KR100651393B1 - Mothod for preparing R-1-amino-2-propanol using hydrolysis enzyme - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가수분해 효소를 이용한 (R)-1-아미노-2-프로판올의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 프로필렌 옥사이드와 나트륨 아지드 및 염화 암모늄을 반응시켜 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 얻는 단계; 촉매 존재하에서 상기 라세믹 1-아지도-2-프로판올과 무수 아세트산을 반응시켜 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르를 얻는 단계; 완충용액 중에서 가수분해 효소와 상기 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르를 반응시켜 광학활성을 갖는 (R)-1-아지도-2-프로판올을 얻는 단계; 및 팔라듐/탄소 촉매의 존재하에서 상기 (R)-1-아지도-2-프로판올의 아지드기를 수소화 반응을 통해 아미노기로 환원시키는 단계를 포함하는 가수분해 효소를 이용한 (R)-1-아미노-2-프로판올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 매우 저가인 프로필렌 옥사이드를 출발물질로 사용하여 종래의 방법과 비교할 때 경제적이며, 최대 97.7%의 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아미노-2-프로판올을 제공한다.The present invention relates to a method for preparing (R) -1-amino-2-propanol using a hydrolase, and more particularly, racemic 1-azido- by reacting propylene oxide with sodium azide and ammonium chloride. Obtaining 2-propanol; Reacting the racemic 1-azido-2-propanol with acetic anhydride in the presence of a catalyst to obtain racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester; Reacting the hydrolase and the racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester in a buffer to obtain (R) -1-azido-2-propanol having optical activity; And reducing the azide group of (R) -1-azido-2-propanol to an amino group through a hydrogenation reaction in the presence of a palladium / carbon catalyst. It relates to a method for preparing 2-propanol. The method of the present invention provides (R) -1-amino-2-propanol having high optical purity of up to 97.7%, which is economical compared to the conventional method using very low cost propylene oxide as starting material.
가수분해, 효소, 에스테르, 아지도, 아미노, 프로판올, 광학활성Hydrolysis, enzyme, ester, azido, amino, propanol, optical activity
Description
본 발명은 가수분해 효소를 이용한 (R)-1-아미노-2-프로판올의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게 출발물질인 프로필렌 옥사이드를 아지드화시켜 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 얻은 후, 에스테르화 반응을 통해 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르를 생성하고, 이로부터 가수분해 효소를 이용한 에스테르 가수분해 반응을 통해 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아지도-2-프로판올을 얻고, 이를 수소화하여 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아미노-2-프로판올을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing (R) -1-amino-2-propanol using a hydrolase, and more specifically, racemic 1-azido-2-propanol by azide-forming propylene oxide as a starting material. After obtaining, the esterification reaction yielded 2-azido-1-methyl-ethyl ester of acetate, from which (R) -1-azide having high optical purity through ester hydrolysis using a hydrolase. This invention relates to a method of obtaining (-2-) propanol with high optical purity by obtaining FIG.-2-propanol and hydrogenating it.
한 형태의 광학활성을 갖는 아미노 알코올류는 현재 중추신경계(CNS:Central Nervous System) 질환의 치료물질 등과 같은 많은 약리활성 화합물의 중간체로 사용된다. 그러나 또 다른 형태의 화합물은 약리효과를 보이지 않거나 독성을 나타내기도 한다. 이러한 이유로, 약리활성 화합물의 키랄 전구체(Chiral precursors)로서 중요한 작용을 하는 아미노 알코올류에 대한 경제적인 생산방법에 연구가 집중되고 있다. Amino alcohols with one type of optical activity are currently used as intermediates of many pharmacologically active compounds such as CNS (Central Nervous System) diseases. However, other forms of the compound may not exhibit pharmacological effects or may be toxic. For this reason, research is focused on economic production methods for amino alcohols, which play an important role as chiral precursors of pharmacologically active compounds.
특히 본 발명의 최종 생성물인 (R)-1-아미노-2-프로판올은 머크(MERCK)사의 성장호르몬 분비 촉진인자 등과 같은 생물학적 검증단계에 있는 의약품 뿐만 아니라, 전임상 단계에 있는 매우 많은 의약품의 중요한 전구체로서 사용되고 있다.In particular, (R) -1-amino-2-propanol, the final product of the present invention, is an important precursor of a large number of drugs in the preclinical stage, as well as drugs in biological verification such as MERCK's growth hormone secretagogue. It is used as.
현재 광학활성을 갖는 아미노 알코올류를 합성하는 방법에는 전구체로서 라세믹 아미노 알코올류를 이용하는 방법 및 라세믹 아지도 알코올류를 이용하는 두가지 방법이 있다.Currently, there are two methods for synthesizing amino alcohols having optical activity by using racemic amino alcohols as precursors and racemic azido alcohols.
우선 라세믹 아미노 알코올류를 전구체로 이용하는 방법에는 아미노 알코올의 아미노기 또는 알코올기가 알킬기로 치환된 라세믹 아미드, 또는 에스테르 중간체를 만든 후 이를 광학 선택적으로 가수분해하는 방법 및, 라세믹 아미노 알코올을 비극성 용매상에서 효소를 이용하여 광학선택적으로 에스테르화 반응시키는 방법 등이 있다. 프랜칼란시(Francalanci) 등은 광학활성이 없는 라세믹 2-(알콕시카르보닐 아미노)-1-알코올류를 수종의 리파아제를 이용한 가수분해를 통해 광학활성을 갖는 2-아미노-1-알코올류로 전환하였다(J.Org.chem., 1987, 52, 5079-5082). 그 후 고터(Gotor)등은 초산 에틸의 존재하에서 25중량% 과량의 리파아제 피피엘(Lipase PPL, Type Ⅱ crude, Sigma사 제품)을 사용하여 라세믹 1-아미노-2-프로판올을 반응시켜 95% 정도의 광학활성을 갖는 (S)형의 1-아미노-2-프로판올을 얻었다(J.Chem.soc.,Chem. Commun., 1988, 957-958). 그러나 사용된 효소가 과량으로 사용되었을 뿐 아니라 제조된 1-아미노-2-프로판올의 광학순도도 최대 95% 정도에 지나지 않았다.First, a method of using racemic amino alcohols as a precursor includes a method of preparing a racemic amide or an ester intermediate in which an amino group or an alcohol group of an amino alcohol is substituted with an alkyl group, and then optically hydrolyzing it, and a nonpolar solvent of racemic amino alcohol. And an optically selective esterification reaction using an enzyme on the bed. Francalanci et al. Convert optically inactive racemic 2- (alkoxycarbonylamino) -1-alcohols into optically active 2-amino-1-alcohols through hydrolysis with several lipases. Conversion (J. Org.chem., 1987, 52, 5079-5082). Gotor et al. Then reacted racemic 1-amino-2-propanol with 25% by weight of lipase PPL (Lipase PPL, Type II crude, manufactured by Sigma) in the presence of ethyl acetate. 1-amino-2-propanol of type (S) having a degree of optical activity was obtained (J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988, 957-958). However, not only was the enzyme used in excess, but the optical purity of the prepared 1-amino-2-propanol was only up to 95%.
한편, 라세믹 아지도 알코올류를 전구체로 이용하는 방법은 대응하는 옥사이 드를 아지드화시켜 라세믹 아지도 알코올을 만드는 것으로부터 시작된다. 이렇게 합성된 라세믹 아지도 알코올을 광학활성을 갖는 아지도 알코올로 만드는 방법은 두가지 방법이 있다.On the other hand, the method of using racemic azido alcohols as a precursor starts with azide a corresponding oxide to make racemic azido alcohol. There are two ways to make the synthesized racemic azido alcohol into an azido alcohol having optical activity.
우선 라세믹 아지도 알코올과 비닐기를 포함한 에스테르 화합물(vinyl ester compounds)을 비극성 용매상에서 효소를 이용하여 광학활성을 갖는 에스테르화된 아지도 알코올로 전환하여 분리한 뒤 이를 가수분해하여 광학활성형의 아지도 알코올을 만드는 방법과, 아지도 알코올의 알코올기를 에스테르화 반응을 통해 알코올기가 알킬기로 치환된 라세믹 에스테르 중간체를 만든뒤 이를 가수분해 효소를 이용하여 광학활성을 갖는 아지도 알코올로 가수분해하는 방법 등이 있다. 상기 라세믹 아지도 알코올류를 이용하는 방법은 제조된 광학활성형의 아지도 알코올의 아지드기를 아미노기로 환원시켜 아미노 알코올로 전환하여 반응을 완성한다. First, racemic azido alcohol and vinyl ester compounds containing vinyl groups are converted to esterified azido alcohols having optical activity by using an enzyme in a non-polar solvent, and then hydrolyzed to separate them. A method of making an alcohol and a method of preparing a racemic ester intermediate in which an alcohol group is substituted with an alkyl group through an esterification reaction of an azido alcohol and then hydrolyzing it to an azido alcohol having an optical activity using a hydrolase. Etc. In the method using the racemic azido alcohols, the azide group of the prepared optically active azido alcohol is reduced to an amino group to convert to an amino alcohol to complete the reaction.
우선, 스퍼-와서탈(Seufer-Wasserthal)등은 비닐기를 포함한 에스테르 화합물과 라세믹 아지도 알코올류를 자일렌 등의 비극성 용매하에서 리파아제 에이에스(Lipase AS, 아마노사 제품)를 이용하여 광학활성을 갖는 에스테르로 전환하는 트랜스 에스테르화 반응(transesterification)을 시도하였다 (미국특허 5,534,436). 그러나 이와 같은 방법은 반응 후 초기의 부산물로서 비닐 알코올(Vinyl alcohol)을 제조하며 이는 곧 아세트알데히드(acetaldehyde)로 재배열(tautomerization)되는데, 상기 아세트알데히드는 반응성이 매우 커서 효소의 활성부위를 변경시킴으로써 효소를 비가역적으로 불활성화시킨다(Mozhaev et al., Advanced Drug delivery Reviews 4:387(1990)). First, Seufer-Wasserthal et al. Have an optical activity using lipase AS (manufactured by Amano) on ester compounds containing vinyl groups and racemic azido alcohols under nonpolar solvents such as xylene. Transesterification was attempted to convert to esters (US Pat. No. 5,534,436). However, this method produces vinyl alcohol as an initial by-product after the reaction, which is rearranged into acetaldehyde, which is very reactive, thereby altering the active site of the enzyme. The enzyme is irreversibly inactivated (Mozhaev et al., Advanced Drug delivery Reviews 4: 387 (1990)).
라세믹 아지도 알코올류를 전구체로 이용하는 또 다른 방법으로 알킬기로 치환된 라세믹 아지도 알코올의 에스테르를 가수분해하여 광학활성형의 아지도 알코올류로 만드는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 상기 방법은 환형의 아지도 알코올류 전구체를 이용하는 방법(Faber K. et al., Tetrahedron Lett.,1988, 29, 16, 1903-1904, Honig H. et al., J.Chem.Soc.Perkin Trans. I, 1989, 2341-2345, Exl C. et al., Tetrahedron:Asymmetry, 1992, 3, 11, 1391-1394) 및 선형의 아지도 알코올류 전구체를 이용하는 방법(Foelsche E. et al., J.Org.Chem., 1990, 55, 1749-1753, Honig H. et al., Biotechnol. Lett., 1992, 14, 5, 367-372)으로 구분할 수 있다. 한편, 현재까지 연구가 진행된 아미노 알코올류 전구체는 구성분자내의 소수성 부분의 크기가 큰 물질로 편중되어 있고, 크기가 작은 아미노 알코올류에 대한 연구는 상대적으로 적은 편이다. 그러나, 분자크기가 작은 아미노 알코올류에 대한 수요는 지속적으로 증가하고 있으므로, 본 발명에서는 분자크기가 작은 아미노 알코올류에 대한 경제적인 제조방법을 확립하고자 하였다. As another method of using racemic azido alcohols as precursors, studies have been actively conducted to hydrolyze esters of racemic azido alcohols substituted with alkyl groups into optically active azido alcohols. A method using a cyclic azido alcohol precursor (Faber K. et al., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 16, 1903-1904, Honig H. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1989, 2341-2345, Exl C. et al., Tetrahedron: Asymmetry, 1992, 3, 11, 1391-1394) and methods using linear azido alcohol precursors (Foelsche E. et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 1749-1753, Honig H. et al., Biotechnol. Lett., 1992, 14, 5, 367-372). On the other hand, amino alcohol precursors that have been studied so far have been biased to materials having a large size of the hydrophobic portion in the constituent molecules, and research on small amino alcohols is relatively small. However, since the demand for amino alcohols having a small molecular size continues to increase, the present invention seeks to establish an economical manufacturing method for amino alcohols having a small molecular size.
이에 본 발명에서는 저가의 프로필렌 옥사이드를 사용하여 분자크기가 작은 전구체인 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 얻은 후, 상기 라세믹 1-아지도-2-프로판올 및 가수분해 효소를 이용하여 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아미노-2-프로판올을 제조하는 방법을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다. Thus, in the present invention, a low molecular weight propylene oxide is used to obtain racemic 1-azido-2-propanol, which is a precursor having a small molecular size, and then, using racemic 1-azido-2-propanol and a hydrolase, A method of preparing (R) -1-amino-2-propanol having optical purity has been found and the present invention has been completed based on this.
따라서, 본 발명의 목적은 출발물질로 저가의 프로필렌 옥사이드를 사용하므 로써 공정의 경제성을 높이고, 종래의 제조방법과 비교하여 작은 구성분자 크기를 갖는 전구체인 라세믹 1-아지도-2-프로판올 및, 가수분해 효소를 이용하여 최대 97.7%의 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아미노-2-프로판올의 제조방법을 제공하는데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to increase the economical efficiency of the process by using a low-cost propylene oxide as a starting material, racemic 1-azido-2-propanol which is a precursor having a small constituent molecular size compared to the conventional manufacturing method and To provide a method for preparing (R) -1-amino-2-propanol having a high optical purity of up to 97.7% using a hydrolase.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은 프로필렌 옥사이드와 나트륨 아지드 및 염화 암모늄을 반응시켜 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 얻는 단계; 촉매 존재하에서 상기 라세믹 1-아지도-2-프로판올과 무수 아세트산을 반응시켜 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르를 얻는 단계; 완충용액 중에서 가수분해 효소와 상기 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르를 반응시켜 광학활성을 갖는 (R)-1-아지도-2-프로판올을 얻는 단계; 및 촉매의 존재하에서 상기 (R)-1-아지도-2-프로판올의 아지드기를 수소화 반응을 통해 아미노기로 환원시키는 단계를 포함한다.The method of the present invention for achieving the above object comprises the steps of reacting propylene oxide with sodium azide and ammonium chloride to obtain racemic 1-azido-2-propanol; Reacting the racemic 1-azido-2-propanol with acetic anhydride in the presence of a catalyst to obtain racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester; Reacting the hydrolase and the racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester in a buffer to obtain (R) -1-azido-2-propanol having optical activity; And reducing the azide group of (R) -1-azido-2-propanol in the presence of a catalyst through an hydrogenation reaction to an amino group.
이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
전술한 바와 같이, 본 발명은 가수분해 효소를 이용한 (R)-1-아미노-2-프로판올의 제조방법에 관한 것으로, 출발물질인 저가의 프로필렌 옥사이드 및 이로부터 생성된 작은 분자크기의 전구체인 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 이용하여 종래의 방법에 비해 경제적이고 독특한 공정을 제공하며, 상기 반응의 반응생성물로부터 가수분해 효소를 이용한 에스테르 가수분해 반응을 통해 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아미노-2-프로판올을 제공한다. As described above, the present invention relates to a method for preparing (R) -1-amino-2-propanol using a hydrolase, and a low-cost propylene oxide as a starting material and a small molecular size precursor produced therefrom. Using Mic 1-azido-2-propanol provides an economical and unique process compared to the conventional method, and has a high optical purity through ester hydrolysis using a hydrolase from the reaction product of the reaction (R) -1-amino-2-propanol is provided.
본 발명에 따르면, 출발물질인 프로필렌 옥사이드와 나트륨 아지드 및 염화 암모늄을 에탄올과 물의 혼합용액 중에서 반응시켜 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 얻는다. 이때의 프로필렌 옥사이드와 나트륨 아지드 및 염화 암모늄의 반응비는 1:1:1 ∼ 1:2:2(M/M/M)이 바람직하다. 상기 프로필렌 옥사이드는 나트륨 아지드와의 반응을 통해 아지드화되어 라세믹 1-아지도-2-프로판올이 생성된다.According to the present invention, racemic 1-azido-2-propanol is obtained by reacting propylene oxide, sodium azide and ammonium chloride as starting materials in a mixed solution of ethanol and water. At this time, the reaction ratio of propylene oxide, sodium azide and ammonium chloride is preferably 1: 1: 1 to 1: 2: 2 (M / M / M). The propylene oxide is azide through reaction with sodium azide to produce racemic 1-azido-2-propanol.
그 다음, 상기 반응생성물인 라세믹 1-아지도-2-프로판올과 무수 아세트산을 트리에틸아민과 같은 촉매의 존재하에서 상온의 디클로로메탄 용액 중에서 반응시켜 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르를 얻는다. 상기 라세믹 1-아지도-2-프로판올의 알코올기는 무수 아세트산과의 에스테르화 반응을 통해 알코올기가 알킬기로 치환된 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르가 생성된다.Then, the reaction product racemic 1-azido-2-propanol and acetic anhydride are reacted in a dichloromethane solution at room temperature in the presence of a catalyst such as triethylamine to give racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-. Obtain ethyl ester. The alcohol group of racemic 1-azido-2-propanol produces a racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester in which the alcohol group is substituted with an alkyl group through an esterification reaction with acetic anhydride.
상기 반응생성물인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르는 가수분해 효소의 존재하에 인산 나트륨과 같은 완충용액 중에서 반응시켜 광학활성을 갖는 (R)-1-아지도-2-프로판올을 얻는다. 이 때, 미반응된 (s)-초산 2-아지도-1-메틸-에틸-에스테르는 반응액중에 남는다. 상기 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르는 가수분해 효소를 이용한 라세믹 에스테르의 가수분해 반응을 통해 광학활성을 갖는 (R)-1-아지도-2-프로판올이 생성된다. 상기 반응생성물은 HPLC를 이용하여 정량한다. 예를 들어, 상기 HPLC 정량은 아밀로스 유도체로 이루어진 키랄팩 에이에스(Chiralpak AS, Daice사 제품) 컬럼 및 헥산과 이소프로판올이 혼합된 용리액을 사용하여 수행된다.The reaction product, racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester, is reacted in a buffer solution such as sodium phosphate in the presence of a hydrolase and has (R) -1-azido-2-propanol having optical activity. Get At this time, unreacted (s) -acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl-ester remained in the reaction solution. The racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester generates (R) -1-azido-2-propanol having optical activity through hydrolysis of the racemic ester using a hydrolase. The reaction product is quantified using HPLC. For example, the HPLC quantification is carried out using a Chiralpak AS column made of amylose derivatives and an eluent mixed with hexane and isopropanol.
본 발명에서 사용되는 가수분해 효소는 리파아제류 또는 프로테아제류 등의 생물체로부터 얻을 수 있는 효소이다. 상기 가수분해 효소는 상업적으로 시판되는 것을 사용하거나 필요에 따라서는 제조하여 사용할 수 있다. 또한 효소의 형태는 미생물 등에서 얻은 효소, 액상형태로 제공되는 효소 또는 담체에 고정화된 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이다. 상업적으로 시판되는 리파아제류의 가수분해 효소는 예를 들어, 아마노(Amano)사의 제품 중 리파제 엠(Lipase M), 노보(Novo)사의 제품 중 팔라타아제 20,000 엘(Palatase 20,000 L) 및 이의 고정화 형태인 리포짐 아이엠(Lipozyme IM), 및 시그마(Sigma)사의 리파제 피피엘(Lipase PPL) 등이 있고, 시판되는 프로테아제류의 가수분해 효소는 예를 들어 산성 프로테아제 II(Acid Protease II), 바이오캣(Bio-cat.)사의 진균 프로테아제(Fungal Protease) 500,000 및 400,000 등이 있다. 이중 본 발명에서 높은 광학순도를 얻을 수 있으며, 반복사용에 가장 바람직한 효소는 리조무코 미헤이(Rhizomucor miehei)에서 유래되어 고정화된 형태로 시판되고 있는 노보(Novo)사의 리포짐 아이엠(Lipozyme IM)이다. The hydrolase used in the present invention is an enzyme obtainable from an organism such as lipases or proteases. The hydrolase may be commercially available or may be prepared and used as necessary. In addition, the enzyme is one selected from the group consisting of enzymes obtained from microorganisms, enzymes provided in liquid form, or enzymes immobilized on a carrier. Commercially available hydrolytic enzymes of lipases are, for example, Lipase M in Amano, Palatase 20,000 L in Novo, and immobilized forms thereof. Lipozyme IM, Lipase PPL from Sigma, and the like, and commercially available protease hydrolytic enzymes include, for example, Acid Protease II, Biocat, and Biocat. fungal protease 500,000 and 400,000. Of these, high optical purity is obtained in the present invention, and the most preferred enzyme for repeated use is Novo Lipozyme IM, which is commercially available in immobilized form derived from Rhizomucor miehei . .
일반적으로, 뮤코(Mucor)에서 유래된 리파아제는 작은 크기의 분자에 대해서도 촉매가 가능한 것으로 공지되어 있다. 따라서, 작은 크기의 분자에 대해서 높은 광학활성을 유지해야 하는 본 발명의 방법에 따른 효소에 있어서, 리조무코 미헤이에서 유래된 리파제는 다른 리파아제에 비해 높은 광학활성을 나타내었다. In general, lipases derived from Muco are known to be able to catalyze small molecules. Therefore, in the enzyme according to the method of the present invention, which must maintain high optical activity for small sized molecules, lipase derived from Rizomuco mihei showed higher optical activity than other lipases.
그러나 균주 및 효소는 상기 예에 한정되지 않고 상기 효소들을 이용한 고정화, 액상 및 분말형에 모두 적용된다.However, strains and enzymes are not limited to the above examples but apply to both immobilized, liquid, and powder forms using the enzymes.
본 발명에 따르면, 상기 반응은 반응시간이 24∼120h, 반응물인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르의 중량 대비 효소의 부피 비율 0.2∼2, 인산 나트륨 완충용액의 pH 3∼11, 및 반응온도 25∼50℃의 조건에서 실시하는 것이 바람직하다.According to the present invention, the reaction has a reaction time of 24 to 120 h, a weight ratio of enzyme to a weight ratio of racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester, 0.2 to 2, pH 3 to sodium phosphate buffer solution. It is preferable to carry out on 11 and the conditions of 25-50 degreeC of reaction temperature.
한편, 상기 가수분해 효소는 반응 후 분리하여 1 내지 5회 반복 사용하여도 반응효율에 큰 영향을 미치지 않으므로 경제적이다.On the other hand, the hydrolase is economical because it does not significantly affect the reaction efficiency even after repeated 1 to 5 times to separate after the reaction.
상기 반응생성물인 활성형의 (R)- 1-아지도-2-프로판올은 촉매의 존재하에서 상기 생성물의 아지드기를 수소화 반응을 통해 아미노기로 환원시켜 (R)-1-아미노-2-프로판올을 얻는다. 상기 반응의 촉매는 팔라듐/탄소 촉매가 바람직하다. The active product of the reaction product (R) -1-azido-2-propanol is reduced in the presence of a catalyst to the amino group by the hydrogenation reaction to the (R) -1-amino-2-propanol Get The catalyst for the reaction is preferably a palladium / carbon catalyst.
하기 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 살펴보지만, 이에 한정되는 것은 아니다. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but is not limited thereto.
실시예 1Example 1
라세믹 1-아지도-2-프로판올의 제조Preparation of Racemic 1-azido-2-propanol
80% 에탄올 용액 250㎖에 프로필렌 옥사이드 50㎖를 넣고 25℃에서 천천히 교반시키면서 나트륨 아지드(sodium azide, NaN3) 60g과 염화 암모늄(ammonium chloride, NH4Cl) 50g을 천천히 투입한다. 상기 반응물은 80℃ 이상의 반응온도에서 10시간 이상 반응시킨 후, 상온으로 온도를 내린다. 물 200㎖를 투입하고 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 추출한 후, 감압증류를 통해 용매를 제거하여 라세믹 1-아지도-2-프로판올(racemic 1-azido-2-propanol) 60g(84%)을 얻었다. 반응생성물이 라세믹 1-아지도-2-프로판올임을 핵자기공명 분석법으로 확인하였다. 50 ml of propylene oxide was added to 250 ml of 80% ethanol solution, and 60 g of sodium azide (NaN 3 ) and 50 g of ammonium chloride (NH 4 Cl) were slowly added while stirring slowly at 25 ° C. The reactant is reacted for at least 10 hours at a reaction temperature of 80 ℃ or more, and then the temperature is lowered to room temperature. 200 ml of water was added and extracted with dichloromethane (CH 2 Cl 2 ), and the solvent was removed by distillation under reduced pressure. 60 g (84%) of racemic 1-azido-2-propanol was extracted. ) The reaction product was confirmed by nuclear magnetic resonance analysis that racemic 1-azido-2-propanol.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ: 3.99(m, 1 H), 3.26(ABX, 2 H), 1.97(br, 1 H, -OH), 1.23(d, 3 H). 1 H NMR (200 MHz, CDCl 3 ) δ: 3.99 (m, 1 H), 3.26 (ABX, 2 H), 1.97 (br, 1 H, —OH), 1.23 (d, 3 H).
실시예 2Example 2
라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르의 제조Preparation of racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester
상기 실시예 1의 방법으로 생성된 라세믹 1-아지도-2-프로판올 162.5g과 디클로로메탄(CH2Cl2) 200㎖를 반응기에 투입하여 25℃에서 천천히 교반시킨다. 트리에틸아민(triethylamine) 337㎖를 투입하고 무수 아세트산(acetic anhydride, Ac2O) 167㎖를 천천히 투입하면서 상온에서 교반시킨다. 4시간 후 라세믹 1-아지도-2-프로판올이 모두 사라진 것을 확인하고 염화 암모늄 포화용액 200㎖을 투입하여 교반시킨다. 층을 분리하여 유기층을 얻은 후, 감압증류하고 용매를 제거하여 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르(racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester) 215g(93%)을 얻었다. 반응생성물인 액체가 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르임을 핵자기공명 분석법으로 확인하였다.162.5 g of racemic 1-azido-2-propanol and 200 ml of dichloromethane (CH 2 Cl 2 ) produced by the method of Example 1 were added to the reactor and stirred slowly at 25 ° C. 337 ml of triethylamine was added and 167 ml of acetic anhydride (Ac 2 O) was slowly added, followed by stirring at room temperature. After 4 hours, all racemic 1-azido-2-propanol disappeared, and 200 ml of saturated ammonium chloride solution was added and stirred. The layers were separated to obtain an organic layer. The mixture was distilled under reduced pressure and the solvent was removed to obtain 215 g (93%) of racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester. Got. It was confirmed by nuclear magnetic resonance analysis that the reaction product liquid was racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ: 5.00(m, 1 H), 3.23(d, 2 H), 2.01(s, 3 H), 1.22(d, 3 H). 1 H NMR (200 MHz, CDCl 3 ) δ: 5.00 (m, 1 H), 3.23 (d, 2 H), 2.01 (s, 3 H), 1.22 (d, 3 H).
실시예 3Example 3
가수분해 효소를 이용한 라세믹 에스테르의 가수분해Hydrolysis of Racemic Ester Using Hydrolase
실리콘/테프론 고무마개로 공기의 흐름을 차단시킨 15㎖의 바이알에 노보사 의 리포짐 아이엠(Lipozyme IM) 0.25g을 정량하여 첨가한 뒤, 실시예 2에서 생성된 기질인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르 0.25㎖ 및 0.1M의 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 최종부피가 5㎖가 되도록 주입한 뒤, 교반조를 사용하여 30℃에서 반응시켰다. 반응이 진행된 후 일정시간마다 바이알에서 일정량의 내용물을 회수하여 원심분리기로 효소 및 생성물을 분리시킨 후, 상등액을 동량의 초산 에틸을 사용하여 3회 추출하고 감압하여 초산 에틸을 제거하고 건조시킨 뒤 이를 헥산에 녹여 분석하였으며, 분석전에 일정량의 황산 마그네슘을 사용하여 수분을 제거시킨 후 HPLC를 이용하여 정량하였다.After quantitatively adding 0.25 g of Novo's Lipozyme IM to a 15 ml vial which blocked the flow of air with a silicone / teflon rubber stopper, racemic acetic acid 2-azido was produced as a substrate in Example 2. 0.25 ml of -1-methyl-ethyl ester and 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) were added to give a final volume of 5 ml, followed by reaction at 30 ° C. using a stirring vessel. After the reaction proceeds, a certain amount of contents are recovered from the vial every time, the enzyme and the product are separated by a centrifuge, and the supernatant is extracted three times using the same amount of ethyl acetate and decompressed to remove ethyl acetate and dried. The solution was dissolved in hexane and analyzed, and water was removed using a certain amount of magnesium sulfate before analysis and quantified using HPLC.
HPLC 분석조건은 다음과 같다.HPLC analysis conditions are as follows.
컬럼으로는 아밀로스 유도체로 이루어진 키랄팩 에이에스(Chiralpak AS, Daicel사 제품)를 사용하였고, 용리액으로는 헥산과 이소프로판올을 97:3의 비율로 사용하여 분당 1㎖의 속도로 흘려주었으며, 반응생성물은 UV 220nm에서 검출하였다. 상기 반응의 반응물인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르는 5.5분, 가수분해 생성물인 (S)-1-아지도-2-프로판올 및 (R)-1-아지도-2-프로판올은 각각 8.6분 및 9.3분에서 검출되었다. Chiralpak AS made of amylose derivatives (Chiralpak AS, Daicel Co., Ltd.) was used as a column, and hexane and isopropanol were used as an eluent at a ratio of 97: 3 and flowed at a rate of 1 ml per minute. Detection was at 220 nm. The reaction product of the reaction is racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester for 5.5 minutes, hydrolysis products (S) -1-azido-2-propanol and (R) -1-azido-2 Propanol was detected at 8.6 and 9.3 minutes, respectively.
분석결과는 전환율[M/M, %]과 광학순도[%]로 나타내었다.The analytical results are expressed as conversion [M / M,%] and optical purity [%].
전환율은 반응물인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르의 농도 대비 생성된 (R)-1-아지도-2-프로판올의 농도의 백분율로 나타내었고, 광학순도는 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다. The conversion was expressed as a percentage of the concentration of (R) -1-azido-2-propanol produced relative to the concentration of racemic 2-azido-1-methyl-ethyl ester as a reactant, and the optical purity is represented by the following Equation 1 Calculated using.
상기와 같은 조건으로 반응시간에 따른 (R)-1-아지도-2-프로판올로의 전환율[%] 및 반응생성물의 광학순도[%]를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.Under the same conditions as above, the conversion rate (%) and the optical purity [%] of the reaction product to (R) -1-azido-2-propanol were measured and shown in Table 1 below.
실시예 4Example 4
(R)-1-아미노-2-프로판올((R)-1-amino-2-propanol)의 제조방법Method for preparing (R) -1-amino-2-propanol ((R) -1-amino-2-propanol)
상기 실시예 3과 같은 방법으로 생성된 (R)-1-아지도-2-프로판올 19.7g과 메탄올 20㎖를 반응기에 투입하고 25℃에서 교반시킨다. 질소 분위기하에서 10% 팔라듐/탄소 (10% Pd/C) 0.1g을 투입한 후, 약 50psi 압력의 수소(H2) 기체와 4시간 이상 반응시키면서 교반시킨다. 반응물인 상기 (R)-1-아지도-2-프로판올이 모두 사라진 것을 확인하고 거름종이를 이용하여 10% 팔라듐/탄소(10 % Pd/C) 촉매를 제거하고 메탄올로 씻는다. 상기 반응용액을 감압증류를 통해 메탄올을 제거하여 (R)-1-아미노-2-프로판올((R)-1-amino-2-propanol) 1.10g을 얻었다. 아미노 프로판올의 광학활성형은 폴라로메터를 사용하여 알드리치사의 시약과 비교하여 결정하였다. 19.7 g of (R) -1-azido-2-propanol and 20 ml of methanol, which were produced in the same manner as in Example 3, were charged to a reactor and stirred at 25 ° C. 0.1 g of 10% palladium / carbon (10% Pd / C) was added under a nitrogen atmosphere, followed by stirring while reacting with hydrogen (H 2 ) gas at a pressure of about 50 psi for at least 4 hours. After confirming that all of the reactants (R) -1-azido-2-propanol disappeared, remove 10% palladium / carbon (10% Pd / C) catalyst using filter paper and wash with methanol. The reaction solution was removed by distillation under reduced pressure to obtain 1.10 g of (R) -1-amino-2-propanol ((R) -1-amino-2-propanol). The optically active form of amino propanol was determined using a polarometer compared to Aldrich's reagent.
실시예 5∼8Examples 5-8
실시예 3의 조건 중 가수분해 효소의 양은 0.25g으로 일정하게 유지시키고, 기질인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르의 부피를 0.05㎖∼0.5㎖로 조절하면서 0.1M의 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 최종부피가 5㎖가 되도록 유지시켜 96시간 동안 반응시킨 후, 바이알의 내용물을 회수하여 실시예 3의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.The amount of hydrolase in Example 3 was kept constant at 0.25 g, and 0.1 M phosphoric acid was adjusted while adjusting the volume of racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester as a substrate to 0.05 ml to 0.5 ml. After adding sodium buffer solution (pH 7.0) to maintain the final volume of 5ml to react for 96 hours, the contents of the vial was recovered and analyzed according to the method of Example 3. The results are shown in Table 2 below.
실시예 9∼12Examples 9-12
실시예 3의 조건 중 기질의 부피를 0.1㎖로 바꾸고, 0.1M의 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)를 첨가하여 최종부피가 5㎖가 되도록 유지시키고, 가수분해 효소의 양을 50m∼500mg로 조절하여 96시간 동안 반응시킨 뒤, 바이알의 내용물을 회수하여 실시예 3의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다.Under the conditions of Example 3, the volume of the substrate was changed to 0.1 ml, 0.1 M sodium phosphate buffer solution (pH 7.0) was added to maintain the final volume of 5 ml, and the amount of hydrolase was adjusted to 50 m to 500 mg. After the reaction for 96 hours, the contents of the vial were recovered and analyzed according to the method of Example 3. The results are shown in Table 3 below.
실시예 13∼20 Examples 13-20
실시예 3의 조건 중 가수분해 효소의 양과 기질인 라세믹 초산 2-아지도-1-메틸-에틸 에스테르의 부피를 일정하게 유지시키고, pH를 3∼11로 다양하게 변화시킨 0.1M 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하고 최종부피가 5㎖가 되도록 유지시켜 96시간 동안 반응시킨 후, 바이알의 내용물을 회수하여 실시예 3의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 4에 나타내었다.0.1 M sodium phosphate buffer in which the amount of hydrolase and the volume of racemic acetic acid 2-azido-1-methyl-ethyl ester in the conditions of Example 3 were kept constant, and the pH was varied from 3 to 11. After the solution (pH 7.0) was added and the final volume was kept to 5 ml and reacted for 96 hours, the contents of the vial were recovered and analyzed according to the method of Example 3. The results are shown in Table 4 below.
실시예 21∼25Examples 21-25
실시예 3의 조건 중 가수분해 효소의 양과 기질의 부피 및 0.1M의 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)의 부피를 일정하게 유지시켜 최종부피가 5㎖가 되도록 유지시키고 교반조의 온도를 25℃∼50℃로 96시간 동안 반응시킨 후, 바이알의 내용물을 회수하여 실시예 3의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다.Under the conditions of Example 3, the amount of hydrolase and the volume of the substrate and the volume of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) were kept constant so that the final volume was kept to 5 ml and the temperature of the stirring vessel was 25 ° C. to 50 ° C. After 96 hours of reaction, the contents of the vial were collected and analyzed according to the method of Example 3. The results are shown in Table 5 below.
실시예 26∼31Examples 26-31
실시예 3의 조건 중 가수분해 효소의 종류를 바꾸어 96시간 동안 반응시킨 후 바이알의 내용물을 회수하여 실시예 3의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 6에 나타내었다.After changing the type of hydrolase among the conditions of Example 3 and reacting for 96 hours, the contents of the vial were recovered and analyzed according to the method of Example 3. The results are shown in Table 6 below.
실시예 32∼36Examples 32-36
실시예 3의 조건에 따라 120시간 동안 반응시킨 후, 내용물을 회수하여 원심분리기로 효소와 반응생성물을 분리시켜 상등액은 실시예 3의 추출방법을 이용하여 분리한 후, HPLC를 사용하여 분석하고 정량하였다. 또한 분리된 효소는 반복사용을 위하여 이소프로판올을 사용하여 2회 세척한 후 건조하여 재사용하였다. 상기와 동일한 방법으로 효소를 5회 반복 사용하여 실험하고 상등액은 회수하여 분석하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다.After reacting for 120 hours according to the conditions of Example 3, the contents were recovered, the enzyme and the reaction product were separated by a centrifuge, and the supernatant was separated using the extraction method of Example 3, analyzed using HPLC and quantified. It was. In addition, the separated enzyme was washed twice with isopropanol for repeated use, dried and reused. The experiment was repeated five times using the same method as above, and the supernatant was recovered and analyzed. The results are shown in Table 7 below.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 출발물질인 저가의 프로필렌 옥사이드 및 이로부터 생성된 작은 분자크기의 전구체인 라세믹 1-아지도-2-프로판올을 이용하여 종래의 방법에 비해 경제적이고 독특한 공정을 제공하며, 상기 반응의 반응생성물로부터 가수분해 효소를 이용한 라세믹 에스테르의 가수분해 반응을 통해 높은 광학순도를 갖는 (R)-1-아미노-2-프로판올을 제공한다.
As described above, the process of the present invention is economical and unique compared to the conventional process, using low-cost propylene oxide as a starting material and racemic 1-azido-2-propanol, which is a precursor of small molecule size produced therefrom. It provides (R) -1-amino-2-propanol having a high optical purity through the hydrolysis reaction of the racemic ester using a hydrolase from the reaction product of the reaction.
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