As described above, the present invention used a nanomarker for early diagnosis of human disease, and specifically, a metal sulfide (MS) nanocrystal such as CdS, PbS, or ZnS was used as an antibody or DNA in phosphate solution (PBS). And a water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal composite was prepared. The present invention is characterized by using metal sulfide as a nanocrystal and binding it to a protein such as an antibody or DNA.

종래의 신호표지물질로서의 나노결정들은 제조절차가 복잡하고 덩치 큰 광학분석법에서만 사용되는데 그 응용이 그쳐있었고, 생체물질(DNA, 단백질)의 정량, 정성분석을 위한 QD-항체중합체 역시 광학 이미징이나 센서분야에서의 신호발생원에만 한정되어있는 실정이었다. 그러나 본 발명에 따른 QD 복합체는 CdS, PbS 또는 ZnS와 같은 메탈설파이드(MS) 나노결정을 이용하여 종전보다 합성이 간편하고, 개체특이 산화환원전위를 갖고 있기 때문에 소형화가 가능한 다중-바이오물질 측정 및 진단용 전기분석법에 적용될 수 있는 것이다. 이와 같이 나노입자를 신호발생 원으로 하여 다중 단백질 분석물질을 전기분석에 의해 한번에 동시 측정할 수 있도록 제조된 나노결정 복합체는 아직까지 알려진 바가 없는 전혀 신규한 것이다.Conventional signal labeling nanocrystals are used only in complex and bulky optical assays, and their application has been limited. QD-antibody polymers for quantitative and qualitative analysis of biological materials (DNA, protein) can also be used for optical imaging or sensors. The situation was limited to signal sources in the field. However, the QD complex according to the present invention can be synthesized more easily than before using metal sulfide (MS) nanocrystals such as CdS, PbS or ZnS, and has a specific redox potential. It can be applied to diagnostic electroanalysis. As such, nanocrystalline complexes prepared to simultaneously measure multiple protein analytes at a time by electroanalysis using nanoparticles as a signaling source are completely novel.

본 발명에 따른 메탈설파이드(MS) 나노결정을 이용한 복합체는 메탈설파이드(MS) 나노결정이 다이티올쓰레이톨(dithiolthreitol:DTT)에 의해 수산화(hydroxylated) 되고 카보닐 다이이미다졸(1,1-carbonyl diimidazole:CDI)로 활성화(activate) 되어, 항체 또는 DNA와 결합되는 것을 특징으로 하고 있다. In the composite using the metal sulfide (MS) nanocrystal according to the present invention, the metal sulfide (MS) nanocrystal is hydroxylated by dithiolthreitol (DTT) and carbonyl diimidazole (1,1-carbonyl). It is activated by diimidazole: CDI) and characterized in that it is bound to an antibody or DNA.

본 발명의 다른 특징으로는 위와 같은 방법에 따라 항체 또는 DNA와 결합하는 메탈설파이드(MS) 나노결정이 다음과 같은 과정을 거치어 제조되는 것이다. 먼저, 헥사데칸(hexadecanol)을 수산화칼슘(KOH) 및 카본 디설파이드(carbon disulfide:CS₂)와 혼합하여 헥사데실 싼테이트(Hexadecyl xanthate:HDX)를 합성하고, 상기 HDX를 MCl₂ 수용액에 반응시켜 메탈 헥사데실 싼데이트(M-HDX)를 합성된 후, 상기 M-HDX가 알킬아민도판트(alkyl amine dopants)와 혼합되어 본 발명에 따른 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체가 제조되는 것이다. Another feature of the present invention is that a metal sulfide (MS) nanocrystal that binds to an antibody or DNA according to the above method is prepared by the following process. First, hexadecanol is mixed with calcium hydroxide (KOH) and carbon disulfide (CS ₂ ) to synthesize hexadecyl xanthate (HDX), and the HDX is reacted with an MCl ₂ aqueous solution to react with metal hexa. After synthesis of decyl sadate (M-HDX), the M-HDX is mixed with alkyl amine dopants to prepare a water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex according to the present invention. Will be.

이와 같이 본 발명에 따른 메탈설파이드(MS) 나노결정은 세가지 이상의 반응 출발물질들을 원-팟 상에서 반응시켜 원하는 화합물을 효율적으로 얻을 수 있는 합성방법이다. 종래에는 두가지의 출발물질을 사용하여 중간체를 형성한 다음 이 중간체와 또다른 세번째의 반응시약과의 반응을 통하여 원하는 생성물을 얻었지만, 본 발명에서는 이를 탈피하여 처음부터 세가지의 반응시약들을 함께 섞어 주어 원-팟(one-pot)상에서 화합물을 합성하였다. 이와 같은 방법에 따라 제조된 나노결정 복합체는 이미 상용화된 입자들에 비해 제조가 간편하고 수용액상에서 안정하다는 장점과 더불어 크기와 형태를 자유롭게 조절가능하며, 항체 또는 DNA와 같은 생체물질과 중합시킬 경우 생물학적 기능성을 제대로 발휘할 수 있도록 하게 하고 있다. As described above, the metal sulfide (MS) nanocrystal according to the present invention is a synthesis method in which three or more reaction starting materials are reacted on a one-pot to efficiently obtain a desired compound. Conventionally, two intermediates are used to form an intermediate, and then a desired product is obtained by reacting this intermediate with another third reaction reagent. However, in the present invention, the three reaction reagents are mixed together from the beginning by removing the intermediate. Compounds were synthesized on one-pots. Nanocrystal composites prepared according to this method have the advantages of being simple to manufacture and stable in aqueous solution compared to the already commercially available particles, and can be freely controlled in size and shape, and when polymerized with biological materials such as antibodies or DNA, I let you show functionality properly.

본 발명의 또 다른 특징으로 위와 같은 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정은 헥사데칸올(hexadecanol)과 수산화 칼륨(KOH)이 혼합된 용액을 150℃의 온도에서 가열하고, 카본 디설파이드(carbon disulfide:CS₂)를 첨가해 상온에서 교반하여 헥사데실 싼테이트(Hexadecyl xanthate:HDX)를 합성하는 단계와 상기 HDX과 메탄올이 동일 몰의(equimolar) CdCl₂, PbCl₂ 또는 ZnCl₂ 수용액 각각에 2분간 반응하여 메탈 헥사데실 싼데이트(M-HDX)를 합성하는 단계 및 상기 M-HDX를 전자 기여 모노써펙턴트(monosurfactant)인 헥사데실아민(decylamine:HDA), 데실아민(decylamine:DA) 또는 트리옥틸아민(trioctylamine:TOA)와 같은 알킬아민도판트(alkyl amine dopants)가 각각 120℃까지 가열된후 50℃까지 냉각된 교반액에 첨가하는 단계를 거치어 제조되는 방법에 관한 것이다. As another feature of the present invention, the water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystals are heated at a temperature of 150 ° C. in a solution containing hexadecanol and potassium hydroxide (KOH), and carbon disulfide. (carbon disulfide: CS ₂₎ was added to it and stirred at room temperature hexadecyl cheap Tate (hexadecyl xanthate: HDX) the HDX synthesis step and the methanol and the same moles of (equimolar) CdCl _2, PbCl _2, or that Reacting each of the aqueous solution of ZnCl ₂ for 2 minutes to synthesize metal hexadecyl sadate (M-HDX) and hexadecylamine (decylamine: HDA), decylamine (monosurfactant), alkyl amine dopants, such as decylamine: DA) or trioctylamine (TOA), are each heated to 120 ° C. and then added to a stirred solution cooled to 50 ° C. It is about.

이와 더불어, 상기와 같은 제조방법에 따라 제조된 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정이 다이티올쓰레이톨에 의해 수산화 되고 카보닐 다이이미다졸로 활성화 된 후, pH 7.4인 인산수용액(PBS)에서 항체 또는 DNA와 결합하는 단계를 더 포함하여 본 발명에 따른 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체가 제조되는 방법에 관한 것이다.In addition, the water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystals prepared according to the above-described method was hydroxylated by dithiolthitol and activated with carbonyl diimidazole, and then the pH 7.4 aqueous solution of phosphate ( PBS) relates to a method for producing a water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex according to the invention further comprising the step of binding to the antibody or DNA.

본 발명에 따른 나노결정 복합체는 기존의 레이블용 QD 입자들의 제조법 (고온, 안전사고)에 비해 보다 환경친화적이고 간편한 원팟(one pot) 합성법에 기초하여 제조되었으며, 멀티 생체분자 분석에 대해 탁월한 선택성 및 민감도를 나타낼 수 있게 되었다. 이를 통하여, 각각의 나노결정들은 개개의 특정 단백질분자의 농도별 피크와 더불어 아날로그 데이터에 비해 상당히 간단하고 신속한 바코드 신호로의 전환을 가능케하였다. 더군다나 그러한 디지털 바코드신호 전환 시스템은 무선 모바일 통신 기술과 접목되어 차세대 의학진단용 도구로써 적용될 수 있는 것이다.The nanocrystal composite according to the present invention was prepared based on a more environmentally friendly and simple one pot synthesis method compared to the conventional method of preparing QD particles for labeling (high temperature, safety accident), and has excellent selectivity for multi biomolecule analysis and Sensitivity can now be shown. This allows each nanocrystal to convert to a barcode signal that is significantly simpler and faster than analog data with concentration peaks for each specific protein molecule. Moreover, such digital barcode signal conversion systems can be applied as a next-generation medical diagnostic tool when combined with wireless mobile communication technology.

이와 같이 본 발명은 인체 질병을 전기화학적으로 조기진단 하기 위한 것으로 나노표지물질을 이용하였고, 개개의 특정 항체 또는 DNA의 농도별 피크를 바코드 신호로 전환하기 위하여 마그네틱 비드에 의해 멀티(Multi)-타겟 단백질을 전기적으로 코딩하고자 하였다. 이를 위해 본 발명은 (가)다중항체가 코팅된 마그네틱 비드를 도입하여; (나)여기에 항원을 인큐베이션 시키고; (다)제1항 내지 제3항에 따른 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체를 인큐베이션 시킨후; (라)상기 수용성 MS QD 나노결정 복합체를 질산 수용액에 용해시켜 스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압(Square wave anodic stripping voltammetric:SWASV)법으로 전기화학적 분석을 수행한 뒤; (마) 여기서 획득된 아날로그 신호를 바코드 출력으로 전환하기 위해 디지털 신호처리 단계를 거치는 것을 특징으로 하였다.As described above, the present invention uses the nanolabel material as an electrochemical early diagnosis of human disease, and multi-target by magnetic beads to convert peaks by concentrations of individual specific antibodies or DNA into barcode signals. An attempt was made to electrically encode the protein. To this end, the present invention (a) by introducing a magnetic beads coated with a multi-antibody; (B) incubating the antigen here; (C) incubating the water soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complexes according to claims 1 to 3; (D) dissolving the water-soluble MS QD nanocrystal complex in an aqueous solution of nitric acid and performing electrochemical analysis by a square wave anodic stripping voltammetric (SWASV) method; (E) It is characterized by going through a digital signal processing step to convert the obtained analog signal to a barcode output.

이와 같은 마그네틱 비드에 의한 멀티(Multi)-타겟 단백질의 전기적 코딩방법은 도 3에서 보는 바와 같이, 항체를 대상으로 하여 (A)다중항체가 코팅된 마그 네틱 비드를 도입하고, (B)항원을 인큐베이션 시키고, (C)이어서 QD-항체 복합체를 인큐베이션 시킨 후에, (D)QD를 용해 시키고 전기화학적 분석(SWASV)을 수행하여, (E)단백질 기반 질병 진단용 바코드해석을 위한 디지털 신호 처리과정을 거치는 것이다.As shown in FIG. 3, the electrical coding method of the multi-target protein by the magnetic beads includes (A) a multi-antibody coated magnetic beads and (B) an antigen. Incubation, (C) followed by incubation of the QD-antibody complex, (D) QD dissolution and electrochemical analysis (SWASV), followed by (E) digital signal processing for protein-based disease diagnostic barcode analysis will be.

또한, 본 발명에 따른 마그네틱 비드에 의한 멀티-타겟 DNA의 전기적 코딩방법은 위와 같이 항체를 대상으로 할 수 있을 뿐만 아니라 DNA와 같은 단백질을 대상으로 하여 적용될 수 있다는 것은 본 발명의 기술분야에서 보통의 지식을 가진자에게는 명백한 사실이다. 즉, 도 4에 나타난 바와 같이 (A)상이한 염기서열을 가진 다중 유전병 원인 DNA의 탐색을 위하여, 다중 DNA 프로브(P1, P2, P3)가 코팅된 마그네틱 비드를 도입하고, (B)타겟 DNA(T1은 예를들어 유방암 유발 DNA, T2는 예를들어 대장암 유발 DNA, T3는 예를들어 간암 유발 DNA)를 인큐베이션 시키고, 이어서 (C)QD-DNA를 하이브리다이제이션(hybridization) 시킨 후에, (D)QD를 용해 시키고 전기화학적 분석(SWASV)을 수행하며, (E) DNA 기반 유전병진단용 바코드해석을 위한 디지털 신호처리 과정을 거치는 것이다.In addition, the electrical coding method of the multi-target DNA by the magnetic beads according to the present invention can be applied not only to the antibody as described above, but also to target proteins such as DNA is common in the art. It is obvious to those who have knowledge. That is, as shown in Figure 4 (A) to search for multiple genetic disease-causing DNA having different sequences, the magnetic beads coated with multiple DNA probes (P1, P2, P3) is introduced, (B) the target DNA ( T1, for example, breast cancer-causing DNA, T2, for example colorectal cancer-causing DNA, T3, for example liver cancer-causing DNA), followed by (C) hybridization of QD-DNA, followed by ( D) Dissolve QD, perform electrochemical analysis (SWASV), and (E) digital signal processing for barcode analysis for DNA-based genetic diagnosis.

오늘날 광학분석법은 비용이 많이 소모되는 대규모 어레이분석에 널리 이용되는반면, 전기분석법(전기화학적 분석법, 일반적으로 수용액상에서 사용되며, 전위, 전류, 전기전도도, 임피던스, 캐이퍼시턴스, 저항 등의 측정을 목적)은 소형화목적에 부합하며 빠른 신호처리에 기반한 소규모 어레이분석에 이상적이기 때문에 광학법에 비해 그 장점을 우수하다. 광학분석법은 형광물질에 근거한 빛의 세기를 측정하여 수행되는데 레이져법이나 케미루미네센트법 등 장비가 크고 운용이 불편 하며, 측정소요시간이 길다는 문제점이 있다. 그래서, 본 발명에 있어서는 특정 산화/환원 기작에 의한 전기적 신호를 인지하고 분석하는 전기화학적 면역분석 장치와 그에 따른 방법을 사용함으로써 분석 시간을 단축하고 절차가 간단하며 장비소형화에도 이상적인 질병진단 시스템을 구축하고자 하였다. 이는 운반성이 용이하여 의료생물학적분석에 있어 자가진단(point-of-care) 테스팅, 환경분야에서의 현지 독성 물질 탐침, 군용 조사 및 감시 시스템 등의 방대한 응용성을 갖는다.Today, optical analysis is widely used for costly large-scale array analysis, whereas electroanalysis (electrochemical analysis, commonly used in aqueous solutions, allows measurements of potential, current, conductivity, impedance, capacitance, resistance, etc.). Aims at miniaturization and is ideal for small array analysis based on fast signal processing. Optical analysis method is performed by measuring the intensity of light based on the fluorescent material, there is a problem that the equipment such as laser method and chemluminescent method is large and inconvenient to operate, and the measurement time is long. Therefore, in the present invention, by using an electrochemical immunoassay device and a method for recognizing and analyzing an electrical signal by a specific oxidation / reduction mechanism, a disease diagnosis system is shortened, a procedure is simple, and is ideal for equipment miniaturization. Was intended. It is easy to transport and has a wide range of applications, such as point-of-care testing, local toxic material probes in the field of environment, military surveys and surveillance systems in medical biological analysis.

이러한 전기화학적분석법의 하나로 스트리핑 전압법(Stripping voltammetry)은 크게 두가지 모드로 구성되는데, 먼저 특정전위를 인가함으로써 금속이온들은 작업전극표면에 모여지고 도포(deposition mode) 되는 과정을 거친 후에, 도포된 금속이온들이 특정 벗김(스트리핑 모드)을 위한 전위에 의해 특정 전류를 나타내게 되는 것이다. 이러한 스트리핑 전압법은 금속측정에 있어 효과적인 전기적 전농도축적(preconcentration deposition) 스텝에 기인한 강력한 고민감도의 전기분석법이다.As one of these electrochemical analysis methods, stripping voltammetry consists of two modes. First, by applying a specific potential, metal ions are collected and deposited on the surface of the working electrode, and then coated metal is applied. The ions exhibit a specific current by the potential for a specific stripping (striping mode). This stripping voltage method is a powerful high sensitivity electroanalytical method due to the effective electrical preconcentration deposition step for metal measurement.

본 발명에 따라 이와 같은 스트리핑 전압법을 본 발명에 따른 수용성 나노결정 복합체에 적용시키는 경우 현저하게 낮은 피코몰(picomolar) 측정한계(detection limits)를 얻을 수 있었고, 이러한 측정방법은 매우 높은 민감도를 보이는 콜로이드 금속이나 무기 결정 나노 표지(tagging) 등의 나노입자 스트리핑 DNA 하이브리드 에세이를 가능케 하였다. According to the present invention, when the stripping voltage method was applied to the water-soluble nanocrystal composite according to the present invention, remarkably low picomolar detection limits were obtained, and this measuring method showed very high sensitivity. Nanoparticle stripping DNA hybrid assays such as colloidal metals and inorganic crystalline nano tagging have been made possible.

구체적으로 본 발명에 따라 마그네틱 비드에 의해 멀티(Multi)-타겟 단백질을 전기적으로 코딩하는 방법으로써, SWASV법으로 전기화학적 분석을 수행하는 것 은 질산 수용액에 용해시킨 수용성 MS QD 나노결정 복합체를 아세테이트(acetate) 버퍼로 전처리(pretreatment) 시키고, 이보다 높은 볼트에서 축적(accumulation)하는 과정을 수행한 후, 휴지기를 거치어 스트리핑이 실행되는 단계를 거치어 수행되는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명에서는 이러한 정량측정을 통해 여러가지 항체 또는 DNA와 같은 단백질을 동정하기 위하여 민감하고 선택적인 전압스트리핑법(voltammetric stripping)을 사용 하였고, 이에 따른 금속 나노결정표지원에의한 특이 피크신호들은 각각 -1.11 V (Zn), -0.67V (Cd), -0.45V (Pb) 범위에서 금속(Hg 또는 Bi) 인시츄전압축적(in situ depositing)법(전기화학적 전압스트리핑분석법중 금속입자 측정시 사용되는 방법)에 의하여 성취되었다. Specifically, according to the present invention, a method of electrically encoding a multi-target protein by magnetic beads, and performing electrochemical analysis by SWASV method is performed by using a water-soluble MS QD nanocrystal complex dissolved in an aqueous solution of nitric acid in acetate ( acetate) buffer, and after performing the process of accumulating at higher volts, the stripping is carried out through the rest period. In the present invention, in order to identify various antibodies or proteins such as DNA through the quantitative measurement, a sensitive and selective voltage stripping method was used, and accordingly, specific peak signals by metal nanocrystal table support were- Metal (Hg or Bi) in situ depositing method in the range of 1.11 V (Zn), -0.67V (Cd), -0.45V (Pb) (used when measuring metal particles in electrochemical voltage stripping analysis) Method).

또한, 여기서 사용된 센서로서는 스크린 프린팅 카본전극과 유리카본작업전극 그리고 Ag/AgCl 기준(reference)전극을 도입하였다. 본 발명에 따라 마그네틱 비드에 의해 멀티(Multi)-타겟 단백질을 전기적으로 코딩하는 다른 방법으로써, 스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압(Square wave anodic stripping voltammetric:SWASV)법으로 전기화학적 분석을 수행하는 것은 수은(Mercury) II 이온 또는 비스무스(Bismuth) 이온이 코팅된 스크린 프린팅 카본 페이스트 전극을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 스크린 프린팅 카본전극과 유리카본전극은 모두 시료분석시 작업전극으로 사용되는데 전자는 일회용으로 사용되어 비용이 절감되며, 후자는 연속적으로 사용되지만 고비용이며 제품크기가 커짐, 매 분석마다 카본전극, 기준전극, 그리고 카운터전극으로 백금와이어가 3전극계로 이용 되었다. 인 츄 분석을 사용함으로써 측정시간의 단축(약 2분 내외; 기존의 전압스 트리핑방법으로는 10-30분 소요됨)을 도모하였다. 최종 아날로그 전기신호피크들의 크기 및 위치는 곧 항원(분석 단백질 물질)의 종류 및 위험농도 수위를 판명케해준다. 또한 나노결정체에 의한 아날로그 전기신호는 즉각 바코드로 신호처리되어 간단한 다중 디지털출력(readout)으로써 질병원인물질분석의 신속성을 부여할 수 있게 한다.As the sensor used here, a screen printing carbon electrode, a glass carbon working electrode, and an Ag / AgCl reference electrode were introduced. As another method of electrically coding a multi-target protein by magnetic beads according to the present invention, performing electrochemical analysis by Square wave anodic stripping voltammetric (SWASV) method is mercury ) II ions or bismuth (Bismuth) ions may be carried out using a screen printing carbon paste electrode coated. Both screen printing carbon electrode and glass carbon electrode are used as working electrode for sample analysis. The former is used for one-time use, and the cost is reduced. The latter is used continuously, but it is expensive and the product size is large. And, as a counter electrode, platinum wire was used as a three-electrode system. By using the in-chu analysis, the measurement time was shortened (about 2 minutes; 10-30 minutes by the conventional voltage striping method). The size and location of the final analogue electrical signal peaks quickly reveal the type and level of risk of the antigen (analyte protein material). In addition, the analog electrical signal by the nanocrystals is immediately signaled by a bar code, it is possible to give a rapid analysis of the cause of the disease by a simple multiple digital readout (readout).

암호화된 QD 나노결정입자들(zinc sulfide, cadmium sulfide, lead sulfide)이 뇨단백질들에 대한 상이한 신호들을 '선택적'으로 탐색하기 때문에 오로지 전기화학적 전압법으로서만 선택적이며 고민감도 및 고해상능의 다중 QD 피크결과치를 얻을 수 있는 것이다. 암호화된 QD 나노결정입자들(zinc sulfide, cadmium sulfide, lead sulfide)이 뇨단백질들에 대한 상이한 신호들을 선택적으로 탐색할 수 있도록 하며, 이는 샌드위치 면역분석법에 근간한 항체 자기입자분리법을 거쳐, 금속 스프리핑 전압법에 적절하게 적용되었다(표 1). 본 발명에서 사용된 하나의 일례로 선택된 분석물질 모델들로서는, 신장 및 심장질환관련 조기 임상 마커(marker)인 인간 혈청 알부민(human serum albumin:HSA), 인간 마이크로글로불린(human β₂-microglobulin:MG) 그리고 인간 미오글로빈(human myoglobin:Mb) 등이 이용되었다. 체내의 그러한 단백질들의 증가는 당뇨병이나 고혈압에 대한 면밀한 검사의 요구뿐만 아니라 비당뇨(nondiabetic) 환자의 심혈관이상도 조기 추정케 할 수 있다. 그러한 상승된 마커에 의한 위험수준은 정확히 신장 및 심혈관비정상에 밀접하게 관련 되어 있는 것이다. 이와 같이 본 발명의 일례에 있어서, 도 3 또는 도 4에 나타난 바와 같은 다중 단백질 또는 DNA를 분석하기 위한 QD 나노결정 복합체는 아래 표 1과 같이 정리될 수 있다.Encoded QD nanocrystals (zinc sulfide, cadmium sulfide, lead sulfide) 'selectively' search for different signals to urine proteins, so they are selective only by electrochemical voltammetry and have high sensitivity and high resolution multiple QD The peak result can be obtained. Encoded QD nanocrystals (zinc sulfide, cadmium sulfide, lead sulfide) allow selective detection of different signals for urine proteins, which are then subjected to metal magnetic soup by antibody magnetic particle separation based on sandwich immunoassays. Applicable to the ripping voltage method (Table 1). As an example analyte models selected in the present invention, human serum albumin (HSA), human microglobulin (human β ₂ -microglobulin: MG), which are early clinical markers for renal and heart disease ) And human myoglobin (Mb). The increase in such proteins in the body can lead to early estimation of cardiovascular abnormalities in nondiabetic patients as well as the need for a closer examination of diabetes or hypertension. The risk level by such elevated markers is precisely closely related to renal and cardiovascular abnormalities. As such, in one example of the present invention, the QD nanocrystal complex for analyzing multiple proteins or DNA as shown in FIG. 3 or 4 may be arranged as shown in Table 1 below.

[표 1: 복합 단백질의 샌드위치 면역분석법을 위한 준비]Table 1: Preparation for Sandwich Immunoassay of Complex Proteins

분석대상물  Analyte 캡쳐 항체 Capture antibody QD-항체 복합체 QD-antibody complex β₂-MG(Ag1) β ₂ -MG (Ag1) (항)anti-β₂-MG(Anti) anti-β ₂ -MG ZnS-(항)anti- ZnS- (anti) anti- Mb(Ag1)  Mb (Ag1) (항)anti-MB Anti-MB CdS-(항)anti-MB CdS- (anti) anti-MB HSA(Ag1)  HSA (Ag1) (항)anti-HSA Anti-HSA PbS-(항)anti-HSA PbS- (anti) anti-HSA

*캡쳐 항체는 바이오티닐레이트(biotinylate) 되었다.Capture antibodies were biotinylate.

한편, 바코드기술은 일반적으로 어떤 특성들에 대해 다양한 두께와 공간 막대들의 조합에 의한 수치로 단순하게 코드화하는데 널리 이용된다. 최근, 이러한 기술은 생물학적 개체에 대해 적용되는 등 생물정보학적 응용수단으로 확대될 수 있다. 특히, 그러한 광범위한 응용범주를 지닌 정보 인지 시스템은 병원과 임상 실험실에서 실제적으로 파급될 수 있다. 환자의 샘플(뇨, 혈청, 플라스마 등) 은 바코드 리더가 탑재된 자동분석기에 의해 분석이 용이하다. 최근 널리 이용되고 있는 분리법과 농도 정량법등은 분석과정이 느리고 번거롭다는 단점이 있다. 그러나 바코드 리더와 같은 기능화된 시각 출력법은 분석기기의 신속함과 아울러 정보전송도 수월하게 한다. 그러므로, 본 발명자는 아주 적은 양의 다중 단백질 시료 동시분석을 위해 나노입자로 이루어진 QD-항체 중합체에 의한 선택적 전기화학 아날로그 신호를 보다 간단하고 신속한 바코드신호로서 전환 및 무선 모바일 기술로 생체정보의 전달과 호환 가능한 시스템을 위한 신규한 신호처리 기술을 도입하였다. 이것은 아날로그 의료진단 장치에 바코드 리더와 같은 디지털 전환파트 및 CDMA 모바일기능을 갖춘 파트와의 이식, 통합된 시스템을 의미하는 것이다.Barcode technology, on the other hand, is commonly used to simply code numerical values by a combination of various thickness and space bars for certain properties. In recent years, these techniques can be extended to bioinformatics applications such as those applied to biological entities. In particular, information recognition systems with such a wide range of applications can be practically disseminated in hospitals and clinical laboratories. Patient samples (urine, serum, plasma, etc.) are easily analyzed by an automated analyzer equipped with a barcode reader. Recently widely used separation method and concentration quantitation method has the disadvantage that the analysis process is slow and cumbersome. However, functionalized visual output methods such as bar code readers make the analysis equipment faster and easier to transmit information. Therefore, the present inventors convert selective electrochemical analog signals by QD-antibody polymers composed of nanoparticles into simpler and faster barcode signals for simultaneous analysis of very small amounts of multiple protein samples, and transfer biometric information through wireless mobile technology. New signal processing techniques have been introduced for compatible systems. This means an integrated system with an analog medical diagnostic device, a digital conversion part such as a barcode reader, and a part with CDMA mobile capabilities.

즉, 본 발명에 따라 나노표지물질을 이용하여 개개의 특정 항체 또는 DNA의 농도별 피크에서 획득된 아날로그 신호를 바코드 출력으로 전환하기 위하여 디지털 신호처리 단계를 거침으로써 마그네틱 비드에 의해 멀티(Multi)-타겟 단백질을 전기적으로 코딩하고자 하였다. 디지털 신호처리 단계는 전기화학적 분석을 수행하는 단계에서 획득된 직선(linear)비례의 아날로그 코딩 신호들을 바코드화 하기 위해, 스트리핑 전압법에 의한 분석 대상 물질의 전기적 신호들이 특이값 대입을 통한 디지타이제이션(digitization) 과정과 노말리제이션(normalization) 과정을 거치는 것을 특징으로 하고 있다.In other words, according to the present invention, a nano-signal is used to perform a digital signal processing step to convert an analog signal obtained at a specific peak of each specific antibody or DNA into a barcode output. An attempt was made to electrically encode the target protein. In the digital signal processing step, in order to barcode the linearly proportional analog coded signals obtained in the step of performing the electrochemical analysis, the digitization of the electrical signals of the analyte to be analyzed by stripping voltage method through substitution of singular values (digitization) and normalization (normalization) process is characterized by.

기존의 병원 및 의학관련 기관에서 사용되는 단백질 조기진단법은 많은 시약처리절차와 분석시간이 허비되며, 복잡하고 값비싼 장비와 전문가에 제한된 인터페이스에 한정되어 조기진단이라는 것이 사실상 비전문인인 환자들에게는 여간 까다롭지 않을 수 없다. 반면, 본 발명에 따른 진단시스템은 규모가 작고 소형운반이 용이하며, 아주 미량의 환자시료(소변, 혈액, 체액)에 함유된 항원농도 또는 DNA농도에 따른 선택적이며 민감한 코딩된 디지털 신호가 전기적으로 실시간으로 바코드화되며 의학정보로서 저장되거나 무선 모바일 신호로 진료전산망 또는 의료인에게 즉각 전송가능하다. 이는 환자가 진료기관에 몸소 찾아가는 불편함없이 환자 스스로가 직접 자신의 임상상태를 손쉽게 자가진단(point-of-care) 하고 당뇨합병증이 나 심장질환의 악화에 임의로 대처할 수 있도록 한다. 최근 미국의 GE(General Electric Co.)사에서 가정용 무선 의료진단 시스템 구축을 마련하기 위한 준비단계에 들어갔으며, 본 발명에 따른 시스템이 단기간내에 상품화될 경우 가장 강력한 파급효과 및 대외 경쟁력을 구비할 수 있을 것이다.The early diagnosis of proteins used in existing hospitals and medical institutions wastes a lot of reagent processing and analysis time, and it is often useful for non-professional patients to be diagnosed early due to limited interface with complicated and expensive equipment and specialists. It can not be tricky. On the other hand, the diagnostic system according to the present invention is small in size and easy to carry, and the selective and sensitive coded digital signal according to the antigen concentration or DNA concentration contained in a very small amount of patient sample (urine, blood, body fluid) is electrically It can be barcoded in real time and stored as medical information or immediately transmitted to a medical network or medical personnel as a wireless mobile signal. This allows the patient to easily point-of-care his or her own clinical condition and cope with the worsening of diabetic complications or heart disease without the inconvenience of visiting the medical institution. Recently, GE (General Electric Co.) of the United States has entered the preparatory stage to prepare for the construction of a home wireless medical diagnostic system, and if the system according to the present invention is commercialized in a short time can have the strongest ripple effect and external competitiveness There will be.

기존의 전기분석장치는 단순히 전기적 아날로그신호로써 분석물질의 정량을 나타내지만 본 발명자가 개발한 바코드 모바일 시스템에 그러한 전기분석장치가 결합되면 얻어진 질병원의 예측 및 분석치는 종래의 것보다 훨씬 신속, 간편하고 해석이 용이한 의료정보로서 bit 단위로의 저장 또는 다자간 무선 교류를 통해 보다 원활하고 신속한 의료진단을 구현 할 수 있다. 종래의 여러 의료 및 진단, 기타 분석장치에서의 아날로그 신호측정시스템과는 차별화된 디지털 및 모바일화된 파격적인 소형의료센서시스템을 보급하고자 하였다. 부연하면, 본기술은 의학적, 임상적 응용뿐만 아니라, 수질, 식품 등의 환경모니터링 및 생물학전, 테러 (TNT) 와 범죄 (마약) 등의 분야에서의 감시 시스템에도 적용이 가능할 수 있는 것이다.Existing electroanalytical device simply represents the quantification of analyte as an electrical analog signal, but when such an electroanalytical device is combined with the barcode mobile system developed by the present inventor, the predicted and analyzed value of the disease agent is much faster and simpler than the conventional one. As medical information that can be easily interpreted, it can be realized smoothly and promptly through medical storage by bit unit or multi-party wireless exchange. It is to spread the digital and mobile small medical sensor system which is differentiated from the analog signal measuring system in various medical, diagnostic and other analysis devices. In other words, the technology can be applied not only to medical and clinical applications, but also to environmental monitoring of water quality, food, and surveillance systems in the fields of biological warfare, terrorism (TNT) and crime (drugs).

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.The invention can be better understood by the following examples, which are intended for the purpose of illustration of the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.

실시예 1: M(Zn, Cd, Pb)-HDX (C₁₆ xanthate) 칼륨(potassium) 염의 제조Example 1 Preparation of M (Zn, Cd, Pb) -HDX (C ₁₆ xanthate) Potassium Salts

나노결정입자들의 안정적 캡핑 물질인 헥사데실 싼테이트(Hexadecyl xanthate:HDX)는 다음과 같은 절차로 합성되었다. 금속 싼테이트 염(metal xanthates salts:M-HDX, M= Zn, Cd, Pb)은 도 1의 방법을 따랐다. 혼합된 동일 농도(0.04 몰)의 헥사데칸올(hexadecanol) 9.69 g과 수산화 칼륨(KOH) 2.24 g 이 혼합된 용액을 전부 용해될 때까지 150℃의 온도에서 가열시켰다. 얻어진 수용액은 100℃의 온도에서 25ml의 톨루엔(toluene)에 넣고 균일하게 교반하였다. 카본 디설파이드(carbon disulfide) 4.41g을 상온에서 미량으로 조금씩 첨가하면 두꺼운 노란색용액이 얻어지며, 이를 냉각시킨후 다시 1 시간동안 강하게 교반시키고, 용액은 100 ml의 페트로리움 에테르(petroleum ether)에 넣고 2 시간동안 추가교반을 실시한다. 최종 산물은 유리 필터(glass funnel)로 걸러지고 에테르로 여러 번 세척된 후 모아졌다. 싼테이트는 진공 오븐에서 완전히 건조시키고 다시 20 ml의 차가운 증류수로 세척한후 다시 필터시키고 다시 건조시키며 에테르로 세척된다. 그러한 최종 HDX는 메탄올로 3번 세척되고 다시 건조된다. Hexadecyl xanthate (HDX), a stable capping material of nanocrystalline particles, was synthesized by the following procedure. Metal xanthates salts (M-HDX, M = Zn, Cd, Pb) followed the method of FIG. 1. The mixed solution of 9.69 g of hexadecanol and 2.24 g of potassium hydroxide (KOH) at the same concentration (0.04 mol) mixed was heated at a temperature of 150 ° C until all of the solution was dissolved. The obtained aqueous solution was put into 25 ml of toluene at the temperature of 100 degreeC, and it stirred uniformly. 4.41 g of carbon disulfide is added in small portions at room temperature to obtain a thick yellow solution. After cooling, the solution is stirred vigorously for 1 hour, and the solution is added to 100 ml of petroleum ether. Carry out additional stirring during the time. The final product was filtered through a glass funnel, washed several times with ether and collected. The acetate is completely dried in a vacuum oven, washed again with 20 ml of cold distilled water, filtered again, dried and washed with ether. Such final HDX is washed three times with methanol and dried again.

실시예 2: 원팟(One-pot) 고순도 메탈 썰파이드 MS(M=Zn, Cd, Pb) 나노결정입자의 합성Example 2 Synthesis of One-pot High Purity Metal Sulfide MS (M = Zn, Cd, Pb) Nanocrystalline Particles

2.1. 금속 나노입자들의 전압서명(signature) 2.1. Voltage signature of metal nanoparticles

바이오 엣세이의 높은 선택성을 고려한 반도체 나노입자 트레이서(tracer)의 비-오버래핑 풀(nonoverlapping pool)을 얻기위해, ZnS, PbS, CdS, InAs, GaAs 또는 CuS와 같은 이원 무기화합물(binary inorganic) 나노입자들을 선별하였다. Cd-In 과 In-Pb 피크쌍의 중첩된 신호를 제외한 전기 코드들은 확연히 구별될 수 있다. 따라서 본 발명서는 ZnS, PbS 및 CdS 나노입자를 도입하게 되었다. 항원농도에 일치하는 각 금속이온들에 의한 피트들은 -1.12V (Zn), -0.68V (Cd) -0.53V (Pb) 등의 전압범위에서 나타났다(도 3).Binary inorganic nanoparticles, such as ZnS, PbS, CdS, InAs, GaAs or CuS, can be used to obtain a nonoverlapping pool of semiconductor nanoparticle tracers that account for the high selectivity of bioassays. Screened. The electrical codes can be clearly distinguished except for overlapping signals of Cd-In and In-Pb peak pairs. Therefore, the present invention introduces ZnS, PbS and CdS nanoparticles. Pits by the metal ions corresponding to the antigen concentration appeared in the voltage range of -1.12V (Zn), -0.68V (Cd) -0.53V (Pb), etc. (FIG. 3).

2.2. 고순도 메탈 썰파이드 나노결정입자들의 합성2.2. Synthesis of High Purity Metal Sulfide Nanocrystalline Particles

고순도 메탈 썰파이드 나노결정입자들의 합성과 표면안정화는 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 요약하면, 메탈 알킬 싼테이트(xanthate) 황화 전구체의 저온(thermal) 침적(decomposition)법에 근간한 합성법으로 이뤄졌다(도 1). HDX 3.56 g, 5 ml의 메탄올이 동일량의 몰의(equimolar) CdCl₂, PbCl₂, ZnCl ₂ 수용액 각각에 2분간 반응된다. 용액은 원심분리로 상층액은 제거되고 최종 M-HDX은 세번정도 세척되고 메탄올로 세척 후 진공 오븐에서 건조된다. 모든 나노 전위금속입자들은 강력한 전자 기여 모노써펙턴트(monosurfactant)로써 알킬 아민 도판트(alkyl amine dopants)인 헥사데실아민(decylamine:HDA), 데실아민(decylamine:DA), 트리옥틸아민(trioctylamine:TOA) 0.5 g씩을 캡핑 안정화 및 나노결정들의 유기용매목적으로 Zn-HDX, Cd-HDX, Pb-HDX에 각각 혼합시켰다. 먼저 알킨 아민도판트들은 각각 120℃까지 가열되고 50℃까지 냉각된 후, 균일하게 교반시키는 동안 각 금속-HDX 분말 0.05g이 첨가된다. 그리고 난 후, 가열온도는 100℃에서 30분간 교반된후, 다시 온도를 조금씩 120℃까지 올리고 1.5시간동안 반응을 지속시킨다. 반응종료 전, 140℃에서 2분간 최종반응을 마친 후, 천천히 70℃까지 온도를 낮춘다. 얻어진 최종 금속 결정입자들은 각각 흰색의 ZnS, 황색의 CdS, 그리고 검정색의 PbS이며, 이들은 메탄올에 의해 프로컬레이션(flocculation)되어 손쉬운 추출을 위해 시험관바닥에 침전된다. 최종입자들이 깨끗이 정제될때 까지 상층액 제거과정이 여 러번 수행되고 상온에서 바짝 건조되어 고운 분말형태의 최종 나노결정입자가 얻어진다.Synthesis and surface stabilization of high purity metal sulfide nanocrystal particles were performed in the following manner. In summary, the synthesis was based on the thermal deposition of metal alkyl xanthate sulfide precursors (FIG. 1). HDX 3.56 g, 5 ml of methanol in the same amount by mole _{(equimolar) CdCl 2, PbCl 2} , It is reacted with each of ZnCl ₂ aqueous solution for 2 minutes. The solution was centrifuged to remove supernatant, the final M-HDX washed three times, washed with methanol and dried in a vacuum oven. All nanopotential metal particles are strong electron contributing monosurfactants, which are alkyl amine dopants, decylamine (HDA), decylamine (DA) and trioctylamine (TOA). ) 0.5 g each were mixed with Zn-HDX, Cd-HDX, Pb-HDX, respectively, for capping stabilization and organic solvents of the nanocrystals. The alkyne amine dopants are first heated to 120 ° C. and cooled to 50 ° C., respectively, and 0.05 g of each metal-HDX powder is added during uniform stirring. Then, the heating temperature was stirred for 30 minutes at 100 ° C, and then the temperature was gradually raised to 120 ° C and the reaction was continued for 1.5 hours. After completion of the reaction at 140 ° C. for 2 minutes before completion of the reaction, slowly lower the temperature to 70 ° C. The final metal grains obtained are white ZnS, yellow CdS, and black PbS, which are flocculated with methanol and are deposited on the bottom of the test tube for easy extraction. The supernatant removal process is performed several times until the final particles are cleanly purified and dried at room temperature to obtain final nanocrystalline particles in the form of fine powder.

실시예 3: 메탈 썰파이드 MSQD 나노결정 항체 복합체의 제조Example 3: Preparation of Metal Sulfide MSQD Nanocrystalline Antibody Complexes

수용성 QD-항체(Ab) 복합체는 다음의 방법대로 수행되었다(도2). 매우 균일한 QD들은 다이티올쓰레이톨(dithiolthreitol:DTT)에 의해 수산화(hydroxylated)되고 카보닐 다이이밀다졸(1,1-carbonyl diimidazole:CDI)으로 활성화(activate)되었다. 100㎕의 CdS, PbS, ZnS 나노결정입자들은 pH 7.4인 인산수용액(PBS) 20 mM에 있는 항(anti)-Mb, 항(anti)-HSA, 항(anti)-b₂-MG 240 mM과 각각 반응 되어진다. 최종수용액pH는 8.5까지 1M NaOH로 조절되었다. 상온에서 24시간동안 교반 반응된후, 미반응된 항체들이 다이옥샌(dioxane)으로 제거된다. 최종 수용성 중합체들은 0.1 M PBS(pH 7.4, 0.05% Tween 20)에 디스퍼스되었다.The water soluble QD-antibody (Ab) complex was performed according to the following method (FIG. 2). Highly uniform QDs were hydroxylated by dithiolthreitol (DTT) and activated with carbonyl diimidazole (CDI). 100 μl of CdS, PbS, and ZnS nanocrystals were mixed with anti-Mb, anti-HSA, anti-b ₂ -MG 240 mM in 20 mM phosphate solution (PBS) at pH 7.4. Each reacts. The final aqueous pH was adjusted to 1 M NaOH up to 8.5. After stirring for 24 hours at room temperature, unreacted antibodies are removed with dioxane. The final water soluble polymers were dispersed in 0.1 M PBS (pH 7.4, 0.05% Tween 20).

실시예 4: 면역복합체-코팅된 마그네틱 비드의 제조 및 면역분석과정Example 4 Preparation and Immunoassay of Immunocomposite-Coated Magnetic Beads

마그네틱 비드에 의한 단백질 분석은 MCB 1200 Biomagnetic processing platform에 기초하였고, Micromax centrifuge(Thermo IEC, MA, USA)를 사용하여 원심분리 과정을 거치었다. 2.5ml의 스트랩트아비딘(streptavidin) 코팅된 마그네틱 비드는 1.5ml튜브로 분주되고 95 ml의 TTL(100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% Tween 그리고 1M LiCl)이 첨가되며 1분동안 0.5rps의 속도로 원심분리시켜 분리된다. 맑은 상층액이 얻어지면 이를 피펫으로 조심스럽게 제거시킨다. 세척과정은 세번 반복 실시되고, 비드들은 21ml의 TTL 버퍼에 분주되어지고 4ml의 바이오티닐레이트 (biotinylated) 처리된 항체들(항(anti)-Mb, 항(anti)-HSA, 항(anti)-b₂-MG)이 각각 200 mg/ml의 최종농도로 버퍼에 첨가된다. 그러한 혼합용액은 30분 반응되고 마그네틱 분리기에 의해 분리되며, TT 버퍼(250 mM Tris-Cl, 0.1% Tween 20)로 세번 세척되고 TTL 버퍼 45 ml를 각 튜브에 첨가시킨다.Protein analysis by magnetic beads was based on the MCB 1200 Biomagnetic processing platform and subjected to centrifugation using a Micromax centrifuge (Thermo IEC, MA, USA). 2.5 ml of strepptavidin coated magnetic beads were dispensed into 1.5 ml tubes and 95 ml of TTL (100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% Tween and 1M LiCl) was added at 0.5 rpm for 1 minute. Separation is carried out by centrifugation at speed. Once clear supernatant is obtained, pipette it carefully. Washing was repeated three times, beads were dispensed in 21 ml TTL buffer and 4 ml biotinylated treated antibodies (anti-Mb, anti-HSA, anti- b ₂ -MG) is added to the buffer at a final concentration of 200 mg / ml each. Such a mixed solution is reacted for 30 minutes and separated by a magnetic separator, washed three times with TT buffer (250 mM Tris-Cl, 0.1% Tween 20) and 45 ml of TTL buffer is added to each tube.

실시예 5: 전기화학적 다중 면역분석법Example 5: Electrochemical Multiple Immunoassay

스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압(Square wave anodic strippingvoltammetric:SWASV)법에 따른 분석은 1.5ml glass cell에서 2x4mm 스크린 프린팅 카본 작업전극(screen-printed carbon (Acheson-ink) working electrodes)과 Ag/AgCl 기준(reference) 전극(CH Instruments, Austin, TX), 그리고 백금 전극을 카운터 전극으로 이용하였다.Analysis based on the square wave anodic stripping voltammetric (SWASV) method was performed using a 2x4 mm screen-printed carbon (Acheson-ink) working electrode and Ag / AgCl reference in 1.5 ml glass cells. Electrodes (CH Instruments, Austin, TX) and platinum electrodes were used as counter electrodes.

스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압법(SWASV)은 수은(Mercury)II 이온 또는 비스무스(Bismuth) 이온이 코팅된 스크린 프린팅 카본 페이스트 전극을 이용하여 수행되었다. QD 나노입자들을 질산수용액에 녹인후, 1분간 전처리(pretreatment) (0.6 V)하고, -1,4V에서 2분 축적(accumulation) 과정을 수행한다. 사용된 버퍼는 1ml의 0.1M 아세테이트(acetate) 버퍼(pH 4.5)이다. 스트리핑은 5초 휴지기(rest period (without stirring)) 후에 실행되어졌다. 구체적인 기기운용변수들은 -1.2 V ~ 0.12 V의 전위범위에서 스텝 전위(step potential) 50 mV, 전폭(amplitude) 20 mV 그리고 주파수(frequency) 25 Hz이다.    Square wave negative electrode stripping voltammetry (SWASV) was performed using a screen printing carbon paste electrode coated with Mercury II ions or Bismuth ions. After QD nanoparticles are dissolved in an aqueous solution of nitric acid, pretreatment (0.6 V) is performed for 1 minute, and a 2 minute accumulation process is performed at -1,4V. The buffer used is 1 ml 0.1 M acetate buffer (pH 4.5). Stripping was performed after a 5 second rest period (without stirring). Specific operating parameters are step potential 50 mV, amplitude 20 mV and frequency 25 Hz in the potential range of -1.2 V to 0.12 V.

센서성능에 대한 부정적 신호인 항체-항원간 교차반응(cross reaction)을 검 사하고자 비특이 항원으로서 헤모글로빈(Hb)과 보바인 혈청 알부민(bovine serum albumins:BSA)을 시료에 넣고 신호를 측정시, 거의 무시할 정도의 신호가 감지되었다. 이러한 신호는 항원이 존재하지 않는 시료에서의 노이즈 신호와 거의 흡사하였다( 5B). 따라서 비특이신호의 제거를 통해 본장치의 높은 민감도와 선택성이 실제 진단에 있어 큰 효율을 나타낼 수 있으며, 실제 시료가 탐지된 전위구간은 -1.11V(b₂ -MG), -0.67V(Mb), -0.45V(HSA)에서 안정적으로 나타났다(도5F). 도5는 동시분석된 3종 MS-QD 복합체에 기반한 면역스트리핑 전압피크와 전환된 관련 바코드 신호를 나타내고 있다. 도5A는 ZnS-β₂-MG, CdS-항(anti)-Mb, PbS-항(anti)-HSA와 중합된 QD들을 질산에 녹인 후 얻어진 피트를 나타낸다. 이것은 5㎕의 각 QD-항체가 20㎕ HNO₃이 용해된 용매에서 중합되고, 10 mg/mL Hg⁺² 를 가진 pH 4.5의 1mL 0.1M 아세테이트 버퍼(acetate buffer)로 전이된다. 도5B는 항원 비존재시 면역분석응답신호를 나타낸 것이고, 도5C 내지 도5F는 각각의 항원타겟(뇨단백질)에 의한 신호를 보여주고 있다. 그리고 도5F는 100 ng/mL농도레벨의 3종 항원(β₂-MG(Ag₁), Mb(Ag₂), and HSA(Ag₃))이 함유된 혼합시료에서의 신호들을 보여주고 있다. 전환된 바코드신호와 바코드 밑의 숫자는 항원의 위헙수준(0-5)의 레벨을 의미한다.To test the antibody-antigen cross reaction, which is a negative signal of sensor performance, hemoglobin (Hb) and bovine serum albumins (BSA) were put into the sample as non-specific antigen, and the signal was measured. An almost negligible signal was detected. This signal was almost similar to the noise signal in the sample without antigen (5B). Therefore, by removing the non-specific signal, the high sensitivity and selectivity of the device can show a great efficiency in the actual diagnosis, and the potential range in which the actual sample is detected is -1.11 V (b ₂ -MG) ), It was stable at -0.45V (HSA) (Fig. 5F). Figure 5 shows the immunostripping voltage peaks based on the three analyzed MS-QD complexes and the associated barcode signals converted. 5A shows the pits obtained after dissolving QDs polymerized with ZnS-β ₂ -MG, CdS-anti-Mb, PbS-anti-HSA in nitric acid. This 5 μl of each QD-antibody is polymerized in a solvent in which 20 μl HNO ₃ is dissolved and transferred to a 1 mL 0.1 M acetate buffer at pH 4.5 with 10 mg / mL Hg ⁺² . Figure 5B shows the immunoassay response signal in the absence of antigen, Figures 5C-5F show the signal by each antigen target (urine protein). 5F shows signals from a mixed sample containing _three antigens (β ₂ -MG (Ag ₁ ), Mb (Ag ₂ ), and HSA (Ag ₃ )) at a concentration of 100 ng / mL. The converted barcode signal and the number below the barcode represent the level of the antigen (0-5).

나노결정입자들은 TEM 전자현미경을 통해 그 크기와 모양이 산정되어 졌으며, 3.9, 4.5, 15.7 nm 가량의 CdS, ZnS, PbS 나노결정입자들에 대하여 각각 추정되어졌다. 최종 전압피크들의 크기 및 위치는 각 항원들의 농도와 일치하며, 이는 손쉬운 멀티-타겟 정량분석을 가능케한다. 즉, 신장 및 심혈관 질환의 농도 레벨의 증가는 도 6에 나타난 바와 같이 항원의 증가로써 예측가능하다(25-125 ng/ml). 도 6은 3 종 항원타겟물질의 25ng/mL 농도별 증가시 얻어진 음전극 스트리핑 신호를 나타낸다. 도 6의 a 내지 f는 0 내지 125 ng/mL이다. 피크의 전압구간의 평평한 베이스라인(baseline) (Cd 과 Zn 피크 사이구간, 또는 Pb 피크 이후의 구간)은 항원 6-8개까지 추가로 동시분석을 위한 확장이 가능함을 시사한다(도 6). 즉, 실제로 확장가능한 금속입자로서 Ga, Cu, As, Tl 또는 Bi 등이 이용될 수 있다. The size and shape of the nanocrystalline particles were estimated by TEM electron microscopy and estimated for CdS, ZnS, and PbS nanocrystal particles of 3.9, 4.5, and 15.7 nm, respectively. The magnitude and location of the final voltage peaks match the concentration of each antigen, which allows for easy multi-target quantitation. That is, an increase in the concentration level of kidney and cardiovascular disease is predictable (25-125 ng / ml) as the increase of antigen as shown in FIG. Figure 6 shows the negative electrode stripping signal obtained by increasing the 25ng / mL concentration of three kinds of antigen target material. 6 a to f are 0 to 125 ng / mL. The flat baseline of the voltage section of the peak (between the Cd and Zn peaks, or after the Pb peak) suggests that up to 6-8 antigens can be further extended for simultaneous analysis (FIG. 6). That is, Ga, Cu, As, Tl, or Bi may be used as the expandable metal particles.

더불어, 5번에 걸친 반복 테스트에 의해 센서의 안정성을 평가하였다. 100 ng/ml(level 4)의 농도로 서로 다른 3개의 항원을 포함한 시료에서 매우 높은 재현성을 나타내었다. Zn, Cd, 및 Pb는 각각 아래 표 2에서 보는 바와 같이 9.3 %, 7.1 %, 및 11.2 %의 표준편차 피크를 나타내었다In addition, the stability of the sensor was evaluated by five repeated tests. Very high reproducibility was observed in samples containing three different antigens at a concentration of 100 ng / ml (level 4). Zn, Cd, and Pb showed standard deviation peaks of 9.3%, 7.1%, and 11.2%, respectively, as shown in Table 2 below.

[표2: 복합단백질의 전기화학적 면역센싱]Table 2: Electrochemical Immune Sensing of Complex Proteins

분석 대상물  Analyte QD 포텔셜(V) QD Potential (V) 측정 한계() Measurement limit () R.S.D.(%) R.S.D. (%) β₂-MG(Ag1) β ₂ -MG (Ag1) -1.11 -1.11 10.6 10.6 9.3 9.3 Mb(Ag1)  Mb (Ag1) -0.67 -0.67 9.5 9.5 7.1 7.1 HSA(Ag1)  HSA (Ag1) -0.45 -0.45 9.8 9.8 11.2 11.2

전형적인 프로테인유리아(Proteinuria) 환자의 소변에서 검출되는 단백질 농도범위인 40-120 mg/l 가 진단에 있어 위험수위를 경고하는 범위라고 가정할 때, 본 센서의 초기 25 ng/ml 항원시료에 대한 신호대잡음비(signal-to-noise) 응답은 10.5 ng/ml의 측정한계(detection limit)을 나타내었다. 이는 환자의 위험수위의 범위에 비해 훨씬 더 낮은 구간에서도 아주 미세한 농도의 질병인자까지도 검출가능함을 의미한다. 이것은 도 6에서 보는 바와 같이 항원농도증가에 비례하는 신호에서도 알 수 있다. 또한, 그러한 낮은 탐지한계능은 예전의 문헌에서 발표된 광학면역센서의 결과들에 비교하여 향상된 민감도와 선택적 해상도를 나타낸다. 더욱 높은 민감도의 증폭을 위해서는 크기와 모양이 좀더 크게 조절된 이원메탈(bimetallic) 나노입자(예, CdS/ZnS core/shell 구조)가 미래의 좋은 후보물질로 대체될 수 있을 것이다.Assuming that the concentration range of 40-120 mg / l, the protein concentration detected in the urine of a typical Proteinuria patient, is a warning range for diagnostics, the signal band for the initial 25 ng / ml antigenic sample of the sensor The signal-to-noise response showed a detection limit of 10.5 ng / ml. This means that even a very low concentration of disease factors can be detected even at a much lower interval than the range of risk levels for the patient. This can be seen in the signal proportional to the antigen concentration increase as shown in FIG. In addition, such low detection limits show improved sensitivity and selective resolution compared to the results of optical immunosensors published in previous literature. For higher sensitivity amplification, bimetallic nanoparticles (e.g., CdS / ZnS core / shell structures) with more controlled sizes and shapes could be replaced with good candidates for the future.

실시예 6: 바코드, RFID, 유비쿼터스(Ubiquitous) 시스템을 위한 신호처리방법Example 6 Signal Processing Method for Barcode, RFID, and Ubiquitous System

획득된 아날로그신호는 디지털 신호처리에 의해 디지털화되고 의료진단 및 통신을 위해 바코드, RFID, 유비쿼터스(Ubiquitous) 시스템 방법이 적용된다. 멀티플랙스(Multiplex) 전기적 단백질 코딩은 면역분석의 멀티-리독스(redox) 코딩이 3가지 상이한QD 입자들에 대해 정밀하게 조절된 농도로써 수행되었다. 그러한 입자들의 전기적 튜닝력(electrical tenability)이 전기화학적 멀티플랙스법의 최적화에 기여되었다. 종래의 광학코딩법(참조문헌: Han, M., Gao, X., Su, J., Nie, S., 2001. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nature biotech 19, 631-635)의 원리와 유사성을 띄며, m 전위와 n 전류세기를 나타낼경우 (n^m-1)의 상이한 이론적 코드수를 얻을 수 있었다. 즉, 실 제 실험치의 경우, 6가지 전류레벨과 3가지 리독스 전위들로써 215가지의 전기적으로 튜닝된 선택적인 분석시료들의 바코드들을 구분해낼 수 있다. 분석물질 8가지를 6 전류레벨로 동시코딩할 경우, 최대 1679615 개까지의 디지털 코드를 얻을 수 있었다. The obtained analog signal is digitized by digital signal processing and barcode, RFID and ubiquitous system methods are applied for medical diagnosis and communication. Multiplex electrical protein coding was performed at concentrations where the multi-redox coding of the immunoassay was precisely controlled for three different QD particles. The electrical tenability of such particles contributed to the optimization of the electrochemical multiplex method. Conventional optical coding methods (Han, M., Gao, X., Su, J., Nie, S., 2001. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nature biotech 19, 631- Similar to the principle of 635), different theoretical codes of (n ^m -1) can be obtained by representing m potential and n current intensity. That is, in the case of the actual experimental value, the bar codes of 215 electrically tuned selective analytical samples can be distinguished by six current levels and three redox potentials. By simultaneously coding eight analytes at 6 current levels, up to 1679615 digital codes were obtained.

신속한 바코드 출력(readout)을 위한 디지털 신호처리는 획득된 직선(linear) 비례의 아날로그 코딩 신호(도 6)를 바코드화 시키기위해 디지털 프로그램으로 처리되었다(도 7). 전압법에 의한 분석물질의 전기적 신호들은 특이값의 대입을 통한 디지타이제이션(digitization)과정(도 7(a))과 노말리제이션(normalization)과정(도 7(b))을 거친다. 마침내, 뚜렷한 전압전류 그래프의 할당된 가변 지역이 바코드 되었다. 도 7의 (a)는 3종 항원의 디지타이즈된 전압신호를 보여주고, 도 7의 (b)는 노말라이즈된 전압신호를 나나탠고 있다. 도 7에서 a는 β₂-MG 이고 b는 Mb 이며, c는 HSA에 관한 것이다. 할당된 유연한 밴드폭은 물리적 리더에 의해 PC로 읽혀지고, 데이타 베이스는 환자의 실제 샘플을 확인한다. 게다가, DNA, RNA 및 세포 뿐만 아니라 각 단백질의 밴드폭은 휴대폰 기술에서 널게 사용되는 CDMA 기술을 사용하여 전체적으로 나뉘어 질 수 있다. Digital signal processing for fast barcode readout was processed with a digital program to barcode the analog coded signal of linear proportion (Figure 6) obtained (Figure 7). The electrical signals of the analyte by the voltage method go through a digitization process (Fig. 7 (a)) and a normalization process (Fig. 7 (b)) through substitution of singular values. Finally, the assigned variable regions of the distinct voltammograms were barcoded. Figure 7 (a) shows the digitized voltage signal of the three antigens, Figure 7 (b) shows the normalized voltage signal. In FIG. 7, a is β ₂ -MG, b is Mb, and c is related to HSA. The assigned flexible bandwidth is read into the PC by the physical reader, and the database identifies the actual sample of the patient. In addition, the bandwidth of each protein, as well as DNA, RNA and cells, can be globally divided using CDMA techniques widely used in cell phone technology.

본 발명은 생체물질의 고순도 무기 반도체 QD 표지입자들에 의한 산화/환원전위를 이용하여 멀티플랙스 전기화학분석법 및 의학용 디지털 신호처리 시스템을 제공하고자 하였다. 이러한 무기 나노결정체들은 광학분석분야인 의학적 영상이나 분자수준 나노이미징을 위한 효율적인 표지물질로서의 역할뿐만 아니라, 새로운 멀티-단백질 전기분석법으로의 도입으로써 기존에 개발되었던 여타 분석법에 비해 향상된 선택성 및 민감도를 보였다. 다양한 생물학적 정보를 인식가능한 특정 산화/환원도를 지닌 암호화된 QD-항체 중합체에 기초한 최종 전기화학적 분자레벨 서명(signature)들은 재현성이 매우 높은 바코드신호로 전환되어 각기 다른 종류의 항원들의 아이덴티티(identity)를 잘 반영해주었다. 여러 번에 걸친 분석시 흡착에 의한 비특이신호는 본실험에서는 무시할만큼 적게 나타났다. 현재 본연구진에 의해 연구개발중인 신호발생원 센싱성능의 대폭 향상을 목적으로 카본 나노튜브(carbon nanotubes), 덴드리머(dendrimer), 또는 폴리머(polymer) 비드 등의 증폭매개물질의 도입은 실제 센서연구의 응용면에서 매우 주목할만하다. 또한, 수은(mercury)-코팅전극이 가진 환경적 단점을 극복하기위한 비스무스(Bi) 코팅전극으로의 교체는 상업적 차원에서 매우 적절할 것이다. 본발명품은 전기화학적 단백질 동시측정시스템의 진보된 필수요소로서 hand-held, battery-powered, real-time, easy-to-use 등 소형진단시스템의 현실적 가용성을 평가시 요구되는 사항들에 모두 부합된다. 현재 본연구진에 의해 완료단계에 있는 96-well 또는 384-well 마이크로어레이 플레이트 기술에 본발명장치를 업그레이드시킴으로써, 산업적 대량화로의 스케일-업(scale-up)을 꾀하고 있으며, 이에, 향후 마이크로패브리케이션(microfabrication) 기술에 의한 정밀화와 소형화가 실현된다면 가장 이상적인 개인 진단키트의 현실화와 더불어 차세대 게노믹(genomic) 혹은 프로테오믹(proteomic) 스크리닝(screening) 기술에 커다란 혁신을 기할 수 있을 것이다. 덧붙여, 본장치의 핵심기술인 바코드 무선 원거리 통신을 통한 의학신호 전달체계는 무엇보다도 환자의 실시간 상태를 분자레벨에서 조기모니터링 및 정보화하는 측면에서 널리 파급효과를 끼칠 수 있으며, 민간에서도 환자의 질병에 대한 임상정보의 신속한 교류로써 기존의 병원진단시 요구되었던 많은 번거로움을 효과적으로 완화시킨다. 본발명품의 강력한 응용성 가운데, DNA, 단백질, 펩티드, 호르몬 수용체 등 다양한 생물분자 센서프로브들의 교체만을 통하여, 첫째, 분석물질로서 단백질뿐만 아니라 DNA 및 RNA 분자, 펩티드, 미생물 등의 다양한 의학/생물학적 탐침에 적합하다. 둘째, 공해물질, 수질검사 등 환경분야에의 도입이 기대되며, 셋째, 식료품의 질 평가 및 독성 검사 등의 식품산업, 넷째, 생물화학전, 군, 경 기관에서의 테러 및 범죄 감시와 조기경보시스템에도 널리 그 응용이 기대될 수 있다.An object of the present invention is to provide a multiplex electrochemical analysis method and a medical digital signal processing system using oxidation / reduction potential by high purity inorganic semiconductor QD labeled particles of a biomaterial. These inorganic nanocrystals not only serve as efficient markers for medical imaging and molecular-level nanoimaging, but also have improved selectivity and sensitivity compared to other assays developed by the introduction of new multi-protein electroanalyses. . Final electrochemical molecular level signatures based on encoded QD-antibody polymers with specific oxidation / reducibility for recognizing a variety of biological information are converted into highly reproducible barcode signals resulting in the identity of different types of antigens. Reflected well. In several analyzes, nonspecific signals by adsorption were negligible in this experiment. The introduction of amplification mediators such as carbon nanotubes, dendrimers, or polymer beads for the purpose of drastically improving the signal source sensing performance under development by the present researchers. Very noteworthy in terms of In addition, the replacement of bismuth (Bi) coated electrodes to overcome the environmental disadvantages of mercury-coated electrodes will be very suitable from a commercial point of view. The present invention is an advanced element of the electrochemical protein simultaneous measurement system, which meets all the requirements for evaluating the realistic availability of small diagnostic systems such as hand-held, battery-powered, real-time, and easy-to-use. . By upgrading the present invention to 96-well or 384-well microarray plate technology, which is currently being completed by the researchers, the company is trying to scale-up to industrial mass production. If precision and miniaturization by microfabrication technology is realized, it will be possible to innovate the next generation genomic or proteomic screening technology with the realization of the most ideal personal diagnostic kit. In addition, the medical signal transmission system through barcode wireless telecommunication, which is the core technology of the device, can have a widespread effect in terms of early monitoring and informatization of the patient's real-time status at the molecular level. The rapid exchange of clinical information effectively alleviates many of the hassles required for conventional hospital diagnosis. Among the powerful applications of the present invention, only by replacing various biomolecular sensor probes such as DNA, proteins, peptides and hormone receptors, firstly, various medical / biological probes such as DNA and RNA molecules, peptides and microorganisms as well as proteins as analytes Suitable for Second, it is expected to be introduced into the environmental field such as pollutants and water quality test. Third, food industry such as food quality evaluation and toxicity test. Fourth, terrorism and crime monitoring and early warning system in biochemical warfare, military and light institutions. Even its application can be expected widely.

Claims (9)

CdS, PbS 또는 ZnS와 같은 메탈설파이드(MS) 나노결정이 인산수용액(PBS) 상태에서 항체 또는 DNA와 결합되는 것을 주요특징으로 하는 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체.A water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex whose main feature is that metal sulfide (MS) nanocrystals such as CdS, PbS or ZnS are combined with antibodies or DNA in aqueous phosphate (PBS). 제1항에 있어서, 메탈설파이드(MS) 나노결정이 다이티올쓰레이톨(dithiolthreitol:DTT)에 의해 수산화(hydroxylated) 되고 카보닐 다이이미다졸(1,1-carbonyl diimidazole:CDI)로 활성화(activate) 되어, 항체 또는 DNA와 결합되는 것을 특징으로 하는 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체.The method of claim 1, wherein the metal sulfide (MS) nanocrystals are hydroxylated by dithiolthreitol (DTT) and activated with carbonyl diimidazole (CDI). Water soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complexes, characterized in that the binding to the antibody or DNA. 제2항에 있어서, 메탈설파이드(MS) 나노결정은 헥사데칸(hexadecanol)을 수산화칼슘(KOH) 및 카본 디설파이드(carbon disulfide:CS₂)와 혼합하여 헥사데실 싼테이트(Hexadecyl xanthate:HDX)를 합성하고, 상기 HDX를 MCl₂ 수용액에 반응시켜 메탈 헥사데실 싼데이트(M-HDX)를 합성된 후, 상기 M-HDX가 알킬아민도판트(alkyl amine dopants)와 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 하는 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체.The method of claim 2, wherein the metal sulfide (MS) nanocrystals are synthesized hexadecyl xanthate (HDX) by mixing hexadecanol with calcium hydroxide (KOH) and carbon disulfide (CS ₂ ) After reacting the HDX with MCl ₂ aqueous solution to synthesize metal hexadecyl succinate (M-HDX), the water-soluble metal is prepared by mixing the M-HDX with alkyl amine dopants. Sulphide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complexes. 헥사데칸올(hexadecanol)과 수산화 칼륨(KOH)이 혼합된 용액을 150℃의 온도 에서 가열하고, 카본 디설파이드(carbon disulfide:CS₂)를 첨가해 상온에서 교반하여 헥사데실 싼테이트(Hexadecyl xanthate:HDX)를 합성하는 단계;Hexadecyl xanthate (HDX) is heated at a temperature of 150 ° C, a solution of hexadecanol and potassium hydroxide (KOH) is mixed, and carbon disulfide (CS ₂ ) is added and stirred at room temperature. Synthesizing); 상기 HDX과 메탄올이 동일 몰의(equimolar) CdCl₂, PbCl₂ 또는 ZnCl₂ 수용액 각각에 2분간 반응하여 메탈 헥사데실 싼데이트(M-HDX)를 합성하는 단계; 및Wherein the HDX and methanol, equimolar (equimolar) CdCl _2, PbCl _2, or Reacting each of the aqueous ZnCl ₂ solutions for 2 minutes to synthesize metal hexadecyl date (M-HDX); And 상기 M-HDX를 전자 기여 모노써펙턴트(monosurfactant)인 헥사데실아민(decylamine:HDA), 데실아민(decylamine:DA) 또는 트리옥틸아민(trioctylamine:TOA)와 같은 알킬아민도판트(alkyl amine dopants)가 각각 120℃까지 가열된후 50℃까지 냉각된 교반액에 첨가하는 단계를 거치어 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정을 제조하는 방법.The M-HDX is an electron-contributing monosurfactant, such as hexadecylamine (decylamine (HDA), decylamine (DA) or trioctylamine (TOA) alkyl amine dopants (alkyl amine dopants) Heated to 120 ° C. and then added to a stirred solution cooled to 50 ° C. to prepare water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystals. 제4항의 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정이 다이티올쓰레이톨(dithiolthreitol:DTT)에 의해 수산화(hydroxylated) 되고 카보닐 다이이미다졸(1,1-carbonyl diimidazole:CDI)로 활성화(activate) 된후, pH 7.4인 인산수용액(PBS)에서 항체 또는 DNA와 결합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 메탈설파이드(MS) 퀀텀닷(QD) 나노결정 복합체의 제조방법.The water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystals of claim 4 are hydroxylated by dithiolthreitol (DTT) and activated with carbonyl diimidazole (CDI). After being activated, the method of producing a water-soluble metal sulfide (MS) quantum dot (QD) nanocrystal complex, further comprising the step of binding to the antibody or DNA in a pH 7.4 phosphate solution (PBS). 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete

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