KR100653948B1

KR100653948B1 - ＩκＢ키나아제 저해제 및 이를 포함하는 ＩκＢ키나아제저해제용 조성물

Info

Publication number: KR100653948B1
Application number: KR1020050029592A
Authority: KR
Inventors: 야스시 오이즈미; 토루 야마쿠니; 츠토무 아라카와; 켄지 오사와; 스스무 시무라
Original assignee: 롯데제과주식회사
Priority date: 2004-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2007-04-16
Also published as: KR20060114295A; KR100729436B1; JP5140231B2; JP2005298379A

Abstract

본 발명은 IκB 키나아제 저해제 및 이를 포함하는 IκB 키나아제 저해제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역, 염증반응, 세포증식억제, 아포토시스 관련 유전자의 전사촉진 원인인 NF-κB의 활성화를 일으키고, 인슐린의 세포내 정보전달 장해, 세포내 당유입 저해의 원인인 IRS-1의 기능저하(인산화)를 일으키는 등의 성질을 갖는 IκB키나아제를 저해하는 IκB키나아제 저해제로서, 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피로부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 함유하는 IκB키나아제 및 이를 포함하는 IκB 키나아제 저해제용 조성물에 관한 것이다.

IκB 키나아제, 망고스틴

Description

ＩκＢ키나아제 저해제 및 이를 포함하는 ＩκＢ키나아제 저해제용 조성물{IκB kinase inhibitor and IκB kinase inhibiting composition comprising thereof}

본 발명은 IκB 키나아제 저해제 및 이를 포함하는 IκB 키나아제 저해제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역, 염증반응, 세포증식억제, 아포토시스 관련 유전자의 전사촉진 원인인 NF-κB의 활성화를 일으키고, 인슐린의 세포내 정보전달 장해, 세포내 당유입 저해의 원인인 IRS-1의 기능저하(인산화)를 일으키는 등의 성질을 갖는 IκB키나아제를 저해하는 IκB키나아제 저해제로서, 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피로부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 함유하는 IκB키나아제 및 이를 포함하는 IκB 키나아제 저해제용 조성물에 관한 것이다.

IκB키나아제는 NF-κB 경로 상의 중요한 키나아제로서 최근 동정된 단백질로, 포유류에서 기초적 면역응답의 본질적인 구성요소이다. 또한 NF-κB는 세 포내의 전사인자로서 다양한 유전자 전사제어를 일으키는 것으로 알려져 있다.

통상 NF-κB는 IκB와 결합하여 세포질 내에 머무르나, 세포가 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS), TNF-α, IL-1등의 염증성 사이토카인, T세포활성화 시그널, 성장인자, 스트레스 유도인자 등에 의해 자극받으면, IκB키나아제가 활성화하여 IκB를 인산화한다. 인산화를 받은 IκB는 NF-κB로부터 유리되고, NF-κB가 활성화하여 핵 내로 이행한다. 핵 내로 이행한 활성형 NF-κB는 특정 유전자 배열로 결합하고, 면역, 염증반응, 세포증식제어, 아포토시스에 관련하는 유전자의 전사를 촉진한다.

따라서, NF-κB의 활성화는 류머티즘, 천식, 갑상선 기능 부전증후군과 오액질, 동맥경화, HIV, EB바이러스, 아포토시스, 허혈/재관류 뇌졸중 모델에서의 세포사, 알츠하이머병, 뇌졸중, 미생물감염, 바이러스발암, 신장경화, 당뇨병 등의 각종 질환의 발생과 관계가 있다.

IκB키나아제 저해제는 IκB키나아제의 활성을 저해하고, 이들 질환의 발생을 억제하기 때문에, 그 탐색이 이루어지고 있으나, 안전하며 유효한 저해제를 개발하는데 성공하지는 못했다. 또한 IκB키나아제는 인슐린에 의한 세포내로의 당 유입을 저해하고, 인슐린저항성, II형 당뇨병에 관여하는 것도 보고되어 있다.

한편, 망고스틴(Garcinia Mangostana L.)은 그 과실 또는 과피의 이용법으로서 식품용 보존제(예를들어, 일본특개평6-98738호, 일본특개평7-147951호 참조), 5α-리덕타제 저해제(예를들어, 일본특개평5-17365호 참조), 항균제(예를들어, 일본특개평7-250658호 참조), 항헬리코박터필로리약(예를들어, 일본특개평8-208501호 참조), 자외선흡수제(예를들어, 일본특개평9-87155호 참조), 세린 프로테아제 저해제(예를들어, 일본특개평10-120586호 참조)가 알려져 있다.

또한 망고스틴(Garcinia Mangostana L.) 과피의 수용성 추출물에 대하여, 비만세포로부터의 히스타민 유리 억제작용에 의한 미백, 항염증 작용(예를들어, 일본특개평4-244004호 참조), 망고스틴(Garcinia Mangostana L.) 과피의 극성용매 추출물 및 그 성분인 α-망고스틴, γ-망고스틴에 대하여 히스타민 및 세로토닌에 대한 길항작용에 의한 항알러지 작용(예를 들어, 일본특개평10-72357호 참조)가 알려져 있다.

또한 망고스틴 추출물은 프로스타그란딘의 생산을 억제하는 것(예를들어, 일본특개2002-47180호 참조)도 알려져 있다. 그러나, 본 발명과 같이 IκB키나아제를 저해하는 사실, NF-κB활성화를 매개하는 유전자발현을 억제하는 것에 대해서는 어떠한 것도 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, 고추나무과 식물로 그 과실이 식용인 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실, 과피로 부터 각종 용매로 추출물을 추출하고, 그 추출물에 함유되어 있는 수종의 성분을 단리하고, 그 추출물 및 수종(數種)의 성분에 대하여 연구를 실시한 결과, 함수 유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 망고스틴 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴이 IκB키나아제 저해작용, NF-κB활성화를 매개하는 유전자발 현 저해작용을 갖는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 면역, 염증반응, 세포증식억제, 아포토시스 관련 유전자의 전사를 촉진하는 원인인 NF-κB의 활성화를 일으키며, 인슐린의 세포내 정보전달 저해, 세포내 당유입의 저해 원인인 IRS-1의 기능저하(인산화)를 일으키는 등의 성질을 갖춘 IκB키나아제를 저해하는 IκB키나아제 저해제 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

즉, 본 발명은 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과실로부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 식물성 추출물을 약효성분으로 활용하므로써 안전하면서 강력한 IκB키나아제 저해제 및 이를 포함하는 IκB키나아제 저해제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피를 함수(含水)유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴 중에서 선택된 1 종 또는 그 이상의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, IκB키나아제 활성 및 NF-κB에 의한 유전자 발현에 의하여 야기되는 질환의 치료 및 예방용 IκB키나아제 저해제를 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 IκB키나아제 저해제를 유효성분으로 포함하는 IκB키나아제 저해제용 조성물을 포함한다.

또한, 본 발명은 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피를 함 수(含水)유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴 중에서 선택된 1 종 또는 그 이상의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, IκB키나아제 저해활성능을 갖는 식품첨가제와 이를 포함하는 식품을 포함한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 면역, 염증반응, 세포증식억제, 아포토시스 관련 유전자의 전사촉진 원인인 NF-κB의 활성화를 일으키고, 인슐린의 세포내 정보전달 장해, 세포내 당유입 저해의 원인인 IRS-1의 기능저하(인산화)를 일으키는 등의 성질을 갖는 IκB키나아제를 저해하는 IκB키나아제 저해제로서, 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피로부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 추출물, α-망고스틴, γ-망고스틴으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 함유하는 IκB키나아제 및 이를 포함하는 IκB키나아제 저해제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 고추나무과 식물로 그 과실이 식용인 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실, 과피로부터 각종 용매로 추출물을 추출하고, 그 추출물에 함유되어 있는 수종의 성분을 단리하고, 그 추출물 및 수종의 성분에 대하여 연구를 실시한 결과, 함수 유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 망고스틴 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴이 IκB키나아제 저해작용, NF-κB활성화를 매개하는 유전자발현 저해작용을 갖는 사실을 발견하여 제안된 발명이다.

즉, 본 발명자들은 IκB키나아제 저해제로서의 효과를 확인한 결과, 망고스틴 과실, 과피로 부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물, 다음 화학식 1로 나타내어지는 α-망고스틴과, 다음 화학식 2로 나타내어지는 γ-망 고스틴에 우수한 IκB키나아제 저해작용, NF-κB 활성화를 매개하는 유전자 발현억제작용을 갖는 사실을 발견하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실, 과피로 부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴 중에서 선택된 1 종 또는 그 이상의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 IκB키나아제 저해제 및 이를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 망고스틴의 과실, 과피로 부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물, α-망고스틴 및/또는 γ-망고스틴을 유효성분으로 하는 IκB키나아제 저해제는 우수한 IκB키나아제 저해작용 및 NF-κB에 의한 유전자 전사 억제작용을 갖는다. 또한, 본 발명의 망고스틴의 과실, 과피로 부터 함수유기 용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물은, 천연물로 부터 조제하는 것이 가능하므로 부작용이 없이 안전하다. 또한, 본 발명의 IκB키나아제 저해제는 정미성이 우수하므로 이를 의약품, 음식품에 함유시킴으로써 정미성이 우수한 IκB키나아제 저해용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 IκB키나아제 저해제의 유효성분인 망고스틴의 과실, 과피로 부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물은 고추나무과 식물인 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실, 과피로부터 추출된다. 또한 망고스틴의 과실 및 과피는 그대로 사용하여도 좋으나, 건조하여 파쇄한 분말을 사용하면 추출효율이 좋게 되어 바람직하다. 또한 망고스틴의 과실, 과피를 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하기 전에, n-헥산, 석유 에테르 등의 비극성용제로 탈지하여도 좋다.

추출용매로서는, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 아세톤, 초산에틸, 디에틸에테르, 클로로포름, 글리세린, 에틸글리콜, 프로필글리콜 등의 유기용제, 바람직하게는 극성용제, 특히 에탄올과 같은 알코올류, 또는 유기용제에 물을 혼합한 것을 사용하면 좋다. 또한, 본 발명의 저해제 및 조성물이 경구투여제 또는 음식품으로서 사용하는 경우를 고려할 때, 추출용제는 안전성면에서 에탄올 만, 또는 물과 에탄올의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 물과의 혼합비율은 특별히 제한하지 않으나, 물의 비율이 바람직하게는 70 %(v/v)이하, 더욱 바람직하게는 60 %(v/v)이하이다. 추출온도에 대해서는 추출효율을 고려하면 실온부터 용매의 환류온도가 바람직하다. 추출시간은 추출용매의 종류, 과실 및 과피의 파쇄상태 및 추출온도에 따라 다르나, 0.5 시간 ∼ 2 시간이 바람직하다.

상기 추출용매로 추출하여 얻어진 추출물은 필요에 따라 에바포레이터(evaporator)에 의해 추출용매를 농축하거나, 또는 제거하여도 좋다. 또한 추출물은 필요에 따라 용매분획 및 크로마토그래피에 의해 정제하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 IκB키나아제 저해제의 유효성분인 α-망고스틴 및 γ-망고스틴은 예를 들어 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 등으로부터 공지의 방법에 따라 추출, 정제하여 제조할 수 있으나, 합성한 것을 사용하는 것도 가능하다.

또한, 현재 IκB키나아제를 저해하는 것으로 질환을 치료, 예방하는 것이 시사되는 제제로서는 아스피린 및 사리틸산나트륨[Yin MJ, Yamamoto Y. and Gaynor RB(1998) The anti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of IκB-b, Nature 396: 77-80]이 알려져 있다. 한편, 본 발명의 IκB키나아제 저해제는 천연유래 IκB키나아제 활성저해제이다.

따라서, IκB키나아제의 활성저해작용, NF-κB에 의한 유전자 발현을 억제하는 작용이 유효한 질환의 치료, 예방에 안전하게 사용할 수 있다. IκB키나아제의 활성저해작용이 유효한 질환 및 NF-κB에 의한 전사발현을 억제하는 작용이 유효한 질환이란, 예를 들어, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 담마진, 결막염, 춘계(春季)카타르, 건선, 궤양성 대장염, 전신성 염증반증후군, 패혈증, 다 발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 알쯔하이머형 치매증, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 만성 관절류머티즘, I형 당뇨병, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염(하시모토병), 세리아크병, 중증근무력증, 심상성(尋常性) 천포창, 전신성 에리테마토데스, 바이러스질환(HIV, 헤르페스, 센다이 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 광견병바이러스, 수포성 구내염바이러스, 라이노바이러스, A형간염바이러스, B형간염바이러스, 풍진바이러스 등), 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 재관류장해, 심장비대, 암 등이다.

더욱이 IκB키나아제는 직접 IRS-1을 인산화하는 작용이 알려져 있으며, 이 작용으로 IRS-1의 기능을 저하하고, 인슐린의 세포내 정보전달의 저해, 세포내로의 당유입의 저해가 일어날 가능성이 있으므로, 본 발명은 인슐린 저항성, II형 당뇨병의 치료, 예방에 사용할 수 있다.

본 발명의 IκB키나아제 저해제는, 단독으로 또는 다른 의약 또는 임의의 제제용 담체, 희석제 등과 혼합하여, 임의의 제형으로 하여 의약으로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 제형으로서 정제, 과립제, 산제, 세립제, 에어로졸제, 경캅셀제, 연캅셀제, 경구용 액체제제, 주사제 등을 예시할 수 있다.

또한 본 발명의 IκB키나아제 저해용 조성물로서는, 예를 들어, 음료, 과자, 냉과, 유제품, 주류, 육류 등과 같은 음식품이 있다. 이들 IκB키나아제 저해용 조성물은 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실, 과피의 함수유기용제 또는 유기용제 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴의 1종 이상을 각종 음식품에 배합하므로써 얻어진다.

이 IκB키나아제 저해용 조성물에서 망고스틴 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴의 유효함량에 대해서는 투여방법 및 필요한 치료에 따라 변하므로 일괄적으로 규정하는 것이 곤란하나, 망고스틴 추출물의 투여량으로 계산하면, 사람 및 동물 체중 1 kg 당 건조중량으로 0.5 mg ∼ 5 g, 바람직하게는 5 mg ∼ 5 g, 더욱 바람직하게는 10 mg ∼ 1 g, 배양세포에 대해서는 1 mg/L ∼ 100 mg/L이며, α-망고스틴 및 γ-망고스틴은 사람 및 동물체중 1 kg 당 0.1 mg ∼ 1 g의 투여량이, 바람직하게는 1 mg ∼ 1 g, 더욱 바람직하게는 2 mg ∼ 200 mg, 배양세포에 대해서는 1 ㎛ol/L ∼ 30 ㎛ol/L이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

시험예

본 시험은 망고스틴(Garcinia mangostana L.)로부터 조제된 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴의 IκB 키나아제 저해작용, IκB의 인산화 억제작용, NF-κB활성화를 매개하는 유전자 발현을 억제하는 작용을 알아보기 위해 실시하였다.

(1) 시료의 조제

본 시험에는 다음 시료를 사용하였다.

1) 시료1

망고스틴(Garcinia Mangostana L.)의 미건조과피 1 kg을 10 L의 메탄올에 침지하고, 24 시간 실온에서 추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하고, 80 g의 추출물을 얻었다.

2) 시료2

망고스틴(Garcinia Mangostana L.)의 건조과피분말 500 g을 5 L의 40% 에탄올에 침지하고, 24 시간 실온에서 추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하고, 104 g의 추출물을 얻었다.

3) 시료3

망고스틴(Garcinia Mangostana L.)의 건조과피분말 480 g을 5 L의 70% 에탄올에 침지하고, 4 시간(60 ℃) 교반추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하고, 128 g의 추출물을 얻었다.

4) 시료4

망고스틴(Garcinia Mangostana L.)의 건조과피분말 1.1 kg을 11 L의 에탄올에 침지하고, 4 시간(60 ℃) 교반추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하고, 128 g의 추출물을 얻었다.

5) 시료5

망고스틴(Garcinia Mangostana L.)의 과실 1.1 kg을 분쇄하고, 5 L의 에탄올에 0.5 시간(70 ℃) 교반추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하고, 88g의 추출물을 얻었다.

6) 시료 6, 7

시료1의 추출물 80 g을 350 ml의 초산에틸에 용해 후, 200 ml의 물로 2회 세정하였다. 초산에틸분획을 에바포레이터로 용매를 제거하고 20 g의 건조물을 얻었다. 이 건조물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 용출은 헥산초산에틸계로 점차, 극성을 올린 그라디엔트 용출을 실시하고, 3개의 분획물을 얻었다. 최초에 얻어진 분획물(5 g)을 재차, 실리카겔 컬럼크로마토그래피(헥산초산에틸, 10:90→30:70→50:50, 이어서 초산에틸만, 마지막에 초산에틸메탄올, 50:50)으로 정제하고, 황색 비결정상의 시료7(γ-망고스틴) 500 mg을 얻었다.

(2) 시험방법

1) LPS유도 IκB 인산화시험　

C6세포를 피험 샘플과 함께 1 시간 배양하고, 10 ㎍/ml LPS를 가하고 30분간 인큐베이트하고 자극하였다. SDS-PAGE용 샘플 완충액으로 세포를 용해시키고, SDS-PAGE를 실시하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride)막으로 전사하였다. 토끼 항인산화 IκB항체 (0.2 ㎍/ml)을 가하여 25 ℃에서 2 시간 인큐베이트하였다. 세정 후, 서양와사비 페록시다아제(peroxidase) 결합 항토끼 IgG항체와 인큐베이트하였다. 화학발광법에 따라 인산화 IκB를 측정하고, LPS를 첨가하지 않은 C6세포의 인산화 IκB양을 1로 한 경우의 상대치를 다음 표 1에 나타냈다.

샘플	샘플농도	인산화IκB
대조군	-	5.37
시료6의 α-망고스틴	3μM	3.56
시료6의 α-망고스틴	10μM	1.60
시료6의 γ-망고스틴	1μM	5.20
시료6의 γ-망고스틴	3μM	3.49
시료6의 γ-망고스틴	10μM	1.56
시료6의 γ-망고스틴	30μM	0.96
시료1의 IκB키나아제저해제	1㎍/ml	4.56
시료1의 IκB키나아제저해제	10g/ml	3.07
시료1의 IκB키나아제저해제	100g/ml	1.00
시료2의 IκB키나아제저해제	10g/ml	2.82
시료3의 IκB키나아제저해제	10g/ml	2.52
시료4의 IκB키나아제저해제	10g/ml	3.13
시료5기재의 IκB키나아제저해제	10g/ml	3.34

2) in vitro IκB키나아제 시험

C6세포를 LPS(10 ㎍/ml)로 10분간 자극하고, PBS로 세정한 후, 용해용 완충액(2 mM EGTA, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM APMSF, 10 ㎍/ml　Leupeptin, 10㎍/ml 아프로티닌(aprotinin) 1 mM Na₃VO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)를 가하고, 세포추출액을 제조하였다. 6 ㎍ 항 IKKα/β항체를 첨가하고, 면역복합체를 proteinA-Sepharose 4B 비즈로 회수하였다. IKK 단백질결합 비즈를 용해용 완충액으로 3회 세정하고, 10 mM MgCl₂·6H₂O, 0.1 mM Na₃VO₄, 2 mM DTT, 5 mM β-글리세로인산, [γ-32P]-ATP, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5의 키나아제 반응액 25 μL에 넣었다. 피험샘플을 가하고, 30 ℃에서 10 분간 인큐베이트한 후, IκBα를 1 ㎍첨가하고 30분간 인큐베이트하였다. SDS-PAGE용 샘플완충액을 가하여 반응을 정지시키고, SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 나누고, 인산화 IκBα를 Molecular Imager(GS363, Bio-Rad)를 이용하여 정량하고, 기질 IκB를 첨가하지 않은 때의 인산화 IκBα양에 대한 상대치를 다음 표 2에 나타냈다.

샘플	샘플농도	인산화IκBα
대조군	-	6.90
시료6의 α-망고스틴	3μM	6.52
시료6의 α-망고스틴	10μM	4.35
시료6의 γ-망고스틴	3μM	6.13
시료6의 γ-망고스틴	10μM	4.17
시료6의 γ-망고스틴	30μM	2.61
시료1의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	3.07
시료2의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	2.82
시료3의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	2.52
시료4의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	3.13
시료5의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	3.34

2) 듀얼 루시페라아제 측정에 의한 NFκB 시그널 전달활성화시험 　

C6세포를 24웰 플레이트에 파종하고, 2 일후, 0.475 ㎍/웰의 pNFκB-Luc(반복 NFκB 응답배열을 포함하는 개똥벌레 루시페라아제 리포터 프라스미드(luciferase reporter plasmid)) 또는 dN-Luc (pNFκB-Luc 중의 NFκB 배열을 결손시킨 리포터 프라스미드, Hirai, 1994)를 트랜스펙션하였다. 또한, C6세포에 0.025 ㎍의 대조 펙터 레닐라(Renilla) 루시페라아제를 동시에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션한 후 세포를 13 시간 배양하고, 피험샘플과 3 시간 인큐베이트하였다. 세포에 1 ㎍/mlLPS를 가하고 8시간 배양하고, 세포를 모았다. 개똥벌레 루시페라아제와 레닐라(Renilla) 루시페라아제 활성은 MiniLumat LB9506으로 측정하였다. 다음 표 3에 피험샘플의 결과를 레닐라(Renilla) 루시페라아제 활성에 대한 개똥벌레 루시페라아제 활성의 상대치로 나타냈다.

샘플	샘플농도	상대적 루시페라아제 활성
대조군	-	0.73
시료6의 α-망고스틴	10μM	0.50
시료6의 γ-망고스틴	10μM	0.50
시료1의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	0.50
시료2의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	0.56
시료3의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	0.49
시료4의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	0.51
시료5의 IκB키나아제저해제	10㎍/ml	0.47

(3) 시험결과

본 실험예의 결과로부터 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피로부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴은 IκB키나아제 저해작용을 갖는다는 사실 및 NF-κB 활성화를 매개하는 유전자 발현을 억제하는 것이 명확해졌다.

따라서, 본 발명품은 IκB키나아제 저해제로서 유용하며, 포유동물의 IκB키나아제가 관여하는 질병 및 NF-κB가 관여하는 질병의 치료 및 예방에 유용할 수 있다.

다음으로 실시예에서 본 발명을 실시하기 위한 최적의 형태에 대하여 상세하게 설명한다.

실시예 1

망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 미건조 과피 1 kg을 10 L의 메탄올에 침지하고, 24 시간 실온에서 추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하여 80 g의 IκB키나아제 저해제를 얻었다.

실시예 2

망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 건조 과피분말 500 g을 5 L의 40% 에탄올에 침지하고, 24 시간 실온에서 추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하여 104 g의 IκB키나아제 저해제를 얻었다.

실시예 3

망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 건조 과피분말 480 g을 5 L의 70% 에탄올로 4시간(60℃) 교반추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하여 128 g의 IκB키나아제 저해제를 얻었다.

실시예 4

망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 건조 과피분말 1.1 kg을 11 L의 에탄올로 4 시간(60 ℃) 교반추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하여 128 g의 IκB키나아제 저해제를 얻었다.

실시예 5

망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 1.1 kg을 분쇄하고 5 L의 70% 에탄올로 4 시간(60 ℃) 교반추출하였다. 여과후, 여액을 에바포레이터로 감압건조하여 128 g의 IκB키나아제 저해제를 얻었다.

실시예 6

실시예 1 기재 추출물 80 g을 350 ml 초산에틸에 용해한 후, 200 ml 물로 2회 세정하였다. 초산에틸 분획물을 에바포레이터로 용매를 제거하여 20 g의 건조물을 얻었다. 이 건조물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 용출은 헥산-초산에틸계로 점차, 극성을 높인 그라디엔트 용출을 실시하고 3개의 분획물을 얻었다. 최초로 얻은 분획물(5 g)을 다시, 실리카겔 칼럼크로마토그래피 (헥산-초산에틸, 10:90→30:70→50:50)으로 정제하고, 황색 결정상 α-망고스틴 2 g을 얻었다. 2번째 분획물(2 g)을 재차 실리카겔 컬럼크로마토그래피(헥산-초산에틸, 30:70→50:50, 계속해서 초산에틸만, 마지막에 초산에틸메탄올 50:50)으로 정제하고, 황색 비결정상의 γ-망고스틴 500 mg을 얻었다.

실시예 7

실시예 1에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 산제를 제조하였다.

유당 25 중량부

감자전분 10 중량부

실시예1에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 5 중량부

실시예 8

실시예 2에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 산제를 제조하였다.

유당 25 중량부

감자전분 10 중량부

실시예 2에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 5 중량부

실시예 9

실시예 3에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 산제를 제조하였다.

유당 25 중량부

감자전분 10 중량부

실시예 1에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 5 중량부

실시예 10

실시예 4에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 산제를 제조하였다.

유당 25 중량부

감자전분 10 중량부

실시예 4에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 5 중량부

실시예 11

실시예 5에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 산제를 제조하였다.

유당 25 중량부

감자전분 10 중량부

실시예 5에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 5 중량부

실시예 12

실시예 6에서 얻어진 α-망고스틴을 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 정제를 제조하였다.

D-만니톨 10 중량부

유당 10 중량부

결정셀룰로오스 2 중량부

히드록시프로필셀룰로오스 1 중량부

α-망고스틴 4 중량부

실시예 13

실시예 6에서 얻어진 γ-망고스틴을 하기 조성으로 배합하여, IκB키나아제 저해제 함유 시럽제를 제조하였다.

단시럽 10 중량부

카르복시메틸셀룰로오스 1 중량부

γ-망고스틴 0.3 중량부

실시예 14

실시예 2에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 주사제를 제조하였다.

클로로부탄올 0.5 중량부

염화나트륨 0.9 중량부

주사용 수(水) 80 중량부

실시예 2에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 20 중량부

실시예 15

실시예 5에서 얻어진 IκB키나아제 저해제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 연고제를 제조하였다.

밀납 3 중량부

수소첨가 라노린 8 중량부

스콸렌 34 중량부

고형파라핀 2 중량부

마이크로크리스탈린왁스 9 중량부

백색바세린 5 중량부

아디핀산헥실데실 13 중량부

세스키올레인산솔비탄 1 중량부

폴리옥시에틸렌(50)경화피마자유 1 중량부

글리세린 10 중량부

에탄올 1 중량부

물 10 중량부

실시예 5에서 얻어진 IκB키나아제 저해제 30 중량부

실시예 16

실시예 6에서 얻어진 γ-망고스틴을 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제함유 캔디를 제조하였다.

그래뉼당 45 중량부

물엿(D. E. 42) 50 중량부

물 20 중량부

γ-망고스틴 0.5 중량부

레몬향료 1 중량부

실시예 17

실시예 2에서 얻어진 IκB키나아제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제함유 초콜렛을 제조하였다.

카카오비터 20 중량부

카카오버터 17 중량부

설탕 43 중량부

전지분유 20 중량부

실시예2에서 얻어진 IκB키나아제 1 중량부

바닐라향료 0.1 중량부

실시예 18

실시예 3에서 얻어진 IκB키나아제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 함유 츄잉껌을 제조하였다.

껌베이스 20 중량부

설탕 56 중량부

물엿 13 중량부

포도당 10 중량부

연화제 1 중량부

실시예 3에서 얻어진 IκB키나아제 0.5 중량부

민트향료 0.5 중량부

실시예 19

실시예4에서 얻어진 IκB키나아제를 하기 조성으로 배합하고, IκB키나아제 저해제 함유 정과를 제조하였다.

설탕 75 중량부

포도당 19 중량부

자당지방산에스테르 0.2 중량부

실시예4에서 얻어진 IκB키나아제 0.5 중량부

물 4 중량부

상술한 바와 같이, 망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피로부터 함수유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻어진 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴은 IκB키나아제 저해작용을 갖는 사실 및 NF-κB 활성화를 매개하는 유전자 발현을 억제하는 것이 명확하였다.

따라서, 본 발명의 IκB키나아제 저해제 및 이를 포함하는 조성물은 IκB키나아제 저해제로서 유용하며, 포유동물의 IκB키나아제가 관여하는 질병 및 NF-κB가 관여하는 질병의 치료 및 예방에 유용한 효과를 기대할 수 있다.

Claims

망고스틴(Garcinia mangostana L.)의 과실 또는 과피를 함수(含水)유기용제 또는 유기용제로 추출하여 얻은 추출물, α-망고스틴 및 γ-망고스틴 중에서 선택된 1 종 또는 그 이상의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, IκB키나아제 활성 및 NF-κB에 의한 유전자 발현에 의하여 야기되는 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 담마진, 결막염, 춘계(春季)카타르, 건선, 궤양성 대장염, 전신성 염증반증후군, 패혈증, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 알쯔하이머형 치매증, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 만성 관절류머티즘, I형 당뇨병, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염(하시모토병), 세리아크병, 중증근무력증, 심상성(尋常性) 천포창, 전신성 에리테마토데스, 바이러스질환(HIV, 헤르페스, 센다이 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 광견병바이러스, 수포성 구내염바이러스, 라이노바이러스, A형간염바이러스, B형간염바이러스, 풍진바이러스 등), 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 재관류장해, 심장비대, 암 및 II형 당뇨병의 치료 및 예방용 IκB키나아제 저해제.
청구항 1의 IκB키나아제 저해제를 유효성분으로 포함하고, IκB키나아제 활성 및 NF-κB에 의한 유전자 발현에 의하여 야기되는 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 담마진, 결막염, 춘계(春季)카타르, 건선, 궤양성 대장염, 전신성 염 증반증후군, 패혈증, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 알쯔하이머형 치매증, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 만성 관절류머티즘, I형 당뇨병, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염(하시모토병), 세리아크병, 중증근무력증, 심상성(尋常性) 천포창, 전신성 에리테마토데스, 바이러스질환(HIV, 헤르페스, 센다이 로타바이러스, 인플루엔자바이러스, 광견병바이러스, 수포성 구내염바이러스, 라이노바이러스, A형간염바이러스, B형간염바이러스, 풍진바이러스 등), 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 재관류장해, 심장비대, 암 및 II형 당뇨병의 치료 및 예방용 IκB키나아제 저해용 조성물.
삭제
삭제