KR100661930B1 - 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법 - Google Patents

미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100661930B1
KR100661930B1 KR1020040067196A KR20040067196A KR100661930B1 KR 100661930 B1 KR100661930 B1 KR 100661930B1 KR 1020040067196 A KR1020040067196 A KR 1020040067196A KR 20040067196 A KR20040067196 A KR 20040067196A KR 100661930 B1 KR100661930 B1 KR 100661930B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chip
microfluidic channel
reaction
enzyme
enzyme activity
Prior art date
Application number
KR1020040067196A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060018698A (ko
Inventor
박제균
강주헌
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020040067196A priority Critical patent/KR100661930B1/ko
Publication of KR20060018698A publication Critical patent/KR20060018698A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100661930B1 publication Critical patent/KR100661930B1/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0874—Three dimensional network
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 미세 유체 채널 기술을 이용한 효소 활성도 분석용 칩에 관한 것으로서, 구체적으로는 측정시료 분배용 미세 유체 채널 부위(1), 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 및 시료와 시약의 반응 및 측정이 수행되는 반응 챔버 부위(2)로 구성된 모듈을 포함하는 효소 활성도 분석용 칩에 관한 것이다. 본 발명의 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩은 서로 다른 기질 농도에서 효소-기질 반응이 가능하고, 상기 반응 결과를 ELISA로 측정함으로써, 효소 키네틱스 분석을 간단하게 수행할 수 있어, 효소 활성의 분석을 이용한 생화학 실험이나 질병의 예측에 유용하게 이용될 수 있다.
효소 활성도 분석, 미세 유체 채널, 칩

Description

미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를 이용한 효소 활성도 측정 방법{Plastic chip for enzyme assay in microfluidic channels and methods for enzyme activity measurement using thereof}
도 1은 본 발명의 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 구성하는 하나의 효소 활성도 분석 모듈의 평면도이고,
도 2는 상기 효소 활성도 분석용 칩을 구성하는 하나의 효소 활성도 분석 모듈의 사시도이고,
도 3은 상기 효소 활성도 분석용 칩의 전체 구성도이고,
도 4는 상기 효소 활성도 분석용 칩의 측면도이고,
도 5는 상기 효소 활성도 분석용 칩의 여섯 개의 반응 챔버에서 서로 다른 농도의 기질 용액의 생성의 농도 예측과 실제 실험 결과를 비교한 그래프이고,
도 6은 효소 키네틱스에 의한 Vmax값을 통해 효소 활성도 값(unit/L)을 예측할 수 있는 전환 그래프이다.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*
(1) : 효소 시료의 주입구 및 반응 챔버까지 같은 시간 동안 같은 양의 효소 시료를 전달하기 위한 미세 유체 채널.
(2) : 서로 다른 여섯 개의 농도를 갖는 기질 용액과 효소 시료가 동시에 혼합되어 효소-기질 반응이 일어나고 측정되는 반응 챔버.
(3) : 기질 용액의 주입구와 서로 다른 농도를 생성하기 위한 미세 유체 채널 네트워크 부분.
(4) : 고농도와 저농도의 기질 용액이 주입되는 두개의 주입구.
(5) : 고농도의 기질 용액이 주입되는 주입구.
(6) : 저농도의 기질 용액이 주입되는 주입구.
(7) : 효소 시료가 주입되는 주입구.
(10) : 효소 시료의 주입시 각 반응 챔버에 도달하는 양과 시간을 같게 조절하기 위한 챔버.
(11)∼(16) : 식(1)의 ⅰ값으로 순차적으로 0부터 5까지의 값을 갖는, 기질 용액과 효소 시료가 혼합되어 효소-기질 반응이 일어나고 측정되는 반응 챔버.
(41) : 측면도에서 효소 시료가 주입되는 주입구와 시료가 전달되는 전달 경로의 단면도.
(42) : 측면도에서 기질 용액이 주입되는 주입구와 용액이 전달되는 전달 경로의 단면도.
(43) : 효소 시료를 반응 챔버로 전달하기 위한 미세 유체 채널 패턴이 존재하는 세 개로 적층된 칩의 기판 중 상층.
(44) : 기질 용액을 반응 챔버로 전달하고 다단계 농도 희석을 하기 위한 미세 채널 패턴이 존재하는 세 개로 적층된 칩의 기판 중 중간층.
(45) : 미세 유체 채널의 바닥 면을 이루는 세 개로 적층된 칩의 기판 중 하층.
본 발명은 미세 유체 채널 기술을 이용한 효소 활성도 분석용 칩에 관한 것으로서, 구체적으로는 측정시료 분배용 미세 유체 채널 부위(1), 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 및 시료와 시약의 반응 및 측정이 수행되는 반응 챔버 부위(2)로 구성된 모듈을 포함하는 효소 활성도 분석용 칩에 관한 것이다.
인간 유전체 프로젝트(human genome project)가 완료되고 포스트게놈(pos t genome) 시대가 도래함에 따라 쏟아져 나오는 많은 양의 바이오 정보는 기존의 실험실 분석 시스템으로는 그 신속한 처리가 어려운 실정이다. 이러한 추세에 따라 생명현상의 규명과 신약 개발 및 진단을 위한 생물학적 검출시스템은 보다 적은 양으로 빠른 시간에 정확하고 편리하게 시료를 분석하기 위한 미세 종합 분석시스템(micro-total analysis systems)과 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 형태로 발전하고 있다. 랩온어칩(lab-on-a-chip)은 '하나의 칩 위에 실험실을 올려놓았다'는 뜻으로 '칩 속의 실험실' 또는 '칩 위의 실험실'로 통한다. 이는 보통 플라스틱, 유리 등의 소재를 이용하여 시료가 이동할 수 있는 나노(10 억분의 1) 리터 이하의 미세 채널을 만들고, 이를 통해 수 나노 리터에 불과한 적은 양의 액체시료(대부분의 생화학적 시료가 용액 상태로 존재하므로)를 이동시켜 기존의 실험이나 연구 과정을 신속하게 수행할 수 있도록 한 것이다.
랩온어칩을 구현하는 방법에 대한 연구는 오래전부터 시작되어 발전하고 있다. 생화학적 시료를 분석하기 위해서는 대부분의 생화학적 시료가 용액 상태로 존재하므로 액체 시료를 전달하는 기술은 그 무엇보다도 중요한 요소라 할 수 있는데, 이러한 미세 유체의 흐름을 조절하는 연구 분야를 미세유체역학(microfluidics)이라고 한다.
지금까지 미세 유체 제어 기술은 여러 가지 방법으로 접근되어 왔는데, 그 방법 중에는 전기적으로 적은 양의 액체 시료를 이동시키는 전기삼투유체흐름(electroosmotic flow)과 박막 펌프(membrane pump), 시린지 펌프(syringe pump) 등이 있다.
전기삼투유체흐름(electroosmoric flow)을 이용한 방법은 액체 시료와 버퍼 용액이 채워진 미세 유체 채널 양단에 전압을 걸어 모세관 전기 삼투현상에 의해 용액의 흐름을 유도하기 때문에 펌프나 밸브 없이 미량의 시료흐름을 제어할 수 있다는 장점이 있으나 전기장을 이용한 액체 시료 전달 방법은 전기장을 이용하여 유체의 흐름을 유도하기 때문에 미세 유체 채널이 하나 이상 복잡하게 구현된 칩 설계에는 한계가 있고, 유체의 흐름이 자체의 pH와 이온세기(ionic strength) 및 점 성 등에 영향을 받으므로 여러 가지 시료에 보편적으로 적용하기 어렵다는 단점이 있다.
한편 박막 펌프(membrane pump) 등 온칩(on-chip) 형 펌프를 이용한 액체 시료 전달 방법은 궁극적인 랩온어칩 기술에 반드시 필요한 요소 기술이지만 제조 방법이 복잡하며 대량 생산에 한계가 있고, 유체 조절에 대한 신뢰성이 기존의 펌프에 비해 떨어지기 때문에 현재의 랩온어칩 개발 단계에서 유체 전달 방법으로 사용하기에는 무리가 있다(William L. Benard, et al., Journal of Microelectromechanical Systems, 7(2); 245-251, 1998)
시린지 펌프는 주사기(syringe)에 시료를 넣고 모터를 이용해 뒤에서 주사기를 밀어주어서 시료를 적당한 유속으로 흘려주는 장치를 말한다. 주사기와 마이크로 칩을 연결해주는 것은 테플론(teflon) 혹은 실리콘(silicone) 튜브(tube)로서 그 사용 용도에 따라 외경 및 내경이 다르다. 유체 제어 기술 중 시린지 펌프에 의한 기술은 가장 넓은 범위의 유속을 제어할 수 있고 상대적으로 높은 신뢰도를 갖고 있다는 장점을 갖고 있다.
또한, 효소 키네틱스(kinetics) 분석 방법을 적용하기 위해서는 실험자가 서로 다른 농도를 지닌 기질용액을 따로따로 준비해서 칩으로 주입해야 하므로 측정에 따른 오차가 발생하고 실시 과정이 번거롭다는 문제가 있다(Robert Scopes, Protein Purification; Principles and Practice, Springer-Verlag, 1982). 본 발명에서는 기존의 실험자에 의해 수행되어진 일련의 생화학 실험 준비과정을 미세유 체 채널 내에서의 반응으로 대체하여 높은 재현성과 단축된 시간, 그리고 편리한 분석 방법으로 제공한다.
한편, 랩온어칩 개발에 있어서 칩 설계와 함께 고려되어야 할 부분이 반응이 일어난 칩의 결과를 분석하는 측정 시스템(detection system)이다.
Caliper, Tecan, Gyros 등의 관련 기업들이 개발한 칩의 경우는 랩온어칩의 표준화가 이루어지지 않았기 때문에 대부분 자사에서 개발된 칩 설계에 따른 측정 시스템을 별도로 구축해야 하는 한계점이 있다. 또한, 랩온어칩 측정의 경우 고가의 광학측정시스템을 요구하기 때문에 랩온어칩의 보급 및 활용에 제한이 되고 있는 실정이다. 최근 Nanostream 등에서는 기존 측정 시스템과 호환될 수 있는 마이크로플루이딕 소자(microfluidic device)를 개발 중이다(Ken Rubenstein, "Microfluidics Second Generation Technologies Driving Commercial Applications", D&MD report, 2003).
따라서, 상기 효소 키네틱스 분석방법에, 상기한 랩온어칩을 접목시키면 빠르고 정확한 효소 활성도 분석이 가능할 것으로 판단하여, 본 발명자들은 측정시료 분배용 미세 유체 채널 부위(1), 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 및 시료와 시약의 반응 및 측정이 수행되는 반응 챔버 부위(2)로 구성된 모듈을 포함하여 서로 다른 농도의 기질 용액을 간편하게 형성시켜 효소와 반응시킬 수 있는 효소 활성도 분석용 칩을 개발하고, 기존의 표준화된 측정시스템인 ELISA로 그 반응 결과를 측정함으로써, 효소 활성도 분석을 신속하고 간편하게 수행할 수 있음을 확인 하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생화학 실험에 필요한 효소 활성도 분석을 용이하게 실시하기 위하여, 기존의 측정시스템으로 반응 측정이 가능한, 미세 유체 채널이 집적화된 칩을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 사용하여 효소 활성도를 측정하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 사용하여 효소 활성도를 측정함으로써 질병을 예측할 수 있는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 제공한다.
본 발명의 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩은 측정시료 분배 용 미세 유체 채널 부위(1), 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 및 시료와 시약의 반응 및 측정이 수행되는 반응 챔버 부위(2)로 구성된 모듈을 포함한다.
본 발명의 칩의 측정시료 분배용 미세 유체 채널 부위(1)는 시료 주입구(7)와 주입된 시료를 복수의 반응 챔버(reaction chamber)로 동량씩 분배시키는 미세 유체 채널로 구성되며,
반응 시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3)는 분석에 필요한 반응 시약 용액의 주입구(5, 6)와 분석에 필요한 서로 다른 시약 농도를 반응 챔버에 형성시키기 위한 다단계의 미세 유체 채널 네트워크로 구성된다.
또한, 시료와 시약의 반응 및 측정이 수행되는 반응 챔버 부위(2)는 시료와 희석된 기질 간의 반응이 일어나고 그 반응이 측정되는 부위로서, 기존의 표준화된 웰-플레이트의 웰 위치와 동일하게 정렬되어 있다(도 1 및 도 2).
상기 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩은 여러 시료를 측정할 수 있는 복수의 분석 모듈로 이루어질 수 있으며(도 3), 전체 크기가 기존 웰 플레이트와 동일한 규격을 갖도록 4 개의 효소 활성도 분석용 모듈로 구성되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩은 미세 유체 전달을 위하여, 하층(45), 중간층(44), 상층(43)의 레이어(layer)로 적층된 구조를 갖는다(도 4). 하층(45)은, 미세 유체 채널 패턴이 없는 평면 플라스틱 층으로 이루어져 있고 중간층(44)의 아랫면은 기질 용액이 서로 다른 농도를 갖게 하기 위한 미세 유체 채널 패턴을 가지며 가장 상층(43)의 아랫면에는 효소 용액의 주입을 위 한 미세 유체 채널 패턴 구조를 갖는다.
효소 용액 샘플 주입구(41)와 시료 분배용 미세유체 채널 부위(1)는 같은 시간에 동량의 효소 시료를 각 반응 챔버(2)에 전달하기 위하여 설계 및 제작된 미세 유체 채널 부분이다. 또한, 기질 용액 전달 부분은 고농도와 저농도의 기질 용액 주입구(42)와 여섯 개의 다른 농도의 기질 용액을 얻어내기 위한 다단계의 미세 유체 채널로 이루어진 희석용 미세 유체 채널 부위(3)로 구성된다. 효소-기질 반응이 일어나고 측정되는 반응 챔버(2)부분은 상층이 외부와 열려 있는 형태를 갖는다.
다단계 미세 유체 채널로 이루어진 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3)의 기질 용액 주입구는 두개의 주입구로 구성된다. 한쪽(5)은 고농도의 기질 용액을, 다른 한쪽(6)은 저농도의 기질 용액을 주입한다. 기질 용액 전달을 위한 다단계의 미세 유체 채널로 이루어진 희석용 미세 유체 채널 부위(3)를 통과한 기질 용액은 최종적으로 여섯 개의 반응 챔버 (11)-(16)에 효소-기질 반응을 위해 저장되게 된다. 효소 활성도 분석을 위해 주입되는 효소 샘플 시료는 효소 샘플 주입구(7)를 통해 주입되며 반응 챔버 (11)-(16)에서 효소-기질 반응을 일으켜 ELISA 측정기에 의해 광학적으로 측정된다. 여기서 챔버 (10)은 시료의 동일 분배를 위한 조절부이다. 이때 여섯 개의 반응 챔버에 모이는 기질 용액의 농도를 알고 있어야 미켈리스-멘튼 (Michaelis-Menten) 관계식을 통한 효소 활성도 분석이 가능하다. 기질 용액 주입구 (5), (6)에 주입되는 기질 용액의 농도를 C1과 C2라고 가정 했을 때 각 반응 챔버 (11)-(16)에서의 농도는 다음 식에 의해 결정된다.
Figure 112004038181997-pat00001
식(1)
여기서 N은 기질 용액 주입구 (5), (6)에서부터 반응 챔버(2) 부위까지 미세 유체 채널의 단수를 나타내고 정수를 가진다. 본 발명에 의한 칩 모델은 반응 챔버(2)의 기질 용액을 여섯 개로 정하는데 필요한 미세 유체 채널의 단수가 5 이므로 N값은 5를 갖는다. i 는 기질 용액 전달을 위한 다단계의 미세 유체 채널로 이루어진 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 부분의 가장 왼쪽 챔버를 0 값으로 시작해서 오른쪽으로 갈수록 1씩 증가하는 값을 갖는 변수이다.
본 발명에 의한 칩 설계에서는 반응 챔버 (11) 은 0값을 갖고 반응 챔버 (12)는 1, (13)은 2, 이런 식으로 하여 반응 챔버 (16)은 5 값을 갖는다. 이와 같이 각 반응 챔버에서 기질 용액의 농도를 얻어내기 위해 식(1)에서 필요한 변수를 모두 정의하고 대입한다. 이와 같이 관계식으로 예측된 값과 실제 실험값을 비교해 봄으로써 기질 용액의 다른 농도 구현을 위한 미세 유체 채널 시스템의 신뢰도를 확인해 볼 수 있다. 도 5는 위에서 언급한 예측된 농도와 실제 실험적으로 측정된 값을 비교한 그래프이다.
상기의 반응 시약 희석용 미세 유체 채널 부위에서 생성되는 서로 다른 농도의 기질 용액의 개수는 기질 용액 주입구로부터 반응 챔버까지 미세 유체 채널 네트워크의 단수(N)에 의해 N+1 로 결정되는데 상기 칩의 단수와 반응 챔버의 수는 필요에 따라 변경될 수 있다.
본 발명의 칩을 제조하는 물질로는 폴리다이메틸실로산(polydimethylsiloxane), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭 올레핀 (polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리우레탄(polyurethanes) 등의 다양한 고분자 재질이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 사용하여 효소 활성도를 측정하는 방법을 제공한다.
기존의 생화학 실험에서 수행되어온 효소활성도 측정방법에는 정지법(stop method)과 효소 키네틱스(enzyme kinetics) 분석 방법이 있다.
그 중 정지법은 주어진 시간 동안 효소가 기질을 이용하여 최종 생산물로 전환시킨 양을 측정하여 효소 활성도를 알아보는 방법으로, 실험 과정과 데이터 처리 과정이 간단하다는 장점이 있지만 효소-기질 반응이 일어나는 시간이 길고 반응 전 효소 시료 자체가 갖고 있는 색으로 인해 반응 전 흡광도 값이 최종 생산물의 흡광도 값에 포함되므로 보정 과정을 거쳐야 하는 번거로움과 분석에 많은 양의 시약이 필요하여 비용 측면에서도 불리한 점이 있다.
반면에 효소 키네틱스(enzyme kinetics) 분석방법은 분석 과정이 복잡하지만 초기 반응 속도를 측정하기 때문에 시간이 적게 걸리고 흡광도 보정 과정이 필요 없다는 장점이 있다. 그러나 상기 효소 키네틱스 방법을 이용하는 경우에도 서로 다른 농도를 갖는 기질 용액에서 효소 반응의 초기 반응 속도(Vo)를 측정해야 하고 이를 위해 최소 다섯 내지 여섯 개의 서로 다른 농도를 갖는 기질 용액 샘플을 실험자가 직접 준비해야 하는 번거로움이 있고, 이 과정에서 실험자의 숙련도에 따라 발생하는 오차는 최종적인 효소 활성도 분석 결과에 영향을 줄 수 있는 문제가 있다.
따라서, 본 발명의 효소 활성도 칩을 이용하면 상기한 효소 키네틱스 분석방법의 문제점을 해결할 수 있어 보다 간편하고 신속하게 효소 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명의 효소 활성도 분석용 칩을 이용하여 효소 활성도를 측정하기 위하여, 효소 용액을 측정시료 분배용 미세 유체 채널 부위의 주입구(7)에 주입하고 기질 용액을 다단계의 미세 유체 채널로 이루어진 반응 시약 희석용 미세 유체 채널 부위의 주입구(5, 6)에 주입하여 반응 챔버(2)에서 효소-기질 반응이 일어나도록 하였다. 반응과 동시에 ELISA로 측정한 흡광도 값을 이용하여 초기 반응 속도 Vo를 구하고 한스-울프식으로 Vmax를 구한 다음 Vmax에 대한 활성도 그래프(도 6)를 그려 미지의 효소 용액의 활성도를 알아내었다. 이 예측값을 기존의 정지법으로 알아낸 실험값과 비교한 결과, 10.5% 이내의 작은 오차값을 나타내었으므로 본 발명의 칩을 이용한 효소 활성도 분석방법의 유용성을 확인할 수 있었다.
아울러, 본 발명은 상기 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 사용하여 효소 활성도를 측정함으로써 질병을 예측할 수 있는 방법을 제공한다.
알칼리성 탈인산화 효소(alkaline phosphatase)는 간, 담관, 장관, 뼈, 신장, 태반, 백혈구 등에 존재하는 효소로서 각 장기마다 조금씩 다른 동종 효소(isoenzyme)를 만들어 내는데, 이들 장기 등에 질환이 있는 경우 혈액 내 상기 효소의 농도 증가가 관찰된다. 따라서, 이 경우 상기 효소의 동종 효소를 분석하여 어느 장기로부터 만들어지는 알칼리성 탈인산화 효소의 양이 증가되었는지를 파악하고 해당 장기에 대한 검사를 실시한다.
본 발명의 실시예에서는 상기 효소 활성도 분석용 칩을 이용하여 암환자의 혈액으로부터 상기 효소의 활성이 유의하게 증가됨을 관찰하고, 상기 칩이 암과 같은 질병의 예측에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서는 플라스틱 칩 상에서 서로 다른 기질 농도를 구현해 냄으로써 실험자가 직접 다른 농도의 시료를 준비하는 일련의 과정을 줄이고 그 과정에서 발생될 수 있는 오차를 줄일 수 있게 하였다. 효소 활성도 분석방법으로는 카이네틱스(kinetics) 방법으로 수행하여 전체 분석 시간을 줄일 수 있도록 하였고, 효소-기질 반응을 6개의 측정 웰(well)에서 동시에 측정토록 함으로써 측정 시작점(starting point)을 동일하게 하여 측정 결과의 신뢰도를 높일 수 있도록 구상하였다. 또한 본 발명에서는 플라스틱 칩의 크기를 웰플레이트(well plate)와 같도록 표준화시키고, 효소 반응이 일어나는 플라스틱 칩 내에 반응챔버의 위치를 기존 검 출시스템에 맞도록 배열시킨 특징이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩의 제작
본 발명의 효소 활성도 분석용 칩은 도 1에 나타난 바와 같이 4개의 효소 활성도 분석용 모듈(module)로 구성되어 있고, 각 모듈은 효소 샘플 주입부(1), 다단계의 미세 유체 채널로 이루어진 기질 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 및 효소 시료와 희석된 기질 간의 반응이 동시에 일어나고 측정되는 반응 챔버 부위(2)로 이루어졌으며, 세 개의 층이 적층된 구조를 갖는다.
본 발명의 칩은 투명하고 탄성을 갖는 폴리다이메틸실로산(polydimethylsiloxane, 이하 “PDMS”라 칭함) 재질을 이용하여 몰딩(molding) 방법으로 제작하였다. 몰딩(molding)을 위한 주형(master)은 실리콘 웨이퍼(silicon wafer) 기판(substrate)위에 SU-8을 감광물질(photoresist)로 이용하여 폭 100㎛, 높이 50㎛인 마이크로 패턴을 제작하는 방법을 이용하였다. 상기 주형에 경화제와 10:1의 비율로 섞은 pre-PDMS를 붓고 80℃에서 2 시간 동안 경화시켰다. 상기 경화 단계를 거친 PDMS 기판에 구멍을 내어 기질과 효소 시료 주입구와 각 반응챔버를 제작하고, 각 PDMS 기판을 공기 플라즈마(air plasma)를 이용해 산화시켜 적층 함으로써 세 층으로 구성된 효소 활성도 분석용 칩을 완성하였다.
< 실시예 2> 미세 유체 채널을 이용한 칩을 사용한 효소 활성도 분석
상기 <실시예 1> 에서 제작한 효소 활성도 분석용 칩을 이용하여 알카리성 탈인산화 효소(alkaline phosphatase)의 효소 활성도를 하기의 방법으로 분석하였다.
기질 희석용 미세 유체 채널 부위의 주입구(5)와 (6)에 각각 기질 용액 C1(3.0 mM p-nitrophenyl phosphate)과 C2(56.8 mM의 p-nitrophenyl phosphate) 용액을 주입하였다. 상기 식(1)에서 N은 기질 용액 주입구로부터 반응 챔버까지 미세 유체 채널 네트워크의 단수이므로 각 반응 챔버에 저장되는 기질 용액의 농도 [S]는, 챔버 (11)은 3.00 mM(i=0), 챔버 (12)는 14.76 mM(i=1), (13)은 24.52 mM(i=2), (14)는 35.28 mM(i=3), (15)는 46.04 mM(i=4) 그리고 (16)은 56.80 mM(i=5) 이 된다.
Figure 112004038181997-pat00002
식(1)
시료 분배용 미세 유체 채널 부위의 시료 주입구(7) 부분으로 효소 시료 용액을 주입하여 반응 챔버에서 효소-기질 반응이 일어나게 하고, 그와 동시에 ELISA 측정기에서 405.0 nm의 파장대에서 시간에 따른 흡광도의 값을 측정하여 초기 반응 1 분 동안의 반응 속도(Vo)를 구하여 미켈리스-멘튼 관계식에 의해 Vmax를 구하였다. 미켈리스-멘튼 관계식은 다음과 같다.
Figure 112004038181997-pat00003
식(2)
이때, 선형 함수가 아닌 미켈리스-멘튼 관계식에서 바로 Vmax값을 구하는 것은 큰 오차값을 발생하게 하는 문제가 있으므로, 보다 작은 오차 범위의 Vmax를 얻어내기 위해 미켈리스-멘튼 관계식의 변형식(라인위버-버크(Lineweaver-Burk)식, 이디-호프스티(Edie-Hofstee)식 및 한스-울프(Hans-Woolf)식)을 이용할 수 있다. 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 가장 안전한 변형식으로 보고된 한스-울프식(식 (3))에 의하여 실험으로 얻어진 기질 농도 값([S])과 초기 반응속도(Vo)값을 대입하여 그 기울기의 역수를 취함으로써 Vmax값을 구하였다.
Figure 112004038181997-pat00004
Figure 112004038181997-pat00005
식(3)
한편, 기존의 정지법을 이용하여 각 효소 샘플의 활성도(activity, unit/L) 값을 구하고 본 발명의 칩을 이용한 효소 키네틱스 분석을 수행하여 Vmax(㎛ol/min)값을 구한 후, 각 활성도(unit/L)에 대한 Vmax(㎛ol/min) 값을 그래프로 나타내어 효소 활성도와 Vmax 간 전환 그래프(conversion plot)를 얻었다(도 5). 미지의 농도를 갖는 알칼리성 탈인산화 효소 시료를 칩 상에서 반응시켜 효소 키네틱스 분석법으로 Vmax를 구하면 최종적으로 전환 그래프를 통해 얻고자 했던 미지의 효소 활성도 값(unit/L)을 알아낼 수 있고, 이때 오차는 10.5% 이내였다.
< 실시예 3> 미세 유체 채널을 이용한 칩을 사용한 질병 예측
본 발명의 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 이용하여 혈액 내에 존재하는 알칼리성 탈인산화 효소(alkaline phosphatase)의 활성도를 측정하고 상기 효소의 활성도가 인체의 여러 질병과 관련되어 있다는 것을 근거로 질병 예측에 적용하였다.
본 발명의 칩을 이용한 효소 활성도 분석의 과정은 < 실시예 2> 에서 설명한 바와 같고, 다만 효소 샘플이 생화학 실험용 알칼리성 탈인산화 효소가 아닌 혈액의 혈청(serum)이라는 것에 차이가 있다.
구체적으로, 신장세포 암종, 흑색종 그리고 기타 암종 환자의 혈액으로부터 알칼리성 탈인산화 효소 활성(mUnit/mL)을 측정하여 질병의 예측에 적용하고자 하였다. 그 결과, 신장세포 암종, 흑색종 그리고 기타 암종 환자의 혈청내에서의 알칼리성 탈인산화 효소 활성(mUnit/mL)도 값은 각각 9.84 ± 5.44(최소값 2.13- 최대값 22.62; n=7); 5.15 ± 2.38(최소값 1.62- 최대값 8.12; n=5) 그리고 3.52 ± 1.41 (최소값 1.62- 최대값 6.75; n=6) 이었다.
정상인의 혈액 내 알칼리성 탈인산화 효소의 활성도가 0-1.0 mUnit/mL의 범위에 있음을 감안할 때 암환자의 혈액내 알칼리성 탈인산화 효소 활성도가 유의하게 증가되었음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 효소 활성도 분석용 칩을 사용하여 알칼리성 탈인산화 효소의 활성도 증가 유무를 측정함으로써 암과 같은 질병을 예측할 수 있다.
본 발명은 미세 유체 채널 기술을 이용한 효소 활성도 분석용 칩에 관한 것으로서, 본 발명의 칩은 기존의 96-웰 마이크로플레이트 등의 경우와 같이 표준화되어 사용되어온 측정 시스템과 호환될 수 있는 규격을 채용함으로써 별도의 광학 측정 장비 없이도 사용가능 하며, 384 웰, 1536 웰 플레이트 측정 장비에 맞도록 하나의 칩에 포함되는 분석 모듈의 수를 증가시킬 수 있는 확장성이 있다. 이러한 칩을 이용한 바이오 분석 기술은 효소 반응 검출뿐만 아니라, 예측용 단백질 칩, 면역분석용 칩, ELISA용 분석 칩 등의 다양한 응용 분야에 이용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 측정시료 분배용 미세 유체 채널 부위(1), 서로 다른 반응 시약 농도를 반응 챔버에 형성시키는 다단계 미세 유체 채널로 구성되는 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3) 및 시료와 시약의 반응 및 측정이 수행되는 반응 챔버(reaction chamber) 부위(2)로 구성된 모듈을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 칩의 상기 측정 시료 분배용 미세 유체 채널 부위(1)는 시료(sample) 주입구(7)와 주입된 미지의 시료를 복수의 반응 챔버로 동일한 양을 분배시키는 미세 유체 채널로 구성되는 것을 특징으로 하는 칩.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 칩의 반응 시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3)는 반응 시약 용액 주입구(5, 6)와 서로 다른 반응 시약 농도를 반응 챔버에 형성시키는 다단계 미세 유체 채널로 구성되는 것을 특징으로 하는 칩.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 칩의 반응 챔버 부위(2)는 기존의 표준화된 웰-플레이트(well-plate)의 웰(well) 위치와 동일하게 정렬되도록 구성된 것을 특징으로 하는 칩.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 칩의 모듈은 각기 여러 개의 시료를 측정할 수 있는 복수 개의 분석 모듈인 것을 특징으로 하는 칩.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 칩은 하층, 중간층, 상층의 레이어로 적층된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 칩.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 칩의 레이어는 미세 유체 전달을 위한 미세 유체 채널 패턴 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 칩.
  9. 제 4항에 있어서, 상기의 반응시약 희석용 미세 유체 채널 부위(3)에서 생성되는 서로 다른 기질 용액의 농도 개수는 기질 용액 주입구로부터 반응 챔버까지 미세 유체 채널 네트워크의 단수(N)에 의해 N+1로 결정되는 것을 특징으로 하는 칩.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 칩의 재질은 폴리다이메틸실로산(polydimethylsiloxane), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭 올레핀 (polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 칩.
  11. 제 1항의 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩을 이용한 효소 활성도 측정 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 효소 활성도 측정방법의 측정시스템은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)인 것을 특징으로 하는 효소 활성도 측정방법.
  13. 삭제
KR1020040067196A 2004-08-25 2004-08-25 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법 KR100661930B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040067196A KR100661930B1 (ko) 2004-08-25 2004-08-25 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040067196A KR100661930B1 (ko) 2004-08-25 2004-08-25 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060018698A KR20060018698A (ko) 2006-03-02
KR100661930B1 true KR100661930B1 (ko) 2006-12-28

Family

ID=37126282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040067196A KR100661930B1 (ko) 2004-08-25 2004-08-25 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100661930B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007139243A1 (en) * 2006-05-30 2007-12-06 Ewha University-Industry Collaboration Foundation Methods and kits for in situ measurement of enzyme activity and amount using single measurement system
KR100915900B1 (ko) * 2008-03-07 2009-09-07 한국과학기술연구원 미세 채널을 이용한 선형 희석 장치 및 방법
CN114279952B (zh) * 2020-09-27 2024-03-12 瑞辰星生物技术（广州）有限公司 用于造纸***控制有机污染物沉积的生物酶酶活力的测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20060018698A (ko) 2006-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nge et al. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications
US6582662B1 (en) Devices and methods for the performance of miniaturized homogeneous assays
US7476361B2 (en) Microfluidics devices and methods of diluting samples and reagents
US8940147B1 (en) Microfluidic hubs, systems, and methods for interface fluidic modules
US9086371B2 (en) Fluidics devices
US6251343B1 (en) Microfluidic devices and systems incorporating cover layers
EP0865606B1 (en) Devices and methods for using centripetal acceleration to drive fluid movement in a microfluidics system with on-board informatics
JP4141494B2 (ja) マイクロ分析測定装置及びそれを用いたマイクロ分析測定方法
US20020151078A1 (en) Microfluidics devices and methods for high throughput screening
EP1284819A2 (en) Microfluidics devices and methods for high throughput screening
KR20090056980A (ko) 평면 기판에 유체 셀을 부착하기 위한 방법 및 장치
Jambovane et al. Determination of kinetic parameters, K m and k cat, with a single experiment on a chip
Ashiba et al. Microfluidic chips for forward blood typing performed with a multichannel waveguide-mode sensor
JP5376427B2 (ja) 分析用デバイス
Waldbaur et al. Microfluidics on liquid handling stations (μF-on-LHS): an industry compatible chip interface between microfluidics and automated liquid handling stations
Liu et al. Integrated microfluidic biochips for DNA microarray analysis
KR100661930B1 (ko) 미세 유체 채널을 이용한 효소 활성도 분석용 칩 및 이를이용한 효소 활성도 측정 방법
Béné Microfluidics in flow cytometry and related techniques
JP5017723B2 (ja) 光学測定用キュベットを有するマイクロチップおよびその使用方法
JP2004157097A (ja) 液体制御機構
KR102065300B1 (ko) 미세 주입기를 가진 미세유체분석칩 및 그 제조 방법 및 그 사용 방법
KR100593481B1 (ko) 적응형 미세 유체 칩 및 이를 이용한 미세 유체 제어 장치및 방법
Lin et al. Design and preparation of microfluidics device
KR102013996B1 (ko) 미세유체분석칩 제조 방법
KR102065301B1 (ko) 미세 주입기를 가진 미세유체분석칩 및 그 제조 방법 및 그 사용 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20101201

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20111129

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee