KR100656590B1 - Bacteria Variant and Method for Preparing Succinate and Amino Acids - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리아에서, 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase) 유전자(ptsG)와 두 개의 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase) 유전자(pykA, pykF)가 모두 결실되어 있는 신규 변이균주, 상기 변이균주를 혐기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법 및 상기 변이균주를 호기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조방법에 관한 것이다. In the present invention, a new variant strain, in which both a glucose phophotransferase gene (ptsG) and two pyruvate kinase genes (pykA and pykF) are deleted, is anaerobic. It relates to a method for producing succinic acid characterized by culturing under conditions and a method for producing amino acids, characterized in that the culturing the mutant strains under aerobic conditions.
본 발명에 따른 대장균 변이균주는 대사흐름 조작에 의해 혐기적 조건에서는 숙신산을, 호기적 조건에서는 L-메치오닌을 고수율로 생산할 수 있어, 숙신산 및 L-메치오닌의 산업적 생산균주로 유용하다. Escherichia coli mutant strains according to the present invention can produce succinic acid under anaerobic conditions and L-methionine under aerobic conditions by metabolic flow manipulation, and are useful as industrial production strains of succinic acid and L-methionine.
숙신산, L-메치오닌, 대장균Succinic Acid, L-Methionine, Escherichia Coli
Description
도 1은 대장균 야생주 W3110으로부터 ptsG, pykA 및 pykF 유전자를 결실시킨 변이균주 W3110GFA의 대사회로를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the metabolic circuit of the mutant strain W3110GFA deletion ptsG, pykA and pykF gene from E. coli wild strain W3110.
도 2는 대장균에서 pTrcEBC를 이용한 상동성 재조합에 의해 ptsG, pykA 및 pykF 유전자를 결실시키는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.Figure 2 shows a schematic diagram of how to delete the ptsG, pykA and pykF gene by homologous recombination using pTrcEBC in E. coli.
발명의 분야Field of invention
본 발명은 박테리아에서, 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase) 유전자(ptsG)와 두 개의 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase) 유전자(pykA, pykF)가 모두 결실되어 있는 신규 변이균주, 상기 변이균주를 혐기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법 및 상기 변이균주를 호기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 제조방법에 관한 것이다. In the present invention, a new variant strain, in which both a glucose phophotransferase gene (ptsG) and two pyruvate kinase genes (pykA and pykF) are deleted, is anaerobic. It relates to a method for producing succinic acid characterized by culturing under conditions and a method for producing amino acids, characterized in that the culturing the mutant strains under aerobic conditions.
발명의 배경Background of the Invention
현재 석유화학공업의 발달로 인하여 대부분의 화학물질들이 석유 및 천연가스로부터 생산되고 있으나, 최근 지구온난화현상 등 환경문제의 대두로 전세계적으로 환경규제가 강화되어, 화학물질의 생산을 위한 대체공정의 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.Due to the development of the petrochemical industry, most chemicals are produced from petroleum and natural gas, but recently, due to environmental problems such as global warming, environmental regulations have been strengthened around the world. The demand for development is increasing.
이에 따라, 미생물 배양기술과 유전공학적 기술의 획기적인 발달에 힘입어 생물공정에 의한 생물학적 물질(biochemical)의 생산이 점차 석유화학공정에 대하여 경쟁력을 갖게 되었다. 생물학적인 방법은 값싼 재생자원(renewable resource)을 원료로서 이용하고, 이산화탄소 등 지구온난화가스의 발생을 공정상에서 억제할 수 있기 때문에 환경문제를 근본적으로 해결할 수 있는 환경친화적 공정으로 알려져 있으므로, 균주개발 및 공정개선 등 원가절감을 위한 연구가 확대되고 있는 추세이다. 아울러, 생물학적 물질의 시장성이 매우 높아지고 있어, 미생물을 이용하여 생물자원(biomass)으로부터 생물학적 물질의 생산에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다. 이러한 생물학적 물질에 속하는 유기산과 아미노산 가운데 숙신산과 L-메치오닌의 생산은 지금까지 주로 화학합성에 의한 방법으로 산업적 생산을 하고 있는 실정이고, 아직 경제적인 생물학적인 발효 생산 방법이 확립되어 있지 않다. Accordingly, thanks to the breakthrough development of microbial culture technology and genetic engineering technology, the production of biochemical by bioprocess has become more competitive with petrochemical process. Biological methods are known as environmentally friendly processes that can fundamentally solve environmental problems because they use inexpensive renewable resources as raw materials and can suppress the generation of global warming gases such as carbon dioxide. Research for cost reduction, such as process improvement, is expanding. In addition, the market of biological materials is very high, and research into the production of biological materials from biomass using microorganisms is being actively conducted worldwide. The production of succinic acid and L-methionine among organic acids and amino acids belonging to these biological materials has been industrially produced mainly by chemical synthesis, and economical biological fermentation production methods have not yet been established.
포도당으로부터 고부가가치의 대사산물을 생산하는 생화학적 과정을 살펴보면, 1분자의 포도당으로부터 해당과정(glycolysis)을 거쳐서 2분자의 포스포에놀파 이루베이트(phosphoenolpyruvate)가 만들어진다. 이것은 도 1에서 보는 바와 같이, 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase; pykA, pykF)와 포도당을 효과적으로 흡수하는 방법인 포도당 인산 전이효소(glucose phophotransferase; ptsG)에 의해 파이루베이트로 전환되거나, 또는 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase) 효소에 의한 아나플레오틱 경로(anaplerotic pathway)를 거쳐서 트리카르복실산 순환구조(TCA cycle)의 중간대사물질인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 바로 전환되기도 한다. 또한, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판과 같은 방향성 아미노산(aromatic amino acids) 생합성에 전구체로 사용되기도 한다.In the biochemical process of producing high-value metabolites from glucose, two molecules of phosphoenolpyruvate are produced by glycolysis from one molecule of glucose. This is converted into pyruvate by glucose phosphate transferase (ptsG), which is a method of effectively absorbing pyruvate kinase (pykA, pykF) and glucose, as shown in FIG. It can also be converted directly to oxaloacetate, an intermediate metabolite of the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle) via the anaplerotic pathway by the enzyme enzypyruvate carboxylase. do. It is also used as a precursor for the biosynthesis of aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan.
그런데, 파이루베이트의 경우는 트리카르복실산 순환구조에 에너지원을 제공하는 역할을 주로 하지만, 옥살로아세테이트는 숙신산과 아스파라긴(asparagine), 아스파테이트(aspartate), 메치오닌(methionine), 트레오닌 (threonine), 아이소루신(isoleucine), 라이신(lysine)과 같은 고부가가치의 아미노산 생합성의 중요한 전구체로 쓰인다. By the way, pyruvate mainly serves to provide an energy source to the tricarboxylic acid cycle, but oxaloacetate has succinic acid, asparagine, aspartate, methionine, threonine, and threonine. It is used as an important precursor of high value-added amino acid biosynthesis such as isoleucine and lysine.
위와 같이 포도당에서 해당과정을 거친 산물인 포스포에놀파이루베이트를 파이루베이트로 전환하지 않고, 대사흐름을 옥살로아세테이트로 전환시키기 위해 여러 가지 시도가 수행되어 왔다. As described above, various attempts have been made to convert metabolic flow to oxaloacetate without converting phosphoenolpyruvate, which is a glycolytic product in glucose, to pyruvate.
우선, fadR 유전자를 결실시킴으로서 글라이옥실레이트 션트(glyoxylate shunt)를 derepress 시키거나(Farmer et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:3205, 1997), 이미 전환된 pyruvate로부터 oxaloacetate로 전환을 위해, 미생물 Rhizobium etli의 pyruvate carboxylase(pyc)를 대장균 내에서 발현시켜 oxaloacetate의 전구체 생산을 증대시킨 예를 찾을 수 있다. 이것은 대사회로에 관여하는 유전자를 도입하거나, 증폭시킨 예라고 할 수 있다. First, derepress the glyoxylate shunt by deleting the fadR gene (Farmer et al., Appl. Environ. Microbiol., 63: 3205, 1997) or for conversion from already converted pyruvate to oxaloacetate. For example, the pyruvate carboxylase (pyc) of the microorganism Rhizobium etli was expressed in Escherichia coli to increase the production of precursors of oxaloacetate. This is an example of introducing or amplifying genes involved in metabolic circuits.
숙신산 발효의 경우, 유전공학적 기법으로 대사회로에서 이산화탄소를 고정하는 유전자인 pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate carboxykinase, malic enzyme 등을 대장균에 도입하여, 숙신산 생산성을 높인 예가 보고되어 있다 (Vemuri et al., Appl. Environ. Microbiol., 68:1715, 2002; Millard et al., Appl. Environ. Microbiol., 62:1808, 1996; Chao and Liao, Appl. Environ. Microbiol., 59:4261, 1993; Stols and Donnelly, Appl. Environ. Microbiol., 63:2695, 1997). In the case of succinic acid fermentation, there has been reported an increase in succinic acid productivity by introducing pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate carboxykinase, malic enzyme, etc. into the E. coli by genetic engineering techniques (Vemuri et al. , Appl.Environ.Microbiol., 68: 1715, 2002; Millard et al. , Appl.Environ.Microbiol., 62: 1808, 1996; Chao and Liao, Appl.Environ.Microbiol., 59: 4261, 1993; Stols and Donnelly, Appl. Environ.Microbiol., 63: 2695, 1997).
아미노산 발효의 경우, oxaloacetate를 중요한 전구체로 사용하는 L-트레오닌(L-threonine)과 라이신(L-lysine) 생산을 C. glutamicum에서 증대시킨 예가 있다 (US 6,455,284). Sugimoto 그룹에서는 phosphoenolpyruvate carboxylase의 돌연변이를 이용한 재조합 균주에서 아미노산 생산 증대효과를 보고하였다 (US 5,876,983).In the case of amino acid fermentation, there is an example of increased production of L-threonine and L-lysine in C. glutamicum using oxaloacetate as an important precursor (US 6,455,284). The Sugimoto group reported the effects of amino acid production on recombinant strains using mutations of phosphoenolpyruvate carboxylase (US 5,876,983).
L-메치오닌 생산 사례를 보면, Kase and Nakayama 그룹에서 에치오닌 (ethionine), 셀레놈, 시오닌, 메치오닌 하이드록아메이트에 대해 구조유사체 내성을 가진 돌연변이주를 선별하여 2g/L의 L-메치오닌을 생산하였다. 같은 그룹에서 선별된 C. glutamicum 돌연변이주에서 250mg/L의 L-메치오닌 생산을 확인하였다. Morinaga 그룹에서 에치오닌에 내성을 가진 obligate methylotroph에서 420mg/L, Ymada 그룹에서 facultative methylotroph Pseudomonas sp.에서 800mg/L의 L-메치오닌 생산을 보고하였다. In the case of L-methionine production, 2g / L L-methionine was selected by mutant strains that were structurally resistant to ethionine, selenium, zionine, and methionine hydroamate in the Kase and Nakayama group. Produced. Production of 250 mg / L L-methionine was confirmed in C. glutamicum mutants selected from the same group. The production of L-methionine at 420 mg / L in the obligate methylotroph resistant to ethione in the Morinaga group and 800 mg / L in the facultative methylotroph Pseudomonas sp. In the Ymada group was reported.
그러나 아직까지 산업적으로 응용가능한 농도의 L-메티오닌 생성능을 가지는 대사공학적 균주에 대한 보고는 없다.However, there are no reports of metabolic strains with L-methionine producing ability at industrially applicable concentrations.
이에, 본 발명자들은 기존의 방법과 다른 대사회로 재구성을 통한 새로운 방법으로 숙신산과 L-메치오닌을 생산하는 균주를 개발하기 위하여, 대장균에서 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase) 유전자(ptsG)와 두 개의 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase) 유전자(pykA, pykF)를 모두 결실시켜 대사회로를 재설계한 신규 대장균 변이균주를 제작한 다음, 이 변이균주가 야생형에 비해 혐기조건에서 배양하여 숙신산을 고수율로 생산하는 것을 확인하고, 호기조건에서 L-메치오닌을 고수율로 생산하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors, in order to develop a strain producing succinic acid and L-methionine by a new method through the metabolic circuit reconstitution different from the existing method, glucose phophotransferase 전자 gene (ptsG) and two pi in E. coli Deletion of the pyruvate kinase genes (pykA and pykF) resulted in the production of a new E. coli mutant strain redesigned from the metabolic circuit, which was then cultured under anaerobic conditions to produce succinic acid in high yield. It was confirmed that, to produce a high yield of L-methionine under aerobic conditions to complete the present invention.
결국, 본 발명의 주된 목적은 혐기조건에서는 숙신산을, 호기조건에서는 L-메치오닌을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 신규 박테리아 변이균주 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.After all, the main object of the present invention is to provide a novel bacterial mutant strain having a characteristic of producing a high concentration of succinic acid under anaerobic conditions, L-methionine under aerobic conditions and a method for producing the same.
본 발명의 다른 목적은 상기 박테리아 변이균주를 혐기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 숙산산의 제조방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing succinic acid, characterized in that the bacterial strain is cultured under anaerobic conditions.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리아 변이균주를 호기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조방법을 제공하는데 있다.
Still another object of the present invention is to provide a method for producing L-amino acid, wherein the bacterial strain is cultured under aerobic conditions.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 루멘박테리아, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균에서 선택되는 숙신산 및 아미노산 생성 박테리아에서 ptsG, pykA 및 pykF 유전자가 모두 결실되어 있고, 상기 3 유전자의 결실시에도 생존이 가능한 변이균주 및 그 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention deletes all ptsG, pykA and pykF genes from succinic acid and amino acid producing bacteria selected from lumen bacteria, Corynebacterium genus, Brevibacterium genus and Escherichia coli. The present invention provides a mutant strain and a method for producing the same, which are viable even by deletion of the three genes.
본 발명에 있어서, 상기 대장균은 W3110이고, 대장균 변이균주는 W3110GFA인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the E. coli is W3110, E. coli mutant strains may be characterized in that W3110GFA.
본 발명은 또한, 상기 변이균주를 혐기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing succinic acid, characterized in that the culturing the variant strain under anaerobic conditions.
본 발명은 또한, 상기 변이균주를 호기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 L-메치오닌의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing L-methionine, wherein the mutant strain is cultured under aerobic conditions.
본 발명은 또한, 상기 변이균주를 호기적 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing L-tryptophan or L-phenylalanine, wherein the mutant strain is cultured under aerobic conditions.
본 발명은 또한, 상기 변이균주를 배양하되, 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 전구체 또는 중간 대사물로 사용하는 것을 특징으로 하는 옥살로아세테이트 대사산물의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing an oxaloacetate metabolite, wherein the mutant strain is cultured, using oxaloacetate as a precursor or an intermediate metabolite.
본 발명에 있어서, 상기 옥살로아세테이트 대사산물은 숙신산, 아스파라긴, 아스파테이트, 메치오닌, 트레오닌, 아이소루신, 또는 라이신인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the oxaloacetate metabolite may be succinic acid, asparagine, aspartate, methionine, threonine, isoleucine, or lysine.
본 발명은 또한, 상기 변이균주를 배양하되, 포스포에놀 파이루베이트 (phosphoenolpyruvate)를 전구체 또는 중간 대사물로 사용하는 것을 특징으로 하는 포스포에놀 파이루베이트 대사산물의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a phosphoenol pyruvate metabolite, wherein the mutant strain is cultured, wherein phosphoenol pyruvate is used as a precursor or an intermediate metabolite. .
본 발명에 있어서, 상기 포스포에놀 파이루베이트 대사산물은 트립토판, 타이로신 또는 페닐알라닌인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the phosphoenol pyruvate metabolite may be characterized as tryptophan, tyrosine or phenylalanine.
본 발명에 있어서, 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase)를 코딩하는 유전자(ptsG)와 두 개의 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 유전자(pykA, pykF)가 모두 결실된 숙신산 및 L-메치오닌을 생산하는 박테리아 균주는 대장균 뿐 아니라, 숙신산을 생산하는 루멘박테리아와 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 등과 같은 아미노산 생산에 산업적으로 사용되는 군에서 선택되는 것이 바람직하다. In the present invention, the gene encoding glucose phophotransferase (ptsG) and the genes encoding two pyruvate kinase (pykA, pykF) are both deleted succinic acid and L-methionine. The bacterial strain to be produced is preferably selected from the group used industrially for producing amino acids such as E. coli, lumen bacteria and Corynebacterium genus, Brevibacterium genus and the like.
본 발명에 따른 대장균 변이균주의 제조방법에 있어서, 상기 ptsG 유전자, pykA 유전자 및 pykF 유전자의 결실은 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 상동성 재조합은 lambda recombinase 유전자를 포함하는 유전자 교환벡터 pTrcEBG(WO 03/016538A1; Appl. Environ. Microbiol., 68:4979, 2002)를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 유전자 교환벡터를 이용한 상동성 재조합은 본 발명자들의 선행특허(대한민 국 특허출원번호 10-2001-0048881)와 선행논문 (Jeong et al., Appl. Environ. Microbiol., 68:4979, 2002)에 자세히 기술되어 있다. In the method for producing a strain of E. coli strain according to the present invention, the deletion of the ptsG gene, pykA gene and pykF gene may be characterized by homologous recombination, the homologous recombination lambda recombinase And a gene exchange vector pTrcEBG (WO 03 / 016538A1; Appl. Environ. Microbiol., 68: 4979, 2002) containing a gene. Homologous recombination using a gene exchange vector has been described in our prior patents (Korean Patent Application No. 10-2001-0048881) and the preceding paper (Jeong et al. , Appl. Environ.Microbiol., 68: 4979, 2002). It is described in detail.
본 발명에 있어서, ‘결실’이란 용어는 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소가 생성되지 못하도록 해당 유전자를 변형시킨 것을 모두 포괄한다.In the present invention, the term 'deletion' encompasses all modifications of the gene so that the enzyme encoded by the gene is not produced.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
특히, 하기 실시예에서는 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase)를 코딩하는 유전자(ptsG)와 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 두 개의 유전자(pykA, pykF)가 결실된 대장균 변이균주를 수득한 다음, 이를 이용하여 숙신산과 L-메치오닌을 생산하는 방법만을 예시하였으나, 다른 박테리아 균주를 사용하여 상기 3개의 유전자가 동시에 결실된 대사회로 재구성 및 재설계 방법을 이용하여 변이균주를 수득하고, 이를 이용하여 숙신산과 L-메치오닌을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.In particular, in the following examples, E. coli mutant strains having two genes (pykA and pykF) encoding glucose phosphotransferase (ptsG) and pyruvate kinase were obtained. Next, only succinic acid and L-methionine were produced using this method. However, using a different bacterial strain, the mutant strain was obtained using a metabolic circuit reconstruction and redesign method in which the three genes were deleted at the same time. The production of succinic acid and L-methionine will also be apparent to those of ordinary skill in the art.
또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법 만을 예시하였으나, 보통의 발효 기질인, 유장(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양(continuous culture) 등 다양한 방법을 사용한 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이 다.In addition, in the following examples, only a specific medium and a culture method are illustrated, but when a medium different from a saccharifying solution such as whey or corn steep liguor, which is a normal fermentation substrate, is used or fed-batch The use of various methods such as culture, continuous culture, etc. will be apparent to those skilled in the art.
실시예 1: ptsG, pykF, pykA 유전자 결실 균주의 제작 Example 1: Construction of ptsG, pykF, pykA gene deletion strains
박테리오파아지 레드오페론(red operon, exo-beta-gam)을 발현하는 재조합 발현벡터 pTrcEBG로 대장균 W3110 균주를 형질전환시켰다. 이어, 형질전환된 균주를 엠피실린(ampicillin, 50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이 형질전환균주를 500㎖ LB배지에서 세포농도(OD600) 0.3까지 배양한 다음, 1mM IPTG를 배지에 첨가하여 발현벡터 pTrcEBG에 클로닝된 exo-beta-gam 유전자 발현을 유도하였다. 1시간 경과 후, 세포를 원심분리하여 회수하고, 3차 증류수 250㎖에 세척하였다. 회수된 세포를 10% 글리세롤 10mL에 현탁한 다음, 다시 원심분리를 통하여 세포를 회수하여 섭씨 -80도의 deep freezer에 저장하였다. E. coli W3110 strain was transformed with recombinant expression vector pTrcEBG expressing bacteriophage red operon (exo-beta-gam). The transformed strains were then selected in LB plate medium with ampicillin (50 μg / L) added. The transformed strains were cultured in a 500 ml LB medium to a cell concentration (OD600) of 0.3, and then 1 mM IPTG was added to the medium to induce exo-beta-gam gene expression cloned into the expression vector pTrcEBG. After 1 hour, the cells were collected by centrifugation and washed with 250 ml of tertiary distilled water. The recovered cells were suspended in 10 mL of 10% glycerol, and then the cells were recovered by centrifugation and stored in a deep freezer at -80 degrees Celsius.
도 2에서와 같이, ptsG 유전자를 결실시키기 위하여, 스펙티노마이신 내성유전자(KCTC 10626BP, Mannheimia sp. LPK7 균주가 스펙티노마이신 내성유전자 함유)를 함유한 플라스미드 pIC156(Steinmetz et al., Gene, 142:79, 1994)을 주형으로 하고, 하기 서열번호 1과 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편을 다시 주형으로 하고, 서열번호 3과 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 수득된 PCR절편을 pTrcEBG로 형질전환된 대장균 세포에 1.8kV, 25μF, 200ohms의 조건으로 일렉트로포레이션(electroporation) 하였다. As shown in Figure 2, to delete the ptsG gene, plasmid pIC156 (Steinmetz et al. , Gene, 142 :) containing spectinomycin resistance gene (KCTC 10626BP, Mannheimia sp. LPK7 strain containing spectinomycin resistance gene): 79, 1994) as a template, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2, and then the obtained PCR fragment was again used as a template, and PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 3 and 4. The obtained PCR fragment was electroporated to 1.8 kV, 25 μF, 200 ohms to E. coli cells transformed with pTrcEBG.
서열번호 1: 5'-TGCCCGCCGTTGTATCGCATGTTATGGCAGGGGGATCGATCCTCTAGASEQ ID NO: 5'-TGCCCGCCGTTGTATCGCATGTTATGGCAGGGGGATCGATCCTCTAGA
서열번호 2: 5'-TGCAGCAACCAGAGCCGGTGCCATTTCGCTGGGCCGACAGGCTTTSEQ ID NO: 5'-TGCAGCAACCAGAGCCGGTGCCATTTCGCTGGGCCGACAGGCTTT
서열번호 3: 5'-TGGGCGTCGGTTCCGCGAATTTCAGCTGGCTGCCCGCCGTTGTATCGCSEQ ID NO: 5'-TGGGCGTCGGTTCCGCGAATTTCAGCTGGCTGCCCGCCGTTGTATCGC
서열번호 4: 5'-GAGGTTAGTAATGTTTTCTTTACCACCAAATGCAGCAACCAGAGCCGGSEQ ID NO: 5'-GAGGTTAGTAATGTTTTCTTTACCACCAAATGCAGCAACCAGAGCCGG
전기충격후, LB 액체배지 1㎖을 가하여 200rpm 37℃의 진탕 배양기에서 1시간동안 배양하였다. 배양액을 스펙티노마이신 항생제[최종농도 50㎍/㎖]를 함유한 LB 고체배지에 도말하여, 37℃에서 24시간이상 배양한 후, 형성된 콜로니를 수득하고, 이것을 W3110G라고 명명하였다. After the electric shock, 1 ml of LB medium was added and incubated for 1 hour in a shaker at 200 rpm of 37 ° C. The culture solution was plated in LB solid medium containing spectinomycin antibiotic [final concentration 50 [mu] g / ml], and cultured at 37 DEG C for at least 24 hours to obtain a colony formed, which was named W3110G.
상기 W3110G를 다시 엠피실린과 스펙티노마이신 항생제를 함유한 500㎖ LB배지에서 세포농도(OD600) 0.3까지 배양한 다음, 1mM IPTG를 배지에 첨가하여, 이미 형질전환되어 가지고 있는 발현벡터 pTrcEBG에 클로닝된 exo-beta-gam 유전자 발현을 유도하였다. 1시간 경과후, 세포를 원심분리하여 회수하고, 3차 증류수 250㎖에 세척하였다. 회수된 세포를 10% 글리세롤 10㎖에 현탁한 다음, 다시 원심분리를 통하여 세포를 회수하여 섭씨 -80도의 deep freezer에 저장하였다. The W3110G was incubated in a 500 ml LB medium containing an ampicillin and spectinomycin antibiotic up to 0.3 (OD600), and then cloned into the expression vector pTrcEBG, which had been transformed, by adding 1 mM IPTG to the medium. exo-beta-gam gene expression was induced. After 1 hour, the cells were collected by centrifugation and washed with 250 ml of tertiary distilled water. The recovered cells were suspended in 10 ml of 10% glycerol, and then the cells were recovered by centrifugation and stored in a deep freezer at -80 degrees Celsius.
pykF 유전자를 결실시키기 위하여, 상기 기술한 바와 같이, 플라스미드 pACYC184(New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.)의 테트라사이클린 내성 유전자를 주형으로 하고, 하기 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR절편을 다시 주형으로 하고, 서열번호 7과 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 수득된 PCR절편을 pTrcEBG로 형질전환된 대장균 W3110G 세포에 1.8kV, 25μF, 200ohms의 조건으로 일렉트로포레이션(electroporation) 하였다. In order to delete the pykF gene, as described above, the tetracycline resistance gene of the plasmid pACYC184 (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.) was used as a template, and PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6 Then, the obtained PCR fragment was again used as a template, and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 7 and 8. The obtained PCR fragment was electroporated to 1.8 kV, 25 μF, 200 ohms to E. coli W3110G cells transformed with pTrcEBG.
서열번호 5: 5'-TGGACGCTGGCATGAACGTTATGCGTCTGAGGGTAGATTTCAGTGCAASEQ ID NO: 5'-TGGACGCTGGCATGAACGTTATGCGTCTGAGGGTAGATTTCAGTGCAA
서열번호 6: 5'-CGCCTTTGCTCAGTACCAACTGATGAGCCGGGGTTCCATTCAGGTCGASEQ ID NO: 5'-CGCCTTTGCTCAGTACCAACTGATGAGCCGGGGTTCCATTCAGGTCGA
서열번호 7: 5'-CCGAATCTGAAGAGATGTTAGCTAAAATGCTGGACGCTGGCATGAACGSEQ ID NO: 5'-CCGAATCTGAAGAGATGTTAGCTAAAATGCTGGACGCTGGCATGAACG
서열번호 8: 5'-AAGTGATCTCTTTAACAAGCTGCGGCACAACGCCTTTGCTCAGTACCASEQ ID NO: 5'-AAGTGATCTCTTTAACAAGCTGCGGCACAACGCCTTTGCTCAGTACCA
전기충격후, LB 액체배지 1㎖을 가하여 200rpm 37℃의 진탕 배양기에서 1시간동안 배양하였다. 배양액을 테트라사이클린 항생제[최종농도 15㎍/㎖]를 함유한 LB 고체배지에 도말하여, 37℃에서 24시간이상 배양한 후, 형성된 콜로니를 수득하고, 이것을 W3110GF라고 명명하였다. After the electric shock, 1 ml of LB medium was added and incubated for 1 hour in a shaker at 200 rpm of 37 ° C. The culture solution was plated in an LB solid medium containing tetracycline antibiotic [final concentration 15 µg / ml], and cultured at 37 ° C. for at least 24 hours to obtain a colony formed, which was named W3110GF.
상기 W3110GF를 다시 엠피실린, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 항생제를 함유한 500㎖ LB배지에서 세포농도(OD600) 0.3까지 배양한 다음, 1mM IPTG를 배지에 첨가하여, 이미 형질전환되어 가지고 있는 발현벡터 pTrcEBG에 클로닝된 exo-beta-gam 유전자 발현을 유도하였다. 1시간 경과 후, 세포를 원심분리한여 회수하고, 3차 증류수 250㎖에 세척하였다. 회수된 세포를 10% 글리세롤 10㎖에 현탁한 다음, 다시 원심분리를 통하여 세포를 회수하여 섭씨 -80도의 deep freezer에 저장하였다. The W3110GF was incubated again to a cell concentration (OD600) of 0.3 in 500 ml LB medium containing an empicillin, tetracycline, spectinomycin antibiotic, and then added with 1 mM IPTG to the medium, and the transformed expression vector pTrcEBG Induced exo-beta-gam gene expression cloned. After 1 hour, the cells were collected by centrifugation and washed with 250 ml of tertiary distilled water. The recovered cells were suspended in 10 ml of 10% glycerol, and then the cells were recovered by centrifugation and stored in a deep freezer at -80 degrees Celsius.
pykA 유전자를 결실시키기 위하여, 상기 기술한 바와 같이, pUC4K (Pharmacia, Freiburg, Germany)의 카나마이신 내성 유전자를 주형으로 하고, 하기 서열번호 9와 10의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR절편을 다시 주형으로 하고, 서열번호 11과 12의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상 기 수득된 PCR절편을 pTrcEBG로 형질전환된 대장균 W3110GF 세포에 1.8kV, 25μF, 200ohms의 조건으로 일렉트로포레이션(electroporation) 하였다. In order to delete the pykA gene, as described above, the kanamycin resistance gene of pUC4K (Pharmacia, Freiburg, Germany) was used as a template, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, and then the obtained PCR fragments. As a template again, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12. The obtained PCR fragment was electroporated to 1.8 kV, 25 μF, 200 ohms to E. coli W3110GF cells transformed with pTrcEBG.
서열번호 9: 5'-CACCTGGTTGTTTCAGTCAACGGAGTATTACATCGGGGGGGGGGGAAAGSEQ ID NO: 5'-CACCTGGTTGTTTCAGTCAACGGAGTATTACATCGGGGGGGGGGGAAAG
서열번호 10: 5'-GTGGCGTTTTCGCCGCATCCGGCAACGTACATCCCAATTCTGATTAGSEQ ID NO: 10'-GTGGCGTTTTCGCCGCATCCGGCAACGTACATCCCAATTCTGATTAG
서열번호 11: 5'-TTATTTCATTCGGATTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGTCSEQ ID NO: 5'-TTATTTCATTCGGATTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGTC
서열번호 12: 5'-GTTGAACTATCATTGAACTGTAGGCCGGATGTGGCGTTTTCGCCGCATCSEQ ID NO: 12'-GTTGAACTATCATTGAACTGTAGGCCGGATGTGGCGTTTTCGCCGCATC
전기충격후, LB 액체배지 1㎖를 가하여 200rpm 37℃의 진탕 배양기에서 1시간동안 배양하였다. 배양액을 카나마이신 항생제[최종농도 25㎍/㎖]를 함유한 LB 고체배지에 도말하여, 37℃에서 24시간이상 배양한 후, 형성된 콜로니를 수득하고, 이것을 W3110GFA라고 명명하였다. After the electric shock, 1 ml of LB medium was added and incubated for 1 hour in a shaker at 200 rpm of 37 ° C. The culture solution was plated in LB solid medium containing kanamycin antibiotic [final concentration 25 [mu] g / ml], and cultured at 37 DEG C for at least 24 hours to obtain colonies formed, which were named W3110GFA.
실시예 2: 혐기조건에서 숙신산의 생산 Example 2: Production of Succinic Acid in Anaerobic Conditions
상기 실시예 1에서 제작된 대장균 변이균주(W3110GFA)의 숙신산 생산능을 알아보기 위하여, CO2로 headspace가 채워진 혐기적 조건에서 배양하고, 이로부터 생산되는 산물을 분석하였다. In order to determine the succinic acid production capacity of the E. coli mutant strain (W3110GFA) prepared in Example 1, the culture was produced under anaerobic conditions filled with CO 2 headspace, and the product produced therefrom was analyzed.
먼저, LB 배지 10㎖를 제조하고, 대장균을 접종한 후, 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 이어, 증류수 1리터당 9g glucose(50mM), 5g yeast extract, 10g NaHCO2, 8.5g NaH2PO4·H2O, 15.5g K2HPO4
(pH 7.0)의 함량을 갖는 serum bottle에 CO2로 headspace를 채웠다. 그리고, 완전 혐기적 조건을 만들기 위해, Na2S를 최종 1mM되게 첨가하였다. 여기에, 대장균 W3110GFA 1ml을 접종하여 37℃에서 200rpm으로 24시간동안 배양하였다. First, 10 ml of LB medium was prepared, and inoculated with E. coli, followed by preculture at 37 ° C. for 12 hours. Then, distilled water 1 liter 9g glucose (50mM), 5g yeast extract,
배지를 채취하고, 이로부터 유기산 생산량을 HPLC로 측정하였다. 표 1은 혐기조건에서 배양한 대장균 W3110GFA의 유기산 정량분석 결과를 나타낸 것이다.The medium was harvested and organic acid yield was determined from this by HPLC. Table 1 shows the results of quantitative analysis of organic acids of Escherichia coli W3110GFA cultured under anaerobic conditions.
표 1에 나타난 바와 같이, W3110GFA 균주에서 생성된 숙신산의 농도는 8.2mM으로, 야생형의 W3110 균주와 비교하여, 숙신산 생성량이 3배이상 증가하였다. 또한, 모든 유기산에서 숙신산이 차지하는 비율 [succinate/ (succinate+lactate+formate+acetate+ethanol)]이 8.3배 증가하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 대장균 W3110GFA를 혐기적으로 배양하여 숙신산을 제조하는 방법은, 모균주인 W3110 균주를 사용하는 경우보다 생산성이 크게 향상된 것을 알 수 있었다. As shown in Table 1, the concentration of succinic acid produced in the strain W3110GFA was 8.2 mM, and the amount of succinic acid produced was increased by three times or more compared with the wild type W3110 strain. In addition, the ratio of succinic acid [succinate / (succinate + lactate + formate + acetate + ethanol)] in all organic acids increased 8.3 times. From these results, it was found that the method of producing succinic acid by anaerobic culturing Escherichia coli W3110GFA of the present invention significantly improved the productivity of the strain W3110.
실시예 3: CaCO3 과량 생산 배지에서 L-메치오닌의 생산 Example 3: Production of L-Methionine in CaCO 3 Overproduction Media
상기 실시예 1에서 제작된 대장균 변이균주(W3110GFA)의 아미노산 생산능을 알아보기 위하여, CaCO3 과량 함유된 배지조건에서 호기적으로 배양하고, 이로부터 생산되는 산물을 분석하였다. In order to determine the amino acid production capacity of the E. coli mutant strain (W3110GFA) prepared in Example 1, the culture was aerobic culture in a medium containing excess CaCO 3 , and the product produced therefrom was analyzed.
먼저, LB 배지 10㎖를 제조하고, 대장균을 접종한 후, 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 이어, 증류수 1리터당 30g glucose, 2g KH2PO4, 10g (NH4 )2SO4·7H2O, 10mg MnCl2·4H2O, 10mg FeSO4·4H2O, 20g CaCO3, 50mg FeSO4·7H2O, 10mg CaCl2, 11mg ZnSO4·7H2O, 2.5mg MnSO4·5H2O, 5mg CuSO4·5H2O, 0.5mg (NH4)Mo7O24·4H20, 0.1mg NaB4O7·10H2O 의 성분이 있고 KOH로 pH를 7.0으로 맞춘 배지 배지 100㎖을 함유한 250㎖ 플라스크에 대장균 W3110GFA 돌연변이주 5㎖을 접종하여, 30℃에서 120rpm으로 72시간동안 배양하였다. First, 10 ml of LB medium was prepared, and inoculated with E. coli, followed by preculture at 37 ° C. for 12 hours. Then, 30 g glucose, 2 g KH 2 PO 4 , 10 g (NH 4 ) 2 SO 4 · 7H 2 O, 10 mg MnCl 2 · 4H 2 O, 10 mg FeSO 4 · 4H 2 O, 20 g CaCO 3 , 50 mg FeSO 4 per liter of distilled water 7H 2 O, 10mg CaCl 2 , 11mg ZnSO 4 7H 2 O, 2.5mg MnSO 4 5H 2 O, 5mg CuSO 4 5H 2 O, 0.5mg (NH 4 ) Mo 7 O 24 4H 2 0, 0.1 5 ml of E. coli W3110GFA mutant strain was inoculated into a 250 ml flask containing 100 ml of medium containing KM NaB 4 O 7 10H 2 O and adjusted to pH 7.0 with KOH, and cultured for 72 hours at 120 rpm at 30 ° C. It was.
배지를 채취하고, 이로부터 아미노산 생산량을 HPLC로 측정하였다. 표 2는 호기조건에서 배양한 대장균 W3110GFA의 아미노산 정량분석 결과를 나타낸 것이다. The medium was harvested and the amino acid production was measured by HPLC. Table 2 shows the results of quantitative analysis of amino acids of E. coli W3110GFA cultured under aerobic conditions.
ND, not detected. ND, not detected.
표 2에 나타난 바와 같이, 야생형의 W3110 균주에서는 L-메치오닌이 생성되지 않은 반면, W3110GFA 균주에서는 L-메치오닌이 12.2mg/L 생성되었다. 이 결과로 부터, 본 발명의 대장균 W3110GFA를 CaCO3 과량 함유된 배지조건에서 호기적으로 배양하여 L-메치오닌을 제조하는 방법은, 모균주인 W3110 균주를 이용하는 경우와 비교하여, L-메치오닌의 생산성이 크게 향상된 것을 확인할 수 있었다. 또한, L-트립토판 및 L-페닐알라닌의 생산량도 크게 향상되었다. 따라서, W3110GFA 균주는 L-메치오닌뿐만 아니라, L-트립토판 및 L-페닐알라닌의 산업적 생산에도 응용이 가능할 것으로 사료된다. As shown in Table 2, L-methionine was not produced in wild-type W3110 strain, whereas L-methionine was produced in 12.2 mg / L of W3110GFA strain. From this result, the method of producing L-methionine by aerobic culture of Escherichia coli W3110GFA of the present invention in a medium containing CaCO 3 excess, compared to the case of using the strain W3110, the productivity of L-methionine It was confirmed that this greatly improved. In addition, the yield of L-tryptophan and L-phenylalanine was also greatly improved. Therefore, the W3110GFA strain may be applicable to the industrial production of L-tryptophan and L-phenylalanine as well as L-methionine.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 ptsG, pykA 및 pykF가 결실되어 있고, 혐기조건에서는 숙신산을 고농도로 생성하고, 호기적 조건에서는 L-메치오닌을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 대장균 변이균주를 제공하는 효과가 있다. As described and demonstrated in detail above, the present invention is E. coli mutant strains having the characteristics of ptsG, pykA and pykF is deleted, succinic acid is produced at high anaerobic conditions, and L-methionine is produced at high aerobic conditions. It is effective to provide.
본 발명에 따른 대장균 변이균주는 이산화탄소로 포화된 혐기적 조건에서는 숙신산을, 호기적 조건에서는 L-메치오닌뿐만 아니라, L-트립토판 및 L-페닐알라닌을 고농도로 생산할 수 있어 숙신산 및 아미노산의 생산균주로 유용하다.E. coli mutant strains according to the present invention can produce succinic acid under anaerobic conditions saturated with carbon dioxide, L-methionine in aerobic conditions, as well as L-tryptophan and L-phenylalanine, which is useful as a production strain of succinic acid and amino acids. Do.
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